Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus

Texto

(1)Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. EFEITO DA Abarema cochliacarpos (Gomes) NA LESÃO MUSCULAR INDUZIDA PELO VENENO DE Bothrops leucurus. Jeison Saturnino de Oliveira. SÃO CRISTÓVÃO/SE 2014.

(2) ii JEISON SATURNINO DE OLIVEIRA. Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe, RENORBIO/SE, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor.. SÃO CRISTÓVÃO/SE 2014.

(3) iii. Jeison Saturnino de Oliveira. Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus. Defesa em 26/02/2014. Conceito:. BANCA EXAMINADORA. _______________________________________ Prof. Dr. Lucindo José Quintans Junior (orientador) Universidade Federal de Sergipe-UFS. _______________________________________. _______________________________________. Prof. Dr. Charles dos Santos Estevam Universidade Federal de Sergipe-UFS. Prof. Dra. Karina C. Gomes Machado de Araújo Universidade Federal de Sergipe-UFS. _______________________________________. _______________________________________. Prof. Dra. Rosilene Calazans Soares Universidade Federal de Sergipe-UFS. Prof. Dra. Deise Maria Furtado de Mendonça DBCI – Campus Itabaiana Universidade Federal de Sergipe-UFS.

(4) iv. Dedicatória Eu dedico este trabalho: A minha esposa ELIZABETH e meus filhos INÁCIO E JOÃO, pelo carinho, apoio e exemplos de lealdade, amor e fraternidade. A minha mãe MARIA CELESTINA e meu pai JOSUÉ SATURNINO (in memorian), pelos exemplos de vida, pelos ensinamentos morais e pelo apoio em todos os setores da minha vida. Aos meus avós OTÍLIA ALBANI e ALCEBÍADES PEREIRA. (ambos in. memorian), que me ensinaram o valor da ética na vida de um ser humano. Aos meus irmãos Josimeri, Josiane, Jeferson e Jansen, pela compreensão, torcida e carinho dedicado a mim..

(5) v. Agradecimentos A Deus, pela saúde e oportunidade de ampliar o conhecimento! Ao Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior, meu orientador, por ter aberto as portas do seu laboratório, pela paciência, tolerância, amizade e estimável orientação. Ao Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos, meu co-orientador, pelas sugestões estabelecidas neste trabalho. Ao Prof. Dr. Paulo de Assis Melo, pai científico de intocáveis alunos e pela colaboração na área de toxinas ofídicas. Ao Prof. Dr. Durvanei Maria, pelo apoio na microscopia eletrônica. Ao Prof. Dr. Charles Santos Estevam, coordenador do RENORBIO/SE, pela amizade, confiança e apoio a todos os doutorandos. Aos professores e amigos Glória Maria, Miguel Lemos, José Tadeu Madeira, Norberg, Tereza Solero, Ana Martinez, Rosangela Machado, Di Pietro, Fabrício Rios, Mércia Margoto, Angelo Antoniolli, Anderson Marçal, Alexandre, Brancilene, Marcli e tantos outros que sempre me incentivaram. Aos colegas e amigos do doutorado: Magna (SE), Alana (SE), Lidiane (PE), Lorena (SE), Marco (SE), Maria Helena (PE) e Mônica (SE) por tudo que passamos juntos. Na certeza de que a “nossa” frase é verdadeira: “TUDO PARECE IMPOSSÍVEL ATÉ QUE SEJA FEITO (NELSON MANDELA)”. Aos amigos Mônica Melo, Marília, Geovana, Makson, Adriana Gibara, Aldirene, Douglas, Simone, Michele, Juliana, Rosana, Renan,........ e tantos outros, por dividirem comigo a alegria de ser um ALUNO LAPEC. Ao colega Antônio Dias, pela presteza em liofilizar o extrato. Aos professores do Departamento de Morfologia/UFS, meus colegas de trabalho, por apostarem no sucesso da nossa equipe. Aos meus alunos de Anatomia Humana, monitores, iniciação científica e aos funcionários da UFS, em especial ao senhor Osvaldo (Biotério setorial da UFS), pela amizade, simpatia e disposição em ajudar. Um agradecimento especial à secretária da pós-graduação da RENORBIO/SE, Jackeline Rittes, que sempre cuidou de tudo incansavelmente, inclusive funções que cabiam a mim e aos meus colegas. E finalmente, quero agradecer a todos que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho: MUITO OBRIGADA!.

(6) vi. RESUMO SATURNINO-OLIVEIRA, J. Efeito da Abarema cochliacarpos (Gomes) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus. 2014. 100f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Universidade Federal de Sergipe, Aracaju/SE, 2014.. O ofidismo é um problema de saúde pública em todo o mundo, especialmente nos países tropicais. O objetivo deste trabalho foi de investigar os mecanismos envolvidos no efeito do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema cochliacarpos (EAc) (popularmente conhecida como “barbatimão”) na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus (BlV). Foram utilizados camundongos Swiss machos (28-32 g; n=6 por grupo), que receberam injeção perimuscular do veneno Bothrops leucurus (BlV – 1 mg/Kg/pata – Volume 50µl) no membro posterior direito, tratados por via oral (v.o.), com veículo (solução salina) ou EAc (100, 200 ou 400 mg/kg). Na hipernocicepção mecânica os animais foram avaliados nos tempos 2, 4 e 6 horas, utilizando o analgesímetro digital (Von Frey). Na atividade edematogênica os animais foram avaliados nos tempos 15, 30, 60 e 90 minutos, utilizando o paquímetro digital. Já atividade motora foi avaliada pelo teste de rota-rod e os animais foram avaliados em 1, 3 e 7 dias. Na avaliação histológica o músculo Extensor digitorum longus (EDL) foi isolado, retirado, fixado, emblocado com parafina (Microscopia óptica) e resina (Microscopia eletrônica) e cortados. Os tecidos foram corados com hematoxilinaeosina e observados ao microscópio óptico e eletrônico e posteriormente fotografados. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa com animais da UFS (CEPA: 61/12). Os resultados foram analisados utilizando o teste StudentʼS t-test. O tratamento, por v.o, com EAc (400 mg/Kg) inibiu a hipernocicepção mecânica, (2h 5,1±0,76; 4h 5,70±0,65; 6h 5,93±0,49; p<0,05) quando comparados aos animais do grupo BlV (veneno) (2h 2,08±0,33; 4h 2,28±0,18; 6h 2,52±0,24). A inibição também foi verificada na atividade edematogênica, com EAc (400 mg/kg), (15 min. 15,35±0,27; 30 min. 12,63±0,69; 60 min. 9,38±0,29 e 90 min. 6,83±0,66; p<0,05), quando comparados aos animais do grupo BlV (veneno) (15 min. 29,7±0,17; 30 min. 25,8±0,26; 60 min. 20,15±0,24 e 90 min. 14,76±0,21). Quanto à atividade motora, o EAc (400 mg/Kg) preservou a capacidade motora (1 dia 83,22±0,46; 3 dias 98,02±0,20 e 7 dias 119,24±0,48; p<0,05), comparados ao grupo BlV (veneno) (1 dia 20,03±0,26; 3 dias 35,22±0,36 e 7 dias 111,21±0,18). Na análise histológica verificou-se uma proteção da lesão muscular após administração do EAc (400 mg/Kg), preservando as fibras musculares. Nossos resultados demonstraram que o EAc inibiu os efeitos nocivos do veneno, sugerindo que este composto apresenta potencial biotecnológico no tratamento coadjuvante do ofidismo. Palavras chave: Bothrops leucurus, Abarema cochiliacarpos, ofidismo, Inflamação, lesão muscular..

