Detecção, isolamento e caracterização parcial da lectina presente na ascídia marinha Symplegma sp

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA

DETECÇÃO, ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LECTINA PRESENTE NA ASCÍDIA MARINHA Symplegma sp

EUDISMAR VALE NUNES

Monografia apresentada ao Departamento de Engenharia de Pesca, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal do Ceará, como parte das exigências para obtenção do título de Engenheiro de Pesca.

FORTALEZA - CEARÁ — BRASIL FEVEREIRO/2006

çrrA BIBLIOTECA SETORIAL

N924d Nunes, Eudismar Vale.

Detecção, isolamento e caracterização parcial da lectina presente na ascídia marinha symplegma sp / Eudismar Vale Nunes. – 2006.

37 f. : il. color.

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Curso de Engenharia de Pesca, Fortaleza, 2006.

Orientação: Prof. Dr. Alexandre Holanda Sampaio. 1. Engenharia de Pesca. I. Título.

COMISSÃO EXAMINADORA

tyjeuf

Prof2 Alexandre Holanda Sampaio, Ph.D. Orientador

Prof. Benildo Sóusa Cavada, D.Sc.

.

Membro

Prof. Alexandre Havt Bindá, D.Sc. Membro

VISTO

Prof. Moisés Almeida de Oliveira, D.Sc. Chefe do Departamento de Engenharia de Pesca

~

7-2

l.

Prof Artamiziá Maria No'gueira Montezuma, M.Sc. Coordenadora do Curso de Engenharia de Pesca

Aos meus pais,

Deuzimar

Maria da Conceição,

incentivo e por terem sempre acreditado na realização desta importante etapa de minha vida.

Aos meus irmãos,

Deusimar

e

Mara,

motivação.

AGRADECIMENTOS

A Deus, fonte de todo conhecimento e inspiração.

Aos meus pais, Deuzimar dos Santos Nunes e Maria da Conceição Vale Nunes, aos meus irmãos, Deusimar e Mara, e minha namorada Roberia, pelo incentivo, pela motivação, compreensão e por estarem sempre presentes em minha vida.

A Professor Alexandre Holanda Sampaio pela excelente orientação, compreensão e conhecimentos passados durante execução e término deste trabalho.

Ao Professor Benildo Souza Cavada, pelas sugestões, por ter concedido espaço em seu laboratório e a importante ajuda durante a realização do trabalho.

Ao Professor Wladimir Ronald Lobo Farias, pelas sugestões e por ter cedido equipamentos de seu laboratório durante execução deste trabalho.

A Professora Silvana Saker Sampaio, pela paciência, ensinamentos e conselhos durante todo o curso.

A Kyria Santiago do Nascimento e Ramon Feitosa Rodrigues, pelo valoroso auxílio na execução dos trabalhos de laboratório, pelo compartilhamento de conhecimentos e pela amizade.

A todos do BioMol em especial Jônatas, Raquel, Taianá, Bruno, Carlos Gadelha e Tatiani Gadelha e Nagano.

A quem comigo dividiu seus conhecimentos durante o período deste curso em especial a Kelma Maria dos Santos Pires, amiga de todas as horas.

Página

LISTA DE FIGURAS vi

LISTA DE TABELAS vii

RESUMO viii 1. INTRODUÇÃO 1 1.1. Lectinas do tipo S 3 1.2. Lectinas do tipo P 3 1.3. Pentraxinas 4 1.4. Lectinas tipo C 4 1.4.1. Selectinas 5 1.4.2. Colectinas 6 2. MATERIAL E MÉTODOS 8

2.1. Coleta das ascídias 8

2.2. Células sanguíneas 8

2.3. Reagentes 9

2.4. Extração de proteínas 9

2.5. Determinação da atividade hemaglutinante 10

2.6. Determinação de proteína 10

2.7. Inibição da atividade hemaglutinante por açúcares e glicoproteínas 10

2.8. Termoestabilidade 11

2.9. Efeito de cátions divalentes 11

2.10. Cromatografia em coluna de DEAE-Sephacel 12

2.11. Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e 12 p-mercaptoetanol

3.1. Estudos de extração protéica 14

3.2. Atividade hemaglutinante 14

3.3. Inibição da atividade hemaglutinante por açúcares e glicoproteínas 15

3.4. Termoestabilidade 16

3.5. Efeito do EDTA e cátions divalentes na atividade hemaglutinante 17 3.6 Cromatografia de troca jônica em coluna de DEAE-Sephacel 17 3.7. Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e 13-mercaptoetanol 18

4. DISCUSSÃO 20

5. CONCLUSÃO 25

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Estrutura das colectinas de animais. 6

Figura 2. Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante do extrato 16 total de Symplegma sp

Figura 3. Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel 18 do extrato total da ascídia marinha Symplegma sp

Figura 4. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e 19 f3-mercaptoetanol (SDS_PAGE) da lectina presente na ascídia marinha Symplegma sp

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Sub-grupos das lectinas tipo C 5

Tabela 2 Determinação da melhor condição de extração da lectina da 14 ascídia marinha Symplegma sp.

Tabela 3 Atividade hemaglutinante (UH/mL) do extrato total de 15 Symplegma sp contra diferentes eritrócitos nativos e tratados com enzimas proteolíticas.

Tabela 4 Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante do extrato 16 total de Symplegma sp

Tabela 5 Efeito do EDTA e cátions divalentes na atividade 17 hemaglutinante de Symplegma sp

RESUMO

O presente trabalho consiste na detecção, caracterização e isolamento parcial de uma lectina presente na ascídia marinha Symplegma sp. As ascídias foram coletadas em banco natural na praia de Penha, Armação do ltapocoroy, do Campus V da Universidade do Vale do Itajaí, estado de Santa Catarina. As ascídias foram levadas para o laboratório, onde se procedeu à triagem, a limpeza, o enxágüe em água do mar filtrada seguida da identificação, sendo imediatamente congelada e liofilizada. Após a liofilização, o material foi triturado até a obtenção de um fino pó. O material submetido a testes de extração em diferentes pHs mostrou que o melhor tampão de extração foi Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6 com NaCI 0,15 M. A atividade hemaglutinante foi mais efetiva em aglutinar eritrócitos de coelho tratadas com a enzima proteolítica tripsina. A lectina teve sua atividade hemaglutinante inibida preferencialmente por mucina submaxilar de porco e mostrou-se se resistente a variações de temperatura, até 60 °C por 30 minutos. A atividade hemaglutinante foi abolida na presença de EDTA e recuperada quando adicionado ao meio cátions divalentes. Isolamento parcial da lectina foi obtido por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel, que apresentou um pico retido na coluna contendo toda atividade hemaglutinante. Quando analisado por SDS-PAGE a lectina apresentou uma única banda com massa molecular aparente de 45 kDa.

