preocupação comum aos industriais que os utilizam nos seus programas de controlo de qualidade, assim como das entidades governamentais que precisam deles nas suas actividades de fiscalização.
Neste trabalho pretende-se desenvolver modelos de análise para produtos específicos, nomeadamente sumos de fruta. A escolha destes produtos baseia-se no conhecimento das necessidades destes sectores da indústria agro-alimentar.
Para a análise, é utilizada metodologia instrumental rápida como a espectroscopia vibracional (infravermelho próximo e médio) e a espectrofotometria de ultravioleta/visível. A extracção de informação dos sinais instrumentais complexos requereu o desenvolvimento de modelos de calibração e discriminação com o recurso a software de análise multivariada.
Uma vez desenvolvidos os modelos, esta tecnologia de análise instrumental/análise multivariada permitiu analisar os alimentos para determinar quantitativamente componentes, detectar adulterações, verificar a autenticidade e globalmente fazer previsões sobre a qualidade.
palavras-chave: sumos, fruta, sumos de fruta, Infravermelho médio, FT-IR, ATR, açúcares, ácidos, edulcorantes, adulteração, contaminação, envelhecimento, espectroscopia, PCA, PLS1.
industry that use them in their programs of control and quality, as well as for the government entities that need them in their control activities.
In this work the main goal comes to develop models for specific products, namely fruit juices. The choice of these products is based on the knowledge of the needs of these sectors of the agro-food industries.
For the analysis, fast instrumental methodology will be used as the vibracional spectroscopy (near and mid infrared) and ultraviolet/visible spectrometry. The information extraction of the complex instrumental signals require the development of calibration models and discrimination with the help of software of multivariate analysis Once developed the models, this instrumental analysis/ multivariate analysis technology will allow to analyse the foods to determine compounds qualitatively, to detect adulterations, to verify authenticity and to do forecasts about their quality.
Keywords: juice, fruits, fruit juices, infrared, FT-IR, ATR, sugars, acids, edulcorants, adulteration, contamination, ageing, spectroscopy, PCA, PLS1, chemometric.
Páginas
CAPÍTULO I – Introdução 1
I.1 – Introdução 1
I.2 – Objectivos 1
I.3 – Espectroscopia de Infravermelho 2
I.3.1 – Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier (FT-IR)
2
I.3.2 – O espectrómetro de FT-IR 5
I.3.3 – Modos de aquisição dos espectros 6
I.4 – Espectrofotometria de Ultravioleta/Visível 7
I.5 – Análise Multivariada 10
I.5.1 – Centrar 11
I.5.2 – Padronizar 12
I.5.3 – Análise em componentes principais 12
I.5.4 – Método PCA 13
I.6 – Frutos e sumos de frutos 14
I.6.1 – Composição geral e principais alterações dos frutos 14
I.6.2 – Hidratos de carbono (ou açúcares) 19
I.6.4 – Vitaminas 25
I.6.5 – Compostos fenólicos 27
I.6.6 – Pigmentos 29
I.6.6.1 – Clorofilas 29
I.6.6.2 – Antocianinas 30
I.6.6.3 – Carotenóides 32
I.6.7 – Compostos Voláteis 34
I.6.8 – Proteínas 34
I.6.9 – Lípidos 35
I.6.10 – Sais minerais 35
1.6.11 – Composição geral dos sumos de fruta 36
I.7 – Principais parâmetros estudados 37
I.7.1 – Determinação dos açúcares redutores 37
I.7.2 – Determinação do ácido ascórbico 38
I.7.3 – Determinação do ácido cítrico 39
I.7.4 – Detecção de edulcorantes 39
I.7.5 – Envelhecimento acelerado dos sumos 40
CAPÍTULO II – Material e Métodos 43
II.1 – Material 43
II.1.1 – Amostras – Sumos 43
II.1.1.1 – Sumos diversificados 43
II.1.1.2 – Amostras de sumos para o estudo da adulteração e/ou contaminação de sumos em sumos e construção de desenho triangular
44
II.1.1.3 – Amostras para estudo de envelhecimento dos sumos 44
II.1.2 – Análise por FTIR 44
II.1.2.1 – Aquisição dos espectros 44
II.1.2.2 – Análise em componentes principais 44
II.2 – Métodos e procedimentos 45
II.2.1 – Determinação dos açúcares redutores 45
II.2.1.1 – Por espectroscopia de infravermelho médio FT-IR 45
II.2.1.1.1 – Plano experimental 45
II.2.1.1.2 – Aquisição dos espectros de infravermelho e calibração
47
II.2.1.2 – Por reacção enzimática 48
II.2.2 – Determinação do teor do ácido ascórbico em sumos 48
II.2.2.2 – Por kit enzimático 49
II.2.3 – Determinação do teor de ácido cítrico em sumos 49
II.2.3.1 – Por espectroscopia de infravermelho FT-IR 49
II.2.3.2 – Por kit enzimático 50
II.2.4 – Detecção dos edulcorantes em sumos por FT-IR 50
II.2.5 – Detecção de adulteração e/ou contaminação de sumos com sumos – Análise por FT-IR
51
II.2.5.1 – Desenho triangular experimental de misturas de sumos 51
II.2.5.2 – Mistura de sumo de limão em sumo de ananás 52
II.2.5.3 – Aquisição de espectros de infravermelho 52
II.2.6 – Estudo do envelhecimento acelerado de sumos por FT-IR 52
II.2.6.1 – Procedimento 52
II.2.6.2 – Aquisição de espectros de infravermelho 53
CAPÍTULO III – Resultados e Discussão 55
III.1 – Quantificação de açúcares 55
III.1.1 – Desenho triangular e calibração de açúcares por FT-IR: glucose, frutose e sacarose
55
III.1.1.2 – Análise multivariada do desenho triangular experimental 56
III.1.1.3 – Calibração dos açúcares por PLS1 60
III.1.1.4 – Previsão dos açúcares em sumos por PLS1 – FT-IR 64
III.1.2 – Calibração de açúcares (glucose, frutose e sacarose) com o conjunto 1 de sumos
67
III.1.2.1 – Espectros de infravermelho de alguns sumos 67
III.1.2.2 – Análise multivariada – PCA do conjunto 1 de sumos 69
III.1.2.3 – Calibração dos açúcares com sumos 73
III.1.2.4 – Modelo de calibração dos açúcares com 12 sumos 77
III.1.2.5 – Previsão dos açúcares em sumos: comparação entre valores estimados por PLS1-FT-IR e valores estimados enzimaticamente
81
III.2 – Determinação da adulteração e/ou contaminação de sumos com sumos por FT-IR
83
III.2.1 – Detecção de misturas de sumos: PCA do conjunto 1 de sumos analisados e de uma mistura equitativa de sumos de lima-limão, de maçã e de alperce
83
III.2.2 – Espectros de infravermelho de sumos de limão, ananás e manga 85
III.2.3 – Análise multivariada do desenho triangular experimental construído com sumos de limão, ananás e manga
86
III.2.4 – Calibração e estimativa da adulteração e/ou contaminação dos sumos por PLS1-FT-IR
III.2.5 – Calibração e estimativa da adulteração e/ou contaminação com 20 soluções de misturas de sumos
91
III.2.6 – Previsão da percentagem dos sumos 93
III.2.7 – Contaminação de sumo de limão em sumo de ananás 95
III.2.7.1 – Análise multivariada da contaminação de sumo de limão em sumo de ananás (concentrações de 0 a 100 % (v/v) de sumo de limão)
95
III.2.7.2 – Calibração da percentagem de sumo de limão em sumo de ananás
97
III.3 – Quantificação do ácido ascórbico 98
III.3.1 – Calibração do ácido ascórbico com padrões por PLS1-FT-IR 98
III.3.2 – Calibração do ácido ascórbico com sumos por PLS1-FT-IR 100
III.4 – Quantificação do ácido cítrico por FT-IR 101
III.4.1 – Calibração do ácido cítrico por PLS1-FT-IR com padrões 101
III.4.1.1 – Modelo de regressão com padrões 101
III.4.1.2 – Previsão do ácido cítrico em sumos por PLS1-FT-IR 103
III.4.2 – Determinação do ácido cítrico com sumos por PLS-FT-IR 104
III.4.2.1 – Modelo de previsão do ácido cítrico com sumos 104
III.4.2.2 – Calibração do ácido cítrico com 15 sumos por PLS1-FT-IR 105
III.5 – Detecção de edulcorantes em sumos 107
III.6 – Estudo espectroscópico do envelhecimento acelerado de sumos 109
III.6.1 – Espectros de infravermelho de sumos envelhecidos 109
III.6.2 – Análise em componentes principais (PCA) 111
III.6.3 – Espectros de infravermelho de sumos armazenados a 50 ºC 113
III.6.4 – Análise em componentes principais dos sumos armazenados à 50ºC
115
III.6.5 – Calibração do tempo de envelhecimento em sumos 117
III.6.6 – Previsão e variação dos açúcares nos sumos envelhecidos por PLS1-FT-IR
119
III.6.7 – Previsão e variação do ácido ascórbico nos sumos envelhecidos por PLS1-FT-IR
122
III.6.8 – Previsão e variação do ácido cítrico nos sumos envelhecidos por PLS1-FT-IR
123
CAPÍTULO IV – Conclusões 125
IV.1 – Determinação dos açúcares 125
IV.2 – Detecção de contaminação e/ou adulteração 125
IV.3 – Detecção de edulcorantes 125
IV.5 – Determinação do ácido cítrico 126
IV.6 – Determinação do envelhecimento dos sumos 127
Páginas
Tabela 1 – Regiões do infra-vermelho e respectivos intervalos de comprimento de onda e número onda.