(7) vii. ABSTRACT SATURNINO-OLIVEIRA, J. Effect of Abarema cochliacarpos (Gomes) in muscle injury induced by Bothrops leucurus. 2014. 100f. Thesis (Ph.D. in Biotechnology) Federal University of Sergipe, Aracaju / SE, 2014. The snakebite is a public health problem worldwide, especially in tropical countries. The objective of this study was to investigate the mechanisms involved in the effect of hydroethanolic extract of the stem bark Abarema cochliacarpos (EAc) in muscle injury induced by Bothrops leucurus. Male swiss mice were used (28-32g ; n= 6 groups), where they received perimuscular injection Bothrops leucurus venom (BlV – 1 mg/Kg/paw – Volume 50 µl) the right hind limb, treated orally (po), with vehicle (saline) or EAc (100, 200 or 400 mg / kg). In the mechanical hypernociception animals were evaluated in time 2, 4 and 6 hours using digital analgesymeter (von Frey). Edema activity in the animals were evaluated at 15, 30, 60 and 90 minutes, using a digital caliper. Have motor activity was assessed by the rota -rod test and the animals were evaluated at 1, 3 and 7 days. Histological evaluation extensor digitorum longus muscle (EDL) was isolated, removed, fixed, paraffin emblocado (Optical Microscopy) and resin (Electron Microscopy) and cut. Tissues were stained with hematoxylin and eosin and observed under optical and electron microscopy and subsequently photographed. The experimental protocols were approved by the ethical committee for animal research at UFS (CEPA: 61/12). The results were analyzed using followed by Studentʼs t-test. The treatment orally with EAc (400 mg / kg ) inhibited mechanical hypernociception (2h 5.1 ± 0.76, 5.70 ± 0.65 4h, 6h 5.93 ± 0.49, (p < 0, 05) compared with the BlV venom group (2h 2.08 ± 0.33; 4h 2.28 ± 0.18; 6h 2.52 ± 0.24). The inhibition of edema was also seen in activity with EAc (400 mg / kg) (15 min 15.35 ± 0.27; 30 min 12.63 ± 0.69; 60 min 9.38 ± 0,29 and 90 min 6.83 ± 0.66, p < 0.05) compared with the BlV venom group (15 min 29.7 ± 0.17; 30 min 25.8 ± 0.26; 60 min 20.15 ± 0.24 and 90 min 14.76 ± 0.21). Regarding motor activity, the EAc (400 mg / kg) preserved motor ability (1day 83.22 ± 0.46; 3 days 98.02 ± 0.20 and 7 days 119.24 ± 0.48, p < 0.05) compared to the BlV venom group (1 day 20.03 ± 0.26, 3 days 35.22 ± 0.36 and 7 days 111.21 ± 0.18). Histological analysis showed an protection of muscle injury after administration of EAc (400 mg / kg), maintaining muscle fibers. Our results demonstrated that EAc inhibited the harmful effects of the venom, suggesting that this compound has biotechnological potential in adjuvant treatment of snakebite. Key-words: Bothrops leucurus, Abarema cochiliacarpos, snakebite, inflammation, muscle injury..

(8) viii. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AAI- Antioxidant activity index AAPH – Diidrocloreto de 2,2 azobis (2-amidinopropano) ACN- Acetonitrila ANOVA- Análisedevariância BlV- Veneno Bothrops leucurus CaCL2 – Cloreto de Cálcio CF- chloroform fraction CK- Creatino kinase CO2- Gás Carbônico COX2- cyclooxygenase-2 DPPH- 2,2’-difenil-1-picril-hidrazil EAc- Extrato Abarema cochliacarpos EAF- ethyl acetate fraction EAFS- ethyl acetate subfraction EC- Eletroforesecapilar EDL- Extensor digitorum longus EE- hidroetanolic extract ELISA- Enzyme Linked Immunono Sorbent Assay EM- Espectro de massa. ESI- Espectroscopia de ionização. FeSO4- Ferrous sulfate FGF- Fatores de crescimento fibroblásticos GSPHx- Gluthatione peroxidase GSR- Gluthatione reductase H2O- Água HF- hexane fraction HMF- hidromethanol fraction HPLC- High Performance/Pressure Liquide Chromatography IL-1 – Interleucina 1 iNOS- Óxido Nítrico IP- Inhibition percentage.

(9) ix KCL- Cloreto de Potássio LOO- Peroxyl MgCL2- Cloreto de Magnésio NaCL- Cloreto de Sódio NaHCO3- Bicarbonato de Sódio NaHPO4- Fosfato de Sódio NO- Óxido de nítrico. O2- Oxigênio PBS- Solução Tampão Fosfato PDGF- Platelet derived growth factor PLA2- Fosfolipase A2 PSS- Solução Salina PTT- Tempo Parcial de tromboplastina RMN- Ressonância magnética nuclear. RNS- Reactive nitrogen species ROS- Reactive oxygen species SAB- Soro Antibotrópico. SOD- Superoxide dismutase TAR- Total antioxidante reactivity TBA- Thiobarbituric Acid TBARS- Thiobarbituric acid-reactive substance TC- Tempo de Coagulação TCA- Trichloroacetic Acid TLC- Thin layer chromatography TNF-α- Fator de necrose tumoral TRAP- Total reactive antioxidante potential TS- Tempo de Sangramento.

(10) x. SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1. 2 OBJETIVOS......................................................................................................... 3. 3 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 4. 3.1 – AS SERPENTES PEÇONHENTAS DO BRASIL...................................... 4. 3.1.1 Gênero Bothrops.......................................................................................... 4. 3.1.2. Análise Epidemiológica dos Acidentes Ofídicos.......................................... 7. 3.1.3. Composição e Atividades Biológicas dos Venenos Botrópicos................... 11. 3.1.4. Resposta Inflamatória................................................................................... 12. 3.1.5. Lesão Músculo-Esquelética.......................................................................... 16. 3.1.6. Manifestações Clínicas, Diagnóstico e Prognóstico..................................... 20. 3.2 – AGENTES ANTIOFÍDICOS....................................................................... 22. 3.2.1 Soroterapia.................................................................................................... 22. 3.2.2 Potencial antiofídico de plantas medicinais.................................................. 24. 3.2.3 Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby e Grimes................................... 27. 4 CAPÍTULO I – Artigo Científico – Abarema cochliacarpos extract inhibited the inflammatory process and skeletal muscle injury induced by Bothrops leucurus venom.................................................................................................... 30. 5 CAPÍTULO II – Prospecção e Patente – Plantas medicinais no tratamento do acidente ofídico: Uma prospecção tecnológica.................................................. 53. 6 CONCLUSÃO...................................................................................................... 64. 7 PERSPECTIVA................................................................................................... 65. 8 REFERÊNCIAS................................................................................................... 66. 9 APÊNDICE......................................................................................................... 76. 10 ANEXOS............................................................................................................. 80.

(11) ___. 1 Introdução. Os acidentes ofídicos apresentam elevada frequência e altas taxas de morbimortalidade, logo é um sério problema de saúde pública no mundo, principalmente nos países tropicais. O Brasil tem o maior número de ataques de serpentes venenosas da América do Sul, com 20.000 casos notificados a cada ano e uma taxa de letalidade de 0,45%. A maioria desses casos são por serpentes do gênero Bothrops e com menor frequência as do gênero Crotalus, Lachesis e Micrurus. A região Nordeste apresenta 43% das serpentes de maior importância médica, incluindo 12 do gênero Bothrops (B.atrox, B.brasili, B.eritromelas, B. jararaca, B. jararacussu, B. leucurus, B. lutzi, B. marajoensis, B. moojeni, B. muriciensis, B. neuwiedi e B. pirajai) (OLIVEIRA et al., 2010). A serpente Bothrops leucurus é uma espécie pouco investigada e pode ser encontra do Sul do Espírito Santo ao Ceará, tratando-se da serpente peçonhenta mais comum em lavouras de cacau e canaviais onde provavelmente produz também o maior número de mordeduras. Sua mordedura produz dor local, edema, hemorragia e necrose que, após algum tempo, pode evoluir para a completa degeneração do músculo, nervos e vasos, podendo ser irreversível, tendo como consequência a amputação do membro atingido. O único medicamento oficialmente aprovado pelo Ministério da Saúde para o tratamento de acidentes ofídicos é o soro antiofídico ou antiveneno, apropriado para cada tipo de serpente. O antiveneno usado no tratamento do empeçonhamento por serpentes do gênero Bothrops é o soro antibotrópico (SAB). É necessário considerar. 1.

(12) a possibilidade de ocorrer reações adversas devido à administração de proteínas estranhas, como reação alérgica e até mesmo o choque anafilático. O soro antibotrópico é eficiente em antagonizar os efeitos hemorrágicos do veneno e previne a letalidade, entretanto, não previne completamente o dano tecidual, como a mionecrose. Apesar das estratégias do Ministério da Saúde em distribuir imunobiológicos para. as. Secretarias. Estaduais. de. Saúde,. frequentemente. os. casos. de. envenenamentos por serpentes (e outros animais) são tratados com preparados populares feitos com plantas medicinais regionais. Já existem muitos estudos biológicos para investigar a eficácia das plantas em neutralizar as ações dos venenos de serpentes, porém nenhum deles foi patenteado. A. Abarema. cochliacarpos. é. uma. planta. da. família. Fabaceae. (Leguminoseae), que contém seus princípios ativos principalmente no caule e apresenta no seu perfil fitoquímico saponinas, catequinas, taninos, fenóis e antraquinonas. Conhecida popularmente como barbatimão essa espécie vegetal tem grande uso nas comunidades tradicionais. Entre as aplicações clínicas desta espécie destacam-se suas propriedades antisséptica, antiinflamatória, analgésica e cicatrizante (DIAS et al., 2012). Desta forma, a pesquisa por novas propostas terapêuticas para o tratamento do acidente ofídico continua sendo uma incessante busca dos pesquisadores e um grande desafio na área biotecnológica. Logo, justifica-se a condução de trabalhos de pesquisa que possibilitem uma avaliação mais precisa dos mecanismos envolvidos no efeito do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema cochliacarpos e seus derivados na lesão muscular induzida pelo veneno de Bothrops leucurus.. 2.