DETECÇÃO, ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE UMA LECTINA PRESENTE NA ASCÍDIA MARINHA Symplegma sp

EUDISMAR VALE NUNES

1. INTRODUÇÃO

As acídias são invertebrados marinhos filtradores sésseis que podem ser solitários, coloniais ou formar grupos de muitos indivíduos embaixo de uma túnica comum. Pertencem ao Filo Chordata, Subfilo Urochordata, também denominado de Tunicados e Classe Ascidiacea. São conhecidos por sua habilidade de concentrar vanádio e outros metais encontrados na água do mar (OSINGA et al., 1998; STORER et al., 2002).

Os invertebrados não possuem um sistema imune baseado em uma multidão de anticorpos altamente específicos e receptores de antígeno equivalente ao de vertebrados (MARQUES et al., 2000). Com isso, alguns tilos marinhos como Porífera, Cnidário, Molusca e Chordata têm sido uma excelente fonte de novos compostos com potencial citotoxico (MUNRO et al., 1999). Fatores ecológicos têm sido provavelmente os mais importantes na variabilidade da expressão desse potencial citotoxico representado pelos metabólicos secundários presentes nesses organismos, que são usados como armas químicas contra competidores, predadores ou parasitas (LINDEL et al., 2000).

Entre essa gama de compostos com grande potencial de aplicação biológica, que podem ser encontrados nos fitos marinhos, existem as lectinas, que foram definidas por Peumans e Van Damme (1995) como proteínas de origem não imune contendo pelo menos um sítio de interação a carboidratos, podendo ou não apresentar outros tipos de sítios catalíticos. Esta definição inclui uma grande faixa de proteínas que podem ser classificadas em três principais tipos, dependendo de

sua estrutura: "merolectinas" que possuem somente um domínio que se liga a açúcares simples não apresentando atividade hemaglutinante; as "hololectinas" que possuem dois ou mais domínios idênticos ou com alto grau de homologia, capazes de aglutinar células ou precipitar glicoconjugados e as "quimerolectinas" que se caracterizam por apresentar, além de pelo menos um domínio de ligação a carboidratos, um outro sítio com atividade distinta (enzimática, inativadora de ribossomas etc). Dependendo ainda do número de domínios que se ligam a açúcares, as quimerolectinas podem ou não apresentar atividade hemaglutinante. Posteriormente, os mesmos autores introduziram uma nova classe de iectinas, as "superlectinas" que são as que apresentam dois ou mais domínios carboidratos ligantes que se ligam a açúcares estruturalmente diferentes (VAN DAMME et al., 1998).

Desde o primeiro relato de lectinas de invertebrados feito por Camus em 1899, que essas proteínas têm sido extremamente investigadas, com o propósito de averiguar a distribuição nas espécies, especificidade e propriedades moleculares (VASTA et al., 1982). Numerosas lectinas são encontradas na hemolinfa dos invertebrados, agindo como anticorpos naturais proporcionando uma primeira linha de defesa, se ligando e neutralizando patogenos e freqüentemente promovendo a fagocitose de células (KILPATRICK, 2002). Contudo outros pesquisadores têm proposto que essas moléculas podem ter função de transporte ou armazenando glicoproteinas, ou poderia estar envolvidas na organização de complexos multienzimaticos (VASTA et al., 1982).

Algumas lectinas de invertebrados têm mostrado funções de antagonismo e isso tem conduzido alguns pesquisadores a considerar a especificidade das lectinas como primeiro passo no reconhecimento de materiais estranhos (VASTA et al., 1982).

Existem seis famílias de lectinas conhecidas: lectinas de leguminosas, lectinas de cereais, S-lectinas, P-lectinas, pentraxinas e lectinas do tipo-C. As quatro últimas ocorrem em animais e somente as pentraxinas e lectinas do tipo-C estão envolvidas na defesa do organismo (ARASON, 1996).

1.1. Lectinas do tipo-S

Mais conhecidas como galectinas, são pequenas proteínas solúveis, independentes de íons metálicos que possui afinidade por 3-galactosideos, não apresentando pontes S-S e glicolisações (ARASON, 1996). As galectinas possuem um ou dois domínios de reconhecimento de carboidrato (DRCs) com uma significante similaridade de seqüência, pois as estruturas resolvidas de 5 lectinas de mamíferos, 1 de ave, 1 de anfíbio, 2 de peixes e 1 de fungo são similares e apresentam uma topologia jellyroll típica de lectinas de leguminosas. (COOPER, 2002; VASTA et al., 2004; VASTA et ai., 1999). As galectinas desempenham papel importante nos organismos como reguladoras do crescimento celular, ponte molecular extracelular e ação antiinflamatória (KILPATRICK, 2002).

1.2. Lectina do tipo-P

A família da lectina do tipo-P possui dois representantes. O primeiro é dependente de cátions e possui domínio de reconhecimento de carboidrato (DRC) por manose-6-fosfato e o segundo também possui DRC por manose-6-fosfato, mas não depende de metais. Essas proteínas possuem a capacidade de reconhecer os resíduos de oligossacarídeos de hidrolases que contenham manose-6-fosfato e os levam do complexo de Golgi para os lisossomos (DAHMS e HANCOCK, 2002; ARASON, 1996).