3
Tabela 2 – Composição em açúcares presentes em alguns frutos. 22
Tabela 3 – Ácidos orgânicos em alguns frutos. 23
Tabela 4 – Antocianinas de alguns frutos. 32
Tabela 5 – Exemplos de enzimas importantes presentes nos frutos. 35
Tabela 6 – Composição de alguns sumos de fruto. 37
Tabela 7 – Características principais dos diferentes sumos. 43
Tabela 8 – As diferentes concentrações de cada açúcar. 45
Tabela 9 – Preparação das soluções mãe. 46
Tabela 10 – Preparação das misturas ternárias. 46
Tabela 11 – Preparação das misturas binárias. 47
Tabela 12 – Preparação das soluções singulares. 47
Tabela 13 – Preparação das soluções de ácido ascórbico. 49
Tabela 14 – Preparação das soluções de ácido cítrico. 50
Tabela 15 – Desenho triangular de misturas de sumos. 51
Tabela 17 – Resultados da aplicação da regressão PLS1 dos espectros originais e dos espectros submetidos à primeira derivada das soluções de açúcares.
60
Tabela 18 – Concentração (g/l) da sacarose estimada por PLS1 e determinadas por testes enzimáticos.
65
Tabela 19 – Concentração (g/l) da frutose estimada por PLS1 e determinadas por testes enzimáticos.
66
Tabela 20 – Concentração (g/l) da glucose estimada por PLS1 e determinadas por testes enzimáticos.
67
Tabela 21 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais e dos espectros submetidos à primeira derivada do conjunto 1 de sumos.
74
Tabela 22 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais e dos espectros submetidos à primeira derivada de 12 sumos.
77
Tabela 23 – Concentrações (g/l) dos três açúcares em 8 sumos estimadas por PLS1 e determinadas por testes enzimáticos.
82
Tabela 24 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros submetidos à primeira derivada das misturas de sumos.
88
Tabela 25 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros submetidos à 1ª derivada de 20 soluções de misturas do conjunto 2 de sumos.
91
Tabela 26 – Percentagens (%, v/v) dos três sumos estimadas por PLS1 em 5 misturas de sumos.
94
Tabela 27 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros submetidos à 1ª derivada de misturas de sumo de limão em sumo de ananás.
97
Tabela 28 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais de soluções de ácido ascórbico.
Tabela 29 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros submetidos à 1ª derivada para os 13 sumos.
100
Tabela 30 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais de soluções padrões de ácido cítrico.
102
Tabela 31 – Concentrações (g/l) do ácido cítrico em sumos estimados por PLS1 e determinados por testes enzimáticos.
103
Tabela 32 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais do conjunto 1 de sumos.
104
Tabela 33 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros originais para 15 sumos.
105
Tabela 34 – Concentrações (g/l) do ácido cítrico em 5 sumos do conjunto 1 estimadas por PLS1 e determinadas por testes enzimáticos.
107
Tabela 35 – Resultados da aplicação da PLS1 dos espectros submetidos à 1ª derivada de sumos com envelhecimento acelerado.
118
Tabela 36 – Concentrações (g/L) dos açúcares estimadas por PLS1-FTIR nos sumos com envelhecimento acelerado e nos sumos armazenados a temperatura ambiente.
120
Tabela 37 – Concentrações (mg/100 mL) de ácido ascórbico estimadas por PLS1-FTIR nos sumos com envelhecimento acelerado e nos sumos armazenados a temperatura ambiente.
123
Tabela 38 – Concentrações (g/L) de ácido cítrico estimadas por PLS1-FTIR nos sumos com envelhecimento acelerado e nos sumos armazenados a temperatura ambiente.
Páginas
Figura 1 – Algumas características das bandas na região de impressão digital 4
Figura 2 – Esquema de um interferómetro de Michelson 5
Figura 3 – Esquema de um possível dispositivo usado em transmitância 6
Figura 4 – Esquema de um dispositivo de ATR 7
Figura 5 – Decomposição da matriz inicial na PCA 13
Figura 6 – Projecções dos dados nos componentes principais 14
Figura 7 – Via da glicólise 17
Figura 8 – Via oxidativa da pentose fosfate 18
Figura 9 – Via da degradação do amido e da síntese da sacarose 20
Figura 10 – Via da oxidação do malato 23
Figura 11 – Ciclo de Krebs ou ciclo do ácido tricarboxílico 24
Figura 12 – Oxidação do ácido L-ascórbico 26
Figura 13 – Compostos fenólicos presentes em alguns frutos 27
Figura 14 – Via dos isoprenóides 28
Figura 15 – Estrutura de alguns pigmentos de frutos 30
Figura 16 – Biossíntese das antocianidinas 31
Figura 18 – Espectros típicos de infravermelho FT-IR (1200-700 cm-1) das soluções singulares aquosas de sacarose, frutose e glucose: a) espectros originais; b) primeira derivada dos espectros.
55
Figura 19 – Mapa de coordenadas factoriais das duas primeiras componentes principais PC1 vs. PC2, obtidas para as soluções de misturas de açúcares: a) dos espectros originais; b) dos espectros submetidos à 1ª derivada.
58
Figura 20 – Mapa de contribuições factoriais para PC1 e PC2 obtidas para as soluções de misturas de açúcares: a) dos espectros originais; b) dos espectros submetidos à 1ª derivada.
60
Figura 21 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficientes B correspondentes obtidos com o modelo de regressão PLS1 para a sacarose, a frutose e a glucose: a) com espectros originais; b) com espectros submetidos à 1ª derivada.
63
Figura 22 – Espectros típicos de infravermelho FT-IR (1200-700 cm-1) dos sumos de alperce, maçã e lima-limão: a) espectros originais; b) primeira derivada dos espectros.
68
Figura 23 – Mapa de coordenadas factoriais das duas primeiras componentes principais, PC1 vs. PC2 (1200-700 cm-1), obtidas para o conjunto 1 de sumos: a) dos espectros originais; b) dos espectros submetidos à 1ª derivada.
71
Figura 24 – Mapa de contribuições factoriais para PC1 e PC2 (1200-700 cm-1) obtidas para o conjunto 1 de sumos: a) dos espectros originais; b) dos espectros submetidos à 1ª derivada.
73
Figura 25 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficientes B correspondentes obtidos com o modelo de regressão PLS1 para a sacarose, a frutose e a glucose: a) com espectros originais; b) com espectros submetidos à 1ª derivada.
