Aula4Va..

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Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geociências

Departamento de Engenharia Química

VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

ANALÍTICOS

Prof. Fernanda A. Honorato

2011.2

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INTRODUÇÃO

VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS

Processo de avaliação que permite garantir que um novo método analítico ou um método que sofreu alterações gere informações analítico, ou um método que sofreu alterações, gere informações

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INTRODUÇÃO

Porquê

Porquê VALIDAR

VALIDAR ??

9 Necessidade de mostrar a qualidade das medições químicas, seja por razões legais, técnicas ou comerciais;

9 Exigência dos órgãos reguladores do Brasil e de outros países;

9 Oferece evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são adequados ao uso desejado.

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INTRODUÇÃO

ALGUMAS DEFINIÇÕES

¾ “A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas assegurando a

ALGUMAS DEFINIÇÕES

método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados” (Anvisa);

¾ “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e ¾ Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação requer” (Eurachemp q p ç q ( Working Group);

¾ “Confirmação por testes e apresentação de evidências objetivas de que determinados requisitos são preenchidos para um dado uso intencional”

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INTRODUÇÃO

LEGISLAÇÃO

¾ Agências credenciadoras no Brasil: ANVISA e INMETRO, que

LEGISLAÇÃO

g , q

disponibilizam guias para o procedimento de validação; - ANVISA: Resolução RE no. 899 de 29/05/2003ANVISA: Resolução RE no. 899 de 29/05/2003 - INMETRO: DOQ-CGCRE-008 de 03/2010

¾ Outros Guias: IUPAC (International Union of Pure and Applied ¾ Outros Guias: IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), US-FDA (United States Food and Drug Administration),

ICH (I t ti l C f H i ti ) ISO (I t ti l

ICH (International Conference on Harmonization), ISO (International Standard Organization).

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INTRODUÇÃO

VALIDAÇÃO: APLICAÇÕES

Com o objetivo de confirmar que os métodos são apropriados para o

VALIDAÇÃO: APLICAÇÕES

uso pretendido, deve-se validar:

Mé d ã li d

• Métodos não normalizados;

• Métodos criados/desenvolvidos;

• Métodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram • Métodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos;

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INTRODUÇÃO

PLANEJAMENTO E EXECUÇÃO DA VALIDAÇÃO

9 Definir a aplicação, objetivo e escopo do método;p j p

9 Definir os parâmetros de validação e critérios de aceitação;

9 Verificar se as características de desempenho do equipamentoVerificar se as características de desempenho do equipamento estão compatíveis com o exigido pelo método em estudo;

9 Qualificar os materiais por exemplo padrões e reagentes; 9 Qualificar os materiais, por exemplo, padrões e reagentes;

9 Planejar os experimentos de validação, incluindo o tratamento t tí ti

estatístico;

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INTRODUÇÃO

TIPOS DE VALIDAÇÃO

¾ Validação no Laboratório (“in house validation”): consiste das etapas

¾ Validação no Laboratório ( in house validation ): consiste das etapas

de validação dentro de um único laboratório; útil nas etapas

li i d d l i t d t d l i bli ã

preliminares do desenvolvimento de uma metodologia e na publicação de artigos científicos;

¾ l d l ( f ll l d ) l d i

¾ Validação completa (“full validation”): envolve todas as características

de desempenho e um estudo interlaboratorial (segundo protocolo da ISO).

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INTRODUÇÃO

FORMAS DE FAZER A VALIDAÇÃO

- Comparando-se os resultados com os obtidos por outros métodos normalizados ou similares já validados;

- Comparações Interlaboratoriais; - Comparações Intralaboratoriais;

- Avaliação sistemática dos fatores que influenciam o resultado;ç q ;

- Avaliação da incerteza de medição com base no conhecimento dos princípios do método e na experiência prática;

princípios do método e na experiência prática; - Ensaios de repetitividade e reprodutibilidade.

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

Similaridades e diferenças entre o INMETRO e a ANVISA

INMETRO ANVISA

Seletividade Especificidade e Seletividade

Similaridades e diferenças entre o INMETRO e a ANVISA

p

Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho Intervalo Linearidade - Sensibilidade (inclinação da

curva)

Linearidade

Limite de Detecção (LD) Limite de Detecção (LD) (sensibilidade) Limite de Quantificação (LQ) Limite de Quantificação (LQ)

Tendência/Recuperação Exatidão Precisão Precisão

Repetitividade Repetibilidade (precisão intracorrida) Precisão intermediária Precisão intermediária (precisão

intercorridas) intercorridas)

Reprodutibilidade _{interlaboratorial)}Reprodutibilidade (precisão Robustez Robustez

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

TENDÊNCIA/RECUPERAÇÃO

9 Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendência de um método são, entre outros: uso de materiais de referência certificados (MRC), participação em comparações interlaboratoriais e realização de ensaios de recuperação;

9A tendência, quando aplicada a uma série de resultados de ensaio, implica numa combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos.

