Avalição de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia pré-invasiva e invasiva de colo uterino.

Avaliação de Neutrófilos Circulantes em

Pacientes com Neoplasia Pré-invasiva e

Invasiva de Colo Uterino

PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

UBERABA–MG

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

Avaliação de Neutrófilos Circulantes em Pacientes com

Neoplasia Pré-invasiva e Invasiva de Colo Uterino

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia, sub-área Patologia Ginecológica e Obstétrica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro como requisito para obtenção do título de Mestre em Patologia Ginecológica e Obstétrica.

ALUNO: PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA

UBERABA – MG 2006

Capa: Lençóis Maranhenses

Foto: Cristian Knepper e Márcio Vasconcelos Criação: VCR Comunicação e Marketing

Catalogação na fonte por Beatriz Gabellini Alves - Biblioteca da UFTM

F411a Fernandes Junior, Paulo Cesar

Avaliação de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia pré-invasiva e invasiva de colo uterino. / Paulo Cesar Fernandes Junior. – – 2006.

106f.: tab.; graf.; fig.

Tese de Mestrado em Patologia Ginecológica e Obstétrica – Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba-MG, 2006.

Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Martins Tavares Murta 1. NEOPLASIA DE COLO UTERINO. 2. NEUTRÓFILOS. 3. ESTADIAMENTO. 4. FUNÇÃO CELULAR. I. Título. II. Murta, Beatriz Martins Tavares.

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Apoio Financeiro:

• Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM)

• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

Local de desenvolvimento do trabalho:

• Ambulatório de Oncologia Ginecológica e Mastologia da Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Escola da UFTM

• Laboratório da Disciplina de Farmacologia do Departamento de Ciências Biológicas da UFTM

iii

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO

TÍTULO: AVALIAÇÃO DE NEUTRÓFILOS CIRCULANTES EM PACIENTES COM NEOPLASIA PRÈ-INVASIVA E INVASIVA DE COLO UTERINO

AUTOR: PAULO CESAR FERNANDES JUNIOR

ORIENTADORA: PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDDIE FERNANDO CANDIDO MURTA

APROVADO COMO PARTE DAS EXIGÊNCIAS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM PATOLOGIA (SUB-ÁREA PATOLOGIA GINECOLÓGICA E OBSTÉTRICIA) PELA COMISSÃO EXAMINADORA:

PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA-MG

PROFª. DRª. WIRLA MARIA DA SILVA CUNHA TAMASHIRO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP-CAMPINAS-SP

PROFª. DRª. RENATA MARGARIDA ETCHEBEHERE

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO – UFTM/UBERABA

DATA DA REALIZAÇÃO: 02 DE AGOSTO DE 2006

_________________________________________ PRESIDENTE DA COMISSÃO EXAMINADORA PROFª. DRª. BEATRIZ MARTINS TAVARES MURTA

-iv

Dedico Este Trabalho Especialmente:

Aos meus pais Paulo Cesar e Maria Emília,

Pelo apoio e, apesar da distância, pelo amor, cumplicidade, carinho...

Aos meus orientadores, Dra. Beatriz e Dr. Eddie, pela confiança e exemplos de atuação profissional...

v

AGRADECIMENTOS

À Professora Beatriz Martins Tavares Murta, pessoa ímpar na orientação e apoio recebidos durante a realização deste trabalho. Ainda, pela atenção, amizade e confiança dispensadas e, sobretudo, pela seriedade e profissionalismo que tanto contribuíram para minha formação.

Ao Professor Eddie Fernando Candido Murta, pela co-orientação, pelo aprendizado no contexto clínico e cirúrgico das pacientes participantes de nosso trabalho e pelo exemplo como médico e professor pesquisador.

Às mulheres, pacientes e voluntárias, pela participação e especialmente, por acreditarem na ciência e assim contribuir para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos funcionários do Laboratório da Disciplina de Farmacologia, Januário Barbosa dos Santos Júnior e Douglas Cobo Micheli, pelo auxílio na realização das técnicas e no dia-a-dia no laboratório e, principalmente, pela amizade e dedicação.

Às secretárias da Disciplina de Farmacologia e da Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia, Beatriz Cibele Resende Gerolin, Kelly Cristina de Araújo Pantaleão e Viviane Beatriz Rodrigues Matos, pelo auxílio em várias etapas deste trabalho, pelo companheirismo, dedicação e grande amizade.

À professora Maria Angélica, por quem tenho um carinho muito especial, exemplo daqueles que possuem o dom da arte de ensinar.

vi

Aos colegas do curso de Pós-Graduação, em especial, Cristiana Bernadelli, pela paciência, respeito e aprendizado.

Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, pela oportunidade de conhecimento nas mais diversas áreas da ciência.

À Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Disciplinas de Ginecologia e Obstetrícia e Farmacologia da UFTM, pela acolhida e pela estrutura que permitiu o desenvolvimento da pesquisa.

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS ABREVIATURAS E SÍMBOLOS RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO ...21

1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco ...21

1.2. Resposta Inflamatória ...24

1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória ...28

2. HIPÓTESE ...32

3. OBJETIVOS ...34

4. PACIENTES E MÉTODOS ...36

4.1. Pacientes ...36

4.2. Tratamento ...37

4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes ...38

4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos ...38

4.4.1. Coleta de Sangue ...38

4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulantes ...39

4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia ...40

4.4.4. Ensaio de Fagocitose ...46

4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagentes e Drogas ...49

viii 4.5.2. Corantes e Reagentes ...50 4.5.3. Drogas e Citocinas ...50 4.5.4. Zimosan ...51 4.6. Análise Estatística ...51 5. RESULTADOS ...53 5.1. População de Estudo ...53 5.2. Avaliação do Leucograma...53

5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilos entre Controles e Pacientes ...58

5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento Inicial e avançado ...61

5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento Inicial antes e após tratamento ...63

5.6. Avaliação da Função Fagocítica ...65

6. DISCUSSÃO ...68

7. CONCLUSÃO ...79

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...81 ANEXOS

ix

LISTA DE FIGURAS E PRANCHAS

Figura 1. Tipos de Câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não melanoma, na população brasileira ... 22

Figura 2. Representação espacial das taxas brutas de incidência por 100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a Unidade da Federação (Neoplasia Maligna do Colo Uterino)... 22

Figura 3. Evento Celular da Inflamação ... 25

Figura 4. Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo anticoagulante. ... 40

Figura 5. Microcâmara de quimiotaxia... 42

Figura 6. Curva Dose-Efeito do Número de Neutrófilos Emigrados ... 45

Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ... 55

Figura 8. Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV (Avaliação quantitativa) ... 56

x

totais) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ... 57

Figura 10. Presença ou não de neutrofilia (n° absoluto de neut rófilos >6.500/mm3) em pacientes com neoplasia de colo uterino dos grupos NIC/MICRO e INV ... 57