Figura 26 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficientes B correspondentes obtidos com o modelo de regressão PLS1 para a sacarose, a frutose e a glucose: a) com espectros originais; b) com espectros submetidos à 1ª derivada.
80
Figura 27 – Mapa de coordenadas factoriais (1200-700 cm-1) das duas primeiras componentes principais, PC1 vs. PC2, dos espectros originais do conjunto 1 de sumos e da mistura equitativa
84
Figura 28 – Mapa de contribuições factoriais (1200-700 cm-1) para PC1 e PC2 dos espectros originais do conjunto 1 de sumos e da mistura equitativa
84
Figura 29 – Espectros típicos de infravermelho FT-IR (1200-900 cm-1) dos sumos de limão, ananás e manga: a) espectros originais; b) primeira derivada dos espectros.
85
Figura 30 – Mapa de coordenadas factoriais após 1ª derivada (1200-900 cm-1) das duas primeiras componentes principais, PC1 vs. PC2, obtidas para as misturas de sumos.
87
Figura 31 – Mapa de contribuições factoriais após 1ª derivada (1200 – 900 cm
-1
) para PC1 e PC2 obtidas para as misturas de sumos.
88
Figura 32 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficientes B correspondentes obtidos com o modelo de regressão PLS1 dos espectros submetidos à 1ª derivada para os sumos de limão, de ananás e de manga.
90
Figura 33 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficientes B correspondentes obtidos com o modelo de regressão PLS1 com espectros submetidos à 1ª derivada para os sumos de limão, de ananás e de manga.
Figura 34 – Mapa de coordenadas factoriais após 1ª derivada (1200-900 cm-1) das componentes principais, PC1 vs. PC3, obtidas para as soluções de misturas de sumo de limão em sumo de ananás.
96
Figura 35 – Mapa de contribuições factoriais após 1ª derivada (1200-900 cm-1) para PC1 e PC2 obtidas para as misturas de sumo de limão em sumo de ananás.
96
Figura 36 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficiente B correspondente obtido com o modelo de regressão PLS1 com espectros submetidos à 1ª derivada: a) do sumo de limão em sumo de ananás; b) do sumo de ananás em sumo de limão.
98
Figura 37 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficiente B correspondente obtido com o modelo de regressão PLS1 com espectros originais de soluções de ácido ascórbico.
99
Figura 38 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada em ácido ascórbico e coeficiente B correspondente obtido com o modelo de regressão PLS1 com espectros submetidos à 1ª derivada de 13 sumos.
101
Figura 39 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada e coeficiente B correspondente obtido com o modelo de regressão PLS1 com espectros originais de soluções de ácido cítrico.
102
Figura 40 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada em ácido cítrico e coeficiente B correspondente obtidos com o modelo de regressão PLS1 com espectros originais de 20 sumos.
105
Figura 41 – Relação entre a concentração real e a concentração estimada em ácido cítrico e coeficiente B correspondente obtido com o modelo de regressão PLS1 com espectros originais de 15 sumos do conjunto 1.
106
Figura 42 – Mapa de coordenadas factoriais (1338-829 cm-1) das componentes principais, PC1 vs. PC2, obtidas para os sumos do conjunto 1.
Figura 43 – Mapa de contribuições factoriais (1338-829 cm-1) das componentes principais, PC1 vs PC2, obtidas para os sumos do conjunto 1.
109
Figura 44 – Espectros de infravermelho FT-IR (1200-700 cm-1) de sumos armazenados a 50 ºC e a temperatura ambiente durante 120 horas: a) espectros originais; b) 1ª derivada dos espectros típicos
110
Figura 45 – Mapa de coordenadas factoriais das componentes principais, PC1 vs PC2 (1200-700 cm-1) dos espectros submetidos à 1ª derivada dos sumos armazenados a temperatura ambiente e a 50ºC.
112
Figura 46 – Mapa de contribuições factoriais das componentes principais, PC1 vs. PC2 (1200-700 cm-1) dos espectros submetidos à 1ª derivada dos sumos armazenados a temperatura ambiente e a 50 ºC.
113
Figura 47 – Espectros de infravermelho FT-IR (1200-700 cm-1) de sumos armazenados a 50 ºC durante 24, 72, 120 e 216 horas: a) espectros originais; b) dos espectros submetidos à primeira derivada.
114
Figura 48 – Mapa de coordenadas factoriais das componentes principais, PC1 vs. PC2 (1200-700 cm-1) dos espectros submetidos à 1ª derivada dos sumos armazenados a 50 ºC.
116
Figura 49 – Mapa de contribuições factoriais das componentes principais, PC1 vs PC2 (1200-700 cm-1) dos espectros submetidos à 1ª derivada dos sumos armazenados a 50ºC.
117
Figura 50 – Relação entre o tempo real e o tempo estimado e coeficiente B correspondente obtidos com o modelo de regressão PLS1 com espectros submetidos a 1ª derivada dos sumos com envelhecimento acelerado a 50 ºC.
118
Figura 51 – Variação das concentrações de açúcares estimadas por PLS1 FTIR dos sumos com envelhecimento acelerado e dos sumos armazenados a temperatura ambiente: a) sacarose; b) frutose; c) glucose.
Glossário
Abreviaturas
AA – Ácido L – ascórbico ADP – Difosfato de adenosina ATP – Tri-fosfato de adenosina
ATR – Reflectância total atenuada (Attenuated Total Reflectance) CoA – Coenzima A
DHA – L-dehidroascórbico F-6-P – Frutose-6-fosfato
FT-IR – Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared)
FTIR-MID – Espectroscopia de infravermelho médio com transformada de Fourier (Fourier Transform Mid Infra Red)
FT-NIR – Espectroscopia de infravermelho próximo com transformada de Fourier (Fourier Transform Near Infra Red)
Fru – Frutose G-6-P – Glucos-6-fosfato G6P-DH – Glucose-6-fosfato desidrogenase Glu – Glucose HK - Hexocinase IR – Infravermelho (Infrared) LV – Variável latente
MIR – Infravermelho médio (Mid Infrared) NAD – Dinucleotídeo de nicotinamida – adenina
NADP – Dinucleotídeo de nicotinamida – adenina- fosfato
NIPALS – Algoritmo parcial em mínimos quadrados iterativo não linear (Non-linear Iterative Partial Algorithm Least Squares)
NIR – Infravermelho próximo (Near Infrared) OPP – Pentose fostato oxidativa
PCA – Análise em componentes principais (Principal Component Analysis) PCR – Regressão em componentes principais (Principal component Regression) PFK – Fosfofrutocinase
PGI - Fosfoglucoisomerase PK - Piruvatocinase
PLS – Regressão parcial em mínimos quadrados (Partial Least Squares regression) PPK – Fosfofrutocinase pirofosfato
PPO – Polifenol oxidase R – Coeficiente de Correlação
RMSEP – Erro médio de previsão (root mean square error of prediction)
RMSEC – Erro médio de calibração (root mean square error of cross-validation) R2 – Coeficiente de determinação
Sac – Sacarose
SG – Savistsky-Golay
SVD – Decomposição singular de valores (Singular Value Decomposition) TCA – Cíclo do ácido tricarboxílico
UV – Ultravioleta
Capítulo I
I.1 – Introdução
A Espectroscopia de Infravermelho (médio e próximo) representa uma ferramenta importante para o controlo da qualidade e processo de monitorização na indústria alimentar, sendo uma técnica de relativo baixo custo, quando tomada em consideração a diminuição do consumo de reagentes, mão-de-obra e tempo de análise. A espectroscopia de infravermelho oferece uma técnica alternativa, rápida e não destrutiva a técnicas de análise química para a caracterização qualitativa e medidas quantitativas em produtos alimentares [1,2,3].
O Infravermelho próximo (FT-NIR) e o médio (FT-IR) aliado à utilização da análise multivariada, foram usados para determinar a autenticidade de alimentose mostraram ser úteis para detectar problemas de adulterações em puré de framboesa, fiambre, azeite, óleos vegetais, presença de gordura de porco em mistura de gorduras animais, outras gorduras vegetais em manteiga de cacau, café, mel, sumo de laranja, leite, carne, e outros produtos [2,3,4].