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

9 A Recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike);

9A t d f tifi d lit l t ê

9As amostras podem ser fortificadas com o analito em pelo menos três diferentes concentrações: baixa, média e alta, da faixa de uso do método.

( )

%

100 Re

3 2 1

⎟

×

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−

=

C

cuperação

3

⎠

⎝

C1 = concentração do analito na amostra fortificada,

C2 = concentração do analito na amostra não fortificada,

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

PRECISÃO

9 T l li di ã d lt d t i

9 Termo geral para avaliar a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas;

ou padrões, em condições definidas;

9 Normalmente determinada para circunstâncias específicas de medição sendo expressa comumente por meio da repetitividade, precisão sendo expressa comumente por meio da repetitividade, precisão intermediária e da reprodutibilidade (expressas pelo desvio padrão e coeficiente de variação).

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

11.. Repetitividade

Repetitividade

pp

9 As condições de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando: • Mesmo procedimento de medição;

• Mesmo observador;

M i d b di õ

• Mesmo instrumento usado sob mesmas condições; • Mesmo local;

• Repetições no menor espaço de tempo possível • Repetições no menor espaço de tempo possível.

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

22.. Precisão

Precisão Intermediária

Intermediária

9 Refere-se à precisão avaliada sobre a mesma amostra, amostras idênticas ou padrões utilizando o mesmo método no mesmo idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou mais) tais como:

ou mais), tais como: • diferentes analistas;

• diferentes equipamentos;q p ; • diferentes tempos;

9 Esta medida de precisão representa a variabilidade dos resultados em um laboratório.

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

33.. Reprodutibilidade

Reprodutibilidade

pp

9 Embora não seja um componente de validação de método executado por um único laboratório, é considerada importante quando se busca a verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação obtidos por meio de comparação interlaboratorial.

9A partir do desvio padrão obtido sob condições de reprodutibilidade é

í l l l li it d d tibilid d (R) l it

possível calcular o limite de reprodutibilidade (R), o qual permite ao analista decidir se a diferença entre os valores da duplicata das amostras analisadas sob condições de reprodutibilidade é significante

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

44 Comparação

Comparação da

da Precisão

Precisão entre

entre Métodos

Métodos

44.. Comparação

Comparação da

da Precisão

Precisão entre

entre Métodos

Métodos

9 Para avaliar se dois métodos (A e B) têm diferenças significativas entre si, em termos de precisão, pode-se recorrer ao teste F.

9 Teste F: razão entre as variâncias dos dois métodos F_calc = S2

A/S2B

9 O valor obtido é comparado com o valor tabelado de F. Se F_calculado <

F d i é d ã dif i ifi i i

F_tabelado, os dois métodos não apresentam diferenças significativas entre si, relativamente às suas precisões.

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

ROBUSTEZ

9 A robustez de um método mede a sensibilidade que este apresenta

di t d i õ

diante de pequenas variações;

9 Para determinar a robustez de um método de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden (teste que permite não só avaliar a robustez do ao teste de Youden (teste que permite não só avaliar a robustez do método, como também ordenar a influência de cada uma das variações nos resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada uma nos resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada uma dessas variações).

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

INCERTEZA DE MEDIÇÃO

9 Parâmetro associado ao resultado de uma medição que caracteriza a 9 Parâmetro associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão de valores que poderiam ser razoavelmente atribuídas ao mensurando;

mensurando;

9 Fontes de incerteza: fatores que contribuem na obtenção da incerteza do resultado de uma medida;;

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

Etapas

Etapas para

para oo Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza

Etapas

Etapas para

para oo Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza

1. Identificação das fontes de incertezas que podem influenciar nos resultados do ensaio;

2. Quantificar os componentes de incerteza e atribuir à distribuição de probabilidade;

3. Determinação da incerteza padrão (u_i) para cada fonte de incerteza;

4 Cál l d i d ã bi d ( )

4. Cálculo da incerteza padrão combinada (u_c);

5. Cálculo dos graus de liberdade efetivo (υ_eff) e do fator de abrangência(k);

abrangência(k);

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

Exemplo

Exemplo de

de Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza:: pH

pH

Exemplo

Exemplo de

de Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza:: pH

pH

pH = Y = f (X₁, X₂, X₃, X₄) Sendo: X₁ = Analista X E i X₂ = Equipamento X₃ = Temperatura

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

Exemplo

Exemplo de

de Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza:: pH

pH

Exemplo

Exemplo de

de Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza:: pH

pH

¾ Cálculo da incerteza padrão combinada (u_c);

¾ Cálculo dos graus de liberdade efetivo (υ_eff) e do fator de abrangência(k); ¾ Cál l d i did (U)

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

Exemplo

Exemplo de

de Cálculo

Cálculo de

de Incerteza

Incerteza:: pH

pH

Exemplo

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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

¾ As características de desempenho do método (ou parâmetros de validação) que necessitam ser calculados durante o processo de validação podem variar de acordo com o método de ensaio.