UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO UNIFESP GUSTAVO BARBOSA DOS REIS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – UNIFESP 

GUSTAVO BARBOSA DOS REIS 

PREPARAÇÃO DE ETIQUETAS ÓPTICAS POR REAÇÃO DE UGI 

4­COMPONENTES (UGI­4CR) PARA A DETECÇÃO DE 

MICROCISTINAS 

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – UNIFESP 

GUSTAVO BARBOSA DOS REIS 

PREPARAÇÃO DE ETIQUETAS ÓPTICAS POR REAÇÃO DE UGI 

4­COMPONENTES (UGI­4CR) PARA A DETECÇÃO DE 

MICROCISTINAS 

Trabalho  de  conclusão  da  unidade 

curricular  Projetos  Dirigidos  em 

Química, como requisito parcial para 

a obtenção do grau de Bacharel em 

Química. 

Prof.  Dr.  DIOGO  DE  OLIVEIRA 

SILVA ­ Orientador 

                                                                  Dados Internacionais da Catalogação na Publicação  (CIP)      Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas,  Campus Diadema da Universidade Federal de São Paulo, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)      dos Reis, Gustavo Barbosa  PREPARAÇÃO DE ETIQUETAS ÓPTICAS POR REAÇÃO DE  UGI 4­COMPONENTES (UGI­4CR) PARA A DETECÇÃO DE  MICROCISTINAS / Gustavo Barbosa dos Reis. – – Diadema, 2021.  95 f.    Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química) ­  Universidade Federal de São Paulo ­ Campus Diadema, 2021.    Orientador: Diogo de Oliveira Silva    1. Reações multicomponentes. 2. UGI­4CR. 3. Derivatização. 4.  Microcistina. 5. LC­MS. I. Título. 

                                        Um brinde a mim, a mim mesmo  Que mudou tanto que continua o mesmo  Ego, egoísmo, não achei o meio termo  Além do mundo que vivemos em comum  Nada temos  (Febem)        De uma ignorância enciclopédica  (Nelson Rodrigues)    

A  utopia  está  lá  no  horizonte.  Me  aproximo  dois  passos,  ela  se  afasta  dois  passos. Caminho dez passos e o horizonte corre dez passos. Por mais que eu 

Agradecimentos    Em primeiro lugar, minha mãe e meu padrasto (que considero como pai).  Sem o apoio deles, eu não estaria aqui. Pelo mesmo motivo, agradeço a minha  tia, tio e primo;   A meu pai que, a sua maneira, me ajudou a poder chegar aonde estou;   Ao  Bruno  e  Matheus  por  todo  o  companheirismo,  apoio,  histórias  e  icônicas frases em todos esses anos. Tenho certeza os que levarei para a vida;  Aos amigos e colegas que fiz na faculdade. Tive muita sorte nesses anos  vividos na UNIFESP, mesmo em meio de tantas coisas difíceis que ocorreram  nesse interim. O meu forte e leal abraço para Marcos, Vinicius, Natan, Arthur,  Cris, Rafa, Carol, Isadora, Possebão e 14;   Ao pessoal do laboratório por toda as ajudas, risadas e motivações que  me deram ao longo desses anos. Aprendi muita coisa no laboratório 10 que irei  levar, com toda certeza, para a vida. Obrigado Ana, Ju, Renan, Dani e Helo;   Ao Professor Diogo por todos os ensinamentos, conselhos e brincadeiras  durante todos esses anos.  

As  minhas  avós  que  vieram  a  falecer  durante  a  minha  jornada  na  faculdade. Peço desculpas por nunca ter falado por qual motivo eu ficava tanto  tempo na universidade. Desculpas por ser um neto tão relapso;   Por fim, ao CNPq pela bolsa e a UNIFESP pela infraestrutura.                          

Resumo   

Em locais onde os efluentes não recebem o tratamento adequado, antes de  retornar aos corpos d’água, ocorrerá um aumento de nutrientes disponíveis no sistema  aquático  (eutrofização)  e  consequente  aumento  na  quantidade  de  cianobactérias, e microorganismos, evento conhecido como blooming. Por sua  vez, esses produzem metabólitos que podem ser nocivos aos humanos, como  as microcistinas (MCs). 

