UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
Avaliação imuno-histoquímica de tumores da mama de rato
fêmea Sprague-Dawley com dois estilos de vida diferentes
Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
Rafael José Carvalho Mendes
Orientador: Professora Doutora Paula Alexandra Martins de Oliveira
Coorientador: Professora Doutora Maria João Miranda Pires
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
Avaliação imuno-histoquímica de tumores da mama de rato
fêmea Sprague-Dawley com dois estilos de vida diferentes
Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
Rafael José Carvalho Mendes
Orientador: Professora Doutora Paula Alexandra Martins de Oliveira
Coorientador: Professora Doutora Maria João Miranda Pires
Composição do Júri:
Professora Doutora Ana Cristina Sampaio
Professora Doutora Carmen Lúcia de Vasconcelos Nóbrega
Professora Doutora Mária do Rosário Carvalho Pinto Leite
Professora Doutora Maria João Miranda Pires
II "As doutrinas expostas neste trabalho
são da exclusiva responsabilidade do autor"
III
Agradecimentos
Ao Magnífico Reitor, Professor Doutor António Fontainhas Fernandes da
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro pelas facilidades concedidas.
À Professora Doutora Paula Alexandra Martins de Oliveira pela orientação, dedicação, ensinamentos, pela amizade, pelo apoio demonstrado e muita paciência, ao longo desta dissertação.
À Professora Doutora Maria João Miranda Pires pela aceitação como minha coorientadora desta dissertação, e pelos ensinamentos transmitidos.
À Professora Catedrática Aura Antunes Colaço por me ter oferecido a oportunidade de trabalhar com ela, e por todos os ensinamentos que me transmitiu, tanto a nível profissional como a nível pessoal ao longo deste ano.
À Doutoranda Ana Isabel Rocha Faustino, pela paciência em estar comigo no laboratório e ensinar-me a técnica que tive de aplicar nesta dissertação, e pelas conversas e dicas pessoais para a realização da escrita da dissertação.
À Doutoranda Antonieta Maria Alvarado, pela ajuda indispensável na análise do trabalho prático, e pelos ensinamentos na matéria abordada nesta dissertação, e pelo tempo que passou comigo em laboratório.
Ao António Pacheco, por ter sido como um irmão que nunca tive para mim, por mais dois anos de boa companhia, por ser um ótimo colega de quarto, por todos os risos, choros, e paciência para me ouvir nos momentos mais difíceis destes últimos dois anos, principalmente neste último, sem ele a minha vida não era a mesma. Obrigado por tudo.
À Bruna Costa, por me mostrar como é ter uma irmã, sem ela a minha vida não tinha o mesmo sentido que tem agora, por toda a amizade e carinho que sempre demonstrou por mim estes anos, e claro por mais dois bons anos com muita amizade e bons momentos. Obrigado por tudo.
À Carolina Santos, por todos os bons momentos passados, por toda a amizade e por me ter mostrado um outro olhar sobre a vida menos preocupado mas com os pés assentes na terra, por todas as conversas, momentos de estudo, saídas e pelos risos. Obrigado pela amizade.
À Ana Sofia Soares e à Marlene Dias, pela boa companhia nestes últimos dois anos de mestrado, por todas as sessões de estudo, e principalmente os bons momentos passados.
À Anicia Gomes, por toda a amizade demonstrada, pelo carinho, pelos bons e maus momentos, mas principalmente pelas conversas que sempre ajudaram a aguentar momentos menos bons, e por me ter deixado entrar na vida dela.
IV À Sara Sario, obrigado por tudo, obrigado por me ajudares todos os dias a ser cada vez mais uma melhor pessoa, mais forte, mais confiante e principalmente mais feliz. Obrigado por todos os risos partilhados, todos os choros, todas as conversas até tarde, por me ajudares a superar os momentos mais difíceis da minha vida, por toda a felicidade que todos os dias me dás. Obrigado por fazeres parte da minha vida e deixares-me fazer parte da tua. Obrigado por seres a minha pessoa.
Por último, mas não menos importante, a pessoa que mais marca a minha vida todos os dias, que se não fosse por ela não estaria aqui, a minha Mãe Lúcia Carvalho. Obrigado por me permitires chegar aqui, por suportares todas as dores, e por me permitires seguir os meus sonhos e ser feliz, e principalmente por me mostrares como ser forte em frente às adversidades da vida. Obrigado por tudo, esta dissertação é dedicada a ti.
V
Resumo
O cancro da mama é um dos cancros mais comuns e mortais. À escala mundial, é o segundo tipo de cancro mais frequente a seguir ao cancro do pulmão e a quinta causa de morte associada a esta doença. A participação numa atividade física regular diminuí a taxa de mortalidade associada a este tipo de cancro. Assim, neste estudo foi proposto avaliar a expressividade por imuno-histoquímica do marcador de proliferação celular Ki-67 em tumores da mama induzidos pela N-metil-N-nitrosureia (MNU), em ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley, sedentários e exercitados. Os animais foram divididos por dois grupos experimentais: grupo sedentário (n=11); e grupo exercitado (n=10). No início do período experimental, o agente carcinogénico MNU (50 mg/kg) foi administrado por via intraperitoneal a todos os animais. Os ratos do grupo exercitado foram submetidos a atividade física 5 dias/semana, 60 minutos/dia, durante 34 semanas. Foram realizados estudos imuno-histoquímicos em cortes de lesões tumorais induzidas por MNU. A expressão da proteína Ki-67 foi menor nos ratos sujeitos ao exercício físico (grupo exercitado) em relação aos ratos do grupo sedentário (p=0,79). Estes dados sugerem que o exercício físico reduz a proliferação celular dos tumores mamários induzidos por MNU.
VI
Abstract
Breast cancer is one of the most common and deadly cancers in the world. Worldwide is the second most frequent type of cancer after pulmonary cancer and the fifth death cause associated with this disease. Participation in regular physical activity has shown that the mortality rate associated with this type of cancer can be reduced. Therefore, this study was proposed to evaluate the expressivity of the immunohistochemical marker of cell proliferation Ki-67 in N-Nitroso-N-methylurea (NMU) induced female rat breast tumors of Sprague-Dawley rats, sedentary and exercised. The animals were divided into two experimental groups: sedentary group (n=11); and exercised group (n=10). In the beginning of the experimental period, the carcinogen NMU (50 mg/kg) was administrated intraperitoneally to all animals. The rats in the exercised group were subjected to physical activity 5 days/week, 60 min/day, 34 weeks. Immunohistochemical studies were performed on sections of tumor lesions induced by NMU. The expression of Ki-67 protein was lower in rats subjected to physical exercise (exercised group) compared to sedentary group (p=0.79). These findings suggest that exercise can reduce cellular proliferation in breast tumors induced by NMU.
VII
Índice Geral
Agradecimentos ... III Resumo ... V Abstract ... VI Índice Geral ... VII Índice de Figuras ... IX Índice de Tabelas ... X Lista de Siglas e Abreviaturas ... XI
1. Introdução ... 1
1.1. Cancro da mama na mulher ... 1
1.1.1. Fatores de risco ... 1
1.1.2. Cancro da mama e taxa de mortalidade ... 3
1.1.3. Diagnóstico ... 3
1.1.4 Metodologias de diagnóstico para o cancro da mama ... 4
1.1.4.1. A técnica de imuno-histoquímica ... 4
1.1.4.1.1.Vantagens e desvantagens da utilização da imuno-histoquímica ... 5
1.1.4.1.2. Estudo da proliferação celular com recurso a imuno-histoquímica ... 6
1.2. Modelos animais para o estudo de cancro da mama ... 7
1.2.1. O Rato como modelo animal ... 7
1.2.2. Compostos carcinogénicos químicos ... 8
1.2.2.1. DMBA ... 9 1.2.2.2. MNU ... 10 2. Objetivos ... 12 3. Materiais e Métodos ... 13 3.1. Amostras ... 13 3.2. Análise histopatológica... 14 3.3. Técnica de imuno-histoquímica... 14
VIII
3.3.1. Princípio do método ... 14
3.3.2. Metodologia ... 15
3.4. Método de quantificação da imunorreatividade ... 16
3.5. Análise estatística ... 16 4. Resultados ... 17 4.1. Avaliação histopatológica... 17 4.2. Imunoreactividade ao Ki-67 ... 18 5. Discussão ... 21 6. Conclusão ... 26 7. Bibliografia ... 27
IX
Índice de Figuras
Figura 1: Classificação histológica dos tipos de lesões mamárias identificadas nos grupos
sedentário e exercitado. ... 18
Figura 2: Corte histológico do padrão papilar (A), cribriforme (B) e cistopapilar (C) (100x).