Figura 11. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com neoplasia de colo uterino em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4, e IL-8... 59

Figura 12. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle e de pacientes com

neoplasia de colo uterino comparando-se a resposta aos quimioatraentes (10-7M) ... 60

Figura 13. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO e INV em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. .... 61

Figura 14. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes dos grupos NIC/MICRO INV, comparando-se a resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. ... 62

Figura 15. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO antes e cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 ... 63

xi

cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8... 64

Figura 17. Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo uterino e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de acordo com o estadiamento ... 65

Figura 18. Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO nos tempos antes e cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico.. ... 66

Prancha 1. Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) quimiotaxia de neutrófilos-10x-400-vezes.jpg); (foto 2) quimiotaxia de neutrófilos-50x-2000-vezes.jpg; (foto 3) quimiotaxia de neutrófilos -100x-4000-vezes.jpg) ... 43

Prancha 2. Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld. (Foto 1) fagocitose em neutrófilos -10x-jpg.jpg; (foto 2) fagocitose em neutrófilos-100x-jpg.jpg; (foto 3) fagocitose em neutrófilos -100x.-jpg.jpg ... 47

xii

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BSA – soroalbumina bovina °C – grau Celsius

CO2 – dióxido de carbono

FIGO – Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia fMLP – formil-metil-leucil-fenilalanina

g – grama

GM-CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos HE – Hospital Escola

HPV – papilomavírus humano IF – índice fagocítico

IFN – interferon IL – interleucina

INCA – Instituto Nacional do Câncer l – litro

LT – leucotrieno

µl – microlitro

µm – micrômetro M – molar

MCP – proteína quimiotática para monócitos

M-CSF – fator estimulador de colônia de monócitos mg – miligrama

MHC – complexo de histocompatibilidade principal min – minuto

xiii

ml – mililitro

n – número da amostra

NIC – neoplasia intraepitelial cervical NK – natural killer

P.A. – para análise

PBS – solução salina tamponada com fosfato pH – potencial hidrogeniônico

q.s.p. – quantidade suficiente para RNL – relação neutrófilo-linfócito

TGF – fator de crescimento e transformação TNF – fator de necrose tumoral

UFTM – Universidade Federal do Triângulo Mineiro UI – Unidade internacional

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RESUMO

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O câncer de colo uterino é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres no mundo. No Brasil, o número de novos casos esperados para 2006 é de 19.260 (MS/INCA-2005). Uma vez que os neutrófilos apresentam atividade anti-tumoral e que funções de leucócitos circulantes podem estar alteradas em pacientes com câncer de diferentes origens, nosso objetivo foi verificar se pacientes com neoplasia de colo uterino, em diferentes estadiamentos, apresentam alterações no número e/ou função quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes e o efeito do tratamento sobre esses parâmetros. Foram estudadas 21 mulheres sadias voluntárias (Grupo Controle) e 23 pacientes, sendo 11 diagnosticadas como NIC alto grau ou carcinoma microinvasivo (Grupo NIC/MICRO) e 12 como carcinoma invasivo (Grupo INV) por meio de biópsia. De acordo com o estadiamento, as pacientes foram submetidas à cirurgia (grupo NIC/MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O leucograma das pacientes no momento do diagnóstico mostrou neutrofilia e aumento da relação neutrófilo/linfócito (RNL) na maioria das pacientes em estadiamento avançado, em oposto ao observado no grupo em estadiamento inicial. A quimiotaxia de neutrófilos purificados do sangue periférico foi avaliada em microcâmara em resposta aos estímulos (10-7M)fMLP, LTB4 e IL-8 comparados a migração aleatória

(RPMI). As pacientes (Grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos estímulos quimiotáticos, porém menor para LTB4 e IL-8 comparado ao grupo

controle (p<0,05). Ainda, foi observado que as pacientes do grupo INV tiveram quimiotaxia reduzida a todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo NIC/MICRO (p<0,01). Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias), houve aumento da migração dos neutrófilos em resposta aos estímulos fMLP e LTB4 em

pacientes do grupo NIC/MICRO (p<0,05). A função fagocítica foi avaliada utilizando zimosan sensibilizado como partícula fagocítica e os resultados apresentados por

xvi

meio do índice fagocítico (IF). Não foi observada diferença no IF entre controles e pacientes, porém, considerando o estadiamento, observou-se uma redução da capacidade fagocítica em pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO (p=0,015). Após o tratamento cirúrgico, não foi observada variação estatisticamente significante quanto ao IF em pacientes do grupo NIC/MICRO (n=6). Conclui-se que o estadiamento mais avançado no câncer cervical é fator determinante para o aumento do número de neutrófilos circulantes e a redução da função dessas células. A retirada da lesão aumentou a capacidade de migração dos neutrófilos frente aos estímulos quimiotáticos, sugerindo a produção de mediadores inibitórios circulantes pelas células tumorais. A neoplasia de colo uterino mesmo em estadiamento pré-invasivo pode ser considerada como uma doença com repercussões sistêmicas.

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ABSTRACT

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Cervical cancer is the second most common type of cancer in women worldwide. In Brazil, the number of new cases awaited for 2006 is 19.260 (MS/INCA-2005). Considering that neutrophils may present anti-tumor activity and that sistemic leucocyte functions can be altered in cancer patients, our aim was to verify if patients with cervical neoplasia, at different tumor stage, present alterations in the number and/or chemotactic and phagocytic function of circulating neutrophils and the effect of treatment on these parameters. It was enrolled twenty one healthy women (Control Group) and 23 patients, being 11 diagnosed as cervical intraepithelial neoplasia grade III or microinvasive carcinoma (NIC/MICRO Group) and 12 as invasive carcinoma (INV Group) through biopsy. According to tumor stage, patients were submitted to surgery (NIC/MICRO Group) or chemotherapy (group INV). Leucogram of patients upon diagnosis showed neutrofilia and increased neutrophil/lymphocyte ratio in most patients of advanced tumor stage (INV Group), in opposite to results found in patients at early stage group (NIC/MICRO Group). The chemotactic activity of blood peripheral neutrophils was evaluated in microchemotaxis chamber assay towards the chemotactic stimuli (10-7M) fMLP, LTB4 and IL-8, compared to random

migration (RPMI). Total patient group had significant neutrophil migration in response to the chemotactic stimuli, however lesser for LTB4 and IL-8 compared to controls

(p<0,05). Moreover, it was observed that patients from INV group had reduced neutrophil migration to all the chemotactic stimuli compared with NIC/MICRO group (p<0,01). After surgical treatment (around 30 days) neutrophil migration was increase towards fMLP and LTB4 in patients of NIC/MICRO group (p<0,05). Phagocytic

function was evaluated using sensitized zimosan as phagocytic particle, and the results were presented as the phagocytic index (IF). It was not observed differences

xix

in IF between controls and patients. However considering tumor stage, a reduction of phagocytic activity was observed in patients of INV group compared to NIC/MICRO group (p=0,015). After surgical treatment in pacients of NIC/MICRO group (n=6) no significant differences were observed compared to time upon diagnosis. It can be concluded that advanced tumor stage in cervical cancer is a determinant factor for the increase in the number of circulating neutrophils and reduction in the function of these cells. The withdrawal of neoplasia cells increased the capacity of neutrophil migration suggesting the production of circulating mediators by tumor cells. Cervical cancer, even at initial stages, can be seen as an illness with systemic findings.