MCs  são  heptapeptídeos  cíclicos  de  alta  toxicidade  hepática  e  adicionalmente podem causar danos  em outros órgãos como os  rins, cérebro,  intestino  e  pulmão.  Dado  que  mesmo  em  baixas  concentrações,  as  MCs  são  nocivas ao organismo humano, o monitoramento destas em águas destinadas  ao  consumo  humano,  recreação  e  em  ambientes  aquáticos  onde  são  obtidos  alimentos, é de extrema importância. No entanto, esses compostos apresentam  um desafio analítico, pois absorvem pouca energia na região visível do espectro,  minimizando a eficácia de análises que utilizam de detecção óptica. Assim, se  faz necessário lançar mão de técnicas mais sensíveis de detecção, como HPLC­ MS ou processos de derivatização.     No cenário da derivatização dessa toxina, é necessário que o probe a ser  utilizado apresente um bom rendimento quântico de absorção na região do UV­ Vis. À luz deste critério, as reações de UGI 4­Componentes (UGI­4CR) fazem­ se  interessantes,  pois  os  adutos  reacionais  apresentam  cadeias  laterais  que  apresentam grande diversidade.  

Palavras­Chave:  Reações  Multicomponentes;  UGI­4CR,  derivatização;  microcistinas; LC­MS. 

Abstract   

At places where effluents don’t have any kind of treatment, before return  to  dams,  an  increase  of  available  nutrients,  and  a  consequent  increase  in  cyanobacteria’s population, will happen. This event is known as blooming. In turn,  these bacterias may produce metabolites, microcystins (MC), that are harmful to  humans. 

MC is a class of cycleheptapetides with high hepatic toxicity and can harm  other  tissues  like  the  brain,  kidneys,  lungs  and  intestines.  Even  in  low  concentrations,  MCs  are  harmful.  Thus,  monitoring  of  water’s quality has an  elevated  necessity.  And  this  can  be  extrapolated  to  waters  for  recreation  and  used  in  plantations  and  seafoods.  However,  this  compound  has  an  analytic  challenge, as it absorbs a little quantity of UV­VIS energy, which makes difficult  analysis in  optics  detectors. Thus, it  becomes  necessary  for a  higher sensitive  analysis, like HPLC­MS, or processes of derivatization. 

On the derivatization way of toxin, the probe that is going to be used must  have  a  high  quantum  yield  on  UV­VIS  region.  So,  the  UGI­4CR  reactions  are  highlighted.  Because  its  reactions  adducts  can  offer  this  with  it  feature  replaceable side chains.     Keywords: Mullticomponent Reactions, UGI­4CR, Derivatizations, microcystins,  LC­MS                    

Sumário    1. Introdução e justificativa ... 13 1.1 Microcistinas ... 13 1.2 Casos de contaminação ... 15 1.3 Análise de Microcistinas ... 16 1.3.1 Análise Biológica ... 16 1.3.2 Análise Química ... 17 1.4 Derivatização ... 19 1.5 Reações Multicomponentes ... 20 1.6 Reações de UGI ... 22 1.7 Peptóides ... 25 2. Objetivos ... 26 3. Metodologia ... 27 3.1 Materiais e reagentes utilizados ... 29 3.2 Formilação das aminas ... 29 3.3 Síntese das isonitrilas ... 31 3.4 Reações de UGI­4CR modelos ... 32 3.5 Síntese do diácido carboxílico ... 33 4 Resultados e discussões ... 35 4.1 Formilação das aminas ... 35 4.2 Síntese das isonitrilas ... 37 4.3 Reações modelo ... 38 4.3 Síntese do diácido carboxílico ... 42 4.5 Síntese do probe ideal ... 44 5. Análises de elucidação estrutural ... 46