1.3.Pentraxinas

As pentraxinas foram relatadas pela primeira vez em 1930 como um anticorpo que tem a capacidade de precipitar a fração polissacarídica da bactéria causadora da pneumonia. Como uma molécula precipitante e com alta afinidade por fosforilcolina sua natureza lectínica não ficou clara. Entretanto, como se tratava de uma proteína ela ficou conhecida como Proteína C-Reativa (PCR) e quando se observou sua capacidade de se ligar a galactanas e a galactose fosfatada percebeu-se que se tratava de uma lectina (KILPATRICK, 2002).

O termo pentraxina foi aplicado para a PCR e ao seu homologo, componente do soro amilóide P (SAP), para refletir sua incomum estrutura quaternária, na qual cinco subunidades polipeptídicas idênticas se combinam para formar um anel com um buraco central, assemelhando-se a uma "rosquinha" (KILPATRICK, 2002).

As pentraxinas têm sido encontradas em muitas espécies de vertebrados e em invertebrados, e sua divisão entre PCR e SAP não é feita com base na homologia da estrutura primaria e sim pela preferência por fosforicolina (PCR) ou por fosfoetanolamina (SAP). As pentraxinas são metaloproteinas, pois depedem de Ca2+ para expressar sua atividade, possuindo a capacidade de se ligar a sacarídeos da superfície das células bacterianas, indicando seu papel de defesa (KILPATRICK, 2002; ARASON, 1996).

1.4. Lectinas do tipo-C

As lectinas do tipo-C, tal como as pentraxinas, são dependentes de cálcio e elas são encontradas no soro, matriz extracelular e membranas. Possuem 18 aminoácidos altamente conservados em uma estrutura de 115-134 aminoácidos (ARASON, 1996).

lectinica (KILPATRICK, 2002).

Tabela 1: Subgrupos das lectinas do tipo-C.

Tipo Subgrupos

Hialectanas

II Receptores de asialoglicoproteinas

III Colectinas

IV Selectinas

V Grupo de receptores transmembrana NK

VI Receptores-manose de macrofagos

VII Lectinas simples ( single domínio)

Fonte: Kilpatrick, 2002.

Dentre as lectinas citadas, destacam-se as colectinas e selectinas, que participam em várias funções correlacionadas ao sistema imune.

1.4.1 Selectinas

As selectinas formam uma família de glicoproteínas dependentes de cátions divalentes, que se liga a carboidratos, especialmente sialyl-lewis X e mucinas. Essa família inclui três membros: E-selectina (selectina endotelial), L-selectina (selectina de adesão de leucócito), P-selectina (selectina de plaqueta). Todos os três membros possuem domínios extracelulares de reconhecimento de carboidratos e um domínio de fator de reconhecimento de crescimento epidermal, possuindo ainda, um número pequeno de domínios repetidos, relacionados a proteinas regulatorias de complemento. Os membros dessa família das selectinas

estão intimamente evolvidos no processo de adesão de leucócitos à parede do endotélio (KILPATRICK, 2002).

1.4.2.Colectinas

As colectinas constitui de um distinto grupo pertencente a subclasse das lectinas do tipo-C que possuem um domínio de reconhecimento de carboidrato combinado com um domínio de reconhecimento a colágeno. As cadeias básicas de polipeptideos das colectinas organizam-se em tripla hélice por entrelaçamento das regiões do tipo colágeno. Essas triplas hélices podem se agrupar assumindo novas estruturas (FIGURAI) em forma de cruz ou em formato de um "buquê de flores" (KILPATRICK, 2002; LILLIE et al., 2005). O interesse considerável por colectinas é devido a sua capacidade de interagir como complemento do sistema imunológico principal em todas as classes de vertebrados (NAIR et al., 2000).

a b c

Figura 1. Estruturas das colectinas de animais. a) tripla hélice na forma nativa; b) forma de buquê de flores; c) forma de cruz.

O isolamento de lectinas de organismos marinhos tem recebido grande atenção em função de suas características que podem proporcionar a descoberta de moléculas de grande interesse biotecnológico. Dentre os organismos marinhos de interesse encontra-se as ascídias marinhas que se constituem de um grupo de invertebrados marinhos pouco evoluído, levando então a possibilidade do isolamento de moléculas únicas, não encontradas em outros grupos de organismos marinhos.

O presente trabalho tem como objetivo o estudo de detecção, isolamento e caracterização parcial de uma lectina presente na ascídia marinha Symplegma sp.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Coleta das ascídias

Exemplares da ascídia marinha Symplegma sp foram coletadas em banco natural na praia de Penha, Armação do Itapocoroy, em uma região de campo de cultivo de mexilhões do Campus V da Universidade do Vale do ltajaí, Estado de Santa Catarina, entre os meses de outubro e janeiro de 2004.

O material foi coletado junto a cordas e bóias e mantidas em monoblocos plásticos com água do mar, onde permaneceram por cerca de 4 horas. Em seguida, as ascídias foram levadas para o laboratório, onde se procedeu a triagem, a limpeza (areia, algas e outros organismos contaminantes), o enxágüe em água do mar filtrada (2x), seguida da identificação da ascídia.

O material devidamente identificado foi armazenado em saco plástico, etiquetado, imediatamente congelado e mantido à —20°C até o momento da liofilização. Após a liofilização, o material foi triturado até a obtenção de um fino pó, com auxilio de um moinho triturador (Severin, Inglaterra), sendo estocado a —20°C até sua utilização.

2.2 Células Sanguíneas

Eritrócitos de coelho foram obtidos de animais adultos e saudáveis mantidos em confinamento no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará.

Hemácias humanas do sistema ABO foram obtidas de doadores sadios junto ao Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE).

2.3 Reagentes

Tripsina, papaína, galactose, a-lactose, 13-lactose, lactulose, ácido galactoneuroamínico, D-galactosamina, N-acetil-galactosamina, metil-D-galactose, D-fucose, L-fucose, fucoidano, D-glicose, N-acetil-glicosamina, metil-a-D-glicopiranosídeo, D-manose, D-arabinose, mucina submaxilar de porco, carragenana, Coomassie brilliant blue G-250 e proteínas padrões para eletroforese foram obtidas da Sigma Chemical Co., St. Louis USA. DEAE-Sephacel, 3-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS) foram obtidos de Merk, Darmstadt, Alemanha.