... 18
Figura 3: Expressividade do Ki-67 (400x). ... 18 Figura 4: Comparação do valor médio do IP das lesões papilar e cribriforme nos diferentes
grupos. ... 19
Figura 5: Expressividade do Ki-67 (400x) em três tipos de lesões; A: papilar; B: cribriforme;
X
Índice de Tabelas
Tabela 1: Exemplos de indução de tumores da mama utilizando DMBA. ... 9
Tabela 2: Exemplos de indução de cancro da mama utilizando MNU. ... 10
Tabela 3: Classificação dos tipos de lesão em comparação com os grupos de estudo. ... 17
Tabela 4: Associação entre o IP nas diferentes lesões em ambos os grupos. ... 19
XI
Lista de Siglas e Abreviaturas ADN – Ácido Desoxirribonucleico ANOVA – Análise de Variância CAB – Complexo Avidina-Biotina
cADN - Ácido Desoxirribonucleico Complementar DAB - Tetra-hidrocloreto de 3-3’-diaminobenzidina DDE - Diclorodifenildicloroetileno
DDT - Diclorodifeniltricloroetano DMBA - 7,12-dimetilbenz(a)antraceno DP – Desvio Padrão
H&E – Hematoxilina e Eosina
HER2 – Fator de Crescimento Epidérmico 2 HQ – Histoquímica
IARC – The International Agency for Research on Cancer IHQ – Imuno-histoquímica
IP – Índice de Proliferação MNU - N-metil-N-nitrosureia NCB – Needle Core Biopsy PBS - Tampão Fosfato-Salino
PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen PID – Proliferação Intra-Ductal
RE – Recetor de Estrogénio RP – Recetor de Progesterona TAC - Tomografia Computorizada
WCRF/AICR - World Cancer Research Fund International/American Institute for Cancer
Research
1
1. Introdução
1.1. Cancro da mama na mulher
O cancro da mama é um problema de saúde mundial e uma das principais causas de morbilidade e mortalidade feminina. A sua incidência tem vindo a aumentar continuamente, particularmente nos países em desenvolvimento (Hortobagyi et al., 2005; Mathivadhani et al., 2007; Pandi et al., 2010; Ouhtit et al., 2014; Ban e Godellas, 2014). À escala mundial, é o segundo tipo de cancro mais comum a seguir ao cancro do pulmão e a quinta causa mais comum de morte associada a esta doença (WHO, 2012; Ban e Godellas, 2014).
O cancro da mama abrange um grupo de doenças heterogéneas com diferentes características biológicas, clínicas e moleculares (Simpson et al., 2005). Esta neoplasia progride de lesões pré-neoplásicas como a atipia para carcinoma in situ, para carcinoma invasivo e posteriormente metastiza por diferentes tecidos (Buerger et al., 1999). A sua evolução reflete características genéticas, estilo de vida, hábitos alimentares, e exposição a diferentes fatores ambientais (Russo e Russo, 1996; Carey et al., 2006). Para além destes fatores, o desenvolvimento é influenciado pela história reprodutiva da mulher, estando um baixo risco de cancro da mama descrito em mulheres que tiveram uma gravidez completa enquanto jovens (MacMahon et al., 1970).
1.1.1. Fatores de risco
São considerados como fatores de risco de cancro da mama já bem conhecidos como, ter história familiar de cancro da mama, a suscetibilidade genética, a idade, os distúrbios metabólicos, as terapias de substituição com hormonas, os fatores ambientais, o consumo de álcool, o estilo de vida e o stresse (Dumalaon-Canaria, et al., 2014; Nabavi et al., 2015).
De seguida fazemos uma breve descrição dos fatores que se consideram mais relevantes para o desenvolvimento de cancro da mama.
Baseado em evidências já estabelecidas, estima-se que as mulheres com história familiar de cancro da mama tenham uma maior probabilidade de desenvolver este tipo de tumor (Newcomb e Wernli, 2010). Admite-se que a probabilidade de uma mulher desenvolver cancro da mama seja tanto maior quanto maior for a proximidade familiar a uma doente que tenha sofrido desta doença (Powers e Stopfer, 2014).
As mulheres com mutação em ambos os genes BRCA1 ou BRCA2 têm um aumento significativo do risco de desenvolverem cancro da mama. Uma meta-análise estimou uma
2 média de risco cumulativo de 65% de desenvolver cancro da mama em portadores de mutação no BRCA1 contra 45% em portadores na mutação no BRCA2 (Antoniou et al., 2003).
A idade é um forte fator de risco nas mulheres para o desenvolvimento de cancro da mama. A maior ocorrência de cancro da mama ocorre nas mulheres pós-menopausa, onde o risco começa a duplicar com cada década a mais de idade até aos 80 anos (Newcomb e Wernli, 2010).
A hiperplasia atípica e a alta densidade das glândulas mamárias são dois fortes fatores associados ao risco de desenvolvimento de cancro da mama (Boyd et al., 2007; Tice et al., 2013). As mulheres com elevada densidade mamária têm pelo menos quatro vezes mais risco de desenvolverem cancro da mama do que as mulheres com uma densidade mamária menor (Cummings et al., 2009; Newcomb e Wernli, 2010). As mulheres com elevada densidade mamária e que fazem terapia hormonal de substituição durante a menopausa têm um maior risco de desenvolverem cancro da mama (Kerlikowske et al., 2010).
A exposição a pesticidas [por exemplo, diclorodifeniltricloroetano (DDT) e diclorodifenildicloroetileno (DDE)], ao metal pesado cádmio, e a grande exposição a emissões de combustíveis durante o período de menarca em mulheres em pré-menopausa está associada ao desenvolvimento de cancro da mama (Newcomb e Wernli, 2010). A exposição à radiação também é classificada como um agente carcinogénico e está associada ao desenvolvimento de cancro da mama (IARC, 2010).
A realização de uma atividade física regular após o diagnóstico de cancro da mama está associada à redução da morbilidade e à melhoria da qualidade de vida das doentes (Paxton et
al., 2012; Kobayashi et al., 2014). Os resultados obtidos numa meta-análise demonstraram que
a taxa de mortalidade é reduzida em 34% nas doentes com elevada atividade física quando comparada com as que têm uma vida mais sedentária, após o diagnóstico de cancro da mama (Ibrahim e Al-Homaidh, 2011).
Dietas muito energéticas durante a puberdade e na adolescência estimulam o crescimento das glândulas mamárias o que pode favorecer a ocorrência de lesões pré-neoplásicas (deWaard e Trichopoulos, 1988; Frazier et al., 2004). De acordo com os dados publicados pelo World Cancer Research Fund International/American Institute for Cancer
Research (WCRF/AICR) uma dieta rica em gordura aumenta o risco de desenvolvimento de
cancro da mama entre as mulheres pós-menopausa (WCRF/AICR, 2007). Para além destes dados está descrito que a restrição energética em modelos animais favorece a redução da incidência de cancro da mama (Mahabir, 2013).
3 O consumo de álcool é com frequência relacionado com um aumento no risco de desenvolver cancro da mama (Smith-Warner et al., 1998; WCRF/AICR, 2007).
Não existe evidência científica que considere o stresse como um fator de risco para o desenvolvimento de cancro da mama (Surtees et al., 2010).