5.3 Análises via cromatografia gasosa (GC­MS e GC­FID) ... 47 5.4 Análises via ressonância magnética nuclear (RMN)... 48 6 Conclusões e perspectivas ... 54 7 Referências ... 56 8 Apêndice ... 61                                                    

Lista de ilustrações     Figura 1. Estrutura geral de uma microcistina [7] ... 13 Figura 2. Mapa indicando a localização de diversos casos de contaminação de  microcistinas reportadas na literatura. ... 15 Figura 3. Métodos de análise de cianotoxinas, adaptada [30]. ... 16

Figura  4.  A)  Perfil  de  absorção  das  MCs;  B)  Perfil  de  absorção  das  MCs  que  apresentam triptofano em sua estrutura. ... 18

Figura  5.  Esquema  sumarizando  os  tipos  de  derivatizações  mencionadas.  A:  adição à carbonilas; B: oxidação da MC para geração do MMPB; C: reação de  Diels­Alder com dienófilo fluorescente; D: adição de Michael na porção Mdha [7]. ... 20 Figura 6. Ilustração comparativa sobre as diferentes abordagens para obtenção  da molécula alvo, [42]. ... 21 Figura 7. Gráfico referente a quantidade de artigos presentes, no web of science,  sobre "Multicomponent reactions". ... 22 Figura 8. Esquema da reação UGI­4CR. ... 22 Figura 9. Mecanismo para a reação de UGI­4CR. ... 23 Figura 10. Rota sintética utilizada pela Merck para a síntese do PZQ. ... 24 Figura 11. Rota sintética para o PZQ utilizando a UGI­4CR. ... 24 Figura 12. (a) Representação de peptídeos (b) representação de peptóides. . 25 Figura 13. Estrutura do probe ideal obtido através da UGI­4CR seguido de um  processo de redução. ... 26 Figura 14. Fluxograma dos procedimentos para as reações modelo. ... 27 Figura 15. Fluxograma de procedimentos para o probe ideal. ... 28 Figura 16. Esquema referente às principais aminas utilizadas para os processos  de formilação. ... 30 Figura 17. Esquema de síntese das isonitrilas ... 31 Figura 18. Metodologia 2 de síntese das isonitrolas. ... 32 Figura 19. Esquema da estratégia "one­pot" para os procedimentos de reações 

Figura  22.  Curva  de  nível  obtida  para  o  sistema  de  modelagem  em  análises 

quimiométricas. ... 36

Figura  23.  Espectros  de  massas  obtidos  durante  os  ensaios  de  fragmentação  com os produtos que apresentavam átomos de cloro na estrutura. ... 40 Figura 24. Fragmentos observados durante os ensaios de fragmentação. ... 41 Figura 25. Produtos de reações modelo e rendimentos reacionais. ... 42 Figura 26. Esquema de síntese do probe ideal ... 44 Figura 27. Cromatogramas e espectros de massas do composto C11 ... 45 Figura 28. Cromatograma e espectro de massas do C1 ... 61 Figura 29. Cromatograma e espectro referente ao C2 ... 62 Figura 30. Espectro de RMN 1_{H do C2 ... 63} Figura 31. Cromatograma e espectro referente ao C3 ... 64 Figura 32. Espectro de RMN 1_{H do C3 ... 65} Figura 33. Espectro de RMN 13_{C do C3 ... 66} Figura 34. Espectro de RMN COSY do C3 ... 67 Figura 35. Cromatograma e espectro de massas do produto C4 ... 69 Figura 36. Cromatograma e espectro de massas do produto C4 ... 70 Figura 37. Espectro de RMN 1_{H do C4 ... 71} Figura 38. Espectro de RMN 13_{C do C4 ... 72} Figura 39. Espectro de RMN HSQC do C4 ... 73 Figura 40. Espectro de RMN COSY do C4 ... 74 Figura 41. Espectro de massas do composto C5 ... 75 Figura 42. Espectro de massas do composto C5 ... 76 Figura 43. Espectro de RMN 1_{H do composto C5 ... 77} Figura 44. Espectro de RMN 13_{C referente ao C5 ... 78} Figura 45. Espectro de RMN HSQC do composto C5 ... 79 Figura 46. Espectro de RMN COSY do composto C5 ... 80 Figura 47. Espectro de massas do composto C6 ... 81 Figura 48. Espectro de RMN 1H do composto C6 ... 82 Figura 49. Espectro de massas do composto C7 ... 83 Figura 50. Espectro de massas do composto C7 ... 84 Figura 51. Espectro de RMN 1_{H do composto C7 ... 85} Figura 52. Espectro de RMN 13_{C do composto C7 ... 86}