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INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

1.1. Neoplasia de Colo Uterino – Aspectos Gerais e Fatores de Risco

O câncer de colo uterino destaca-se dos demais tumores malignos do trato genital feminino pela maior freqüência e por levar a óbito, grande número de mulheres em idade ainda jovem (GUSBERG; RUNOWICZ, 1991). Em 2006, estima-se o aparecimento de 237.480 novos casos de câncer não especificados em mulheres. Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), espera-se, para o ano de 2006, cerca de 20.000 novos casos de câncer do colo uterino (Figura 1). Na região sudeste, existe uma estimativa de 7.970 novos casos de câncer de colo de útero para este ano, sendo que, no Rio Grande do Sul, se observa a maior incidência por 100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006 (30,9) (Figura 2).

Dentre os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, destaca-se a infecção pelo papilomavírus humano (HPV), pois, em 99,7% das neoplasias invasivas do colo uterino, é detectado DNA do HPV (PEREYRA; PARELLADA, 2003).

Fonte: MS/INCA-2005

Figura 2: Representação espacial das taxas brutas de incidência de neoplasia maligna do

colo uterino por 100.000 mulheres, estimadas para o ano de 2006, segundo a Unidade da Federação.

Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2006, exceto pele não melanoma, na

Segundo um estudo controlado, o fator mais convincente relacionado com o risco de câncer do colo do útero foi a presença dos tipos de HPV 16, 18, 31 e 33 (ELUF-NETO et al., 1994).

Além do HPV, outros fatores de risco são identificados para o câncer de colo de útero, tais como: baixas condições sócio-econômicas, início precoce da atividade sexual, multiplicidade de parceiros, idade precoce do primeiro parto, tabagismo (diretamente relacionado à quantidade de cigarros fumados), higiene íntima inadequada e uso prolongado de contraceptivos orais. A prevenção primária do câncer do colo de útero pode ser realizada por meio do uso de preservativos durante a relação sexual, uma vez que a prática de sexo seguro é uma das formas de evitar o contágio pelo HPV (MS/INCA, 2006).

A principal estratégia utilizada para detecção precoce da doença (prevenção secundária), no Brasil, é pela realização do exame de Papanicolaou. Este teste, combinado com o teste de HPV colhido por profissional de saúde, mostrou ser a estratégia mais efetiva (maior número de casos detectados) para a detecção precoce da neoplasia de colo uterino, em um estudo de custo-efetividade realizado pelo INCA. Porém, pelo seu alto custo, torna-se incompatível com a realidade brasileira (INCA, 2006).

A transformação maligna do epitélio do colo uterino, normalmente, é um processo lento, que passa pelos estádios (facultativo) de displasia e carcinoma in

situ (neoplasia intraepitelial cervical, NIC I-III) até o carcinoma invasivo. A maioria

das neoplasias cervicais invasivas (90-95%) deriva do epitélio escamoso; 2-8% do epitélio colunar. Por definição, a neoplasia intraepitelial cervical (NIC) é pré-invasiva e limitada ao epitélio. Existem três estádios de desenvolvimento. O primeiro é a

transição de NICII a NICIII, quando a possibilidade de reversão da displasia é menor. O segundo é o início do crescimento invasivo (estádio IA1) com invasão estromal microscópica inferior a 5 mm de profundidade e 7 mm de largura do estroma cervical subjacente. A terceira é a transformação de microcarcinoma (estádio IA1) para doença franca (estádio IB), invadindo além do útero, mas não a parede pélvica ou o terço inferior da vagina, quando a lesão desenvolve potencial metastático (SELLORS; SANKARANARAYANAN, 2003).

Em fases muito precoces da invasão do estroma, a neoplasia do colo uterino pode não dar origem a sintomas manifestos ou características clínicas e, portanto, é conhecida como doença invasiva pré-clínica. O câncer cervical (estádio IB-IV), com freqüência, apresenta um ou mais dos seguintes sintomas: hemorragia intermenstrual, hemorragia pós-coito, fluxos menstruais mais intensos, corrimento seroso purulento excessivo, corrimento de odor fétido, cistite recorrente, urgência miccional e aumento da freqüência urinária, dor nas costas e dor abdominal no quadrante inferior. Em estádios avançados, as pacientes podem apresentar falta de ar devido à anemia grave, uropatia obstrutiva, edema de membros inferiores, hematúria, obstrução intestinal e caquexia (SELLORS; SANKARANARAYANAN, 2003).

1.2. Resposta Inflamatória

A inflamação é uma resposta do organismo a diversos agentes lesivos, como, por exemplo, microorganismos, queimaduras, trauma físico ou células tumorais (DEJANA, CORADA; LAMPUGNANI, 1995).

Os neutrófilos, também denominados leucócitos polimorfonucleares, graças aos seus núcleos morfologicamente diferenciados e multilobulados, são os mais numerosos dentre os granulócitos presentes no sangue periférico. Estas células respondem rapidamente aos estímulos quimiotáticos, realizam funções fagocitárias e são a população celular principal na resposta inflamatória (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 1995). Após sua migração, os neutrófilos são ainda capazes de liberar mais mediadores, o que promove a amplificação da resposta inflamatória (HEIT et al., 2002). O recrutamento de neutrófilos para o local da inflamação envolve uma seqüência de eventos (ativação, rolamento, adesão e transmigração), coordenada por moléculas de adesão expressas na superfície dos leucócitos e das células endoteliais, envolvidas na interação leucócito-endotélio (Figura 3).

O início do rolamento dos neutrófilos é mediado pela ligação reversível das glicoproteinas selectinas encontradas tanto no neutrófilo como no endotélio (SPERTINI et al., 1991; KADONO et al., 2002). Devido à expressão de outras glicoproteínas na superfície dos leucócitos, denominadas de integrinas, que

Modificado de Holgate ST, Church MK, Lichtenstein LM. — Allergy. 2end _{edition. London: Mosby}

Endotélio Tecido Fagocitose Quimiotaxia Corrente sangüínea Atividade microbicida TNF-αααα

IL-8 ÓxidoÓxido Nítrico Nítrico

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reconhecem moléculas de adesão endoteliais (família das imunoglobulinas), ocorre a ligação de alta afinidade dos leucócitos ao endotélio. A Mac-1 é reconhecida como a integrina mais relevante na maioria dos modelos de resposta inflamatória com participação de neutrófilos, com sítios de ligação específicos nas células endoteliais (WAGNER; ROTH, 1999). Entre as células endoteliais, ocorre a transmigração do neutrófilo, que, para chegar ao local de injúria tecidual, se move em direção ao gradiente quimiotático representado por um excesso de mediadores (DITTMAR et

al., 2000).