1.1.2. Cancro da mama e taxa de mortalidade
O cancro da mama é a neoplasia mais comum a afetar mulheres com idade inferior a 45 anos e possui elevada prevalência nas mulheres cuja faixa etária se compreende entre os 45 e os 65 anos (Altobelli e Lattanzi, 2014). As maiores taxas de remissão de cancro da mama envolveram mulheres com idade inferior a 50 anos. Em países que não possuem programas de rastreio ativos, as remissões foram menos significativas entre a faixa etária dos 50 a 69 anos, e uma grande variabilidade, mesmo incluindo fortes incrementos, foram encontrados entre mulheres com idade superior a 70 anos (Bosetti et al., 2013; Reyna e Lee, 2014).
Desde 1950, a mortalidade devida a cancro da mama diminuiu em média 0,6% por ano nos Estados Unidos. Os cinco anos de remissão de cancro da mama aumentaram drasticamente 60% de 1950 a 1954 e quase 92% entre 2003 e 2009. Entre 2004 e 2008, a mortalidade por esta doença nos Estados Unidos continuou a decrescer em 2,3%, apesar de um estável a ligeiro aumento da incidência. Em 2010, foi estimado que 2,8 milhões de mulheres que viviam nos Estados Unidos já tinham um diagnóstico anterior de cancro da mama, incluindo mulheres com a doença ativa e mulheres previamente tratadas (Ban e Godellas, 2014).
1.1.3. Diagnóstico
Há vários desafios no diagnóstico do cancro da mama nas mulheres jovens. O uso generalizado da mamografia no rastreio e a introdução de técnicas de imagiologia ainda mais sensíveis, requerem a ajuda de médicos patologistas para um diagnóstico preciso e para a categorização histológica das lesões detetadas pelos métodos considerados como convencionais. A biópsia de agulha fina (NCB) tornou-se no tipo de diagnóstico não-operatório. No entanto, apesar das altas especificidade e sensibilidade desta técnica, existem várias lesões difíceis de identificar através da NCB. Isto pode ser devido à capacidade destas lesões conseguirem mimetizar carcinomas invasivos ou porque existe um risco de carcinoma associado. Outras lesões difíceis de diagnosticar incluem proliferações epiteliais atípicas, lesões escleróticas e cicatrizes radiais ou papilares, células colunares, lesões apócrinas e neoplasias lobulares in situ. A imuno-histoquímica (IHQ) pode ajudar a clarificar a natureza de algumas destas lesões. A boa comunicação entre o imagiologista e o patologista é especialmente
4 importante no rastreio do cancro da mama de maneira a evitar erros de diagnóstico, assegurar a categorização correta das amostras obtidas por NCB e para assegurar o tratamento adequado da doente (Provenzano e Pinder, 2009). As guidelines Europeias recomendam um estudo comparativo entre os resultados do estudo histológico com as imagens radiológicas e aspetos clínicos, de modo a sugerir a melhora abordagem terapêutica para cada situação de cancro da mama (Perry et al., 2008).
1.1.4 Metodologias de diagnóstico para o cancro da mama
A um aumento da incidência de cancro da mama nos anos 80, do século passado, em todos os países desenvolvidos, seguiu-se uma redução da mortalidade tanto em países que adotaram programas de rastreio como naqueles a onde a implantação destas medidas falhou, provavelmente devido aos avanços nas técnicas de diagnóstico e às novas abordagens terapêuticas (Botha et al., 2003; Trocchi et al., 2013).
Atualmente, os recetores hormonais como o recetor do estrogénio (RE) e o recetor da progesterona (RP), bem como o recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) são avaliados rotineiramente, nas amostras recolhidas de mulheres com cancro da mama invasivo (Hammond et al., 2010). Estes marcadores ajudam a estabelecer um diagnóstico mais preciso e a decidir as melhores opções terapêuticas.
A ressonância magnética com uso de alto contraste é um teste de diagnóstico já bem estabelecido para se detetar a vascularização tumoral, mas com uma baixa especificidade e com uma difícil uniformização (Madjar et al., 2000). A tomografia computorizada (TAC) utiliza-se muito na obtenção de imagens da mama, sendo um método muito empregado (Lanconelli et al., 2012).
A maioria dos diagnósticos de cancro da mama consegue ser feita a partir de amostras preservadas em parafina e coradas com hematoxilina e eosina (H&E). A histoquímica (HQ) é uma técnica de grande auxílio na melhoria do diagnóstico de cancro da mama com o recurso a marcadores específicos [por exemplo para apoptose, proliferação, marcadores específicos para células endoteliais (von Willebrand, PECAM-1 [CD31], e caderina-VE [CD144]) ou marcadores para componentes da membrana basal (colagénio IV)] e pode ser feita a partir de cortes de parafina (Lee, 2013; Ayata et al., 2014).
1.1.4.1. A técnica de imuno-histoquímica
A IHQ é uma técnica imunológica usada por rotina para estudar amostras tumorais e para estabelecer o diagnóstico e o prognóstico dos tumores. Acrescentou uma nova dimensão
5 no diagnóstico patológico ao evidenciar antigénios visíveis com microscopia ótica normal (Haines e Chelack, 1991). Esta técnica baseia-se no mecanismo básico de ligação entre o antigénio e o anticorpo, foi conceptualizada e implantada pela primeira vez por Albert Coons em 1941 (Coons et al., 1941). Porém, só no fim dos anos 80, início da década de 90, do século passado o seu uso começou a ser aplicado por rotina na patologia clínica, pois o surgimento de novos reagentes e equipamento criou uma deteção mais sensível.
Anteriormente a maioria das colorações imuno-histoquímicas usava anticorpos marcados com fluoresceína e a técnica podia ser realizada em amostras de tecidos frescos ou congelados (Coons et al., 1941). Uma das técnicas mais versáteis é o método do complexo avidina-biotina (CAB). A imunocoloração CAB depende da alta afinidade da biotina (vitamina B) para a avidina (glicoproteína da clara de ovo) (Hsu et al., 1981). A imunocoloração CAB tem sido utilizada para a deteção da maioria dos marcadores tumorais e de agentes de doenças infeciosas em tecidos fixados em formalina (von Beust et al., 1988). O método do CAB é tecnicamente complexo, mais demorado e caro comparado com técnicas diretas e indiretas. Contudo, a amplificação proporcionada por esta coloração é frequentemente necessária para detetar poucos antigénios ou antigénios imunogeneticamente alterados pela fixação com formalina (Haines e Chelack, 1991).
As imunocolorações diretas são simples e económicas de se realizar, contudo, elas fornecem pouca amplificação do sinal visível, por isso o seu uso é limitado para a deteção de um grande número de antigénios como os depósitos de imunoglobulinas em biopsias da pele para o diagnóstico de doenças autoimunes da pele. Uma desvantagem adicional das imunocolorações diretas é que cada anti-soro primário tem de ser conjugado com uma enzima (Haines e Chelack, 1991).
Apesar das imunocolorações indiretas serem um pouco mais complexas e mais demoradas, estas colorações têm duas vantagens em relação aos métodos diretos. As colorações indiretas aumentam a sensibilidade da deteção antigénica, porque vários anticorpos secundários vão ligar-se a cada anticorpo primário. Além disso, as colorações indiretas não exigem a conjugação de cada um dos anti-soros primários (Haines e Chelack, 1991).
1.1.4.1.1.Vantagens e desvantagens da utilização da imuno-histoquímica
A IHQ deve ser interpretada em combinação com a morfologia analisada, pela coloração com H&E, como já foi referido anteriormente (Lee, 2013). A IHQ é útil para esclarecer se as lesões proliferativas são de natureza benigna ou maligna e para determinar os subtipos
6 histológicos dessas lesões (Moriya et al., 2009). Considerando que as células neoplásicas expressam características semelhantes às das células das quais elas derivam, a IHQ representa uma ferramenta fiável para identificar o local primário do tumor maligno (Bugat et al., 2003). Para além disso, a IHQ deteta lesões micro-invasivas, e realça células de carcinoma disseminado (Lerwill, 2004). Por último, os resultados da IHQ auxiliam no estudo dos fatores de prognóstico, e na orientação clínica do uso de terapias específicas para cada caso em particular (Trocchi et al., 2013).