Os demais reagentes utilizados no decorrer do trabalho foram de grau analítico, sendo obtidos comercialmente.

BIBLIOTECA SETORIAL)

2.4 Extração de proteínas X

.4

A extração das proteínas do material liofilizado foi realizada com tampões salinos em diferentes pHs (Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6; glicina 0,1 M, pH 2,6; pH 9,0; pH 11 e acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, todos contendo NaCI 0,15M) na proporção de 1:20 (m/v), com agitação constante por uma hora, a temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi centrifugada a 7000 x g por 20 minutos a 4°C em centrifuga Eppendorf (5810R). O precipitado foi desprezado e o sobrenadante, denominado de extrato total, foi filtrado em papel filtro e usado para etapas posteriores.

2.5 Determinação da Atividade Hemaglutinante

Os ensaios de atividade hemaglutinante nas diversas frações de

Symplegma sp foram realizados através de diluições seriadas (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,

1/32 etc) em tubos de ensaio, com tampão Tris-HCI 0,1M , pH 7,6 com NaCI 0,15M. A 200 1.11_ de cada diluição foi adicionado igual volume de uma suspensão de eritrócitos a 2%, levemente agitados e incubados a 37°C por 30 minutos. A mistura foi deixada em repouso por mais 30 minutos a temperatura ambiente e a aglutinação observada macroscopicamente, sendo o título expresso em unidade de hemaglutinação (UH/mL), que é o inverso da maior diluição da amostra que apresentou nítida aglutinação.

2.6 — Determinação de Proteína

As dosagens de proteínas solúveis dos extratos totais foram realizadas segundo o método de BRADFORD (1976), utilizando como padrão albumina sérica bovina (BSA). A absorção a 595 nm foi utilizada para determinação de proteínas nos extratos totais.

2.7 — Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares e Glicoproteínas

A inibição da atividade hemaglutinante foi determinada a partir da fração protéica contendo 4 Unidades de Hemaglutinação (U.H.). Este método consiste no preparo de diluições seriadas (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 etc), com NaCI 0,15 M dos açúcares e glicoproteínas em tubos de ensaio. A 100 gt_ de cada diluição foi adicionado igual volume de uma solução da lectina contendo 4 U.H. A mistura foi

deixada em repouso por 1 h e posteriormente foram adicionados 100 gL de uma suspensão de eritrócitos de coelho a 2% tratados com tripsina. Os tubos foram deixados em repouso a temperatura ambiente por 30 min e levados a uma estufa a 37°C por mais 30 min. O título de inibição da atividade hemaglutinante foi determinado como a maior diluição do açúcar ou glicoproteína capaz de inibir uma solução da lectina contendo 4 U.H.

2.8 Termoestabilidade

A estabilidade térmica da atividade hemaglutinante presente no extrato total foi determinada pela incubação em banho-maria de alíquotas da extrato total (1,0 mL) nas temperaturas de 40, 60, 80 e 100 °C por 30 minutos. Após cada período de incubação as amostras foram imediatamente transferidas para um banho de gelo e centrifugadas, sendo então determinada a atividade hemaglutinante. A amostra sem aquecimento foi utilizada como controle.

2.9 Efeito de cátions divalentes.

No teste de dependência de cátions divalentes foi realizada a diálise de alíquotas do extrato total em 5mM de EDTA. Após esse período as alíquotas foram dializadas contra água deionizada, para a retirada do EDTA. Posteriormente, as amostras foram submetidas a ensaio de atividade hemaglutinante, sendo duas alíquotas testada com adição de MnCl2 e CaCl2 10mM. O controle consistiu da determinação do título de aglutinação no extrato sem tratamento, utilizando-se de eritrócitos de coelho tratados com tripsina para todas as determinações.

2.10 Cromatografia em coluna de DEAE-Sephacel

O extrato total foi submetido à cromatografia de troca iônica em coluna de

DEAE-Sephacel. A coluna medindo 5,0 x 2,5 cm foi montada por gravidade, e em seguida, equilibrada com tampão Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6. Posteriormente, o extrato total foi aplicado na coluna e eluido com o tampão e as frações de 2 mL coletadas por gravidade. Após a eluição completa do pico não retido pela resina (PI), um segundo pico foi eluído pela adição de tampão Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6, com gradiente de NaCI de 0-2,0 M. As absorbâncias foram monitoradas a 280nm (espectrofotômetro Genesys) e determinada a atividade hemaglutinante. As frações ativas foram dialisadas contra água destilada, concentradas por liofilização e estocadas para posterior utilização.

2.11 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com SDS e p-mercaptoetanol

A fração obtida por HPLC foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida e [3-mercaptoetanol (SDS-PAGE), segundo o método descrito por LAEMMLI (1970), adaptado paro o uso de placas de vidro verticais. Para a montagem do gel, foi usada uma concentração de 4% de poliacrialmida em tampão tris-HCI 0,5 M, pH 6,8 e para o gel de separação uma concentração de 12,5% de poliacrilamida em tampão tris-HCI 1,5 M pH 8,8. A amostra liofilizada foi dissolvida em tampão tris-HCI 0,08M, pH 6,8, contendo glicerol 5%, SDS 2%, f3-mercaptoetanol 5% e 0,05% de azul de bromofenol. Em seguida a amostra foi incubada a 100°C por 10 min. Alíquotas de 15 I.11_ foram aplicadas em poços previamente feitos no gel de aplicação. A corrida eletroforética foi realizada em corrente constante de 40 mA, durante 3 horas. O coramento das proteínas foi realizado com uma solução de Coommasie Brilliant Blue R-250 a 1% em metanol:ácido acético:água (40:10:60), por um período de 12 horas. O descoramento foi realizado por uma solução de metanol:ácido acético:água

(40:20:40). Proteínas de massas moleculares conhecidas (albumina sérica bovina 66kDa; ovoalbumina 45kDa; anidrase carbonica 29kDa, inibidor da tripsina 20,1KDa, citocromo C 12,1KDa) foram utilizadas como padrões.