A aplicação de FT-NIR aos óleos e gorduras tornou-se muito comum para os estudos da qualidade e de composição. Nos azeites, o NIR é usado para a previsão/identificação de adulterações, diferenciação/classificação de óleos vegetais e monitorização on-line de carotenóides e pigmentos de clorofila [5].
No caso de espectroscopia NIR, para a detecção típica é usada a região entre 10000 e 4000 cm-1. No caso de espectroscopia FT-IR, as regiões de interesse são 3100-2800 cm-1 e 1800-900 cm-1 para os óleos e gorduras. São usadas as regiões 1800-1200 e 3200-2800 cm-1 para os hidratos de carbono, os ácidos carboxílicos e os aminoácidos. A região 1200-700 cm-1 (região de impressão digital) é usada para os hidratos de carbono [6].
I.2 – Objectivos
O projecto pretende desenvolver aplicações de técnicas de análise rápidas como o Infravermelho médio, Ultravioleta/Visível na:
• Quantificação de parâmetros físico-químicos de alimentos, com particular relevância em sumos de fruta.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de açúcares em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de ácido ascórbico em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de ácido cítrico em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a diferenciação/classificação de sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a previsão/identificação de adulterações em sumos.
I.3 – Espectroscopia de Infravermelho
I.3.1 – Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIR) O espectro electromagnético está dividido em várias regiões: raios gama, raios X, ultra-violeta, visível, infra-vermelho, micro-ondas e radio-frequências.
Cada uma destas regiões possui diferentes energias, que está relacionada com um tipo de transição atómica ou molecular. Desta forma, a radiação IR, não provoca as mesmas transições electrónicas que as suas congéneres ultra-violeta, visível ou raios-X. A radiação do Infravermelho não tem energia suficiente para provocar excitação dos electrões, conseguindo apenas alterar os estados vibracionais e rotacionais das moléculas, podendo ser usado como técnica espectroscópica não destrutiva [7].
A radiação no infra-vermelho é dividida em três tipos: IR longínquo, IR médio e IR próximo, sendo a mais popular e usada em química alimentar a do infravermelho próximo (NIR) [8].
A posição de absorção de uma banda no espectro pode ser expressa em microns (µm) ou em comprimentos de onda (cm-1) sendo esta mais comum (Tabela 1). O intervalo usual de um espectro de infravermelho é entre 4000 cm-1 para as altas frequências e 625 cm-1 para as baixas frequências [9].
A exploração da espectroscopia de FTIR tem uma série de vantagens: rapidez, possibilidade de realizar análises não destrutivas e sem pré-tratamento ou reduzido das amostras.
Tabela 1 – Regiões do infra-vermelho e respectivos intervalos de comprimento de onda e número onda
Região Gama de comprimentos de onda (λ), µm Número de onda (µ), cm-1
Próximo 0,78 – 2,5 12800 - 4000
Médio 2,5 - 50 4000 - 400
Longínquo 50 – 1000 400 - 10
De uma forma simples, pode-se dizer que, quando a frequência da radiação infra-vermelho emitida é igual à frequência vibracional da molécula, dá-se a absorção de energia por parte desta, resultando numa alteração da amplitude de vibração molecular. De forma semelhante ocorre para a rotação.
Para as moléculas absorverem energia na gama do infra-vermelho, tem de ocorrer uma alteração do momento de dipolo como consequência dos seus movimentos vibracional e rotacional.
A variação do momento dipolar com a alteração da distância inter – atómica durante a vibração, corresponde a um campo eléctrico oscilante que pode interactuar com o campo eléctrico oscilante associado à radiação electromagnética.
Quanto maior a simetria da molécula, menor o número de bandas observadas, pois algumas ligações absorvem à mesma frequência.
A intensidade das bandas depende da natureza e da polaridade das ligações. Por exemplo, a ligação C=O, fortemente polar e composta de átomos diferentes, absorve fortemente, enquanto que a ligação C=C tem relativamente fraca absorção.
As moléculas com um mesmo grupo funcional apresentam, nos seus espectros, bandas sensivelmente à mesma frequência, independentemente da sua cadeia atómica principal, sendo esta absorção denominada frequência de grupo. Estas frequências encontram-se a números de onda superiores a 1300 cm-1.
A região 1300-400 cm-1 contém bandas vibracionais que são mais dificilmente atribuíveis a grupos funcionais específicos, uma vez que as massas e as forças de ligação de cada uma das espécies absorventes são muito similares. No entanto, esta região contém
bandas com especial significado para a molécula como um todo, sendo denominada de região das impressões digitais [7].
As bandas na região das frequências de grupo são facilmente identificáveis pelas tabelas; no entanto, as bandas na zona das impressões digitais devem-se por vezes a mais de uma ligação ou grupo funcional (Figura 1).
1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 Alcanos OCOCH3 e COCH3 C(CH3)3 C(CH3)2 CH=CH trans Outros olefinicos C-H O-H C=O 5-aromático adjacente C-H 4-aromático adjacente C-H 3-aromático adjacente C-H 2-aromático adjacente C-H 1-aromático isolado C-H C NO3 O NO3 N NO3 N =O N O C=S CSNH SO SO2 SO2N SO2O SO2Cl P O alquil P O aril P=O P Sr-CH3 C-F C Cl
I.3.2 – O espectrómetro de FT-IR
A maioria dos interferómetros usados em espectroscopia de infravermelho é baseada no primeiro interferómetro originalmente desenhado por Michelson em 1891 [10].
A fonte de radiação usada neste tipo de espectrómetros – Globar (SiC) – emite uma gama de comprimentos de onda que abrange toda a gama do infra-vermelho médio.
Na Figura 2 pode-se observar o esquema de um interferómetro de Michelson.
Figura 2 – Esquema de um interferómetro de Michelson
A radiação enviada pela fonte passa por um orifício e é orientada por espelhos antes de chegar a um divisor de feixe. Aí, uma parte da radiação continua na mesma direcção, interagindo com um espelho em movimento, enquanto que a outra parte da radiação é reflectida para um espelho fixo. Posteriormente a radiação, tendo sido reflectida pelos espelhos, chega novamente ao divisor de feixe, sendo mais uma vez dividida, levando apenas uma parte a interferir com a amostra, reduzindo a amplitude de algumas frequências, e chegando então ao detector.
O espelho móvel pode mover-se de uma forma muito precisa e a uma velocidade determinada, de uma extremidade à outra do seu eixo. O movimento permite adquirir uma curva de intensidade da energia que chega ao detector em função do espaço percorrido pelo espelho – o interferograma. Tendo o interferograma médio, aplica-se a transformada de
Fourier, obtendo-se um espectro de transmitância em função da frequência. Este pode ainda ser facilmente convertido num espectro de absorvância em função da frequência (ou do número de onda).
O espectrómetro possui um detector piroeléctrico DTGS (sulfato de triglicina deuterado), que é termo-sensível, reagindo à alteração de temperatura provocada por uma radiação incidente. O espelho móvel permite codificar a quantidade de energia incidente através do uso da transformada de Fourier, permitindo a passagem do domínio do espaço-tempo para o domínio da frequência.
O espectro infravermelho representa a curva da intensidade transmitida em função do comprimento de onda, da frequência ou da energia da radiação incidente.
I.3.3 – Modos de aquisição dos espectros
Em espectroscopia FT-IR, as duas formas mais utilizadas de aquisição de espectros são a transmissão e a reflexão total atenuada (ATR).
Na técnica de transmissão, as amostras sólidas podem ser misturadas com KBr e prensadas, formando uma “pastilha” que pode ser atravessada pela radiação
Em amostras líquidas, estas são colocadas numa célula-contentor específica ou, em amostras mais viscosas, entre duas janelas de KBr.