Figura 54. Espectro de RMN COSY do composto C7 ... 88 Figura 55. Cromatograma e espectros de massas do composto C8 ... 89 Figura 56. Cromatograma e espectros de massas do composto C8 ... 90 Figura 57. Espectro de RMN 1_{H do composto C8 ... 91} Figura 58. Espectro de RMN 13_{C do composto C8 ... 92} Figura 59. Espectro de RMN HSQC do composto C8 ... 93 Figura 60. Espectro de RMN COSY do composto C8 ... 94 Figura 61. Análise de GC­MS do composto C9 ... 95 Figura 62. Espectro de RMN 1_{H do composto C9 ... 96} Figura 63. Espectro de RMN 13_{C do C9. ... 97} Figura 64. Espectros de massas referente ao C10 ... 98 Figura 65. Espectros de massas referente ao C10 ... 99 Figura 66. Análises de ensaios sobre MS/MS do C10... 99 Figura 67. Espectro de RMN 1_{H do composto C10 ...100} Figura 68. Espectro de RMN 13_{C do composto C10 ...101} Figura 69. Espectro de RMN COSY do composto C10. ...102     Lista de tabelas    Tabela 1. Tabela sumarizando desempenho de diferentes metodologias ... 35 Tabela 2. Tabela sumarizando os valores obtidos para o sistema de modelagem ... 37 Tabela 3. Tabela com aspectos físicos das formamidas obtidas. ... 37 Tabela 4. Tabela de sumarização de resultados obtidos das reações modelo 38 Tabela 5. Tabela com espectros de  massas de produtos com átomos de cloro  em sua composição molecular. ... 39 Tabela 6. Aspectos físicos dos compostos obtidos nas reações modelo. ... 42 Tabela 7. Rendimentos reacionais nas etapas de síntese do diácido chave. .. 43 Tabela 8. Características físicas dos compostos ... 44

1.  Introdução e justificativa  1.1 Microcistinas  

  As  microcistinas  (MC)  são  metabólitos  secundários  de  processos  de  biossínteses  de  fitoptigmentos  [1]  de  algumas  cianobactérias.  MCs  são  as  espécies de toxinas mais recorrentes, pois podem ser produzidas por mais de  uma  espécie  de  cianobactéria  [2].  Além  disso,  estudos  indicam  que  esses  metabólitos  estariam  correlacionados  com  o  controle  populacional  desses  próprios microorganismos [3]. 

  Tais compostos apresentam a forma de um heptapeptídeo cíclico. Onde  se fazem presentes três D­aminoácidos, dois aminoácidos não usuais, além de  outros  dois  que  podem  variar  [1],  [3]–[6].  Os  aminoácidos  incomuns,  que  se  fazem presentes na estrutura, são: 3­amino­9­metoxi­10­fenil­2,6,8­trimetildeca­ 4,6­ácido dienóico (Adda) e N­metildehidroalanina (Mdha). 

As  MC  são  usualmente  compostas  por  Ala­2­isoMeAsp­4­Adda­isoGlu­ Mdha, onde os aminoácidos variáveis são justamente os que se encontram nas  posições  2  e  4  (Figura  1).  E  estas  substituições  são  responsáveis  por  cada  estrutura  receber  um  nome.  Como,  por  exemplo,  as  MC­LR  apresentam  uma  estrutura  como  a  representada  na  imagem,  pois  nas  posições  2  e  4  se  fazem  presentes a leucina e a arginina, respectivamente [7].  