3. RESULTADOS

3.1. Estudos de extração protéica

Os resultados obtidos através do estudo da solubilidade da fração protéica, em diferentes tampões de extração, presentes no material liofilizado da ascídia marinha Symplegma sp estão apresentados na tabela 2.

Tabela 2: Determinação da melhor condição de extração da lectina da ascídia marinha Symplegma sp.

Solução tampão Normal Papaína Tripsina

UH/m L* UH/mL* UH/mL*

Glicina 0,1 M, pH 2,6

Acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0 4 8

Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6 4 32 32

Glicina 0,1 M, pH 9,0 4 32 16

Glicina 0,1 M, pH 11,0 4 32 32

UH = unidades de hemaglutinação; *= eritrócitos de coelho a 2%

3.2. Atividade hemaglutinante

O extrato protéico da ascídia marinha Symplegma sp apresentou atividade hemaglutinante preferencial contra eritrócitos de coelho nativos e tratados com enzimas proteolíticas (Tabela 3).

Tabela 3. Atividade hemaglutinante (UH/mL) do extrato total de Symplegma sp contra diferentes eritrócitos nativos e tratados com enzimas proteolíticas. Tratamento enzimático Nativos Tripsina Coelho 4 32 Humano A Humano B Humano O Eritrócitos Papaína 32

3.3. Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares e Glicoproteínas

Os resultados da inibição da atividade hemaglutinante no extrato total de

Symplegma sp mostraram que a lectina foi inibida apenas pela glicoproteína

mucina de porco, na concentração de 1,25 mg.mL-1. Os açúcares D-galactose, a-lactose, 3-lactose, lactulose, ácido galactoneuroamínico, D-galactosamina, N-acetil-galactosamina, metil-D-galactose, D-fucose, L-fucose, fucoidano, D-glicose, N-acetil-glicosamina, metil-a-D-glicopiranosídeo, D-manose, D-arabinose, carragenana não apresentaram inibição na concentração máxima testada (50 mM).

3.4. Termoestabilidade

A atividade hemaglutinante da lectina presente na fração protéica de

Symplegma sp, quando submetida ao tratamento térmico em temperaturas de 40, 60, 80 e 100°C por 30 minutos, está apresentada na tabela 4 e figura 2.

Tabela 4. Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante no extrato total de

Symplegma sp. Temperatura (°C) (UH/mL*) Controle 32 40 32 60 32 80 4 100 O

*= eritrócitos de coelho a 2% tratados com tripsina.

100 - 80 -Ç v 60 -

-±

Figura 2. Efeito da temperatura na atividade hemaglutinante no extrato total de

3.5. Efeito do EDTA e cátions divalentes na atividade hemaglutinante presente no extrato total de Symplegma sp.

Os resultados do efeito do EDTA e de cátions divalentes na atividade hemaglutinante presente do extrato total da ascídia marinha Symplegma sp estão apresentados na tabela 5.

Tabela 5. Efeito do EDTA e cátions divalentes na atividade hemaglutinante de

Symplegma sp.

Atividade hemaglutinante

Soluções (UH/mL*)

Extrato total 32

Extrato total + EDTA O

Extrato total + EDTA + CaCl2 32

Extrato total + EDTA + MnCl2 32

*= eritrócitos de coelho a 2% tratados com tripsina.

3.6. Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel.

A figura 3 apresenta o resultado da cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel do extrato total da ascídia marinha Symplegma sp. Um pico não retido (PI) foi eluído com Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6, não apresentando atividade hemaglutinante. O pico retido (PII) foi eluído com tampão Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6 em gradiente de sal de 0 a 2 M, contendo toda a atividade hemaglutinante.

1000

-

Figura 3. Cromatografia de troca iõnica em coluna de DEAE—Sephacel do extrato total da ascídia marinha Symplegma sp. O extrato total foi dialisado em tampão Tris-HCI 0,1 M, pH 7,6, e em seguida aplicado na coluna (5,0x2,5 cm). A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio por gravidade e eluída com gradiente de NaCI de O a 2 M no mesmo tampão. Foram coletadas frações de 2 mL e submetidas a atividade hemaglutinante, utilizando eritrócitos tripsinizados de coelho.

3.7. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS e

13-mercaptoetanol.

A determinação da massa molecular aparente da lectina da ascídia marinha

Symplegma sp foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença

de í3-mercaptoetanol (SDS-PAGE), utilizando o pico II oriundo da cromatografia de troca iõnica em DEAE-Sephacel. Após o resolução do gel observou-se uma banda protéica correspondente a massa molecular de 45 kDa (Figura 3).

1 2 3 66 kDa 45 kDa 29 kDa 20,1 kDa 12,1 kDa

Figura 4. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e 13-mercaptoetanol (SDS-PAGE) da lectina presente na ascidia marinha

Symplegma sp. Linha 1: marcadores moleculares: albumina sérica

bovina (66kDa); ovoalbumina (45kDa); anidrase carbonica (29kDa), inibidor da tripsina (20,1KDa), citocromo C (12,1KDa). Linha 2 ( sem presença de 3-mercaptoetanol) e linha 3 (com presença de

4. DISCUSSÃO

Embora as lectinas apresentem a característica comum de interagirem reversivelmente com carboidratos, elas apresentam características particulares, o que reflete em diferentes atividades biológicas, justificando assim a busca por novas lectinas, propiciando um imenso campo de aplicação biológica dessas proteínas, em diversas áreas da bioquímica, medicina, farmácia, agricultura etc. Além disso, está bem estabelecido que os organismos marinhos produzem compostos de baixo peso molecular, com características e atividades biológicas bastante peculiares, quase sempre expressando uma determinada atividade biológica em concentrações inferiores do que lectinas oriundas de outras fontes. Fica evidente, então, que a descoberta, o isolamento e a caracterização química, físico-quimica e biológica de novas lectinas oriundas de organismos marinhos se reveste de grande importância, na medida em que se possa encontrar novas lectinas com diferentes aplicabilidades.