(13) 2 Objetivos. Objetivo Geral:  Investigar os efeitos do extrato hidroetanólico da entrecasca da Abarema cochliacarpos (EAc) como agente antiinflamatório, antinociceptivo e antimiotóxico na lesão do músculo esquelético Extensor digitorum longus de camundongos induzida pela injeção do veneno bruto de Bothrops leucurus.. Objetivos Específicos:  Avaliar o efeito do EAc na atividade edematogênica em camundongos injetados com o veneno bruto de Bothrops leucurus;  Avaliar a hiperalgesia de camundongos injetados com o veneno bruto de Bothrops leucurus e tratados com EAc;  Avaliar a atividade motora de camundongos injetados com o veneno bruto de Bothrops leucurus e tratados com EAc;  Avaliar qualitativamente o aspecto morfológico (Microscopia óptica e eletrônica) da lesão do músculo Extensor Digitorum Longus de camundongos injetado com o veneno bruto de Bothrops leucurus e tratado com EAc;  Traçar uma prospecção tecnológica dos pedidos de patentes referentes à utilização e aplicação das plantas medicinais no tratamento do acidente ofídico;  Descrever e depositar a patente “Extrato da Abarema cochliacarpos no tratamento coadjuvante do acidente ofídico causado por serpentes do gênero Bothrops”, juntamente ao INPI.. 3.

(14) 3 Revisão de Literatura 3.1 As Serpentes Peçonhentas do Brasil 3.1.1. Gênero Bothrops. No Brasil existem alguns gêneros de serpentes conhecidas popularmente por “serpente de quatro ventas” consideradas peçonhentas, por apresentarem dentes inoculadores bem desenvolvidos e móveis, situados na porção anterior do maxilar (fig. 2) e fosseta loreal que é um orifício entre o olho e a narina (fig. 1), um órgão termorreceptor, encontradas nas serpentes do gênero Bothrops, Crotalus e Lachesis, exceto nas serpentes do gênero Micrurus (fig.3), que possuem dentes inoculadores pouco desenvolvidos e fixos na região anterior da boca (fig.4). Esses gêneros também podem ser identificados pelo tipo de cauda que são classificadas como: lisa, guizo ou chocalho e escamas eriçadas (fig. 5, 6,7) (BRASIL, 2001; BERNARDE, 2013).. presas. nariz. Fig.1. Fosseta loreal nariz. Fig.2. 4.

(15) olho presas. nariz. Fig. 3 Micrurus. Cauda lisa. Fig. 5 Bothrops. Fig. 4 Micrurus. Guizo ou Chocalho. Fig. 6 Crotalus. Escamas eriçadas. Fig. 7 Lachesis. Distribuídas por todo o território nacional as serpentes do gênero Bothrops pertencem a Família Viperidae e compreendem cerca de 30 espécies. As mais conhecidas são Bothrops pirajai, endêmica do sudeste da Bahia e de algumas áreas do recôncavo baiano, Bothrops muriciencis, endêmica do Alagoas, ambas restritas a áreas de Mata Atlântica e Bothrops erythromelas encontrada em ambientes áridos e semiáridos que circundam florestas tropicais secas, áreas rochosas, vegetações rasteiras de bromélias terrestres e ao longo de margens de rios, também registraram a sua ocorrência na Região Metropolitana do Salvador (Lauro de Freitas e Salvador, municípios litorâneos caracterizados por apresentarem formações secundárias de Mata Atlântica e restingas). As espécies não estão restritas à Bahia, mas também podem ser encontradas em Sergipe, Alagoas, Paraíba e Rio Grande do Norte, ressaltando que, neste último, a caatinga atinge o litoral, assim ampliando sua distribuição (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009; BRASIL, 2001 e 2010; ARGOLO, 2006).. 5.

(16) As Bothrops são popularmente conhecidas como jararaca, ouricana, jararacuçu,. urutu-cruzeira,. jararaca-do-rabo-branco. (filhotes),. malha-de-sapo,. cabeça-de-patrona (ou simplesmente “patrona”), surucucurana, combóia, surucucupingo-de-ouro, surucucu-de-ouricana, surucucu-pico-de-jaca (ou simplesmente “pico-de-jaca”) patioba, jaracuçu-tapete, jaracuçu-quatro-ventas (ou simplesmente “quatro-ventas”) e caissaca (jovens). Possuem cauda lisa, não tem chocalho e as suas cores variam muito, dependendo da espécie e da região onde vivem, preferindo ambientes úmidos como matas e áreas cultivadas e locais onde haja facilidade para proliferação de roedores (paióis, celeiros, depósitos de lenha). Tem hábitos predominantemente noturnos ou crepusculares, quando se sentem ameaçadas apresentam comportamento agressivo desferindo botes sem produzir ruídos (CARDOSO, 2009; FENWICK, 2009). A serpente Bothrops leucurus (Fig.8) é vista com frequência da região do Ceará até o Espírito Santo, sendo a mais importante espécie causadora de acidentes nessa região. Essa constatação, no entanto, ainda carece de dados sobre a abundância, aspectos da biologia e etologia das espécies (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009; ARGOLO, 2006).. Fig. 8: Bothrops leucurus Foto: Breno Hamdan.. 6.

(17) 3.1.2 Análise epidemiológica dos acidentes ofídicos. Em 1901 foi realizado o primeiro estudo epidemiológico de acidentes ofídicos por Vital Brazil, quando registrou-se o número de óbitos por mordeduras de serpentes peçonhentas no Estado de São Paulo, registrando 63, 88 e 104 óbitos em 1897, 1899 e 1900, respectivamente. Após esse registro Vital Brazil entregou os primeiros tubos de soros antipeçonhentos para o consumo em 14 de agosto do mesmo ano e a partir daí passou a distribuir, junto com as ampolas de soro, o Boletim para Observação de Accidente Ophidico, para ser preenchido com dados referentes ao acidente que levou ao uso desses antivenenos. Os estudos epidemiológicos sobre acidentes ofídicos realizados no Brasil apresentados por Vital Brazil em seu Boletim para observação de Accidente Ophídico, analisam sexo e idade da vítima, mês de ocorrência do acidente, local da picada, gênero da serpente, tempo decorrido entre o acidente e o atendimento e evolução (FRANÇA et al., 2009) . A consolidação do controle do acidente ofídico no Brasil veio a partir de 1987, com o Programa Nacional de Controle de Acidentes por Animais Peçonhentos, onde implantou-se uma política de coordenação da produção, distribuição de antiveneno, capacitação de recursos humanos e vigilância epidemiológica a nível nacional. Porém, nas primeiras ações de sistematização verificou-se ausência de informações atualizadas das equipes de saúde, tanto em referência ao diagnóstico e tratamento, quanto à identificação do agente agressor. Com o intuito de melhorar o atendimento, a Coordenação Nacional de Zoonoses e Animais Peçonhentos (CNCZAP-MS) passou a coordenar as ações envolvendo as Secretarias Estaduais e Municipais, Centros de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos, Núcleos de Ofiologia e Laboratórios Produtores. Dentre essas ações, foram apoiados os primeiros projetos. 7.