Vários estudos demonstraram que vários subtipos de cancro da mama conseguem ser estratificados usando painéis de marcadores imuno-histoquímicos, de um modo semelhante por aqueles definidos por perfis genéticos obtidos usando microarrays de cADN (Vallejos et al., 2010).
1.1.4.1.2. Estudo da proliferação celular com recurso a imuno-histoquímica
Ki-67
A determinação do estado proliferativo de um tumor é normalmente feita através do estudo IHQ da expressividade do Ki-67, um antigénio nuclear estritamente associado à proliferação celular (Sysel et al., 2013). O Ki-67 é expresso durante a fase G1 tardia, fase S, G2 e M do ciclo celular, enquanto que as células em repouso (fase G0) não expressam este antigénio (Unek et al., 2014). Uma vez que a expressão da proteína Ki-67 é necessária para a progressão do ciclo celular, o Ki-67 é um excelente marcador do estado proliferativo de uma determinada população de células (Sysel et al., 2013).
A utilidade do estudo da expressão IHQ do Ki-67 no diagnóstico de tumores tem sido bem estabelecida para vários tipos de malignidades. A análise da expressão do Ki-67 tem sido usada para ajudar a diferenciar tecidos benignos de malignos, estabelecer o grau tumoral, identificar a transformação maligna de tumores benignos, estudar a extensão da invasão vascular peritumoral, avaliar a invasão linfática, ajudar na seleção de um tratamento adequado e monitorizar doenças recorrentes ou metastáticas. No entanto, existe controvérsia relativamente à expressão da proteína e à sua localização durante o ciclo celular, à sua semivida, e à expressão em tipos celulares diferentes e o valor prognóstico e protocolos para fixação e coloração das amostras (Muskhelishvili et al., 2003; Sysel et al., 2013). Atualmente, o clone de Ki-67 mais utilizado em humanos é o MIB-1 pois, ao contrário do que acontece com outros clones do Ki-67, este oferece a vantagem de poder ser utilizado em secções de parafina fixadas em formalina após um passo de recuperação antigénica (Scholzen e Gerdes, 2000). Devido à
7 sua grande utilidade, o Ki-67 tem-se tornado um dos biomarcadores mais frequentemente estudados nos dias de hoje (Sysel et al., 2013).
Para os modelos de ratos, o anticorpo MIB-5, é o clone ideal utilizado para a marcação do antigénio de Ki-67 (Gerlach et al., 1997; Birner et al., 2001).
1.2. Modelos animais para o estudo de cancro da mama
Modelos animais adequados são essenciais para melhorar não só o diagnóstico como a terapia do cancro da mama, sendo que de entre os vários modelos desenvolvidos com este propósito consideram-se como os mais adequados os que recorrem aos roedores de laboratório (Russell e Proctor, 2006).
O cancro da mama representa uma doença molecular heterogénea, e até ao momento nenhum modelo consegue refletir na totalidade a sua natureza. Deste modo, novos modelos de cancro da mama são claramente necessários (Cianfrocca e Gradishar, 2009). Um modelo animal mimetiza a doença humana, e permite elucidar a interferência dos fatores do hospedeiro, e do ambiente, nos processos neoplásicos, por exemplo, serve para estudar se a suscetibilidade da glândula mamária ao desenvolvimento oncológico varia com a idade, a história reprodutiva, entre outros, e para descobrir se é possível manipular estas características (Russo e Russo, 1996).
1.2.1. O Rato como modelo animal
O desenvolvimento das tecnologias genómicas permitiram aos investigadores tirar proveito de 40 anos de caraterização biológica extensiva dos modelos do tumor mamário induzidos por compostos carcinogénicos em ratos fêmea (Adamovic et al., 2008). O uso destes modelos e uma compreensão dos seus mecanismos fisiopatológicos serão reforçados no futuro por novas ferramentas descobertas que permitam uma melhor compreensão dos fenómenos de biopatologia (Russell e Proctor, 2006). Algumas estirpes de rato desenvolvem tumores espontâneos por serem mais suscetíveis (estirpes Sprague-Dawley e Wisthar-Furth), noutras através da administração de compostos carcinogénicos químicos ou exposição à radiação (como os raios-x) desenvolvem tumores mamários (Russo e Russo, 1996). Está descrito que ratos fêmea com tumores mamários induzidos quimicamente têm algumas semelhanças com as características de um cancro da mama humano, incluindo a dependência acrescida das hormonas do ovário e a progressão histológica (Yuri et al., 2006). Nos carcinomas induzidos quimicamente, em ratos fêmea, identificam-se com frequência infiltrações de linfócitos e
8 estroma reativo, características também descritas no cancro da mama da mulher (Russo e Russo, 2000).
1.2.2. Compostos carcinogénicos químicos
A indução experimental de cancro da glândula mamária com recurso a compostos químicos, carcinogénese química, foi realizada pela primeira vez nos anos 30, do século passado, mas o interesse nesta metodologia apenas atingiu o auge durante a década de 60 do mesmo século quando Charles Huggins introduziu um método simples e fiável de induzir carcinomas mamários nos ratos fêmea: com uma simples administração de 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA). O DMBA é um produto conhecido por induzir predominantemente tumores mamários em roedores (Ip, 1996). Contudo, pode induzir tumores noutros órgãos, nomeadamente no cólon, dependendo da via de administração, da espécie e estirpe dos animais bem como da sua idade e género. Outro composto químico que também pode ser utilizado com o mesmo objetivo é a N-metil-N-nitrosureia (MNU) (Russo e Russo, 1996).
Os procedimentos de indução mamária tanto pelo DMBA, como pela MNU, são simples e fáceis de executar, e ambos podem ser utilizados não só em estudos onde se analisa a biopatologia dos tumores da mama, como também em trabalhos onde se avalia a eficácia das novas metodologias de diagnóstico e novas abordagens terapêuticas. Uma vantagem do recurso aos modelos animais é a possibilidade de ser acompanhada uma elevada amostra de animais, desde que mantida nas condições adequadas (Ip, 1996). Diferenças genéticas são conhecidas por interferirem na suscetibilidade dos ratos fêmea desenvolverem tumores da mama quando expostos a compostos carcinogénicos. Os ratos fêmea das estirpes Sprague-Dawley, Wistar-Furth e Lewis são os mais sensíveis à indução experimental de tumores da glândula mamária pelo DMBA e pela MNU, em contrapartida os ratos Long-Evans e Copenhagen são menos sensíveis (Isaacs, 1986). A suscetibilidade das glândulas mamárias para a carcinogénese induzida por DMBA ou MNU são também fortemente dependentes da idade dos ratos fêmea, e o valor máximo na percentagem de indução é alcançado quando estes agentes carcinogénicos são administrados aos animais com 45 e os 60 dias de idade; esta idade corresponde à sua maturidade sexual. Atualmente sabe-se que a suscetibilidade dos ratos fêmea desenvolverem tumores da glândula mamária pode ser manipulada por vários fatores nomeadamente pela administração de dietas com um elevado teor em lípidos (Rose et al., 1980).
9
1.2.2.1. DMBA
A percentagem de tumores induzidos em ratos fêmea virgens aos quais foi administrado o DMBA pode ser alterada pela dose do composto carcinogénico administrado (Rose et al., 1980). Os tumores desenvolvidos nos animais aos quais é administrado este agente são maioritariamente carcinomas.
Na tabela 1 podem observar-se vários ensaios experimentais em que se administrou o agente carcinogénico DMBA a ratos fêmea da mesma estirpe, bem como as lesões identificadas. Tabela 1: Exemplos de indução de tumores da mama utilizando DMBA.