No presente trabalho foi realizada a detecção, isolamento e caracterização parcial de uma lectina presente na ascídia marinha Symplegma sp.

Os resultados de atividade hemaglutinante frente a diferentes eritrócitos nativos e tratados com enzimas proteolíticas evidenciaram que os eritrócitos de coelho tratados com tripsina foram os mais efetivos.

Eritrócitos de coelho tratados com enzimas proteolíticas foram também os mais eficientes para a detecção de lectinas presentes em algas marinhas (AINOUZ, SAMPAIO, 1991, SAMPAIO et al., NAGANO et ai., 2002). Resultados semelhantes foram observados para a ascídia marinha colonial Bottyllus

schlosseri (BALLARIN et al., 1999), que exibiu também aglutinação preferencial

para eritrócitos de coelho tratados com tripsina.

Com relação aos eritrócitos humanos dos grupos ABO, nativos e tratados com enzimas proteolíticas, foi evidenciado que o extrato total de Symplegma sp não apresentou aglutinação positiva. Diferentemente, extratos protéicos de

B. schlosseri foram capazes de aglutinar hemácias humanas A, B e O, tratadas

com tripsina (BALLARIN et al., 1999).

Os estudos de eficiência de extração da fração hemaglutinante a partir da farinha de Symplegma sp, com diferentes tampões, mostraram que os tampões Tris-HCI 0,1 M pH 7,6 e glicina 0,1 M pH 11,0 foram os que apresentaram melhor efeito na solubilidade da fração lectínica, sendo o tampão de pH 7,6 o escolhido para as extrações posteriores tendo atividade especifica de 22, 52 UH/mgP e por ter pH próximo ao encontrado nas células. Entretanto, Belogortseva et ai. (1998) evidenciaram que a atividade hemaglutinante em extratos protéicos da ascídia marinha Didemnum ternatanum apresentava incremento da atividade hemaglutinante na faixa de pH de 3,0 a 6,0.

Ensaios de inibição da atividade hemaglutinante do extrato total, utilizando açucares simples e giicoproteínas, mostraram que a glicoproteina mucina de porco foi a única substância a inibir a atividade hemaglutinante, na concentração de 1,25 mg.m1j1.

Os resultados encontrados na literatura evidenciam que lectinas presentes em diversas espécies de ascídias foram inibidas por açucares simples. Por exemplo, D-galactose, 2-deoxi-D-galactose, metil-a-D-galactosídeo, D-lactulose foram potentes substâncias inibitórias da atividade hemaglutinante presente na ascídia Bottyllus schlosseri (BALLARIN et al., 1999). A inibição da atividade hemaglutinante por D-galactose e seus derivados foi também observada nas ascídias Styela clava (KELLY et al., 1992), Didemnum candidum e Halocynthia

pyriformis (VASTA et al., 1982) e D. ternatanum (MOLCHANOVA et al., 2005).

Entretanto, também foi observada a inibição por glicose e seus derivados para algumas dessas lectinas presentes em ascídias marinhas.

Embora a maioria dos trabalhos evidenciem que as lectinas presentes em ascídias são geralmente galactose-específicas, alguns autores encontraram também a inibição por D-glicose e seus derivados, tais como N-acetil-glicosamina, para extratos de D. ternatanum (MOLCHANOVA et al., 2005), H. pyriformis, inibida por N-acetil-glicosamina e D. candidum inibida por D-glicose (VASTA et al., 1982).

Inibição da atividade hemaglutinante por D-galactose, D-glicose e alguns de seus derivativos foi também observada por Sampaio et al. (2002) com a lectina da alga marinha vermelha Ptilota plumosa.

Belogortseva et al. (1998) relataram que extratos de D. ternatum, isolada por cromatografia de afinidade em coluna de ovalbumina, foram inibidos pelas glicoproteínas asialofetuina, ovalbumina, ovomucoide, IgG de coelho, asialo-IgG de coelho, sendo que a mais potente foi a glicoproteína ovomucoide, na concentração inibitório mínima de 0,001 mM. Posteriormente, Molchanova et al. (2005) reportaram o isolamento e caracterização de uma segunda lectina presente no eluato (fração não ligante) da cromatografia de afinidade em ovalbumina de

D. ternatum. Essa segunda lectina apresentou inibição pelas glicoproteínas

mucina sub-maxilar de boi (BSM), asialo-BSM, fetuina, e asialofetuina. A remoção de ácido siálico da BSM proporcionou um maior efeito inibitório, passando de 0,12 mM para 0,024 mM. Essa evidencia pode estar relacionada com a diminuição da carga negativa da forma asialo-BMS.

Como observado em nosso estudo, a inibição da atividade hemaglutinante de Symplegma sp por mucina de porco, foi também constatada em outro grupo de organismos marinhos, notadamente as macroalgas, sendo em alguns casos, o suporte para isolamento por cromatografia de afinidade em coluna de mucina-Sepharose 6B (Sampaio et al., 1998a, 1998b, 1999, Nascimento et al., 2006).

A lectina de Symplegma sp mostrou ser resistente a variação da temperatura, mantendo-se estável nas temperaturas de 20, 40 e 60 °C, durante 30 minutos, sem perda na atividade hemaglutinante. Entretanto, quando aquecida a 80 °C por 30 minutos, a atividade hemaglutinante decresceu cerca de 87,5% e sendo abolida totalmente a 100°C.

Em contraste, a lectina presente em Bottyllus schlosseri (BALLARIN et al., 1999), mostrou ser bastante sensível a variações de temperatura, chegando a perder cerca de 87,5% de sua atividade quando submetida ao aquecimento a 40 °C por 30 minutos e quase que totalmente abolida na temperatura de 80 °C.