A migração celular é um evento chave na resposta inflamatória de qualquer etiologia. Os leucócitos circulantes migram em resposta aos mediadores inflamatórios liberados no sítio de lesão, como os componentes do sistema complemento (C5a), os produtos derivados da via das lipooxigenases (LTB4) e as

quimiocinas (COUSSENS; WERB, 2002). Grande parte destes agentes quimiotáticos, IL-8, fMLP, LTB4 e C5a, ligam-se aos neutrófilos por receptores

transmembrana específicos. Estes receptores ativam as proteínas G triméricas, nos neutrófilos, iniciando, deste modo, a sinalização que permitirá a essas células migrarem para os sítios inflamatórios. As quimiocinas, subdivididas em quatro famílias (CXC, CC, C e CX3C), de acordo com a seqüência de resíduos de cisteína, podem controlar a evolução natural da resposta inflamatória, recrutando células efetoras específicas. Desta forma, a contínua produção de citocinas no sítio inflamatório torna-se importante para o desenvolvimento de uma doença crônica, incluindo uma neoplasia (WAHL; KLEINMAN, 1998).

Sabe-se que, para manter outras funções importantes dos leucócitos, como a fagocitose e atividade microbicida, é essencial que sua função quimiotática esteja preservada (MacFADDEN, SAITO; PRUZANSKI, 1985). Em pacientes com sepse

observa-se redução da função quimiotática de neutrófilos comparado a voluntários sadios, maior no grupo de pacientes não sobreviventes, sugerindo que essa disfunção contribui para o prognóstico da doença (TAVARES-MURTA et al., 2002). Em doenças infecciosas, o papel de neutrófilos como células de defesa é bem documentado. Em pacientes com AIDS, as drogas antiretrovirais aumentam a quimiotaxia de neutrófilos e monócitos e reduzem a incidência de infecções (MASTROIANNI et al.,1999).

A fagocitose é um evento celular complexo no qual partículas são reconhecidas, internalizadas e eliminadas. Consistindo na primeira linha de defesa do organismo na remoção de microorganismos, esse processo envolve o reconhecimento de antígenos por receptores de superfície nas células fagocíticas, iniciando a polimerização e a internalização de partículas externas ou organismos no fagossomo (ALLEN; ADEREM, 1996). Além de microorganismos, a remoção de células em apoptose ocorre por fagocitose (FRANK, WHITE; EZEKOWITZ, 1999). Na superfície do fagócito, são expressos vários receptores capazes de reconhecer e decodificar seus ligantes cognatos, presentes na superfície de agentes infecciosos e células apoptóticas, e desencadear o englobamento (STUART; EZEKOWITZ, 2005). Neste processo, ocorre interação de receptores de membrana com moléculas específicas ligantes, localizadas na superfície de partículas. O complexo ligante-receptor estimula a reorganização local do citoesqueleto de actina submembranosa, que provê força para a internalização das partículas (KWIATKOWSKA; SOBOTA, 1999). A fagocitose é seguida pela fusão do fagossomo com lisossomos contendo enzimas digestivas, formando o fagolisossomo, seguindo-se a degradação da partícula. O remodelamento e a homeostase do número de células são outras funções para as quais a fogocitose foi adaptada. Desta forma, o excesso de células

ou células danificadas, removidas durante o desenvolvimento, está diretamente relacionado com a apoptose ou morte programada de células (STUART; EZEKOWITZ, 2005).

1.3. O Câncer e a Resposta Inflamatória

Os tumores malignos, ou câncer, crescem de modo descontrolado, invadem os tecidos normais e, freqüentemente, desencadeiam metástases e crescem em sítios distantes do tecido de origem. O câncer pode surgir, a partir de quase todos os tecidos do organismo. Os derivados de células epiteliais, denominados carcinomas, são os tipos mais comuns. Sarcomas são tumores malignos dos tecidos mesenquimatosos surgindo a partir de células como fibroblastos, células musculares e adiposas. A presença de infiltrados de células mononucleares, compostos de linfócitos T, células NK e macrófagos circundando diversos tumores, assim como o achado freqüente de proliferação linfocitária (hiperplasia) nos linfonodos de drenagem dos sítios de crescimento tumoral sugere que os tumores podem ser imunogênicos. Uma função fundamental do sistema imune é o reconhecimento e a destruição de células malignas denominadas “clones mutantes”, antes que elas cresçam e originem tumores. Vários tipos de antígenos tumorais estudados são compartilhados por diferentes tumores, sendo denominados antígenos associados a tumor, podendo ser encontrados em células tumorais e em células normais (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 1995).

Os macrófagos são células potencialmente importantes da imunidade anti-tumoral, pois são capazes de lisar, preferencialmente, as células tumorais e não as células normais. Na resposta imune contra o HPV, tanto na região cervical como na

circulação periférica, o ambiente pode tornar-se favorável à transformação de neoplasias, o que permite a progressão de lesões intraepiteliais cervicais para carcinoma cervical (AHMED et al., 2002). A imunidade local é considerada fator importante no desenvolvimento do carcinoma cervical. Em tecidos tumorais, encontra-se infiltrado de leucócitos no próprio estroma (NEGUS et al., 1997) e nos líquidos neoplasicos (MONTOVANI et al., 1997).

Vários estudos têm demonstrado que as citocinas podem modular o desenvolvimento tumoral (SRIVANI; NAGARAJAN, 2003). Síntese de RNAm para IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 e proteína quimiotática para macrófago (MCP-1) foi detectada em diversas linhagens de células de carcinoma cervical (HAZELBAG et al; 2001). Acredita-se que os neutrófilos ativados pela IL-8 tenham papel tumoricida (SCHROEDER et al., 1990), além de produzir mediadores capazes de reduzir o crescimento tumoral (LLOYI., OPPENHEIN, 1992). Por outro lado, a IL-8 pode promover a migração de células tumorais (WANG et al., 1990) e, em associação com os fatores de crescimento de endotélio vascular (VEGF) e derivado de plaquetas (PDGF), produzido por células malignas ou pelo estroma, participar na angiogênese do carcinoma cervical (FUJIMOTO et al., 2000). Em pacientes com câncer de mama, foi demonstrada, já no sítio tumoral, a correlação positiva entre o número de macrófagos infiltrantes, grau de vascularização e prognóstico da doença (LEEK et al,. 1996).