(18) regionalizados sobre a distribuição das serpentes no país. Em 1998 foi implantado o VIGISUS – Estruturação do Sistema Nacional de Vigilância em Saúde, primeiramente direcionado para a região Sul e Sudeste e o segundo, para a região Nordeste (LIRA-DA-SILVA, et al., 2009). Em conseqüência nesta ação foi realizada uma atualização da distribuição geográfica, com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre as espécies de serpentes de importância médica do Nordeste do Brasil que possibilitou a fundamentação necessária às ações da vigilância ambiental pelos órgãos públicos da região, bem como permitiu o diagnóstico presuntivo da etiologia destes acidentes e subsidiou as políticas de produção e distribuição de soro antiofídico (IBGE, 2011). Hoje os acidentes por serpentes representam problema de Saúde Pública especialmente em países tropicais, devido à morbi-mortalidade e por algumas informações colhidas com omissões, subnotificações de dados e deficiências na coleta subestima a real magnitude dos acidentes ofídicos no país (LIMA, et al. 2009; MELGAVAREJO, 2009). A definição de medidas de prevenção e controle, bem como para explicar o porquê de um município apresentar mais ou menos casos que seus vizinhos esta associada uma análise da relação entre variáveis ambientais e sócio-econômicas com a incidência deste tipo de acidente, de forma a apontar possíveis fatores de risco ou mesmo de proteção (WALDEZ & VOGT, 2009). Cerca de 21.000 acidentes por serpentes são registrados no Brasil anualmente. Foram notificados 81.611 acidentes, o que corresponde ao coeficiente de incidência de 13,5 acidentes/100.000 habitantes de janeiro de 1990 a dezembro de 1993 no Brasil. Na região nordeste registrou-se a maior letalidade (0,81%), cerca. 8.

(19) do dobro da média nacional (0,45%), apesar de apresentar o menor coeficiente de incidência do País (6,84 acidentes/100.000 habitantes) (SIAN, 2009). No período de 1999 a 2003, foram notificados 15.345 acidentes ofídicos, o que corresponde a uma média de 3.069 casos por ano. A incidência média para a Região foi de 4,57/100.000. A Bahia mostrou maior número de casos (8.599, média de 1.719,8 casos por ano) e maior incidência média (13,16 casos/100.000hab.) no período (Tabela 1) (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009).. Tabela 1: Incidência do acidente ofídico no Nordeste (LIRA-DA-SILVA, et al. 2009).. Existem aproximadamente 250 espécies de serpentes no mundo, sendo 70 são peçonhentas, devem-se as serpentes do gênero Bothrops (jararaca, jararacuçu, urutu e outros) e Crotalus (cascavel), sendo raros os Lachesis (surucucu, surucutinga) e Micrurus (coral). Dentre os acidentes por serpentes, o acidente botrópico destaca-se pela sua elevada incidência, onde se observou um maior percentual de acidentes por Bothrops (78,6%), seguida por Crotalus (20,8%) e Micrurus (6%) (RIBEIRO, 2008). Em 2001, aspecto epidemiológico CIAVE-BA atendeu e/ou notificou 740 acidentes ofídicos; destes, 665 (89,9%) foram acidentes botrópicos perfazendo uma. 9.

(20) incidência de 5,0 acidentes botrópicos/100.000 habitantes. Apenas 11 (1,7%) dos casos foram confirmados com a identificação da serpente causadora do acidente, sendo todos exemplares da espécie Bothrops leucurus (MISE, 2007). Já em agosto de 2003 a agosto de 2004, foi feito uma distribuição das espécies de serpentes de importância médica nos Estados do Nordeste brasileiro, onde foram identificadas 25 espécies de serpentes, das quais doze do gênero Bothrops (LIRA-DA-SILVA, 2009). A ocorrência do acidente ofídico está, em geral, relacionada a fatores climáticos e aumento da atividade humana nos trabalhos no campo. A maior ocorrência de acidentes com pessoas do sexo masculino tem sido referida em todas as casuísticas nacionais e provavelmente deve-se à maior frequência com que os homens realizam atividades no campo. Já foi referida também a acentuada frequência de acidentes com indivíduos entre 15 e 49 ou 50 anos de idade (GRACIANO, et al., 2013). Na Bahia, os acidentes botrópicos registrados predominaram nos meses de março a agosto, devido provavelmente à inundação dos abrigos e outros esconderijos, tornando-as mais susceptíveis a atacarem suas presas (MISE, 2007). A predominância de acidentes ofídicos acometendo membros inferiores (75,2%) reflete o hábito terrícola da maioria das espécies do gênero Bothrops. Seguido por membros superiores (22,8%), cabeça e pescoço (0,5%) e tronco (0,3%). Essa situação, observada em todas as regiões do Brasil, denota a não utilização de equipamentos de proteção, em especial nas zonas de agricultura não mecanizada (PAULA, 2010).. 10.

(21) 3.1.3 Composição e atividades biológicas dos venenos botrópicos. O veneno da serpente contém vinte ou mais componentes da peçonha botrópica, e é mais complexa de que outros gêneros. Mais de 90% do peso seco do veneno é composto por proteínas (proteínas não-tóxicas), tem uma grande variedade de toxinas não-enzimáticas como as fosfolipases, fosfodiesterases, fosfatases, acetilcolinesterases e enzimas proteolíticas (CALVETE, 2013).Conforme a origem geográfica a toxicidade da complexa mistura de compostos dos venenos ofídicos contém componentes protéicos (enzimáticos e não enzimáticos) e nãoprotéicos (orgânicos e inorgânicos), (HIDALGO, 1999; CAMARGO et al., 2012). Segundo Gutiérrez, 2009, no veneno botrópico não-protéico encontram-se substâncias inorgânicas e orgânicas, onde desempenha um papel importante ajudando na ação enzimática, que é menos expressivo em quantidade e ativo biologicamente. As substâncias inorgânicas são encontradas nos metais (cátions e ânions), pode variar de um veneno pra o outro a fração de metais (cálcio, zinco, magnésio, sódio, potássio, cobre, ferro e níquel), que agem como neutralizadores de cargas que compõem os protéicos do veneno, principalmente os cátions monovalentes, em maior quantidade o sódio, já os íons monovalentes não apresentam nenhuma significância em termos biológicos nas atividades enzimáticas. No entanto, na constituição de metaloproteínas e diferentes atividades biológicas e enzimáticas, alguns metais bivalentes atuam como co-fatores. O cálcio por ser um metal bivalente é utilizado para a ativação da fosfolipase A2, em concentrações moderadas nos venenos ofídicos. O veneno pertencente das espécies do gênero Bothrops tem efeito proteolítico, coagulante, hemorrágico, inflamatório, edematogênico e miotóxico. 11.

(22) (MELO, et al., 2010; CINTRA-FRANCISCHINELLI, et al., 2010; MOREIRA, et al., 2011; PATRÃO-NETO, et al., 2013). Com as técnicas bioquímicas de separação, cerca de 70 proteínas foram encontradas, com ou sem ação enzimática, e peptídeos, que são constituídos em um único veneno e com ampla variação de ações farmacológicas e tóxicas (TASHIMA, et al., 2012). Vários componentes foram isolados das secreções dos venenos botrópicos, apresentando um fator clínico hemorrágico (HIGUCHI, et al., 2011), proteases que atuam na coagulação sangüínea causando distúrbios de coagulação (NAUMANN, et al., 2011), enzimas proteolíticas (GOMES, et al., 2011) e as miotoxinas, que encontradas nas enzimas proteolíticas e as fosfolipases nas atividades miotóxicas dos venenos ofídicos. (CACCIN, et al., 2013; SARAVIA-OTTEN, et al., 2013; TONELLO, et al., 2012; SCHAFFAZICK, et al., 2010; TOMAZ, et al., 2008).. 3.1.4 Resposta Inflamatória. O processo inflamatório ocorre devido principalmente à presença de agentes que lesam os tecidos e a reação pode ser desencadeada por bactérias, agentes físicos como corpo estranho, a luz solar em alta intensidade, o calor e mesmo a corrente elétrica. A intensidade da resposta inflamatória irá depender da capacidade do agente em estimular a liberação de citocinas, quimiotaxinas e da grande mobilização de células que resultará em vasodilatação, transudação, edema, calor local e dor (COTRAN, 2012). Os leucócitos aderem aos vasos sangüíneos e deixam a corrente sangüínea para exercerem influências protetoras nos tecidos vizinhos. Para isto, ocorrem interações complexas entre o endotélio e diferentes categorias de leucócitos.. 12.