Esta técnica tem o inconveniente da espessura da amostra, pois o feixe tem de atravessar completamente a amostra o que, de acordo com a lei de Beer-Lambert, diferentes espessuras implicam diferentes absorções de energia. Em transmitância, a proporção de energia luminosa absorvida pelas moléculas é calculada a partir do conhecimento da radiação incidente e da radiação transmitida ao detector, pois a radiação reflectida é desprezável.
A técnica de espectroscopia ATR utiliza o fenómeno de reflexão interna total. O feixe da radiação penetrando um cristal submete-se a uma reflexão interna total quando o ângulo de incidência na interface ente a amostra e o cristal for superior ao ângulo crítico, onde este é uma função dos índices de refracção de duas superfícies. O feixe penetra uma porção de comprimento de onda além da superfície reflectindo quando o material que absorve selectivamente a radiação está em estreito contacto com a superfície reflectindo. Há uma perda de energia do feixe ao comprimento de onda onde o material absorve. É medida a radiação atenuada resultante, e usada pelo espectrofotómetro como uma função de comprimento de onda, dando assim as características espectrais de absorção da amostra [11].
Este método é utilizado na análise de sólidos e de líquidos pouco ou muito viscosos. Os modelos de cristais de ATR são vários, com especificidades diferentes; contudo, é o tamanho do cristal que vai determinar o número de interacções que o feixe tem com a amostra.
Figura 4 – Esquema de um dispositivo de ATR [12]
I.4 – Espectrofotometria de Ultravioleta/Visível
A espectrofotometria é um método de análise óptico muito usado em análises biológicas e físico-químicas sobretudo na área alimentar. O espectrofotómetro permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante.
A espectrofotometria no ultravioleta visível (UV/Vis) envolve fotões, e utiliza a luz na faixa do visível (800 a 400 nm), do ultravioleta próximo (400 a 200 nm) e ultravioleta longínquo (200 a 80 nm). Nessas faixas de energia, as moléculas sofrem transições electrónicas moleculares.
Os espectros de ultravioleta e visível são associados a transições entre diferentes níveis de energia electrónica. Geralmente essas transições ocorrem entre uma orbital ligante σ e
Detector Fonte
uma orbital anti-ligante σ*. O comprimento de onda da absorção corresponde a medição da separação dos níveis de energia entre as orbitais. A maior energia de separação é encontrada quando os electrões das orbitais σ estão excitados resultando numa absorção na região 120-200 nm. Esse gama, conhecida como o ultravioleta de vácuo, é difícil de medir e pouca informativa. No entanto, acima de 200 nm, a excitação dos electrões das orbitais p e d e as orbitais π, particularmente os sistemas π conjugados, oferece espectros de fácil medição e informativos.
É usada a Lei de Beer-Lambert para determinar quantitativamente a concentração de substâncias em solução que absorvem a radiação:
A = - log10 (I/Io) = ε . c . L Onde:
A é a absorvância medida
Io é a intensidade da luz incidente a um dado comprimento de onda I é a intensidade transmitida pela amostra
L é o percurso óptico da amostra (distância que a luz percorreu pela amostra)
ε é a absortividade molar (ou coeficiente de absorção molar, específica para cada substância)
c é a concentração da substância [9,13, 14, 15, 16].
A espectrofotometria de Ultravioleta/Visível fornece um método rápido de análise para a determinação de compostos fenólicos em vários alimentos usando um procedimento colorimétrico [17,18]. Permite também estimar de forma rápida os açúcares principais em sumos [19,20]. O método mais usado é baseado na determinação da concentração do NADPH. A concentração da D-Glucose é determinada antes e depois da hidrolise da sacarose pela β-frutosidase. O teor da D-Frutose é determinado na sequência da determinação da D-glucose, depois da isomerização pela fosfoglucose isomerase. A pH igual a 7,6 e na presença da ATP, a hexocinase (HK), catalisa a fosforilação da D-Glucose em glucose-6-fosfato (G-6-P) com a formação de ADP (difosfato de adenosina) (reacção 1).
(HK)
Na presença da Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH), a G-6-P é oxidada em gluconato-6-fosfato pelo dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato (NADP+) com a formação do dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato na forma reduzida (NADPH) (reacção 2)
(G6P-DH)
G-6-P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2)
Nesta reacção, o teor de NADPH formado é estequiométrico com o teor de D-Glucose. O NADPH é quantificado pelo aumento da absorvância a 340 nm.
A hexocinase catalise também a fosforilação da D-Frutose em frutose-6-fosfato (F-6-P) pelo ATP com formação de ADP (reacção 3).
(HK)
D-Frutose + ATP F-6-P + ADP (3)
A F-6-P é convertido em G-6-P pela fosfoglucoisomerase (PGI) (reacção 4)
(PGI)
F-6-P G-6-P (4)
A G-6-P reage com NADP+ formando o gluconate-6-fosfato e NADPH, levando a um aumento suplementar da absorvância que é estequiométrico ao teor de D-Frutose.
A pH 4,6, a sacarose é hidrolisada pela β-frutosidase em D-glucose e D-frutose (reacção5).
(β-frutosidase)
Sacarose + H2O D-glucose + D-frutose (5)
Depois da hidrólise da sacarose a D-glucose da amostra (D-glucose total) é determinada como descrita acima (reacções de 2 a 4)
A concentração da sacarose é calculada entre a diferença entre as concentrações da D-glucose antes e depois da hidrolise pela β-frutosidase [21,22,23]. Esta técnica de análise pode ser usada como uma ferramenta complementar na detecção de adulterações em alimentos.
I.5 – Análise Multivariada
A análise estatística multivariada diz respeito à aplicação de técnicas de cálculo matricial para a recuperação de fontes de informação em várias dimensões. Uma das dificuldades dos métodos descritivos para dados dimensionais elevados é o sistema de percepção humano. As nuvens de ponto em duas dimensões são fáceis de compreender e interpretar. Com técnicas computacionais interactivas modernas, temos a possibilidade de ver em tempo real rotações em 3D e perceber assim dados tridimensionais.
As dificuldades da apresentação dos dados ocorrem para as dimensões superiores ou igual a cinco, a menos que a estrutura de elevada dimensão possa ser traçada como componentes de baixa dimensão. As características como subgrupos ou aglomerados, entretanto, podem ser detectadas usando uma análise puramente gráfica [24].
Por outro lado, devido a uma complexidade elevada dos sistemas químicos e biológicos, deve-se utilizar técnicas instrumentais tais como a espectroscopia, espectrofotometria, cromatografia, para os poder estudar. Contudo, os sinais obtidos apresentam uma tal complexidade que é difícil de interpretar. No entanto a quimiometria vai permitir a extracção da variabilidade dos sinais e facilitar assim a compreensão dos modelos resultantes. A quimiometria utiliza métodos matemáticos, estatísticos, técnicas de lógica formal e computação para:
- Planear e/ou seleccionar métodos ou procedimentos óptimos
- Extrair o máximo de informação possível através da análise de dados químicos.
Pode-se assim obter um sistema de três tipos de informação: 1) Informação quantitativa
2) Informação qualitativa
3) Informação fundamental sobre as propriedades que o caracterizam
A análise multivariada apresenta diferentes ferramentas de análise. No entanto, é necessário seleccionar a ferramenta adequada para um determinado tipo de análise. Algumas ferramentas disponíveis em análise multivariada são:
- Noções de cálculo vectorial/matricial - Formas e estruturas de sinais típicos - Análise em componentes principais (PCA)
- Regressão multivariada:
Regressão linear multivariada (MLR) Regressão de Ridge (RR)
Regressão em componentes principais (PCR) Regressão multivariada parcial (PLS1 e PLS2) - Análise factorial de correspondência
- Análise discriminante (FDA) - Análise canónica de correlação
- Métodos de selecção de variáveis [25]
A interpretação dos dados em análise multivariada depende decisivamente do pré-processamento dos dados. Raramente os dados são usados na sua forma original [26].
Os dados obtidos através de FT-IR são os espectros da amostra subtraídos de um espectro do fundo, de forma a retirar ao espectro da amostra a contribuição da célula e do meio ambiente. Cada espectro destes é representado por um vector, que consiste num conjunto de valores de transmitância (ou absorvância) observados a determinados comprimentos de onda para uma determinada amostra.