Sabe-se que, no infiltrado de células inflamatórias tumorais, macrófagos e neutrófilos desenvolvem papel importante na progressão e disseminação de vários tipos de tumores (BALKWILL; MONTOVANI, 2001; COUSSENS; WERB, 2002). Funções celulares podem estar alteradas em pacientes com câncer de diferentes origens, já no momento do diagnóstico (LUKAC et al., 1994; GEBHARD et al., 2000).

Além disso, durante o tratamento, as drogas quimioterápicas podem alterar funções de leucócitos circulantes (HUMPHREYS et al., 1993, MENDONÇA et al., 2006).

Dependente do sistema citotóxico clássico, o efeito anti-tumoral dos neutrófilos têm sido sugerido como um importante mecanismo na depuração de células tumorais (KOGA et al., 2004). Uma vez que os neutrófilos podem exercer atividade anti-tumoral por meio de diferentes mecanismos (KIM et al., 2000), o conhecimento de alterações de funções de leucócitos, em determinadas doenças ,possibilita a correção farmacológica desses defeitos, o que pode ser benéfico para o prognóstico da doença.

2. HIPÓTESE

Pacientes com neoplasia de colo uterino devem apresentar alterações no número e funções de neutrófilos, variáveis de acordo com o estadiamento do tumor.

3. OBJETIVOS

3.1. Verificar se ocorrem alterações no número e/ou na função quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes em pacientes com neoplasia de colo uterino, em estadiamento inicial ou avançado da doença, antes do início de qualquer tratamento.

4. PACIENTES E MÉTODOS

4.1. Pacientes

Foram estudadas pacientes com neoplasia de colo uterino, independente do estadiamento, não submetidas a tratamento anterior, atendidas no Ambulatório de Oncologia Ginecológica do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (HE/UFTM). O diagnóstico foi realizado por meio de história, exame clínico e ginecológico - incluindo toque retal para a avaliação de paramétrios, citologia oncótica, colposcopia e biópsia de colo uterino. O diagnóstico citopatológico seguiu a classificação de BETHESDA (KURMAN; SOLOMON, 1994) e a de Richart (1990) (SILVEIRA; PESSINI, 2000), sendo as lâminas avaliadas pelos citopatologistas da instituição (HE-UFTM). As análises das biópsias guiadas por colposcopia foram efetuadas pelo serviço de Patologia Cirúrgica do HE-UFTM.

Para estadiamento e avaliação pré-tratamento, foram utilizados Raio X de tórax; eletrocardiograma; ultrassonografia de abdome total e pélvico; tomografia computadorizada de abdome total e tórax; rotina de sangue, incluindo hemograma, eletrólitos, uréia, creatinina, transaminases, bilirrubina (total e frações), glicemia de jejum, proteínas (total e frações), urina I e urocultura com antibiograma.

Foram considerados critérios de exclusão, as pacientes submetidas a tratamento anterior ou em estado de imunossupressão (diagnóstico de doença imunossupressora ou uso de medicamentos).

microinvasivo (grupo MICRO) ou carcinoma invasivo (grupo INV). Posteriormente, foram agrupadas em estadiamento inicial (grupo NIC/MICRO) ou avançado (grupo INV).

Os controles foram mulheres adultas (≥ 18 anos) voluntárias sadias, isto é, sem doença diagnosticada, sem uso de medicamentos imunossupressores, e com citologia cervicovaginal normal nos últimos 12 meses, abordadas quando da realização dos experimentos.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos em 19 de dezembro de 2003 (Protocolo número 445). O “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Participação em Pesquisa” (Anexo J) foi lido e assinado pelas participantes ou seu responsável, quando de acordo em participar da pesquisa.

4.2. Tratamento

Conforme o estadiamento, as pacientes foram submetidas a tratamento cirúrgico (grupo NIC e MICRO) ou quimioterapia (grupo INV). O tratamento cirúrgico consistiu de um dos seguintes procedimentos: 1) conização: procedimento diagnóstico, mas que, em muitos casos, promove uma terapia definitiva, descrito como sendo a retirada de um cone de tecido do colo uterino contendo toda a lesão; 2) histerectomia simples: retirada do útero; 3) cirurgia de Wertheim-Meigs: remoção do útero, ovários, tubas uterinas, paramétrios, linfadenectomia pélvica.

O tratamento quimioterápico foi realizado com cisplatina (100 mg/m2) em infusão intravenosa, durante 2 h no primeiro dia (D1), associada ao 5-fluorouracil

(5-FU, 1000 mg/m2 por dia) em infusão contínua do primeiro ao quinto dia (D1 a D5). O intervalo entre os ciclos foi cerca de 21 dias.

Nas pacientes submetidas ao tratamento cirúrgico, foi efetuada uma segunda coleta de sangue, cerca de 30 dias após a cirurgia, para nova avaliação.

4.3. Avaliação do Número de Neutrófilos Circulantes de Pacientes

Em todas as pacientes, foi realizado o leucograma no diagnóstico, como parte da rotina de avaliação pré-tratamento. Mediante este exame, foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) Relação neutrófilo/linfócito (RNL), que é a divisão entre número absoluto de neutrófilos e linfócitos. A RNL foi calculada para cada paciente e determinada se <5 ou ≥5 (WALSH et al., 2005). 2) Presença ou não de neutrofilia, definida como número de neutrófilos absolutos >6.500/mm3 ou ≥70% do número de leucócitos totais, de acordo com o critério do laboratório no qual foi efetivado o exame (Laboratório de Patologia Clínica HE-UFTM).

4.4. Avaliação da Função Quimiotática e Fagocítica de Neutrófilos Circulantes

4.4.1. Coleta de Sangue

As amostras de sangue foram coletadas em 2 tempos: 1) no diagnóstico, antes de qualquer tratamento; 2) cerca de 30 dias após o tratamento cirúrgico. A coleta foi feita utilizando material descartável e esterilizado, seguindo os princípios de assepsia. Em cada tempo, foi coletada 1 amostra de sangue (5 ml) em tubo

contendo anti-coagulante (heparina 100 UI/ml), empregada para o ensaio de quimiotaxia e fagocitose de neutrófilos. O mesmo procedimento foi realizado para a coleta de sangue das mulheres voluntárias sadias, em um único tempo.

4.4.2. Obtenção e Preparo dos Neutrófilos Circulantes

Os neutrófilos presentes no sangue venoso coletado de pacientes e controles foram isoladas pelo meio Histopaque (densidade 1,119), utilizado de acordo com as instruções do fabricante (Sigma Chemical, St. Louis, MO). O sangue coletado foi adicionado a um tubo contendo Histopaque, na proporção de 5,0 ml sangue/4,5 ml Histopaque. Os tubos foram centrifugados (150 x g), em temperatura ambiente, até a completa separação das bandas celulares (Figura 4). A camada de neutrófilos foi coletada com o auxílio de micropipeta, e, a seguir, as células foram lavadas com meio de cultura RPMI-1640 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) contendo soroalbumina bovina (BSA) 0,01%, por meio de centrifugação (150 x g, 10 min, temperatura ambiente), procedimento que foi repetido outras duas vezes. Logo após, as células foram ressuspensas em 1,0 ml do mesmo meio.