Lectinas resistentes a variação de temperatura estão presentes em algas marinhas, como pode ser constatado com as lectinas de Bryothamnion triquetrum

e B. seaforthii (AINOUZ et al., 1995), Hypnea japonica (HORI et al., 2000) e

H. musciformis (NAGANO et al., 2002).

A maioria das lectinas isoladas de ascídias mostraram requer cátions divalentes para manutenção da sua atividade hemaglutinante (KELLY et al., 1992; BELOGORTSEVA et al., 1998; NAIR et al., 2000). Da mesma forma, o extrato total de Symplegma sp mostrou ser dependente de cátions divalentes para exercer sua atividade hemaglutinante. Dados disponíveis na literatura evidenciam que apenas as lectinas das ascídias Didemnum ternatanum (BELOGORTSEVA et al., 1998) e

Bottyllus schlosseri (BALLARIN et al., 1999) e a esponja marinha Halíclona cratera

(PAJIC et al., 2002), não apresentaram dependência de cátions.

Os estudos de isolamento da lectina de Symplegma sp. foram realizados através de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel. Quando o extrato total foi aplicado na coluna de DEAE obteve-se dois picos, sendo um não retido (PI), o qual não apresentou atividade hemaglutinante e outro retido (PII), com atividade hemaglutinante, e eluído da coluna com gradiente de NaCI 0-2,0 M. A fração que continha toda a atividade hemaglutinante foi então utilizada para a determinação da massa molecular aparente por eletroforese em gel de poliacrilamida e determinação do grau de pureza da preparação.

Como abordagem inicial utilizamos apenas a cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel devido aos bons resultados obtidos no isolamento em nosso laboratório de lectinas de algas marinhas. Esta metodologia de purificação de agiutininas de algas tem sido utilizada com eficiência para o isolamento de várias lectinas de organismos marinhos, como as macroalgas marinhas (AINOUZ et al., 1995; NAGANO et al., 2002; NASCIMENTO et al., 2006).

O perfil eletroforético da lectina da ascídia marinha Symplegma sp apresentou uma banda principal com massa molecular aparente de 45 kDa. Esse perfil se assemelha ao encontrado para a lectina da ascídia Styela plicata que apresentou massa molecular aparente de 43 kDa (NAIR et al., 2000). Entretanto, outras lectinas isoladas de diferentes espécies de ascídias tem apresentado baixo peso molecular aparente, como 17,5 kDa para a lectina de Styela clava (KELLY et al., 1992), 19 kDa para Bottyllus schlosseri (BALLARIN et al., 1999) e 14 kDa e

28kDa para as duas lectinas presentes em Didemnum ternatanum (BELOGORTSEVA et al., 1998 e MOLCHANOVA et al., 2005).

A importância do presente trabalho está relacionada com a descoberta de urna nova lectina encontrada em um organismo invertebrado marinho, a ascídia

Symplegma sp. Embora os resultado apresentados nesta monografia sejam

preliminares, nosso grupo tem como objetivo continuar com os trabalhos de isolamento, caracterização, estudos estruturais e cristalização da lectina, pois possibilitará um novo insumo biotecnológico para as áreas relacionadas com a aplicação biológica das lectinas, como as ciências biomédicas.

Com os avanços da biologia molecular, especificamente a clonagem de genes, ficou ainda mais interessante se descobrir novas lectinas com atividades biológicas específicas, pois a clonagem facilitaria a produção em larga escala dessas proteínas preservando assim as espécies do ambiente natural.

5. CONCLUSÃO

A ascídia marinha Symplegma sp apresentou uma lectina isolada parcialmente por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel, com especificidade pela glicoproteína mucina de porco, dependente de cátions divalentes, termoestável e com massa molecular aparente de 45 kDa.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AINOUZ, 1.L.; SAMPAIO, A.H.; FREITAS, A.L.P.; BENEVIDES, N.M.B.; MAPURUNGA, S. Comparative study on hemagglutinin from the red algae

Blyothamnion seaforthii

Bryothamnion triquetrum.

ARASON, G.J. Lectins as defence molecules in vertebrates and invertebrates. Fish & Shellfish lmmunology, London, v. 6, n. 4, p. 277-289, May 1996.

BALLARIN, L.; TONELLO, C.; GUIDOLIN, L.; SABBADIN, A. Purification and characterization of a humoral opsonin, with specificity for D-galactose, in the colonial ascidian

Bottyllus schlosseri

p.115-123, May 1999.

BELOGORTSEVA, N.; MOLCHANOVA, V.; GLAZUNOV, V.; EVTUSHENKO, E.; LUK'YANOV, P. N-Acetyl-D-glucosamine-specific lectin from the ascidian

Didemnum ternatanum.

Amsterdam, v.1380, n.2, p.249-256, Apr 1998.

COOPER, D.N.W. Galectinomics: finding themes in complexity. Biochimica

et Biophysica Acta — General Subjects, Amsterdam, v.1572, n.2-3,

p.209-231, Sep 2002.

DAHMS, N.M.; HANCOCK, M.K. P-type lectins. Biochimica et Biophysica

Acta — General Subjects, Amsterdam, v.1572, n.2-3, p.317-340, Sep 2002.

HORI, K.; MATSUBARA, K.; MIYAZAWA, K. Primary structures of two hemagglutinins from the marine red alga

Hypnea japonica.

Apr 2000.

KELLY, K.L.; COOPER, E.L.; RAFTOS, D.A. Purification and characterization of a humoral opsonin from the solitary urochordate

Styela clava.

KILPATRICK, D.C. Animal lectins: a historical introduction and overview.

Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, Amsterdam, v.1572,

n.2-3, p.187-197, Sep 2002.

LILLIE, B.N.; BROOKS, A.S.; KEIRSTEAD, N.D.; HAYES, M.A. Comparative genetics and innate immune functions of collagenous lectins in animais.

Veterinary Immunology and Immunopathology, Amsterdam, v.108, n.1-2,

p.97-110, Oct 2005.

LINDEL, T.; HOFFMANN, H.; HOCHGURTEL, M.; PAWLIK, J.R. Structure— activity relationship of inhibition fish feeding by sponge-derived and synthetic pyrrole-imidazole alkaloids. Journal of Chemical Ecology, New York, v.26, n.6, p.1477-1496, Jun 2000.