Os espectros são geralmente transformados antes da análise multivariada. As razões para estas transformações são várias; por exemplo: minimizar efeitos de linha de base, dar igual peso às variáveis, mover o sistema de coordenadas de forma a ter o centro em zero, maximizar diferenças entre os espectros, aumentar a resolução, etc.
Os dados são normalmente apresentados de forma que cada espectro (objecto) seja uma linha de uma matriz de valores iniciais, sendo as colunas os diferentes comprimentos de onda (variável).
I.5.1 – Centrar
Centrar consiste em subtrair a cada um dos valores do espectro (ou de uma variável) a respectiva média. Assim sendo, os dados centrados representam a diferença entre cada valor e a média do espectro (ou da variável), para que o baricentro fique na origem. Esta operação pode ser realizada antes ou depois de uma outra transformação. Centrar pode ser importante em alguns conjuntos de dados com problemas na linha de base ou quando se usa uma pequena região do espectro dos dados [26].
I.5.2 – Padronizar
Esta operação consiste em dividir por cada um dos valores do vector o desvio padrão do mesmo. Matematicamente, se se pretende padronizar um vector, temos então, para cada valor i do vector x:
Pode ser aplicado a uma amostra ou a uma variável. Se aplicado às variáveis, atribui-lhes um peso semelhante, ou seja, todas as variáveis são reduzidas à mesma escala, o que é importante no caso de se querer anular diferenças grandes nas suas magnitudes. Quando aplicado às amostras, pode por exemplo, homogeneizar réplicas e ao mesmo tempo maximizar diferenças entre amostras. Brereton refere que deve ser usado após centrar os dados [26].
I.5.3 – Análise em componentes principais
A técnica de análise em componentes principais (PCA), inicialmente descrita por Karl Pearson em 1901, recebeu contribuições matemáticas de Hotelling na década de 1930, mas teve de esperar pelo aparecimento dos computadores para ser largamente aplicada no domínio das ciências sociais, naturais e exactas, estabelecendo-se como uma peça base da análise multivariada [27].
Uma das razões para aplicar a Análise em Componentes Principais reside na sua capacidade de analisar uma quantidade enorme de dados, como aqueles produzidos pelos modernos equipamentos digitais.
A abordagem de estudar cada um dos sinais (individualmente) e extrair as suas propriedades torna virtualmente impossível utilizar/analisar inteligentemente os dados. Por exemplo a análise de 300 objectos de ar onde 150 substâncias (variáveis) são quantificadas origina uma matriz de 150x300 = 45000 elementos a analisar.
A PCA procura extrair as principais fontes de variabilidade de um conjunto de dados: relação entre amostras; descriptores (variáveis) e amostra/variáveis, através da factorização da matriz.
Como técnica exploratória, permite a visualização dos dados após a projecção das amostras no espaço multi-dimensional determinado pela factorização. Não sendo supervisionada, não se propõe nenhuma relação a priori entre os objectos e/ou as variáveis,
x
σ x
x i
procurando ela própria as relações entre os diferentes parâmetros (objectos e variáveis), permitindo observar eventuais agrupamentos entre objectos ou variáveis
Geometricamente, pode ser compreendida como uma rotação/projecção dos eixos do espaço multivariado de uma matriz, de forma a maximizar a variação ao longo de cada eixo. Estes novos eixos são denominados componentes principais ou variáveis latentes.
Matematicamente, este processo consiste numa simples transformação linear das a – variáveis de partida, para criar k variáveis características das fontes de variabilidade dos dados.
As principais vantagens do PCA são: • Facilita a extracção de informação • Auxilia a descrição de um modelo
• Reduz o número de variáveis, através de uma combinação linear das variáveis originais
• Método exploratório
• Método de extracção das principais fontes de variabilidade I.5.4 – Método PCA
A Análise em Componentes Principais (PCA) decompõe uma matriz X em duas matrizes: uma de contribuições factoriais (“Loadings”) P e outra de coordenadas factoriais (“Scores”) T.
X (n,a) = T (n,k) . P’ (k,a) + E (n,a)
Figura 5 – Decomposição da matriz inicial na PCA
A matriz de contribuições factoriais define o novo sistema de eixos e a de coordenadas factoriais representa a posição de cada amostra quando projectada nesse novo espaço.
As contribuições factoriais são obtidas para cada uma das variáveis (coluna) da matriz X e representam a relação entre as variáveis originais e os componentes principais.
As coordenadas factoriais são uma combinação linear das variáveis originais, ou por outras palavras, a projecção de cada amostra no espaço dos componentes principais. Estas
podem ser obtidas para todos os objectos e em todos os componentes principais, da seguinte forma:
T (n,k) = X (n,a) . P (a,k)
Figura 6 – Projecções dos dados nos componentes principais
Os gráficos das coordenadas factoriais podem mostrar relações entre as amostras, agrupando-as ou dispondo-as ao longo dos componentes principais.
A combinação dos gráficos de dispersão das coordenadas factoriais (scores) com os das contribuições factoriais (loadings), permite estudar a influência das variáveis nas amostras. A cada um dos componentes principais está associada uma percentagem de variância. Quando se usa o algoritmo SVD ou NIPALS para a PCA, a percentagem de variância é decrescente à medida que vão sendo calculados novos componentes. Esta variância é denominada por valor próprio e é, para cada componente principal, a soma dos quadrados das coordenadas factoriais.
I.6 – Frutos e sumos de frutos
I.6.1 – Composição geral e principais alterações dos frutos
Os frutos são produtos alimentares que fornecem os nutrientes essenciais na dieta alimentar humana. Em geral, são pobres em fontes de proteína ou gordura. Em algumas dietas, os frutos podem representar as fontes principais de energia como por exemplo a importância dos seus teores em vitaminas e minerais. Os frutos contém uma percentagem elevada do seu peso fresco em água, exibindo assim uma actividade metabólica elevada em comparação com outros produtos vegetais alimentares. Essa actividade metabólica continua depois da colheita.
O amadurecimento requer a síntese de novas proteínas e mRNAs, bem como novos pigmentos e compostos de aroma. Estes processos anabólicos requerem energia e uma
fonte de carbono, e são fornecidos no fruto. Mesmo se todos os frutos efectuam a respiração, existem diferenças entre frutos nos seus teores e sua forma de alteração da respiração entre frutos. Os frutos são geralmente classificados como climatéricos (por exemplo a manga, o tomate, o figo, a maçã) e não climatéricos (por exemplo o limão, a uva, a cereja, o ananás). Os frutos climatéricos apresentam um pico característico da actividade respiratória durante o amadurecimento, definido por climatérico respiratório. Dependendo do tipo de fruto, este pico pode corresponder a maturidade óptima de consumo, ou pode preceder ou seguir esta. Ao contrário, os frutos não climatéricos simples exibem uma diminuição gradual da sua respiração durante o amadurecimento. No entanto existem diferenças na taxa respiratória entre os frutos. Também existe uma correlação geral entre uma taxa respiratória elevada e um tempo de vida curto.
Os açúcares e os ácidos orgânicos são os dois substratos principais da respiração nos frutos. Alguns frutos tal como o abacate contem níveis elevados em lípidos, embora estes não parecem ser usados como substrato. Os açúcares (principalmente glucose, frutose e sacarose) parecem ser os substratos predominantes na respiração. No entanto, o metabolismo dos ácidos orgânicos (principalmente os ácidos cítrico, málico e tartárico) pode ter um papel significante. Os açúcares e ácidos orgânicos são encontrados largamente sequestrados nos vacúolos dando uma contribuição maioritária ao sabor do fruto [28].