Estirpe Idade dos animais Dose administrada Via de administração Classificação histológica Referência bibliográfica Sprague-Dawley
50 dias 20 mg/kg Intragástrica Carcinoma mamário (Mccormick et al., 1982) Sprague-Dawley 50 a 65 dias 20 mg/kg Intragástrica Carcinoma mamário (Huggins, et al., 1961)
A idade é um fator determinante na indução de cancro da mama por DMBA. Um dos primeiros artigos publicados por Dao (1969) descreve uma tendência decrescente da incidência de tumores de 80%, 65%, 50% e 20% em ratos fêmea Wistar Furth ao ser-lhes administrada DMBA (por via intravenosa) aos 55, 70, 90, ou 120 dias de idade, respetivamente (Dao, 1969). Por sua vez, Sinha et al. (1983) reportaram uma incidência de tumor mamário de 90% a 100% quando o DMBA foi administrado entre os 10 e 55 dias de idade. Quando o DMBA foi administrado aos 10 dias de idade, as proporções de adenocarcinomas e fibroadenomas foram aproximadamente 15% e 85%, respetivamente. A percentagem de adenocarcinomas aumentou gradualmente para 25%, 35%, 60%, 80%, 83% e 100% quando o DMBA foi administrado aos 15, 20, 25, 30, 35 e 55 dias de idade, respetivamente. Assim a indução de tumores mamários por DMBA antes da maturação sexual decididamente favorece a formação de fibroadenomas, por sua vez o tratamento com DMBA após a maturação sexual dos animais induz predominantemente o desenvolvimento de adenocarcinomas (Sinha et al., 1983).
10 Uma incidência de 100% de carcinomas é obtida quando o DMBA é administrado a ratos com 30 a 50 dias de idade, mas a percentagem mais elevada de tumores por animal é identificada quando o agente carcinogénico é administrado aos animais entre os 40 e os 46 dias de idade (Russo e Russo, 1996).
1.2.2.2. MNU
Na tabela 2 podem observar-se alguns ensaios experimentais nos quais se administrou o agente carcinogénico MNU a ratos fêmea da mesma estirpe, bem como o espectro de lesões identificadas.
Tabela 2: Exemplos de indução de cancro da mama utilizando MNU.
Estirpe Idade dos animais Dose administrada Via de administração Classificação histológica Referência bibliográfica Sprague-Dawley
50 dias 50 mg/kg Intravenosa Tumores malignos (Mccormick et al., 1982) Sprague-Dawley 50 dias 10 mg/kg 35 mg/kg 50 mg/kg Intravenosa Tumores malignos (Mccormick et al., 1981) Sprague-Dawley 35 a 50 dias
5 mg/kg Intravenosa Carcinomas (Grubbs et
al.,1983)
De acordo com Gullino et al. (1975), a indução de tumores da mama com recurso ao MNU seria mais vantajosa do que o uso de DMBA, uma vez que os tumores induzidos com MNU teriam caraterísticas biológicas mais semelhantes aos tumores mamários humanos do que os tumores induzidos com recurso ao DMBA, constituindo assim um modelo mais apropriado para o estudo desta doença (Gullino et al., 1975).
Deste modo, num estudo realizado por Rose et al. (1980) usando ratos Sprague-Dawley tratados com a mesma dose de 50 mg/kg de MNU como a descrita por Gullino et al. (1975),
11 Rose e os seus colegas aparentemente não encontraram nenhuma metástase quando os animais foram sacrificados às 25 semanas após a administração do agente carcinogénico (Rose et al., 1980).
Na comparação entre o efeito dos dois agentes carcinogénicos, o DMBA administrado na dose de 20 mg/kg por gavage, e a MNU administrada na dose de 50 mg/kg por via intravenosa, a incidência de tumores malignos foi superior nos tumores induzidos pela MNU (Mccormick et al., 1982).
Thompson et al. (1992) concluíram através dos seus trabalhos e dos seus muitos anos de experiência com o modelo MNU que nunca conseguiram observar metástases tumorais em ratos quando o agente carcinogénico foi administrado aos 50 dias de idade. Este foi o primeiro trabalho a sugerir que a idade à qual o animal é exposto à MNU pode afetar o potencial metastático dos carcinomas mamários (Thompson et al., 1992).
Linhas de evidência sugerem, que uma única dose de administração de MNU pode ser capaz de induzir tumores mamários com 100% de incidência e que tais tumores podem ser potencialmente utilizados para clarificar a biologia do cancro da mama em humanos (Pula et
al., 2013). Contudo, a existência de algumas diferenças moleculares entre os tumores mamários
de ratos e humanos podem vir a causar problemas em implementar os resultados obtidos em modelos animais para a prática clínica (Ogawa et al., 1996).
O manuseamento da MNU deve ser feito com algum cuidado, uma vez que este agente é sensível à luz e à humidade e deve ser armazenado no escuro e na presença de um dessecante. Uma vez que se decompõe rapidamente numa solução aquosa, ela deve ser preparada fresca imediatamente após o seu uso (Ip, 1996).
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2. Objetivos
É objetivo deste estudo:
Avaliar a expressividade por IHQ do marcador de proliferação celular (Ki-67) em tumores da mama em ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley induzidos pela administração de MNU sujeitos a um protocolo de exercício físico ou sedentários.
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3. Materiais e Métodos 3.1. Amostras
Foram analisados 70 tipos de neoplasias mamárias provenientes de ratos fêmea de um protocolo experimental de tumores quimicamente induzidos com o agente carcinogénico MNU. Este protocolo foi realizado pelo grupo de Investigação da Professora Paula A. Oliveira e encontra-se descrito na dissertação de Ana Isabel Rocha Faustino (Faustino-Rocha, 2012). Assim descrevemos brevemente o protocolo: Os procedimentos descritos foram realizados de acordo com a legislação em vigor em Portugal para a utilização de animais para fins experimentais (Diretiva Europeia 2010/63/EU, Decreto-lei 113/2013) e foram aprovados pela Direção Geral de Alimentação Veterinária (no. 008961), foram adquiridos à empresa Harlan (Interfauna, Barcelona, Espanha) 21 ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley com cinco semanas de idade. Os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato duro (1500U Eurostandard Type IV S, Tecniplast, Itália) no biotério da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, sob condições controladas de temperatura (23±2ºC), humidade relativa (50±10%), sistema de renovação e filtração de ar (10-20 ventilações/hora) e um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os animais foram alimentados com uma dieta comercial (ração Diet Standard 4RF21, Mucedola, Itália) e água engarrafada ad libitum, foram colocados tubos de plástico no interior das gaiolas de modo a enriquecer o ambiente.
Após o período de quarentena de duas semanas, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: sedentário (n=11) e exercitado (n=10). Às sete semanas de idade, todos os animais receberam uma administração intraperitoneal do agente carcinogénico MNU (ISOPAC, lote 100M1436V, Madrid, Espanha) numa concentração de 50 mg/kg. No dia seguinte à administração da MNU, os animais do grupo exercitado foram aclimatizados ao treadmill (Treadmill Control LE 8710, Panlab, Harvard Apparatus, EUA) durante um período de cinco dias, a uma velocidade de 20 m/min com um aumento gradual do período de exercício de 20 para 60 min/dia. Após o período de aclimatização, os animais foram exercitados 5 dias/semana, durante 34 semanas mantendo a velocidade de 20 m/min e um período de treino de 60 min/dia. Os animais do grupo sedentário permaneceram nas suas gaiolas na sala onde estava a ser realizado o protocolo de exercício e foram manipulados diariamente de forma a serem expostos a condições semelhantes às dos animais exercitados.