Figura 4: Separação de leucócitos a partir do sangue total contendo

anti-coagulante. A) Tubos de centrífuga mostrando as camadas das subpopulações de leucócitos isolados. B) Esquema demonstrativo da purificação de neutrófilos.

Foi realizada a contagem total e diferencial das células purificadas. Para a contagem total, 20 µl da solução de células foram adicionados à solução de Turk (400 µl), e as células foram contadas em câmara de Neubauer. A contagem diferencial foi feita em lâmina preparada com 20 µl da solução de células em citocentrífuga (150 x g, 5 min, Cito-Spin). A lâmina foi corada (corante de Rosenfeld) e observada em microscópio de luz com objetiva em óleo de imersão (100x). Foram contadas 100 células, diferenciando-se os tipos celulares – mononucleares, neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Uma solução final de neutrófilos foi preparada contendo 1,0 x 106 neutrófilos/ml RPMI-BSA.

4.4.3. Ensaio de Quimiotaxia

A quimiotaxia foi efetuada em microcâmara de 48 poços (Neuro Probe, Cabin John, MD), separados por membrana de policarbonato com poros de 5 µm de

A B PLASMA MONUCLEARES NEUTRÓFILOS HISTOPAQUE HEMÁCIAS

diâmetro (Figura 5). Na câmara inferior, foram colocados 28,5 µl do meio de cultura RPMI-BSA 0,01% (controle) ou de um dos estímulos quimiotáticos: fMLP, LTB4 ou

IL-8, diluídos em RPMI-BSA. Uma solução (50 µl) de células purificadas (1,0 x 106 células/ml) foi colocada na câmara superior. O ensaio foi feito em triplicata para cada uma das amostras (paciente e controle). As câmaras foram incubadas por 60 min, a 37ºC e 5% CO2. Em seguida, a membrana de policarbonato foi removida, fixada e

corada (kit de coloração Hema 3 Stain set, Biochemical Sciences, Bridgeport, NJ).

O número de células emigradas para a parte inferior do filtro foi contado (objetiva 100x) em 10 campos aleatórios (Prancha 1). Os resultados foram expressos com base no número de neutrófilos por campo. As células que migraram em direção aos estímulos quimiotáticos foram consideradas como migração direcionada, e as células que migraram em direção ao RPMI foram caracterizadas como de controle (migração randomizada ou aleatória).

Foi realizado um ensaio inicial para avaliar o grau de migração de neutrófilos induzida por diferentes concentrações dos estímulos quimiotáticos fMLP, LTB4 ou

IL-8. Para isso, foram utilizados neutrófilos obtidos de voluntárias sadias e foi quantificada a resposta quimiotática de neutrófilos frente a diferentes concentrações (10-8, 10-7 e 10-6 M) das substâncias quimioatraentes. A Figura 6 mostra o número de neutrófilos emigrados em resposta ao fMLP, LTB4 e IL-8, sendo que a

concentração de 10-7 M, que promoveu efeito máximo, foi selecionada para uso nos demais experimentos.

Figura 5: Microcâmara de quimiotaxia: os

neutrófilos (106 células/ml) foram colocados na câmara superior e os estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8 na câmara inferior. 50 µl de neutrófilos Membrana de policarbonato 28,5µl de RPMI ou estímulos (fMLP, LTB4 e IL-8, 10-7_M)

Prancha 1

Prancha 1

Foto 1. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-10X-400-VEZES.jpg

Foto 2. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS-50X-2000-VEZES.jpg

Foto 3. QUIMIOTAXIA DE NEUTRÓFILOS -100X-4000-VEZES.jpg

Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.

(M) RPMI 10-8 10-7 10-6 0 10 20 30 40 50 60 fM LP (M ) N°°°° D E N E U T R Ó F IL O S / C A M P O




RPMI 10-8 10-7 10-6 0 10 20 30 40 50 N°°°° D E N E U T R Ó F IL O S / C A M P O LTB4




RPMI 10-8 10-7 10-6 0 10 20 30 40 50 60 IL-8




N°°°° D E N E U T R Ó F IL O S / C A M P O fMLP (M) LTB4 (M)

Figura 6. Curva Dose-Efeito do Número de

Neutrófilos Emigrados. As barras indicam a migração de neutrófilos, obtidos de voluntárias, em resposta a diferentes concentrações (10-6, 10-7 ou 10-8M) de fMLP, LTB4 ou IL-8. O meio

de cultura RPMI foi utilizado como controle. *p<0,01, **p<0,001 comparado ao RPMI (ANOVA + Teste de Bonferroni).

4.4.4. Ensaio de Fagocitose

Para o ensaio de fagocitose, os neutrófilos purificados foram utilizados na concentração de 2,0 x 106/ml, e o zimosan sensibilizado (com plasma normal fresco a 10%) foi utilizado como partícula fagocítica. As partículas de zimosan foram pesadas e diluídas em PBS (1,0 ml). Desta suspensão, foram pipetados 10 µl e colocados em 1,0 ml de plasma (10%) e incubados (37ºC, 5% CO2) sob agitação

para sensibilização das partículas. Esta mistura foi centrifugada (150 x g, 10 min) e adicionada sobre o concentrado de células (1,0 ml). A solução de células e partículas foi incubada durante 60 min (37ºC, 5% CO2), e, após esse tempo, as

células foram citocentrifugadas e coradas. Foram contadas 100 células em cada lâmina, com e sem fagocitose, como também o número de partículas fagocitadas (Prancha 2). Os resultados foram expressos por meio do Índice Fagocítico (IF):

Prancha 2

1

2

Prancha 2

Foto 1. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -10x-jpg.jpg

Foto 2. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS-100x-jpg.jpg

Foto 3. FAGOCITOSE EM NEUTRÓFILOS -100X.-jpg.jpg

Neutrófilos purificados coloração de Rosenfeld.