A polpa dos jovens frutos em desenvolvimento contém muito pouco açúcar e as grandes quantidades de amido, ácidos e fenóis presentes os tornam não comestíveis. Ao longo do processo de amadurecimento, as células da polpa aumentam consideravelmente e o conteúdo em açúcar aumenta enquanto os teores em amido, ácidos e fenóis diminuam. Além disso, são produzidos certos compostos voláteis, dando ao fruto o seu aroma característico. A degradação da clorofila (perda da cor verde) e a síntese de carotenóides (cores amarela e laranja) e antocianinas (cores vermelha e azul) tomam lugar na polpa com o amadurecimento do fruto. Todos os frutos amolecem quando estão maduros devido a alterações na composição e estrutura da parede celular [29].
As vias respiratórias usadas pelos frutos para a oxidação dos açúcares são aquelas comuns a todos os tecidos vegetais nomeadamente a glicólise (Figura 7), a via oxidativa da pentose-fosfato (OPP) (Figura 8) e a via do ácido tricarboxílico (TCA). O aumento da respiração dos açúcares em frutos climatéricos parece ser mediado pelo aumento do fluxo através da glicólise. A contribuição da OPP parece ser mínimo mas significante em frutos
pré-climatéricos e a sua contribuição pode diminuir durante o climatérico. A capacidade respiratória do fruto pré-climatérico parece ser suficiente para explicar o fluxo máximo respiratório durante o climatérico. Então, na maioria dos frutos climatéricos o aumento da respiração durante o climatérico pode resultar da inibição da respiração.
Os passos principais da regulação da glicólise são mediados por enzimas, a fosfofrutocinase (PFK) e a piruvato cinase (PK), as quais convertem a frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifosfato e o fosfoenolpiruvato em piruvato (Figura 7). Quando são extraídas dos tecidos vegetais, estas enzimas parecem ser possíveis moduladores metabólicos. No entanto, isto não significa que alguns ou todos sejam reguladores importantes da actividade in vivo. Os principais “efectores” são o ATP e o fosfoenolpiruvato os quais actuam como inibidores, e os iões fosfato e potássio actuando como activadores. Nos frutos, o teor de ATP tende a aumentar durante o amadurecimento, como seria esperado com o aumento da respiração. O teor de fosfoenolpiruvato diminui durante o amadurecimento, e os teores dos iões fosfato e potássio vão aumentar.
α-D-glucose ATP ADP Mg++ hexocinase α-D-glucose-6-fosfato Fosfoglucoisomerase β-D-frutose-6-fosfato ATP ADP Mg++ Fosfofrutocinase β-D-frutose-1,6-bifosfato Aldolase
Diidroxiacetona fosfato + Gliceraldeido-3-fosfato
Triose fosfato isomerase
Gliceraldeido-3-fosfato NAD+ + Pi NADH Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase 1,3-Bifosfoglicerato ADP ATP Mg++ fosfoglicerato cinase 3-fosfoglicerato fosfoglicerato mutase 2-fosfoglicerato Mg++ Enolase Fosfoenolpiruvato ADP ATP Mg++ Piruvato cinase Piruvato
α-D-glucose-6-fosfato NADP NADPH glucose-6-fosfato desidrogenase gluconolactona-6-fosfato Fosfogliconolactonase gluconato-6-fosfato NADP CO2,NADPH Gluconato-6-fosfato desidrogenase ribulose-5fosfato Ribulose-5-fosfato 3-epimerase Ribose-5-fosfato Xilose-5-fosfato Transcetolase Sedoheptulose Gliceraldeido-3-fosfato Transaldolase Transcetolase Frutose-6-fosfato Eritrose-4-fosfato Gliceraldeido-3-fosfato
Figura 8 – Via oxidativa da pentose-fosfato
O papel da actividade do PFK na regulação da glicólise em tecidos vegetais é ainda mais dificultado pela existência da fosfofrutocinase dependente de pirofosfato (PPK), o qual catalisa uma reacção semelhante a do PFK. Esta enzima converte também a frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifrutose-6-fosfato, mas é uma reacção reversível e utiliza o pirofrutose-6-fosfato em vez do ATP como substrato secundário. Ao contrário da actividade do PFK, a actividade do PPK pose ser regulado pelos teores do seu activador metabólico principal, o frutose-2,6-bifosfato [28].
Ribose-5-fosfato isomerase
I.6.2 – Hidratos de carbono (ou açúcares)
Os hidratos de carbono são os compostos mais abundantes e largamente distribuídos nos frutos e sumos. Os frutos frescos variam muito entre eles no seu conteúdo em hidratos de carbono com uma gama geral entre 10% e 25%. Estrutura, textura, sabor e valor alimentar do fruto fresco estão relacionados com o conteúdo de hidratos de carbono.
Sacarose, glucose e frutose são os açúcares principais encontrados nos frutos, e a sua importância relativa varia consoante os frutos (Tabela 2). Os açúcares são encontrados principalmente no citoplasma e variam de 0.9 % nas limas a 16 % nos figos. O teor de sacarose varia de vestígio nas cerejas, uvas, romãs até 8 % nas bananas e ananás maduros. Tal variação influencia o sabor, pois a frutose é mais doce que a sacarose e a sacarose é mais doce que a glucose.
O amido encontra-se como pequenos grânulos no interior das células dos frutos não maduros. O amido é convertido em açúcar no fruto maduro [25]. A degradação do amido em glucose, frutose ou sacarose é uma característica do processo de amadurecimento. Várias enzimas dos tecidos vegetais são capazes de metabolizar o amido (Figura 9). A α-amilase hidrolise as ligações α (1-4) da amilose de forma aleatória para formar uma mistura de glucose e maltose. Ao contrário, a β-amilase vai atacar a penúltima ligação e libertar assim unicamente maltose. A maltose produzida pode ser hidrolisada em glucose pela acção da glicosidase. A enzima amidofosforilase vai hidrolisar a ligação α(1-4) terminal para dar a glicose-1-fosfato que pode ser convertido a glicose-6-fosfato pela acção da glicose fosfato mutase.
As três enzimas de degradação do amido, α- e β-amilase e amido fosforilase foram identificadas nos frutos. Estas ocorrem em várias formas de iso-enzimas, e as suas actividades aumentam durante o amadurecimento.
Figura 9 – Via da degradação do amido e da síntese da sacarose UDP-Glucose Maltose Amido Glucose CLOROPLASTO Glucose-1-fosfato Glucose-6-fosfato Triose-fosfato Triose-fosfato Frutose-1,6-bifosfato
Frutose-6-fosfato Glucose-6-fosfato Glucose-1-fosfato
Piruvato
Sacarose-6-fosfato Sacarose Glucose
Frutose CITOPLASMA α-glucosidase β-amilase α-amilase Amido fosforilase
Glucose fosfato mutase
Via da Glicólise
Triose fosfato /Transportador
Via da Glicólise Via da Glicólise
Glucose fosfato mutase fosfofrutofosfotransferase Frutose bifosfatase Sacarose fosfato sintetase Sacarose fosfato fosfatase UDP-glucose pirofosforilase Invertase Sacarose sintase
Em todos os casos, as enzimas são unicamente activas para as cadeias lineares de glucose da amilose encontradas no amido. Não podem degradar as ligações α(1-6) da amilopectina do amido. Os grãos de amido são uma mistura de amilose e amilopectina.
Os produtos finais da degradação do amido são a glucose ou glucose-1-fosfato. Qualquer um pode ser convertido em glucose-6-fosfato pela acção de hexocinase ou pela glucose fosfato mutase. A maior utilização dos produtos de degradação do amido ocorre principalmente no citoplasma, sendo que nos tecidos de folhas, são os trioses fostatos (diidroxiacetona, gliceraldeido fosfato e glicerofosfatos) que são transportados através do tegumento do cloroplasto. Uma vez no citoplasma, os produtos de degradação podem então entrar na via da glicólise para a respiração, ou de novo convertidos em glicose fosfato e frutose para ser usados na síntese da sacarose [28].