Trinta e cinco semanas após a administração do agente carcinogénico MNU, os animais foram sacrificados através da administração intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg; Imalgene 1000, Merial S.A.S., lote LBF133BB, Lyon, França) e xilazina (10 mg/kg; Rompum 2%, Bayer
14 Healthcare S.A., lote KPO78X0, Kiel, Alemanha), seguida da exsanguinação por punção cardíaca, método aplicado por Forbes et al. (2007), técnica aceite pelas diretivas comunitárias. Foi realizada uma necropsia completa de todos os animais e os tumores mamários identificados foram recolhidos e fixados em formol tamponado a 10%.
3.2. Análise histopatológica
Após 24 horas de fixação, os tumores mamários foram cortados, a sua superfície foi cuidadosamente avaliada, e foram processados para inclusão em parafina de acordo com o protocolo utilizado pelo Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. De seguida realizaram-se vários cortes de 3 µm de espessura num micrótomo automático (Leica RM 20035). Os cortes foram corados com a coloração de rotina H&E para serem avaliados e classificados por histopatologia de acordo com a classificação proposta por Russo e Russo (2000). Tomou-se em consideração os tipos histológicos que estivessem em maior proporção (mais de 50%) na lesão neoplásica. Posteriormente foram realizados cortes de 2 µm das áreas adjacentes aos cortes para diagnóstico histopatológico para a realização do estudo da IHQ. As neoplasias da glândula mamária do rato fêmea foram classificados em: adenoma tubular, adenoma lactante, proliferação intra-ductal (PID), papilar, cribriforme, comedo, tubular, cistopapilar, fibroadenoma.
3.3. Técnica de imuno-histoquímica 3.3.1. Princípio do método
Neste estudo, utilizaram-se técnicas de imuno-histoquímica baseadas no mecanismo básico de ligação entre antigénio e anticorpo. Para conseguir obter marcação do anticorpo primário monoclonal para o antigénio Ki-67 (clone MIB-5, DAKO) (que irá revelar a proteína Ki-67 presente nos núcleos das células, caso estas estejam na fase ativa), recorreu-se ao método indireto, utilizando o kit NovoLink (Leica Biosystems) onde o anticorpo primário serve de antigénio para o anticorpo secundário. O método é baseado na polimerização controlada para a preparação de conjugados poliméricos de anticorpos com a peroxidase de ligação, evitando assim a marcação inespecífica que pode ocorrer com os métodos estreptavidina-biotina pela biotina endógena. Posteriormente procede-se a incubação do substrato-cromagénio [tetra-hidrocloreto de 3-3’-diaminobenzidina (DAB)], a reação com a peroxidase produz um precipitado castanho visível no local onde se encontra o antigénio.
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3.3.2. Metodologia
Para a técnica de imuno-histoquímica efetuaram-se cortes seriados do material incluído em parafina, sendo estes colados em lâminas previamente revestidas com uma solução de silane (Sigma). A técnica de imuno-histoquímica inclui: a incubação com o anticorpo primário e a revelação e montagem.
Para a incubação com o anticorpo primário procedeu-se à desparafinação com xilol e hidratação das lâminas com uma série de álcoois de concentrações decrescentes (álcool absoluto, álcool a 95%, álcool a 80% e álcool a 70%), seguida de recuperação antigénica pelo método térmico. A recuperação antigénica foi efetuada submergindo as lâminas em tampão citrato (constituído por 9 mL de ácido cítrico e 41 mL de citrato de sódio, completando depois o volume com água destilada num balão volumétrico de 500 mL) com o pH=6,2±0,2. As lâminas foram colocadas no micro-ondas a 750 W, e realizados 4 ciclos de 5 minutos cada com pausas entre eles para acrescentar tampão citrato de forma a evitar que as lâminas secassem. Após a recuperação antigénica e o arrefecimento das lâminas à temperatura ambiente, durante 30 minutos, os cortes foram delimitados com uma caneta hidrofóbica e lavados com tampão fosfato-salino (PBS) a pH=7,4. Depois de colocados numa câmara húmida (Bio Optica), foram incubados com Peroxidase Block [peróxido de hidrogénio a 3-4% (v/v)] durante 30 minutos de modo a inibir as peroxidases endógenas. Para que a fixação do anticorpo primário fosse possível os cortes foram incubados à temperatura ambiente com o Protein Block (caseína a 0,4% em soro com tampão fosfato, estabilizadores, agente surfactantes e Bronidox L a 0,2% como produto conservante) durante 5 minutos e depois os cortes foram incubados durante a noite no frigorífico a 4ºC com o anticorpo primário monoclonal para o antigénio Ki-67 (clone MIB-5, DAKO), diluição 1:50 em PBS.
Após 16 horas de incubação retiraram-se as lâminas do frigorífico mantendo-as à temperatura ambiente durante 30 minutos. De seguida efetuou-se a lavagem dos cortes com PBS. Foi feita uma primeira incubação com o Post Primary [IgG de coelho anti-rato (<10 g/mg) em soro animal a 10% (v/v) numa solução salina tamponada com Tris/ProClin 950 a 0,09%] durante 10 minutos para detetar os anticorpos primários. Após lavagem com PBS, prosseguiu-se à incubação com o soro NovoLink Polymer [IgG-HRP-IgG anti-coelho (<25 mg/g) que contém soro animal a 10% (v/v) em solução salina tamponada com Tris/ProClin™950 a 0,09%] durante 10 minutos, seguida de uma nova lavagem. As lâminas foram reveladas durante 4 minutos (após se terem feitos testes controlos onde esse tempo foi determinado) numa solução aquosa de DAB [5 µL DAB Chromogen (3,3’–diaminobenzidina a 1,74% peso/volume numa
16 solução estabilizadora) em 100 µL Novolink DAB Substrate Buffer (solução tamponada que contém peróxido de hidrogénio a ≤0,1% e um produto conservante)]. De seguida os cortes foram colocados numa tina com água destilada, sendo retirados para se proceder à contra coloração com solução hematoxilina durante 30-60 segundos. As lâminas foram lavadas em água morna corrente. Por fim, procedeu-se à desidratação com uma série crescente de álcoois e diafinização com xilol. A montagem das lâminas foi efetuada com resina sintética Entellan (Merck).
No procedimento foram utilizados controlos positivos e negativos: como controlo positivo utilizaram-se gânglios linfáticos; no controlo negativo ocorreu a substituição do anticorpo primário por PBS.
3.4. Método de quantificação da imunorreatividade
A imunorreatividade foi avaliada por dois observadores independentes. Para determinar o índice de proliferação (IP) consideraram-se os núcleos marcados positivamente, independentemente da invasividade da neoplasia pelo o antigénio Ki-67; com a objetiva de 10x foram localizadas as áreas de maior marcação, em seguida com a objetiva de 40x foram contadas 1000 células neoplásicas em cada lâmina considerando como positivos os núcleos marcados evidentemente de cor castanha e com uma imuno-marcação homogénea. O IP foi determinado com base na seguinte fórmula:
𝐼𝑃 (%) =𝑛º 𝑑𝑒 𝑛ú𝑐𝑙𝑒𝑜𝑠 𝑚𝑎𝑟𝑐𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑛º 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑛𝑒𝑜𝑝𝑙á𝑠𝑖𝑐𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥100
3.5. Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o programa JMP® Starter 5.0.1 (SAS Institute Inc, Carolina do Norte, EUA). A relação do tipo de neoplasia com os grupos estudados foi realizada através do teste de χ2, o teste ANOVA foi utilizado para comparação entre as classificações de
neoplasias e os grupos em relação ao índice de proliferação. Os resultados obtidos foram considerados estatisticamente significativos para valores de p<0,05.
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4. Resultados
4.1. Avaliação histopatológica
Na avaliação histopatológica dos tumores da mama induzidos quimicamente pela MNU foram identificados 38 tipos de neoplasias no grupo sedentário e 32 tipos de neoplasias no grupo exercitado, em quatro classificações dos tipos de lesão (tabela 3).