(23) Participam deste processo mediadores como as citocinas. As citocinas são polipeptídeos produzidos por diversos tipos celulares e têm uma grande variedade de propriedades biológicas na resposta inflamatória. O fator de necrose tumoral (TNF-α) e a interleucina 1 (IL-1) são exemplos destas moléculas solúveis que agem através da ligação com receptores específicos, na superfície das células alvo (ROCK & KONO, 2008). Quando os leucócitos são recrutados para a área da inflamação, eles passam pelas seguintes etapas: rolagem, ativação, adesão e transmigração. Para que estas etapas ocorram, é preciso que as células mudem sua localização no vaso. E é exatamente o que acontece no evento chamado de marginação. Ou seja, o aumento da permeabilidade vascular leva à diminuição do fluxo sanguíneo e modificação no curso das células que normalmente seguiam o fluxo no centro do vaso e passam para a posição periférica, próximas às células endoteliais que revestem o vaso. O aumento da expressão das moléculas de adesão na superfície do endotélio e nas células pode ser induzido por TNF-α e IL-1, sintetizados por macrófagos. Isto faz com que as células rolem pelo endotélio, se tornem ativadas, sofram adesão firme e migrem para o local da inflamação (MEDZHITOV, 2008; COTRAN, 2012). Neutrófilos e macrófagos são capazes de fagocitar e destruir o antígeno e este fato, em parte, explica o recrutamento destas células para o local da inflamação. A fagocitose também leva à produção do óxido nítrico (NO) por macrófagos. e. este. gás. solúvel,. que. é. radical. livre,. é. citotóxico. para. microorganismos. Além disso, causa vasodilatação contribuindo para o edema e recrutamento de outras células. Tanto o TNF-α quanto a IL-1 estimulam macrófagos e em conseqüência deste estímulo há o aumento da produção do NO e a liberação de enzimas proteolíticas (proteases, colagenases, elastases) e. 13.

(24) metabólitos reativos do oxigênio que podem induzir destruição tecidual (KING, 2007). A inflamação é reação característica do envenenamento pelos venenos de serpentes Viperidae e Crotalidae, apresentando fase aguda e crônica. Durante a fase aguda ocorre intenso edema seguido de infiltração do tecido lesado de polimorfonucleares, mastócitos e plaquetas. Naqueles empeçonhamentos em que o veneno possui componentes hemorrágicos além do edema e infiltrados inflamatório aparecem hemácias e plaquetas, que demonstram a ocorrência de lesão vascular. Nestes casos, a reação inflamatória é mais intensa e o dano celular é muito maior. O aparecimento de macrófagos caracteriza a fase crônica do processo inflamatório (Fig. 9) (GALVÃO, et al., 2010; TEIXEIRA, et al., 2009).. Fig. 9: Inflamação induzida por serpente do gênero Bothrops (TEIXEIRA, et al., 2009).. 14.

(25) A hipernocicepção inflamatória depende da ativação de nociceptores quimiossensíveis a mediadores inflamatórios.. No teste da pressão de pata,. carragenina e lipopolissacarídeos estimula a hipernocicepção resultante da liberação de uma cascata de vários mediadores. A Bradicinina, que inicia a cascata, estimula a liberação de fator de necrose tumoral (TNF-α) que, por sua vez, induz a liberação interleucina-1-β. (IL-1-β),. a. interleucina-6. (IL-6). e. interleucina-8. (IL-8).. Posteriormente, a IL-1 e IL-6 estimulam a produção de eicosanóides, enquanto que a IL-8 estimula a produção de aminas simpatomiméticas (CUNHA et al. 1991 e 1992; FERREIRA et al. 1993; POOLE et al. 1999). Teixeira e colaboradores, (1994) demonstraram primeiramente que a hipernocicepção causada pelo veneno botrópico é independente de respostas edematogênicas induzidas pelo veneno e é mediada por prostaglandinas e leucotrienos. Rocha e colaboradores, (2000) mostraram a participação de aminas biogênicas e metaloproteases na hipernocicepção induzida pelo veneno de Bothrops jararaca. Chacur e colaboradores, (2002) sugeriram que receptores de bradicinina B2 estariam envolvidos na hipernocicepção induzida pelo veneno de Bothrops jararaca.. 15.

(26) Veneno Bothrops. TNF-α. KC. HIPERALGESIA. Ácido Araquidônico IL-1β. COX Prostaglandinas. Aminas simpatomiméticas. Fig.10: Hipernocicepção induzida pelo veneno Bothrops (CHACUR et al., 2002; Adaptação Adriana Gibara).. 3.1.5 Lesão Músculo-Esquelética. No tecido muscular lesado, imediatamente após a lesão, inicia-se o processo degenerativo do segmento afetado. A primeira etapa deste processo é marcada pela autólise celular em resposta à perda da homeostasia intracelular e á entrada de íons cálcio e consequente ativação de proteases cálcio-dependentes (BYRD, 1992; TIDBALL, 2008). Em seguida, os fibroblastos que se encontram em estado quiescente no músculo, são ativados e atraídos para o sítio de lesão pela ação de fatores de crescimento como o FGF(Fibroblast growth factors) e o PDGF(plateletderived growth fator), liberados pelo tecido necrótico. Após serem sensibilizados, os fibroblastos causam a degradação da matriz extracelular próximo às células lesadas, e os fragmentos proteolíticos produzidos são quimiotáxicos para outros fibroblastos 16.

(27) e células inflamatórias, e podem estimular a atividade fagocítica de neutrófilos e macrófagos. (TIDBALL,. 2008).. Com. a. sinalização. quimiotáxica,. células. mononucleares são atraídas para o sítio de lesão, tendo papel fundamental na liberação de proteases e remoção dos componentes celulares lesados. A fagocitose das fibras lesadas é um evento muito importante, uma vez que a presença de tecido necrótico inibe o início da regeneração (SUMMAN, et al., 2006; SERRANO & MUÑOZ-CÁNOVES, 2010). Segundo. TIDBALL (2008), os neutrófilos. são. as primeiras. células. inflamatórias que aumentam substancialmente em número entre 1 a 6 horas pós – lesão. Em seguida, observa – se o aumento da população de macrófagos, enquanto que a de neutrófilos diminui. O acúmulo de macrófagos no sítio de lesão é muito importante, já que são responsáveis, além da fagocitose, pela liberação de mediadores quimiotáxicos para linfócitos e polimorfonucleares, e também pela estimulação da angiogênese. As alterações das células musculares produzidas pelas miotoxinas dos venenos caracterizam-se por hipercontração dos miofilamentos levando à agregação das miofibrilas, acompanhada por despolarização e necrose da célula. O mecanismo proposto para explicar essas alterações tem sido o de que haveria hidrólise dos fosfolipídios da membrana devido à atividade enzimática, ruptura do sarcolema e perda da habilidade da célula em regular o fluxo de cálcio extracelular, o que levaria às alterações patológicas observadas (Fig. 11) (GUTIÉRREZ & OWNBY, 2003; GUTIÉRREZ et al., 2010). Mitocôndrias também mostram sinais de danos, como o intumescimento, cristas anormais, densidades floculantes e ruptura. Algumas enzimas, tais como a creatino kinase (CK) são rapidamente liberadas das fibras necróticas. O processo degenerativo é acompanhado por edema tecidual e. 17.

(28) infiltração de células fagocitárias. Aproximadamente, entre 12 e 24 horas após a inoculação do veneno, as fibras musculares encontram-se totalmente destruídas com aparência amorfa e hialina (EVANS & OWNBY, 1999; CALIL-ELIAS et al., 2002a ; 2002b).. Fig. 11: Características da Mionecrose induzida pelo veneno Botrópico (GUTIÉRREZ & OWNBY, 2003).. Estudos realizados por Melo e colaboradores (2010) sobre as diferentes etapas da mionecrose em experimentos com venenos de Crotalus viridis, Naja naja e Crotalus atrox mostraram que estas etapas se manifestam em quatro períodos: fase inicial (15 min a 3 horas), fase intermediária (3 a 72 horas), fase tardia (72 a 96 horas) e fase final (após 96 horas). O início do processo caracteriza-se pelas chamadas lesões “delta” (MURAKAMI et al., 2005), que são lesões das fibras musculares em forma triangular→ originada por lise focal da membrana plasmática.. 18.

(29) Além disso, há o aparecimento de vacúolos claros, miofibrilas em diferentes graus de condensação, intercaladas com áreas claras irregulares, de aparência amorfa no citoplasma (o que levou pesquisadores estrangeiros a usar a expressão “moth-eaten lesions“ por assemelharem-se essas regiões da fibra como se tivessem sido comidas por traças). Em uma fase intermediária, durante a patogênese do processo mionecrótico. predominam. pelo menos dois estágios. patológicos. caracterizados por miofibrilas condensadas, que se assemelham às da fase inicial, e por células com aparência amorfa, e, em uma terceira fase, a presença de intenso infiltrado de células fagocíticas, e na fase final, áreas de células musculares pequenas, em fase de regeneração, intercaladas com áreas de tecido fibrótico (Fig.12) (SATURNINO-OLIVEIRA, et al., 2012).. Fig. 12: Exemplo da lesão mionecrótica induzida pelo veneno (SATURNINO-OLIVEIRA, et al., 2012).. 19. Bothrops.