4.5. Preparo de Meios de Cultura, Soluções, Reagentes e Drogas

4.5.1. Meios de Cultura e Soluções

a) Meio de cultura RPMI-1640 simples, com glutamina, sem bicarbonato de sódio:

RPMI 1640 (Sigma) 10,4 g

Bicarbonato do sódio (Merck) 2,2 g

Água bidestilada e deionizada q.s.p. 1,0 l

O pH do meio foi acertado para 7,45 e a solução foi filtrada (filtros de Milipore 0,22 µm) e armazenada em geladeira antes do uso.

b) Meio de cultura RPMI-1640 contendo BSA 0,01%:

O meio de cultura foi preparado conforme descrito no item a, acrescido de BSA fração V (Sigma), na concentração de 0,01g/100 ml, imediatamente antes do uso, e esterilizado por filtros Milipore 0,22 µm antes do uso.

c) Solução salina tamponada com fosfato (PBS):

Cloreto de sódio P.A. (Merck) 80,0 g

Cloreto de potássio P.A. (Merck) 2,0 g Fosfato de sódio dibásico P.A. (Merck) 11,5 g Fosfato de potássio monobásico P.A. (Merck) 2,0 g Água bidestilada e deionizada q.s.p. 1,0 l

O pH da solução final foi acertado para 7,45 com NaOH 0,1 N, e a solução autoclavada (127°C) antes do uso.

4.5.2. Corantes e Reagentes

a) Corante pancrômico de Rosenfeld

Giemsa-azul-eosina-azul de metileno 97 mg May-Grunwald-eosina-azul de metileno 53 mg

Metanol (Merck) 100 ml

Após o preparo, o corante foi filtrado e estocado em temperatura ambiente.

b) Solução de Turk

Ácido acético glacial P.A. (Merck) 20,0 ml

Azul de metileno (Merck) 0,5 g

Água bidestilada e deionizada q.s.p. 1,0 l

c) Azul de Tripan

Azul de Tripan (Reagen) 100 mg

PBS q.s.p. 100 ml

4.5.3. Drogas e Citocinas

a) fMLP (Sigma): a solução-mãe foi preparada na concentração de 5mg/ml, diluída em 10% de DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma) e água estéril. A solução utilizada nos experimentos foi, a seguir, diluída em RPMI-BSA.

b) LTB4 ou IL-8 (Sigma): foram diluídos em RPMI-BSA para obter a

4.5.4. Zimosan

Partículas de zimosan, na concentração de 5,0 mg/ml, foram diluídas em 1,0 ml de PBS e estocadas em geladeira antes do uso.

4.6. Análise Estatística

Os resultados foram avaliados mediante o programa SigmaStat 2.0 e apresentaram distribuição não paramétrica. As diferenças entre dois grupos e três ou mais grupos não pareados foram comparadas por meio do teste de Mann-Whitney e teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn, respectivamente. Diferenças entre dois grupos pareados (pré e pós-tratamento) foram comparadas por meio do teste de Wilcoxon. Os resultados foram expressos por medianas e percentis, valores mínimo e máximo. A significância estatística foi estabelecida em p<0,05.

5. RESULTADOS

5.1. População de Estudo

Foram avaliadas 23 pacientes com neoplasia de colo uterino, registrando idade (média ± DP) de 47,8 ± 13,8 anos, sendo a média menor no grupo apresentando estadiamento inicial (42 ± 12 anos) e maior no grupo com diagnóstico de estádio mais avançado (53 ± 14 anos), porém sem diferenças estatisticamente significativas. Os controles foram 21 mulheres adultas, voluntárias, na faixa etária de 34,9 ± 9,5 anos. Dentre as pacientes, 11 tiveram diagnóstico de NIC e/ou carcinoma microinvasivo e 12 apresentaram carcinoma invasivo.

5.2. Avaliação do Leucograma

A análise deste exame, no momento do diagnóstico, mostrou que apenas uma (10%) paciente do grupo NIC/MICRO apresentou RNL ≥5, comparado a 8 (67%) pacientes do grupo INV (p<0,05) (Figura 7). Em 22 pacientes o leucograma foi avaliado, sendo que 1 paciente do grupo NIC/MICRO não apresentava leucograma no momento do diagnóstico.

Analisando o número absoluto de neutrófilos, foi observado aumento nas pacientes do grupo INV comparado ao grupo NIC/MICRO (p<0,05) (Figura 8). A análise de outros parâmetros de neutrofilia mostrou que quando esta foi considerada como número absoluto de neutrófilos ≥70% do número de leucócitos totais, 9 pacientes (90%) em estadiamento inicial não apresentaram neutrofilia, enquanto que

em mais de 80% das pacientes do grupo INV a neutrofilia foi observada (Figura 9). Considerando neutrofilia como número absoluto de neutrófilos ≥6.500/mm3, de acordo com o padrão do Laboratório de Patologia Clínica da UFTM, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos NIC/MICRO e INV (Figura 10).

Figura 7. Relação neutrófilo-linfócito (RNL) em pacientes com neoplasia de

colo uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A RNL foi determinada pela divisão entre o número absoluto de neutrófilos e linfócitos apresentados no leucograma. *p<0,05 (Teste exato de Fisher).

NIC/MICRO

INV

67%

33%

RNL

RNL

≥≥≥≥

5 (n=1)

< 5 (n=9)

≥≥≥≥

5 (n=8)

< 5 (n=4)

(n=10)

(n=12)

0

5000

10000

15000

20000

25000

NIC/M ICRO

INV

N

d

e

a

b

s

o

lu

to

d

e

n

e

u

tr

ó

fi

lo

s

Figura 8: Número absoluto de neutrófilos em pacientes com neoplasia de colo uterino em estadiamento inicial (NIC/MICRO) e avançado (INV). p<0,05 (Mann-Whitney)

Figura 9. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo

uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida como número de neutrófilos ≥70% em relação ao número de leucócitos totais apresentado no leucograma. *p<0,01 comparado aos grupos NIC/MICRO e INV (Teste exato de Fisher).

Figura 10. Presença ou não de neutrofilia em pacientes com neoplasia de colo

uterino dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12). A neutrofilia foi definida com número absoluto de neutrófilos >6.500/mm3 determinado pelo leucograma. p>0,05 (Teste exato de Fisher).

NIC/MICRO 90% 10% Sem neutrofilia (n=9) Com neutrofilia (n=1) INV 83,3% 16,6% Sem neutrofilia (n=2) Com neutrofilia (n=10) NIC/MICRO 70% 30% Sem neutrofilia (n=7) Com neutrofilia (n=3) INV 33% 67% Sem neutrofilia (n =4) Com n eutrofilia (n =8)

5.3. Avaliação da Função Quimiotática de Neutrófilos entre Controles e Pacientes

A função quimiotática foi avaliada em 22 pacientes e 15 controles, sendo que, em cada ensaio, foi utilizado pelo menos 01 controle. Não foi possível realizar o ensaio de quimiotaxia na paciente de número 11 pelo número insuficiente de células obtidas na purificação (Anexo D).