MARQUES, M.R.F.; BARRACCO, M.A. Lectins, as non-self-recognition factors, in crustaceans. Aquaculture, Amsterdam, v.191, n.1-3, p. 23-44, Nov 2000.

MOLCHANOVA, V.; CHIKALOVETS, I.; LI, W.; KOBELEV, S.; KOZYREVSKAYA, S.; BOGDANOVICH, R.; HOWARD, E.; BELOGORTSEVA, N. New GIcNAc/GaINAc-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum. Biochimica et Biophysica Acta - General

Subjects, Amsterdam, v.1723, n.1-3, p.82-90, May 2005.

MUNRO, M.H.J.; BLUNT, J.W.; DUMDEI, E.J.; HICKFORD, S.J.H.; LILL, R.E.; LI, S.; BATTERSHILL, C.N.; DUCKWORTH, A.R. The discovery and development of marine compounds with pharmaceutical potential. Journal

Biotechnology, Amsterdam, v.70, n.1-3, p. 15-25, Apr 1999.

NAGANO, C.S.; MORENO, F.B.M.B.; BLOCH Jr. C.; PRATES, M.V.; CALVETE, J.J.; SAKER-SAMPAIO, S.; FARIAS, W.R.L.; TAVARES, T.D.; NASCIMENTO, K.S.; GRANGEIRO, T.B.; CAVADA, B.S.; SAMPAIO, A.H. Purification and characterization of a new lectin from the red marine alga Hypnea musciformis. Protein and Peptide Letters, Hilversum, v.9, n.2, p.159-165, Apr 2002.

NAIR, S.V.; PEARCE, S.; GREEN, P.L.; MAHAJAN, D.; NEWTON, R.A.; RAFTOS, D.A. A collectin-like protein from tunicates. Comparative

Biochemistry and Physiology B - Biochemistry & Molecular Biology,

Oxford, v.125, n.2, p.279-289, Feb 2000.

NASCIMENTO, K.S.; NAGANO, C.S.; NUNES, E.V.; RODRIGUES, R.F.; GOERSCH, G.V.; CAVADA, B.S.; CALVETE, J.J.; SAKER-SAMPAIO, S.; FARIAS, W.R.L.; SAMPAIO, A.H. Isolation and characterization of a new agglutinin from the red marine alga Hypnea cervicomis, J. Agardh.

Biochemistry and Cell Biology, Ottawa, v.84, n.1, p.49-54, Feb 2006.

OSINGA, R.; TRAMPER, J.; WIJIFFELS, R.H. Cultivation of marines sponges for metabolites production: applications for biotechnology? Trends in

Biotechnology, Oxford, v.16, n.3, p.130-134, Mar 1998.

PAJIC, I.; KLJAJIC, Z.; DOGOVIC, N.; SLADIC, D.; JURAMIC, Z.; GASIC, M.J. A Novel lectin from the sponge Haliclona cratera: isolation,

characterization and biological activity. Comparative Biochemistry and

Physiology C-Toxicology & Pharmacology, New York, v.132, n.2,

p.213-221, Jun 2002.

SAMPAIO, A.H.; ROGERS, D.J., BARWELL, C.J. Isolation and characterisation of the lectin from the green marine alga Ulva lactuca Linnaeus. Botanica Marina, Berlin, v.41, n.4, p.427-433, Jul 1998a.

SAMPAIO, A.H.; ROGERS, D.J.; BARWELL, C.J. A galactose-specific lectin from the red marine alga Ptilota filicina. Phytochemistry, Oxford, v.48, n.5, p.765-769, Jul 1998b.

SAMPAIO, A.H.; ROGERS, D.J.; BARWELL, C.J.; SAKER-SAMPAIO, S.; COSTA, F.H.F.; RAMOS, M.V. A new isolation procedure and further characterisation of the lectin from the red marine alga Ptilota serrata. Journal

Applied Phycology, Dordrecht, v.10, n. 6, p.539-546, 1998c.

SAMPAIO, A.H.; ROGERS, D.J.; BARWELL, C.J.; SAKER-SAMPAIO, S.; NASCIMENTO, K.S.; NAGANO, C.S.; FARIAS, W.R.L. New affinity procedure for the isolation and further characterization of the blood group B specific lectin from the red marine alga Ptilota plumosa. Journal Applied

Phycology, Dordrecht, v.14, n.6, p.489-495, Dec 2002.

STORER, T.I.; USINGER, R.L.; STEBBINS, R.C.; NYBAKKEN, J.W. Filo

chordate: cordados inferiors. In: . Zoologia geral. 5. ed. São

Paulo: Companhia Editora Nacional, 2002. cap.27, p. 569-571.

VAN DAMME, E.J.; GOOSSENS, K.; SMEETS, K.; VAN LEUVEN, F.; VERHAERT, P.; PEUMANS, W.J. The major tuber storage protein of araceae species is a lectin. - characterization and molecular - cloning of the lectin from Arum maculatum L. Plant Physiology, Rockville, v.107, n.4, p.1147-58, Apr 1995.

VAN DAMME, E.J.M.; PEUMANS, W.J.; BARRE, A.; ROUGÉ, P. Plant lectins: a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles. Criticai Reviews in Plant

Sciences, Boca Raton, v.17, n.6, p.575-692, 1998.

VASTA, G.R.; AHMED H.; ODOM E.W. Structural and functional diversity of lectin repertoires in invertebrates, protochordades and ectothermic vertebrates. Current Opinion in Structural Biology, London, v.14, n.5, p.617-630, Oct 2004.

VASTA, G.R.; QUESENBERRY, M.; AHMED, H.; LEARY, N.O. C-type lectins and galectins mediate innate and adaptive immune functions: their roles in the complement activation pathway. Developmental and Comparative

lmmunology, Oxford, v.23, n.4-5, p.401-420, Jun 1999.

VASTA, G.R.; WARR, G.W.; MARCHALONS,J.J Tunicate lectins: distribution and specificity. Comparative Biochemistry and Physiology Pad B