(30) 3.1.6 Manifestações clínicas, diagnóstico e prognóstico. As Manifestações sistêmicas se apresentam em forma de sangramentos em ferimentos cutâneos preexistentes, hemorragias à distância como gengivorragias, epistaxes, hematêmese e hematúria, náuseas, vômitos, sudorese, hipotensão arterial sendo mais raro o choque e nefrotoxicidade. Já as manifestações locais são caracterizadas por dor e edema endurecido no local da mordedura de caráter precoce e progressivo. Com mais freqüência surgem equimoses, lesões bolhosas e sangramentos no local da mordedura. No estado mais grave, pode ocorrer necrose de tecidos moles com formação de abscessos e desenvolvimento de síndrome comportamental, podendo deixar seqüelas e perda funcional do membro acometido (MANUAL, 2001, PINHO, 2001; PITTA, 2003). Essas. manifestações. aparecem. devido. às. serpentes. possuírem. importantes atividades fisiopatológicas de ações proteolíticas, coagulante e hemorrágica. As ações proteolíticas do veneno causam processo inflamatório onde estão. envolvidos. a. histamina,. bradicinina,. prostaglandina,. leucotrienos. e. eicosanóides, levando o tecido afetado à necrose tecidual. As ações anticoagulantes e hemorrágicas também influenciam na evolução da atividade inflamatória (HERRERA, 2009). A ação coagulante ativa os fatores da coagulação sangüínea onde forma um coágulo visível in vitro sendo tidos como coagulantes. O veneno botrópico, prócoagulante, ativa o fator X ou o fator II (protrombina) da cascata de coagulação, gerando trombina, que por sua vez hidrolisa diretamente o fibrinogênio em fibrina podendo induzir incoagulabilidade sanguínea por consumo de fibrinogênio. Este processo promove liberação de substâncias hipotensoras e provoca lesões na membrana basal dos capilares por ação das hemorraginas (ação hemorrágica), que. 20.

(31) associada à plaquetopenia e alterações da coagulação, induz a hemorragia, freqüentemente disseminada (OLIVEIRA, et al. 2003; HERRERA, 2009). Os acidentes botrópicos são classificados em casos leves, moderados e graves de acordo com alterações clínicas e laboratoriais. Manifestações sistêmicas que definem o caso como grave independentemente do quadro local são hipotensão arterial, choque, oligoanúria ou hemorragias intensas (BRASIL, 2001; PINHO, 2001; PITTA, 2003). A avaliação laboratorial é realizada através do tempo de coagulação (TC), exame de baixo custo e de fácil execução, que é importante para o acompanhamento dos casos, geralmente está aumentado, bem como o tempo parcial de tromboplastina (PTT), ambos são importantes para diagnóstico, conduta e evolução clínica. O valor poderá estar normal (até 10 min), prolongado (entre 10 e 30 min) ou incoagulável (>30 min). Após a terapia com soro antibotrópico deve-se fazer o controle até a sua normalização. É interessante salientar, que o tempo de sangramento (TS) não se altera (BRASIL, 2001; AZEVEDO-MARQUES, 2003; PITTA, 2003). Outros exames também podem ser solicitados como hemograma que geralmente. revela. leucocitose. com. neutrofilia. e. desvio. à. esquerda,. hemossedimentação elevada nas primeiras horas do acidente e plaquetopenia de intensidade variável. O exame sumário de urina pode apresentar proteinúria, hematúria e leucocitúria. Outros exames complementares importantes incluem dosagem de eletrólitos, uréia e creatinina, com a finalidade de detectar precocemente distúrbios hidroeletrolíticos e insuficiência renal aguda. A confirmação laboratorial do acidente pode ser feita através do Método de imunodiagnóstico (técnica de ELISA), onde antígenos do veneno botrópico podem ser detectados no. 21.

(32) sangue ou outros líquidos corporais do paciente (BRASIL, 2001; AZEVEDOMARQUES, 2003; PITTA, 2003).. 3.2 Agentes Antiofídicos 3.2.1 Soroterapia. A soroterapia é uma imunização passiva artificialmente adquirida pela transferência de anticorpos de um indivíduo sensibilizado (doador) para outro indivíduo (receptor). Pode ser homóloga quando ambos doadores e receptores na mesma espécie animal, e heteróloga quando espécies diferentes (GUIDOLIN, 1989). Nos estudos pioneiros de dois pesquisadores, o francês Albert Calmette e o brasileiro Vital Brazil foram evidenciados os princípios da soroterapia sendo o procedimento mais efetivo no tratamento da mordedura de serpente (BRASIL, 1998; ROSENFELD, 1969; BRAZIL, V. 1987; SCHVARTSMAN, 1992). Os primeiros soros antiofídicos que chegaram ao Brasil, através do médico Vital Brazil em 1905, para combater o veneno foram os de Bothrops, Lachesis lanceolatus (hoje classificada como Bothrops jararaca) e contra o veneno de Crotalus, Crotalus terrificus (hoje, Crotalus durissus terrificus) (SCHVARTSMAN, 1992). Vital Brazil, iniciou preparando no Brasil os antivenenos (1901) mono e polivalentes, demonstrando sua especificidade. Foi criada assim a soroterapia heteróloga com o desenvolvimento de uma terapia efetiva para vítimas de acidentes ofídicos e o antiveno monovalente, que já existia, incluía o soro anticrotálico e antibotrópico (IHERING, 1911; ROSENFELD, 1969; BÜCHERL, 1980; GUIDOLIN, 1989; WATT, 1989). 22.

(33) No Brasil, a produção de antivenenos é feita pelo Instituto Butantan (SP), Instituto Vital Brazil (RJ) e Fundação Ezequiel Dias (MG), sendo distribuído para todo o país pelo Ministério da Saúde. A preparação do antiveno é obtida através de solução. purificada. de. imunoglobulinas. específicas. do. soro. de. eqüinos. hiperimunizados com venenos de serpentes ou aracnídeos e escorpiões (SCHVARTSMAN, 1992; CAMEY et al., 2002). A comercialização no Brasil da maioria dos antivenenos (AV) é de origem equina e a imunização é realizada de maneira que possa aumentar o espectro de neutralização do antisoro com venenos de várias espécies de serpentes de mesmo gênero, ou de diferentes gêneros (RUSSELL, 1988). Ménez, 1985, demonstrou que a neutralização de diferentes espécies de venenos usadas na imunização pode ocorrer devido à reatividade antigênica cruzada, podendo estar relacionadas entre si, farmacológica e/ou estruturalmente, o que permite a consequente neutralização por AV heterólogo. O tratamento fundamental quando indicado para os pacientes acidentados pela maioria dos animais peçonhentos é a soroterapia AV. O objetivo do tratamento é neutralizar a maior quantidade possível de veneno circulante independente de ser em adultos ou crianças, a dose utilizada independentemente do peso do paciente e aplicação deve ser feita, preferencialmente, na unidade de emergência ou de internação (BRASIL, 1993). A patogenia da doença deve-se à formação do complexo imune AV/veneno, com ativação e consumo de complemento, embora seja a única abordagem terapêutica a soroterapia heteróloga usada nos acidentes ofídicos, pode acarretar reações adversas, como reações anafiláticas, anafilactóides e a doença do soro, além disso, os pacientes podem apresentar febre, artralgia, linfadenomegalia,. 23.

(34) hepatoesplenomegalia, urticária e proteinúria. (MALASIT et al., 1986; JURKOVICH et al., 1988; CARDOSO et al., 1993; BRASIL, 1993; DART & HOROWITZ, 1996; OTERO-PATIÑO et al., 1998). Os venenos de cinco espécies botrópicas brasileiras tem o efeito farmacológico letal, atividade hemorrágica, necrotizante, proteolítica da fosfolipase, coagulante e fibrinolítica. A eficácia de um antiveneno produzido in vitro e in vivo a partir de um “pool” neutralizador no veneno atividade tóxica e enzimática dos mesmos, indica que o antiveneno foi efetivo na neutralização sistêmica da atividade tóxica de todos os venenos testados. Entretanto, os efeitos locais ainda não são neutralizados pelo uso dos antivenenos, verificados na Fundação Ezequiel Dias (FUNED) contra veneno botrópico (CAMEY et al. 2002; DA SILVA et al. 2007; WILLIAMS, et al. 2010).. 3.2.2 Potencial Antiofídico de Plantas Medicinais. Desde época dos egípcios, assírios e hebreus (2.300 a.c.) cultivavam e utilizavam diversas ervas em suas atividades diárias, como embalsamento de múmias, que com o decorrer da história do homem ainda utilizamos plantas como medicamento, por apresentar propriedades terapêuticas ou tóxicas importância na medicina popular. A flora brasileira é considerada uma ampla fonte de material com potencial farmacológico e biotecnológico do mundo devido à diversidade de espécies e aos conhecimentos oriundos da medicina tradicional, torna-se cada vez maior o interesse pelas plantas medicinais nativas do Brasil e em outros países (DE FÁTIMA, et al., 2008).. 24.