Outros polissacarídeos presentes nos frutos incluem celulose, hemicelulose, e pectina, os quais junto com a lenhina são encontrados principalmente (até 50%) na parede celular e variam muito consoante os frutos. Estas grandes moléculas quebram-se em moléculas mais simples e mais solúveis tendo como resultado o amolecimento do fruto. A transformação de pectinas insolúveis em pectinas solúveis é controlada, em maioria, pelas enzimas pectinesterase e poligalacturonase. As actividades reduzidas destas duas enzimas foram associadas a uma textura pouco sumarenta e pobre em pêssegos que amadureceram depois de um armazenamento a 1ºC durante mais de 3 semanas [29]. Devido à presença de substâncias pécticas, a viscosidade dos sumos vai aumentar, o que dificulta a clarificação e a concentração dos sumos [30].
Tabela 2 – Composição em açúcares presentes em alguns frutos Açúcar, g/100ml de sumo
Fruto Sacarose Glucose Frutose Sorbitol
Maçã 0,82 ± 0,13 2,14 ± 0,43 5,31 ± 0,94 0,20 ± 0,04 Cereja 0,08 ± 0,02 7,5 ± 0,81 6,83 ± 0,74 2,95 ± 0,33 Uva 0,29 ± 0,08 9,59 ± 1,03 10,53 ± 1,04 ND Nectarina 8,38 ± 0,73 0,85 ± 0,04 0,59 ± 0,02 0,27 ± 0,04 Pêssego 5,68 ± 0,52 0,67 ± 0,06 0,49 ± 0,01 0,09 ± 0,02 Pêra 0,55 ± 0,12 1,68 ± 0,36 8,12 ± 1,56 4,08 ± 0,79 Ameixa 0,51 ± 0,36 4,28 ± 1,18 4,86 ± 1,3 6,29 ± 1,97 Kiwi 1,81 ± 0,72 6,94 ± 2,85 8,24 ± 3,43 ND Morango 0,17 ± 0,06 1,8 ± 0,16 2,18 ± 0,19 ND
ND: não detectado (até 0,05g/100ml) I.6.3 – Ácidos orgânicos
A maioria dos frutos é ácida. Certos frutos tais como limões e limas contêm até 2-3 % do seu peso fresco total em ácido. A acidez total titulável, os ácidos orgânicos específicos presentes, a sua quantidade respectiva e outros factores influenciam a sua capacidade tampão e afectam o pH. Geralmente o teor de ácido diminui durante o amadurecimento devido a utilização dos ácidos orgânicos na respiração ou a sua conversão em açúcares. Os ácidos málico e cítrico são os mais abundantes nos frutos, excepto nas uvas (onde o ácido tartárico é o mais importante na maioria dos cultivars) e nos kiwis (onde o ácido quínico é o mais abundante) (Tabela 3).
Os ácidos orgânicos são produtos intermediários importantes do metabolismo. O ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido tricarboxílico) é a via principal para a oxidação dos ácidos orgânicos nas células vivas e fornece a energia necessária para a manutenção da integridade da célula. Os ácidos orgânicos são metabolizados em muitos constituintes incluindo aminoácidos os quais são a base da formação das proteínas. Os principais ácidos são o ácido cítrico, o tartárico e o málico [29].
Piruvato Acetil CoA Citrato oxaolacetato Malato CO2 Enzima málica Piruvato desidrogenase
Malato desidrogenase Citrato sintase
Tabela 3 – Ácidos orgânicos em alguns frutos Ácido orgânico, mg/100ml de sumo
Fruto Cítrico Ascórbico Málico Quínico Tartárico
Maçã ND Ve 518 ± 32 ND ND Cereja ND Ve 727 ± 20 ND ND Uva Ve Ve 285 ± 58 ND 162 ± 24 Kiwi 730 ± 92 114 ± 6 501 ± 42 774 ± 57 Ve Nectarina 140 ± 39 Ve 383 ± 67 136 ± 28 ND Pêssego 109 ± 16 Ve 358 ± 72 121 ± 11 Ve Pêra ND Ve 371 ± 16 220 ± 2 ND Ameixa ND Ve 294 ± 24 214 ± 68 ND Morango 207 ± 35 56 ± 4 199 ± 26 ND ND
ND: não detectado; Ve : vestígios (<10 mg/100ml)
O principal ácido orgânico usado na respiração é o malato. A única utilização do malato como substrato da respiração é mediada pela enzima málica, e sua actividade está difundida nos tecidos vegetais. Nos frutos, existem a enzima málica NADPH dependente citossólica e a enzima málica NAD dependente mitocondrial. Estas enzimas catalizam a descarboxilação reductiva do malato a piruvato, permitindo assim a introdução do carbono do malato no ciclo de Krebs sem qualquer exigência para a produção do piruvato pela via de glicólise (Figura 10).
H2O CoA-SH 2 3 Piruvato Acetil CoA Citrato Isocitrato α-Cetoglutarato Succinil-CoA Succinato Fumarato Malato Oxaloacetato NAD -NADH+H+ CO2 CO2 CoA-SH CoA-SH GTP GDP+Pi NAD -NAD -NAD -NADH+H+ NADH+H+ NADH+H+ CO2 H2O FAD FADH2 1 4 5 6 7 8 9
Quando o malato é usado como substrato da respiração, o aumento do fluxo parece ser acompanhado pelo aumento da actividade da enzima málica. Outros ácidos orgânicos como os ácidos cítrico e sucínico podem entrar directamente no ciclo do ácido tricarboxílico (Figura 11) [28].
Enzimas:
1- Complexo piruvato desidrogenase: Piruvato desidrogenase Diidrolipóide transacetilase Diidrolipoide desidrogenase 2- Citrato sintase 3- Aconitase 4- α-Cetoglutarato desidrogenase 5- Succinato tiocinase 6- Fumarase 7- Malato desidrogenase
Este processo de energia ocorre nas mitocôndrias das células do sumo. A célula do suco é alongada e quando associada à outras células, forma vesículas de suco. No fruto, as vesículas são organizadas em secções. Como a célula cresce, o fluido da seiva das árvores carregado de hidratos de carbono fluí até o fruto e às células do suco. Os vacúolos celulares que tem uma função de armazenamento alimentar para a célula, vão absorver o fluido aquoso de hidratos de carbono. Com o amadurecimento do fruto, os vacúolos vão crescer e assim ocupar todo o volume celular. O fluido dos vacúolos torna-se o sumo do citrino. Com esta acumulação, as mitocôndrias, as organelas ao lado dos vacúolos vão gerar a formação dos ácidos via o ciclo de Krebs. Os hidratos de carbono são dissociados em piruvato na membrana da mitocôndria. Uma vez dentro da mitocôndria, o piruvato entra no ciclo produzindo vários ácidos.
O ácido cítrico é o primeiro ácido formado no ciclo. Uma das explicações mais lógicas da formação do ácido cítrico parece ser que logo a sua formação na mitocôndria, o ácido cítrico migra através das membranas das organelas dentro do vacúolo antes de poder continuar o ciclo. É evidente que as mitocôndrias são muito activas durante todo o tempo de vida do fruto, indicando que nem todo o ácido cítrico sai da mitocôndria, mas algum continua no ciclo para fornecer energia para o crescimento e o amadurecimento do fruto. Alguns observadores sugeriram que a enzima aconitase que converte o ácido cítrico em ácido aconítico pode estar dormente nas primeiras etapas da maturidade do fruto. Foi estipulado que a inactividade resulta de uma acumulação antecipada de ácido cítrico no fruto. Com o amadurecimento do fruto, a enzima aconitase torna-se mais activa, o ácido cítrico continua no ciclo fornecendo energia muito necessária para desenvolvimento do fruto resultando numa diminuição ou o fim da acumulação do ácido cítrico no vacúolo celular do suco. Contudo, a acumulação dos hidratos de carbono e da água continua no vacúolo, provocando uma diluição da concentração ácida, dando uma diminuição característica da acidez ou amargura do fruto com a maturidade [31].
I.6.4 – Vitaminas
As vitaminas solúveis em água envolvem a Vitamina C (ácido ascórbico), a Vitamina B (tiamina), a Riboflavina, a Niacina (ácido nicotínico), a Vitamina B6, o ácido fólico, a Vitamina B12, a Biotina e o ácido pantoténico. As vitaminas solúveis em gordura