As pacientes (grupo total) apresentaram migração de neutrófilos frente aos estímulos quimiotáticos (fMLP, LTB4, IL-8), comparada à migração aleatória (RPMI),

assim como o grupo controle (Figura 11). Porém, quando comparados cada estímulo entre os grupos, essa migração foi menor para LTB4 e IL-8 nas pacientes

RPMI fMLP LTB4 IL-8 0 5 10 15 20 25

A

B

Figura 11. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos controle (n=15,painel A) e de pacientes com neoplasia de colo uterino (n=22, painel B) em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e

IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,001) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

0 5 10 15 20 25 Controle s Pacie nte s RPMI N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20 25 fMLP N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20 25
LTB4 N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20 25
IL-8 N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o

Figura 12. Quimiotaxia de neutrófilos nos grupos

controle (n=15) e de pacientes com neoplasia de colo uterino (n=22) comparando-se a resposta aos quimioatraentes (10-7M). As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%,e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao grupo controle (Mann-Whitney).

5.4. Avaliação da Função Quimiotática de acordo com o Estadiamento

Tanto as pacientes do grupo NIC/MICRO quanto do grupo INV apresentaram significativa migração de neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8,

comparada à migração aleatória (RPMI) (Figura 13).

Entretanto quando comparados cada estímulo entre os grupos, foi observado que as pacientes do grupo INV tiveram migração de neutrófilos reduzida frente a todos os estímulos quimiotáticos comparado ao grupo NIC/MICRO (Figura 14).

RPMI fMLP LTB4 IL-8 0 5 10 15 20


Grupo NIC/MICRO A N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o RPMI fMLP LTB4 IL-8 0 5 10 15 20


Grupo INV B N o. d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o

Figura 13. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo NIC/MICRO

(n=10, painel A) e INV (n=12, painel B) em resposta ao RPMI e aos estímulos quimiotáticos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,001) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

0 5 10 15 20 NIC/M ICRO INV RPMI N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20
fMLP N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20
LTB4 N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o 0 5 10 15 20
IL-8 N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o

Figura 14. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes

dos grupos NIC/MICRO (n=10) e INV (n=12), comparando-se a resposta aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as

medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,01 comparado ao grupo controle (Mann-Whitney).

5.5. Avaliação da Função Quimiotática nas Pacientes com Estadiamento Inicial antes e após tratamento

Após o tratamento cirúrgico (cerca de 30 dias) manteve-se preservada a migração dos neutrófilos frente aos estímulos fMLP, LTB4 e IL-8 em pacientes do

grupo NIC/MICRO, da mesma forma como observado no momento do diagnóstico (Figura 15). Porém a comparação de cada estímulo quimiotático entre os grupos, mostrou que houve um aumento da migração dos neutrófilos em resposta ao fMLP e LTB4 , quando comparada ao tempo pré-cirurgia (Figura 16).

RPMI fMLP LTB4 IL-8 0 10 20 30


PRÉ A N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o RPMI fMLP LTB 4 IL-8 0 10 20 30


PÓS B N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o

Figura 15. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes do grupo

NIC/MICRO (n=4) antes (PRÉ, painel A) e cerca de 30 dias após (PÓS, painel B) tratamento cirúrgico, em resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8. As barras representam as

medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskal-Wallis (p<0,05) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao respectivo RPMI.

Figura 16. Quimiotaxia de neutrófilos em pacientes

do grupo NIC/MICRO (n=4) antes e cerca de 30 dias após tratamento cirúrgico, comparando-se a resposta ao RPMI e aos estímulos (10-7M) fMLP, LTB4 e IL-8.

As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. *p<0,05 comparado ao tempo pré-tratamento (teste de Wilcoxon).

RPMI 0 5 10 15 20 25 Pré-tratamento Pós-tratamento N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o fMLP 0 5 10 15 20 25
N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o LTB4 0 5 10 15 20 25
N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o IL-8 0 5 10 15 20 25 N o . d e n e u tr ó fi lo s /c a m p o

5.6. Avaliação da Função Fagocítica

O índice fagocítico foi avaliado em 17 pacientes, sendo 09 do grupo NIC/MICRO e 08 do grupo INV, e em 18 controles.

A função fagocítica avaliada, utilizando zimosan sensibilizado como partícula fagocítica, não demonstrou diferença entre controles e pacientes (Figura 17, Painel esquerdo), mas, considerando o estadiamento, o IF foi menor em pacientes do grupo INV, comparado ao grupo NIC/MICRO (p=0,015) (Figura 17, Painel direito). Não foi observada variação significativa quanto ao IF antes e após cirurgia em pacientes do grupo NIC/MICRO (Figura 18).

CONTROLES PACIENTES NIC/M ICRO INV

0 10 20 30 40 50 60 70 Pacientes
(n=18) (n=17) (n=9) (n=8) Ín d ic e F a g o c ít ic o

Figura 17. Índice fagocítico (IF) de controles e pacientes com neoplasia de colo

uterino (painel esquerdo) e pacientes divididas em grupos NIC/MICRO e INV, de acordo com o estadiamento (painel direito). As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo. Kruskall-Wallis (p<0,05) seguido do teste de Dunn: *p<0,05 comparado ao grupo NIC/MICRO.

PRÉ PÓS 0 10 20 30 40 50 60 70 Ín d ic e F a g o c ít ic o

Figura 18. Índice fagocítico do grupo NIC/MICRO (n=6) nos tempos

antes (PRÉ) e cerca de 30 dias após (PÓS) tratamento cirúrgico. As barras representam as medianas (linha horizontal) e os percentis 25% e 75%, e as linhas verticais os valores mínimo e máximo.

6. DISCUSSÃO

Alterações de funções celulares em pacientes com câncer já são estudadas há algum tempo e constituem-se em tema de controvérsias. Trabalhos específicos em câncer de colo uterino são escassos, desta forma, no presente estudo, foram avaliadas as funções quimiotática e fagocítica de neutrófilos circulantes de pacientes com neoplasia de colo uterino, comparando a mulheres voluntárias sem doença diagnosticada, utilizadas como grupo controle.

A incidência do câncer de colo uterino já é evidenciada em mulheres na faixa etária de 20 a 29 anos, e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico, geralmente, na faixa etária de 45 a 49 anos (MS-INCA, 2006). Em acordo, neste estudo, a idade média do grupo total de pacientes foi de 48 anos, sendo a média menor no grupo apresentando estádio inicial (43 anos) e maior no grupo com diagnóstico em estádio mais avançado (53 anos). Porém tem sido observado aumento da incidência de estadiamentos mais avançados, assim como as lesões precursoras, em pacientes mais jovens (HERBST et al., 1992; PALO et al., 2002). Trabalhos clássicos demonstram que o câncer do colo uterino é mais agressivo em mulheres jovens, com idade inferior a 40 anos (CHAVES et al., 1984).

Recentemente, tem sido proposto que o microambiente tumoral é capaz de controlar, por meio da liberação de mediadores específicos, como as quimiocinas, a migração de leucócitos e outras funções desempenhadas por essas células após sua chegada no sítio tumoral, sendo essencial para o início e a regulação da resposta inflamatória/imune (FINE et al., 2001; BALKWILL; MANTOVANI, 2001).