(35) Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 65 a 80% da população mundial que vive em países em desenvolvimento dependem essencialmente de plantas que são os primeiros cuidados de saúde e uma alternativa para tratar diversas enfermidades, devido da falta de acesso pela pobreza a medicamentos industrializados (ARAÚJO, et al., 2002). Todas as populações nativas do mundo vêm usando plantas no combate aos efeitos dos acidentes ofídicos, utilizando o sulco da maceração destas plantas aplicando-o sobre o local da mordedura ou mesmo fazendo ingestão oral, principalmente nas regiões onde o acesso à soroterapia é limitado. Através desses conhecimentos, surgiram evidências científicas sobre as propriedades antiofídicas destes extratos, sendo que nos meios científicos só foram dar atenção nos últimos vinte anos (MARTZ, 1992; RIZZINI, et al., 1988; PEREIRA, et al., 1984). No Brasil são utilizados como foco medicinal 152 espécies de plantas com potencial terapêutico, sendo que cerca de 578 plantas apresentam potencial terapêutico antiofídico, distribuídas em 94 famílias, principalmente Asteraceae (9%), Leguminosae (7,8%) e Euphorbiaceae (4,5%) (MARCUSSI, et al., 2007; SOARES, et al., 2004). As que possuem validação científica são 18 espécies (12%) onde mostram uma pequena fração de plantas documentadas cientificamente. Sendo assim, vários estudos estão sendo realizados com o intuito de investigar o isolamento e caracterização dos princípios ativos presentes nos extratos vegetais como agentes terapêuticos, destacando alguns extratos de plantas e seus princípios ativos com propriedades antiofídicas (MARCUSSI, et al,. 2007). Apesar de poucos relatos sobre o possível mecanismo de ação de diversas plantas das mais diferentes regiões do planeta capazes de neutralizar os venenos. 25.

(36) de diversas serpentes, poucos autores atribuem esta propriedade a uma determinada classe de substâncias (PEREIRA, et al.,1984; SILVA, et al., 2004). Uma alternativa no tratamento ofídico, por conter um grande número de componentes químicos com diversas propriedades farmacológicas de interesse medicinal destas plantas é atribuída a classes de constituintes ativos, incluindo flavonóides, alcalóides, taninos e outras (MAIORANO, et al., 2005). Tem sido testado e demonstrado excelente atividade antiofídica nos extratos de plantas, principalmente o extrato aquoso de Mandevilla veluntina e o Mikonia glomerata que foram capazes de inibir atividades farmacológicas de diversos venenos de serpentes. (SOARES, et al., 2004; MELO, et al., 1994, OLIVEIRA, et al., 2005; BIONDO, et al., 2003; MAIORANO, et al., 2005). Borges e colaboradores, (2000) relataram que o extrato aquoso de Casearia sylvestris (Flacourtiaceae), uma espécie vegetal nativa encontrada em pastos abertos. brasileiros,. tem. a. capacidade. de. inibir. os. efeitos. miotóxicos,. edematogênicos e hemorrágicos dos venenos de Bothrops moojeni, B. pirajai, B. neuwiedi e B. Jararacussu e suas toxinas isoladas Lys49 e Asp49-PLA2. Já Cavalcante e colaboradores, (2007) demonstraram que o extrato aquoso de C. sylvestris apresentou efeito protetor na lesão muscular induzida por duas fosfolipases isoladas do veneno botrópico (Lys49-PLA 2 - PrTX-I de B. pirajai e BthTX-I de B. jararacussu). As principais classes de inibidores da PLA2 são os compostos fenólicos, os quais incluem flavonóides (Primetina), cumestanos (wedelolactona), alcalóides (12Metoxi-Nb-metil-voacalotina), esteróides (sitosterol e estigmasterol) e os terpenóides (mono-, di-, e triterpenos), e polifenóis (taninos vegetais) (CARVALHO, et al., 2013).. 26.

(37) 3.2.3 Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby e Grimes. Uma espécie de árvore na família das Fabaceae (Leguminoseae) (IUCN, 2009) planta nativa do Brasil, principalmente no Nordeste Sergipano na cidade de Lagarto, encontrada na Mata Atlântica e nos biomas da Caatinga chamada de A.cochiliacarpos (Fig.13) popularmente conhecida “barbatimão”, representada por uma espécie vulnerável à extinção, devido à classificação à fragmentação de sua área de ocorrência e ainda é pouco estudada as suas propriedades farmacológicas (DA SILVA et al., 2010; SILVA, 2003).. Fig.13: Árvores de A.cochliacarpos (Gomes).Fonte: SILVA, 2013.. No Brasil existem outras quatro diferentes espécies de plantas que possuem o mesmo nome popular (barbatimão). São as espécies Stryphnodendron adstringens, S. poliphylum, S. obovatum e Imorphandra mollis, que são utilizadas para os mesmos propósitos terapêuticos. Estudos têm demonstrado que extratos das. cascas. de. S.adstringens. possuem. propriedades. como. cicatrizantes,. antisséptica, anti-inflamatória e propriedades antiulcerogênicas (MIGLIATTI, 2003). Lopes e colaboradores, (2005) destacaram que cascas de S. adstringens, S.. 27.

(38) obovatum e S. polyphylum têm sido utilizadas na medicina popular para o tratamento de feridas, queimaduras e outras injúrias da pele. Já a Abarema cochliacarpos é muito utilizada na medicina tradicional na forma de chá como cicatrizante, analgésica, antiulcerogênica, antiinflamatória, antisséptica,. dentre. outros. usos.. Suas. atividades. biológicas. vêm. sendo. comprovadas em laboratório, seu extrato aquoso reduziu significamente as lesões gástricas (SILVA, 2003 e 2009) e o extrato hidroetanólico apresentou atividade antimicrobiana frente às bactérias Gram-positivas (ARAÚJO et al., 2002; SANTOS et al., 2007). Silva, (2006) avaliou a atividade antinociceptiva e o perfil fitoquímico dos extratos aquosos e metanólico produzidos a partir de cascas do caule de A.cochliacarpos. Os extratos apresentaram atividade analgésica quando avaliado pelo teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético por via intraperitoneal, apresentando respostas superiores às drogas usadas como referência acetominofeno e ácido acetil salicílico, bem como no modelo de dor induzida por capsaicina. Já a avaliação fitoquímica demonstrou a presença de saponinas, catequinas, taninos, fenóis e antraquinonas. Da Silva e colaboradores, (2010), com a técnica de espectroscopia de ionização (ESI) acoplado ao. espectro de massa (EM), encontraram na fração. butanólica um elevado conteúdo de polifenóis, tais como taninos, proantocianidinas, destacando-se como majoritários, catequinas e em menor proporção seus dímeros e trímeros. Tais constituintes foram confirmados através de espectrospia de ressonância magnética nuclear (RMN). Sánchez-Fidalgo, (2013) após ter caracterizado a fração butanólica do extrato da Abarema cochliacarpos - BFAC, também identificou a (+) – catequina como seu. 28.

(39) principal componente (Fig.14). Após o teste de indução do processo inflamatório por bactéria lipossacarídea (Escherichia coli) - LPS em macrófagos peritoneais, verificou-se que ambos BFAC e (+) - catequina apresentaram efeito antioxidante e antiinflamatório. Reduzindo significativamente a expressão de proteínas próinflamatórias, provavelmente através das vias de sinalizações: c-Jun N-terminal quinase e MAPK p38.. Fig.14. Identificação por UPLC/MS dos componentes presentes na fração butanólica da Abarema cochliacarpos (SÁNCHEZ-FIDALGO, S. 2013).. 29.

(40) Capítulo I Artigo científico: Abarema cochliacarpos extract inhibited the inflammatory process and skeletal muscle injury induced by Bothrops leucurus venom. 30.