Entre o grupo sedentário e o exercitado verifica-se que foram encontrados mais tipos de neoplasias no primeiro grupo em comparação com o segundo grupo, contudo estas diferenças não foram estatisticamente significativas (p=0,4313) (tabela 3). Tanto num grupo como no outro os carcinomas identificados são maioritariamente neoplasias epiteliais, sendo que dentro destas as mais prevalentes são as epiteliais malignas (88,57%).
Tabela 3: Classificação dos tipos de lesão em comparação com os grupos de estudo.
Classificação dos tipos de lesão Grupo sedentário n (%) Grupo exercitado n (%) Total (%) Epitelial benigna 2(2,86) 1(1,43) 3(4,29) Epitelial maligna 34(48,57) 28(40) 62(88,57) Epitelial-estroma benigna 0(0) 2(2,86) 2(2,86) Pré-cancerosa 2(2,86) 1(1,43) 3(4,29) 38(54,29) 32(45,71) 70(100) (χ2 p=0,4313)
O estudo histológico das neoplasias identificadas (figura 1) mostra dois padrões predominantes: papilar e cribriforme, e encontram-se na maioria das vezes nas mesmas neoplasias. No grupo exercitado encontraram-se dois fibroadenomas e adenomas lactantes, e no grupo sedentário, foi o único onde se detetaram duas PID, dois comedos e dois tubulares.
O padrão papilar é o mais detetado em ambos os grupos, pertencendo à classificação de lesão epitelial maligna. De entre os outros padrões, destacam-se o padrão cribriforme e o cistopapilar, sendo que este último se identificou apenas no grupo exercitado (figura 2).
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4.2. Imunoreactividade ao Ki-67
Vinte e duas lâminas analisadas apresentaram mais do que um tipo de lesão com imunoreactividade positiva ao antigénio Ki-67, sendo que de todas as lesões analisadas a maioria tinha marcação positiva. A marcação imuno-histoquímica do Ki-67 apresentou marcação nuclear (figura 3).
A B C
Figura 1: Classificação histológica dos tipos de lesões mamárias identificadas nos grupos sedentário e exercitado.
Figura 2: Corte histológico do padrão papilar (A), cribriforme (B) e cistopapilar (C) (100x).
19 Os valores médios do IP entre o grupo sedentário e o grupo exercitado para as lesões papilar e cribriforme são diferentes, como se pode observar na figura 4.
Os valores médios do IP para cada lesão e em ambos os grupos (sedentário e exercitado) estão sumariados na tabela 4. Não houve diferença significativa entre os grupos (p=0,07). A média do IP do tipo de lesão cribriforme destaca-se (9,75±10,5), devido ao fato de ser a lesão com mais proliferação em ambos os grupos.
Tabela 4: Associação entre o IP nas diferentes lesões em ambos os grupos.
Lesão Número total χ̅ DP
Adenoma tubular 2 0,650,35 Adenoma lactante 2 0,400,57 PID 2 1,852,62 Papilar 32 4,204,94 Cistopapilar 8 1,781,40 Cribriforme 18 9,7510,5 Comedo 2 2,652,62 Tubular 2 1,051,48 Fibroadenoma 2 0,100,14
Média e desvio padrão (χ̅ ±DP) (p=0,07)
20 Os tipos de lesões mais detetadas (papilar, cribriforme e cistopapilar) mostram um IP diferente em ambos os grupos (sedentário versus exercitado), como se pode verificar na figura 5. Esta diferença relaciona-se com o número de células marcadas positivamente que foi superior na lesão cribriforme (figura 5B), seguida da lesão papilar (figura 5A) e foi inferior na lesão cistopapilar (figura 5C).
A relação do IP entre os grupos sedentário e exercitado, não foi estatisticamente significativa (p=0,79) (tabela 5).
Tabela 5: Associação ente o IP em ambos os grupos. Média e desvio padrão.
Grupo Número total χ̅ DP
Sedentário 38 5,418,26
Exercitado 32 4,135,09
Média e desvio padrão (χ̅ ±DP) (p=0,79)
A B C
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5. Discussão
Neste trabalho experimental foram utilizados 21 ratos fêmea Sprague-Dawley, com o objetivo de avaliar, pela técnica de IHQ, o efeito do exercício físico e do sedentarismo na proliferação celular de tumores quimicamente induzidos pelo agente carcinogénico MNU. Observou-se expressividade do marcador de proliferação celular Ki-67 nas lesões neoplásicas identificadas em ambos os grupos experimentais, sendo que no grupo exercitado o valor do índice de proliferação foi menor que no grupo sedentário. Estes resultados sugerem que o exercício físico pode influenciar a proliferação celular.
Para este estudo a classificação das lesões histológicas foi feita de acordo com o publicado por Russo e Russo (2000). Esta classificação é usualmente utilizada em trabalhos experimentais nos quais a indução de tumores da mama é feita através da administração intraperitoenal de MNU em ratos fêmea, semelhante ao que realizámos neste trabalho.
Nos 21 animais utilizados identificaram-se 70 lesões mamárias, 38 delas no grupo sedentário e 32 no grupo exercitado. As lesões dos animais pertencentes ao grupo sedentário foram classificadas em: adenomas tubulares (5,26%); proliferações intra-ductais (5,26%); papilares (50%), cribriformes (28,95%), comedos (5,26%) e tubulares (5,26%). No grupo de animais exercitados as lesões foram classificadas em tubulares lactantes (6,25%); papilares (40,63%), cistopapilares (25%) e cribriformes (21,88%) e fibroadenomas (6,25%). As lesões neoplásicas do tipo papilar e cribriforme foram as com maior percentagem de ocorrência em ambos os grupos, resultados idênticos aos observados em estudos de carcinogénese química induzida pela MNU em ratos fêmea Sprague-Dawley já publicados (Russo e Russo, 1987; Pula
et al., 2013).
Alguns estudos publicados demonstraram a influência da atividade física no desenvolvimento de cancro da mama (Thompson, 1997; Zhu et al., 2009; Malicka et al., 2015). Há indícios de que a atividade física com intensidade moderada a alta parece exercer um efeito protetor contra o desenvolvimento neoplásico (Thompson et al., 2010).
Neste trabalho observamos que a incidência dos diferentes tipos de lesões da glândula mamária foi menor no grupo exercitado em comparação com o grupo sedentário. Apesar desse valor não ser estatisticamente significativo, estes resultados são semelhantes aos publicados por Malicka et al. (2015), onde se induziram quimicamente tumores mamários a 50 ratos fêmea Sprague-Dawley com a administração intraperitonial de 180 mg/kg de MNU, e se dividiram os ratos por 4 grupos (sendo um de controlo, e os outros 3 de exercício), verificando-se uma menor incidência de tumores nos grupos exercitados do que no grupo de controlo (sedentário).
22 Contudo, da análise dos trabalhos publicados constata-se que os resultados sobre o impacto do exercício físico na incidência de cancro são ambíguos. No trabalho realizado por Zhu et al. (2009) observou-se que a incidência no desenvolvimento de tumores foi inferior no grupo exercitado em comparação com o grupo sedentário. Neste trabalho utilizaram-se 90 ratos fêmea Sprague-Dawley, às quais foi administrado 50 mg/kg de MNU por via intraperitoneal, o exercício físico foi realizado em roda. Há um estudo publicado onde a incidência de tumores aumentou nos animais que realizaram exercício físico (Whittal-Strange et al., 1998) contudo, num trabalho de revisão feito por Thompson (1997), onde foram analisados vários artigos sobre o efeito do exercício físico (natação e corrida) em ratos, tendo como objetivo avaliar a interferência da duração e da intensidade do mesmo, conclui-se que os dados analisados são ambíguos, pois tanto o aumento como a inibição do processo carcinogénico são referidos pelos autores.
Está demonstrado que o grau de proteção contra o cancro é proporcional à intensidade da atividade física realizada (Thompson et al., 1995). No nosso trabalho os ratos foram submetidos a um exercício físico com uma intensidade moderada, durante 35 semanas, até ao momento nenhum trabalho publicado teve uma duração de exercício tão longa. Nos trabalhos publicados, referidos ao longo desta discussão, a duração do exercício físico dos animais está compreendida entre as 8 a 12 semanas. Os nossos resultados, sugerem que em vez de uma intensidade alta de exercício físico uma maior duração temporal da atividade física favorece uma diminuição no desenvolvimento de neoplasias da glândula mamária quimicamente induzidas.