(41) Title: Abarema cochliacarpos extract inhibited the inflammatory process and skeletal muscle injury induced by Bothrops leucurus venom Authors: Jeison Saturnino de Oliveira1,3,4; jeison_fisioterapia@yahoo.com.br Daiana Do Carmo Santos1; dai.sud@gmail.com Adriana Gibara Guimarães1; adrianagibara@hotmail.com Antônio Santos Dias2; asdias6@hotmail.com Marcelo Amorim Tomaz5; marcelotomaz.fisio@gmail Marcos Monteiro-Machado5;. marcosmmachado@gmail.com. Charles Santos Estevam2; cse.ufs@gmail.com Waldecy De Lucca Júnior3; wlucca1@gmail.com Durvanei Augusto Maria6; durvanei@usp.br Paulo de Assis Melo5; melo.pa@gmail.com Adriano Antunes de Souza Araújo7; adriasa2001@yahoo.com.br Márcio Roberto Viana Santos8; marcio@infonet.com.br Lucindo José Quintans Júnior1; lucindo_jr@yahoo.com.br. 1 Laboratório de Farmacologia Pré-clínica de Produtos Naturais, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil 2 Laboratório de Bioquímica e Química de Produtos Naturais, Departamento de Fisiologia, SE, Brasil 3 Departamento de Morfologia - Laboratório de Biologia Celular e Estrutura – Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil 4 Programa de Pós-Graduação RENORBIO – Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil 5 Instituto de Ciências Biomédicas – Laboratório de Toxinas Ofídicas – Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brasil 6 Instituto Butantan - Laboratório de Ciências Fisiológicas e Química - São Paulo, SP, Brasil 7 Departamento de Fisiologia - Laboratório de Ensaios e de toxicidade farmacêutica – Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil 8 Departamento de Fisiologia - Laboratório Cardiovascular e Produtos Naturais – Universidade Federal de Sergipe, SE, Brasil Corresponding author: Department of Physiology - Laboratory Preclinical Pharmacology of Natural Products - Federal University of Sergipe, S/N Marechal Rondon Ave – ZIP Code: 49.100-000, São Cristovão, SE - Brazil. Phone: + 55 (79) 2105-6645 / Fax: + 55 (79) 3212-6640, E-mail: lucindo_jr@yahoo.com.br; lucindo@pq.cnpq.br. 31.

(42) Abstract Snakebites are a public health problem, especially in tropical countries. However, treatment with antivenom has limited effectiveness against venoms’ local effects. Here we investigated the ability of Abarema cochliacarpos hydroethanolic extract (EAc) to protect mice against injection of Bothrops leucurus venom. Swiss mice received perimuscular venom injection and were subsequently treated orally with EAc in different doses. Treatment with EAc 100, 200 and 400 mg/kg reduced the edema induced by B. leucurus in 1%, 13% and 39%, respectively. Although lower doses showed no anti-hypernociceptive effect in the Von Frey test, the higher dose significantly reduced hypernociception induced by the venom. Antimyotoxic activity of EAc was also observed by microscopy assessment, with treated muscles presenting preserved structures and decreased edema and inflammatory infiltrate as compared to untreated ones. Finally, on the rotarod test the treated mice showed better motor function, once muscle fibers were preserved and there was less edema and pain. Treated mice could stand four times more time on the rotating rod than untreated ones. Our results have shown that EAc presented relevant activities against injection of B. leucurus venom in mice, suggesting that it can be considered as an adjuvant in the treatment of envenomation. Keywords: Bothrops leucurus, Abarema cochiliacarpos, antiophidic plants, myotoxicity.. 1. Introduction Accidents with venomous snakes represent a significant health problem, especially in tropical countries, where they frequently affect young and economically active men working in the countryside. In Brazil, most accidents are caused by snakes belonging to Bothrops genus, which induce extensive local damage, such as myonecrosis and edema [1, 2]. Particularly, the snake Bothrops leucurus is present in the Northeastern region of Brazil [3], being related to accidents with rural workers who often have difficult access to health services to receive the antiophidic treatment proposed by the Health Ministry, i.e. the antibothropic antivenom. Antibothropic antivenom is the only official treatment available, but it has low and limited effectiveness against the local effects of venoms [1]. The antivenom therapy is often applied late after the accident, when tissue destruction is already in process, potentially 32.

(43) causing irreversible and disabling damage [4, 5, 6]. The use of plants and other alternative approaches to halt the effect of snake venoms or to accelerate tissue recovery has been proposed by previous studies [7, 8, 9, 10, 11]. Therefore, our group has been particularly concerned with the search for new and effective pharmacologically active principles from plants used in folk medicine to treat or prevent damage caused by accidents with venomous snakes. Many traditional communities of Northeastern Brazil make use of the bark of Abarema cochliacarpos in popular medicine. A. cochliacarpos is an ornamental tree native to Brazil, occurring mainly in the Atlantic Forest and in the Caatinga biomes. It belongs to the Mimosaceae. family,. being. popularly. known. as. “barbatimão”. [12,. 13].. An. ethnopharmacological survey accomplished in a rural community in the Caatinga in the state of Sergipe, Northeastern Brazil, identiﬁed popular applications of the bark of A. cochliacarpos [12]. In this community, the decoction of the bark is used to wash external ulcers while its tincture, made by placing the bark in the Brazilian beverage known as “cachaça”, is used against inﬂammation and gastric ulcers, among other uses [12, 13]. Other authors also observed similar applications in different traditional communities [14, 15]. According to previous studies, the hydroethanolic extract presents phenolics such as aurones, catechins, chalcones, flavanols, flavones, flavonols, leucoanthocyanidins, tannins and xanthones, besides saponins and steroids [30]. In our study we assessed the antiophidic ability of A. cochliacarpos extract, in order to propose a new option for the treatment of envenoming, besides the antivenom, by using a plant that is abundant in Brazil, and compared the extract activity with dexamethasone, a steroidal anti-inflammatory drug previously described to be active against some Bothrops venoms’ effects [11].. 33.

(44) 2. Material and Methods. 2.1 Material B. leucurus snake venom was obtained from CEPLAC (Bahia, Brazil). B. leucurus venom and hydroethanolic extract of A. cochliacarpos were dissolved in physiological saline solution (PSS); PSS was composed of (mM): NaCl, 135; KCl, 5; CaCl2, 2; MgCl2, 1; NaHPO4, 1; NaHCO3, 15 and dextrose, 11. The pH of this solution was equilibrated to 7.3 with 5% CO2 / 95% O2. Dexamethasone was obtained from Aché (São Paulo, Brazil).. 2.2 Plant material and extract preparation Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby & Grimes stem barks were collected in São Cristóvão, state of Sergipe, Brazil (230 m, 11° 01′ 63.2″ South, 37° 15′ 86.6″ West). The plant material was identified by Dr Ana Paula Prata and a voucher specimen was deposited at the herbarium of the Federal University of Sergipe under the number ASE 014639. Plant material (5 kg) was dried at 370C with air circulation and renewal until complete dehydration. Then, it was reduced to powder and subsequently subjected to extraction in 90% ethanol for 5 days with exhaustive maceration. After this period, the extract was filtered and concentrated in a rotary evaporator under reduced pressure at 50°C yielding 533.4 g of hydroethanolic extract. The phytochemical analysis of Abarema cochliacarpos has been recently performed and described [30].. 2.3 Animals Male Swiss mice (25.0 ± 5.0 g), 2-3 months of age, were used throughout this study. The animals originated from the Central Bioterium of the Federal University of Sergipe. The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2ºC on a 12h light/dark cycle with. 34.

(45) free access to food and water. Experimental protocols were approved by the Animal Care and Use Committee (CEPA/UFS # 10/11) at the Federal University of Sergipe.. 2.4 Experimental Design Mice were divided into six groups of 6 animals. They were. anesthetized with. ketamine (100 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) and then injected with crude venom of Bothrops leucurus (BlV) 1.0 mg/kg in PSS by applying 50 µL of the solution next to the extensor digitorum longus (EDL) muscle of the right hind limb (EDL perimuscular injection, in order to prevent direct mechanical damage to the muscle), as described previously [9, 16].. Group I (Control group): Mice were not subjected to muscle injury induced by venom and instead they received PSS in order to check for any changes in the parameters analyzed. Group II (BlV group): Mice received 1.0 mg/kg of B. leucurus venom injection (50 µL) into the right paw. Group III (BlV + Dexamethasone – Dexa): 10 minutes after venom injection, intravenous dexamethasone (2 mg/kg) was administered. Group IV (BlV + EAc 100 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 100 mg/kg in 100 L). Group V (BlV + EAc 200 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 200 mg/kg in 100 L). Group VI (BlV + EAc 400 mg/kg): 10 minutes after venom injection, mice received oral hidroethanolic extract of A. cochliacarpos (Eac, 400 mg/kg in 100 L).. 35.