Na maioria dos estudos em que se avaliou a interferência do exercício na incidência de neoplasias malignas induzidas quimicamente pela MNU as lesões identificadas são do tipo papilar e cribriforme (Pula et al., 2013). A descrição da ocorrência de lesões do tipo fibroadenoma em animais exercitados tem sido pouco descrita na literatura, perante a identificação desta lesão no nosso trabalho experimental podemos assumir que a duração prolongada deste protocolo pode ser um fator influenciador da ocorrência desta lesão. Um protocolo de longa duração pode favorecer o stresse dos ratos; o stresse aumenta a libertação de corticosteroides endógenos. Os corticosteroides podem favorecer o desenvolvimento destas neoplasias, ou mesmo serem responsáveis pela maior taxa de desenvolvimento das neoplasias do tipo malignas. Este mecanismo de desenvolvimento de lesões associadas ao stresse foi sugerido por Sáez et al. (2007). Estes investigadores avaliaram o efeito anti-stresse da hormona melatonina em ratos submetidos a stresse provocado por natação durante 30 minutos, 5 dias por
23 semana, ao longo de 4 semanas. Concluíram que um alto nível de stresse provocado por exercício físico aumentou a carcinogénese mamária, e confirmam que a melatonina tem um efeito terapêutico contra cancro da mama, principalmente durante situações de stresse, isto é, nas condições em que foi realizada esta experiência.
Neste trabalho prático recorreu-se à técnica de imuno-histoquímica para determinar o índice de proliferação celular nas diferentes lesões mamárias induzidas pela MNU, entre o grupo de animais exercitados e o grupo de animais sedentários. A IHQ é uma técnica simples de realizar, contudo dispendiosa, requer cuidados especiais nas fases consideradas críticas, nomeadamente na recuperação antigénica, porque a fixação das amostras em formol tamponado a 10% pode favorecer o bloqueio dos epítopos específicos dos antigénios (zonas de ligação específica entre o antigénio e o anticorpo). Outra das etapas a ter precaução durante a realização desta técnica corresponde à inibição das peroxidases endógenas. O bloqueio das peroxidases endógenas evita a ocorrência de uma reação não específica do agente cromogéneo DAB com outras peroxidases, sem ser as presentes no complexo enzimático. E por último, a revelação com DAB deve ser feita com muita precaução, porque para além de ser um composto classificado como carcinogénico, por levar ao aparecimento de fundo indesejável nos cortes histológicos, pode conduzir à dificuldade na interpretação da expressividade dos anticorpos.
Neste estudo foi utilizado o anticorpo monoclonal para a identificação e quantificação do antigénio Ki-67. O marcador Ki-67 reconhece um antigénio nuclear expresso durante o ciclo celular, caso as células se encontrem na fase de proliferação ativa (Dierendonck et al., 1989; Sysel et al., 2013). Esta proteína nuclear não histona está envolvida na replicação do ADN e é expressa durante a fase G1 tardia, fase S, G2 e M do ciclo celular, com exceção das fases G0 e início de G1 (Unek et al., 2014). Este marcador é considerado um bom indicador do estado proliferativo de uma população de células em vários tipos de neoplasias (Veronese et al., 1993; Sysel et al., 2013).
Neste trabalho, o marcador de proliferação celular Ki-67 apresentou expressividade em todas as lesões neoplásicas identificadas nos grupos sedentário e exercitado, induzidas quimicamente pela MNU. No entanto, houve diferenças na proliferação celular comparando as lesões encontradas em ambos os grupos estudados, sendo que na lesão do tipo papilar o IP foi superior no grupo exercitado, e na lesão do tipo cribriforme o IP foi superior no grupo sedentário. Estes resultados são diferentes dos publicados no trabalho feito por Malicka et al. (2015). Como já foi referido anteriormente, no trabalho desenvolvido por estes investigadores, os tumores foram quimicamente induzidos em 50 ratos fêmea Sprague-Dawley, administrando
24 intraperitonialmente 180 mg/kg de MNU, havendo posteriormente a divisão por 4 grupos (um de controlo, e os outros três de exercício). No trabalho destes investigadores foi utilizado o marcador Ki-67, não se tendo observado diferenças na proliferação celular nos 4 grupos estudados.
No nosso trabalho, o valor médio do índice de proliferação em ambos os grupos permite constatar um aumento da proliferação celular durante a progressão de uma lesão epitelial benigna como o adenoma tubular (0,65±0,35), para uma lesão epitelial maligna como o papilar (4,20±4,94), tendo sido registado o valor mais alto na lesão do tipo cribriforme (9,76±10,5). Apesar destes valores não serem estatisticamente significativos observámos que a proliferação celular está presente nos tumores da mama quimicamente induzidos pela MNU no rato fêmea da estirpe Sprague-Dawley, e nomeadamente no desenvolvimento de diferentes tipos de neoplasias, idêntico ao observado por Pula et al. (2013). Estes autores realizaram um trabalho com 27 ratos fêmea da estripe Sprague-Dawley, onde foram induzidos quimicamente tumores mamários através da administração de 180 mg/kg de MNU, por via intraperitoneal e recorreram à técnica de IHQ para avaliar o desenvolvimento tumoral, observando-se 100% de incidência de tumores mamários, entre eles lesões do tipo cribriforme, papilar, entre outros, onde a proliferação celular foi mais elevada nas lesões com maior grau de malignidade.
Ao comparar a média e o respetivo desvio padrão do índice de proliferação para os diferentes tipos de neoplasias entre os diferentes grupos de estudo, observamos uma diferença entre o grupo sedentário (5,41±8,26) e o grupo exercitado (4,13±5,09), que mesmo não sendo um valor estatisticamente significativo, comprova que o exercício físico ajuda a reduzir o desenvolvimento do cancro da mama visto que diminui a proliferação celular. Ao contrário do que foi verificado neste trabalho, Westerlind et al. (2002) demonstraram um aumento na proliferação celular de neoplasias mamárias em 80 ratos submetidos ao exercício físico através de um treino num treadmill, seguindo um protocolo experimental descrito por outros investigadores. Estes resultados podem justificar-se por estes autores terem usado um marcador de proliferação celular diferente no seu estudo, o proliferating cell nuclear antigen (PCNA). O PCNA é um marcador que não só identifica proliferação celular como também reparação celular, sendo por isso pouco sensível neste tipo de estudos.
Para um futuro trabalho seria interessante estudar mais aprofundadamente a relação entre os recetores do estrogénio e da proliferação celular em ratos exercitados e ratos sedentários com cancro da mama induzidos quimicamente pela MNU. Também seria interessante relacionar a expressividade do Ki-67 com o marcador de apoptose p53, visto que a
25 apoptose e o ciclo celular estão interligados, podendo assim esclarecer melhor essa mesma relação e o desenvolvimento neoplásico mamário.
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6. Conclusão
O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressividade por IHQ do marcador de proliferação celular (Ki-67) em tumores da mama quimicamente induzidos pela MNU em ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley sedentários e exercitados, sendo possível concluir:
A administração intraperitoneal de MNU induziu o desenvolvimento de neoplasias mamárias em ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley.
O exercício físico diminuiu o desenvolvimento de neoplasias mamárias e esteve associado a um menor índice de proliferação.
Este trabalho permite-nos, assim, concluir que o exercício físico de intensidade moderada parece ter um efeito benéfico no desenvolvimento de neoplasias mamárias em ratos fêmea da estirpe Sprague-Dawley.
Além disso, com a realização deste trabalho foram adquiridas novas competências relativas à realização da técnica de imuno-histoquímica, e análise da sua expressividade.
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