  Devido  a  essas  possíveis  variações,  já  foram  descritas  uma  grande  quantidade de diferentes microcistinas [8]–[10].  

  Os danos causados pela toxina têm como axioma a forma com que ocorre  o contato, que pode ocorrer por ingestão de alimentos ou águas contaminadas,  além de contato na pele através de água destinada para recreação (como em  lagos  e  represas).  Os  sintomas  clássicos  podem  ir  desde  irritações  na  pele,  vertigem,  fadiga,  vômitos,  cólicas  abdominais,  comprometimento  hepático,  dependo de como ocorre a contaminação [4] e se os valores de concentração  estiverem acima do recomendado pela Organização Mundial de Saúde [11].  

As  MCs,  por  apresentarem  um  caráter  polar  têm  sua  passagem  pela  membrana celular dificultada, sendo necessário que algum tipo de transportador  atue  no  sistema.  Essa  hipótese  justificaria  a  nocividade  em  órgãos  como  o  fígado, o rim, pulmão e o cérebro, pois são tecidos que apresentam em maior  concentração  um  tipo  de  transportador  nas  membranas  celulares.  Esses  são  transportadores de ânions orgânicos  (OATP) [3], que seria o responsável  pelo  transporte. 

Quando  a  toxina  chega  ao  fígado,  as  proteínas  fosfatases  1  e  2A,   responsáveis pela forma e a estruturas dos hepatócitos, são inibidas [6], [12]– [14].  Além  disso,  a  sua  atividade  dentro  dos  hepatócitos  fomenta  o  desenvolvimento de tumores no fígado [2, 12]. O mecanismo de inibição dessas  proteínas estaria correlacionado com as interações intermoleculares do resíduo  Adda  com  as  porções  hidrofóbicas  das  fosfatases,  seguido  de  reações  irreversíveis  dos  resíduos  de  grupos  tiois  presente  nas  cisteínas  destas  proteínas (Cys­273 na fosfatase 1 e a Cys­266 na 2ª) com a porção Mdha [4, 7,  12].            

1.2 Casos de contaminação    

Os tratamentos de quadros de contaminação tendem a ser difíceis, pois  os  ataques  aos  hepatócitos  são  rápidos,  irreversíveis  e  severos  [12],  logo,  é  possível  perceber  o  motivo  destas  serem  consideradas  um  dos  maiores  problemas  de  contaminação  de  água  [15].  Com  isso  em  vista,  é  de  fácil  compreensão a necessidade de que ocorra um monitoramento da concentração  desse tipo de composto em águas destinada ao consumo humano e a recreação.  

Um claro exemplo da importância de realizar tais procedimentos analíticos  no  controle  de  qualidade  da  água  é  o  caso  de  uma  clínica  de  tratamento  de  hemodiálise  em  Caruaru.  Em  1996,  60  pessoas  morreram  por  exposição,  durante o tratamento à água com elevadas concentrações de MCs [16], [17].  

Ademais,  estudos  indicam  que  processos  de  bioacumulação  destas  toxinas  são  comuns  [1],  o  que  justificaria  a  presença  dessas  em  diversos  alimentos,  desde  vegetais  [10],  peixes  [18],  frutos  do  mar  [19]  e  suplementos  alimentares a base de algas no comércio italiano [9].  Além dos diversos casos  de contaminação de represas de água [18], [20­29]. A figura 2 mostra as diversas  localidades com casos de contaminação supracitados.          Figura 2. Mapa indicando a localização de diversos casos de contaminação de microcistinas reportadas na  literatura. 

1.3  Análise de Microcistinas   

Para evitar que mais casos de contaminação tragam maiores complicações  torna­se  necessário  uma  maior  quantidade  monitoramento  de  águas  e  de  possíveis alimentos que entrem em contato com esta fonte. Para realizar este  tipo  de  análise,  porém,  são  necessárias  técnicas  sensíveis  para  realizar  uma  quantificação  com  confiabilidade,  que  consigam  diferenciar  as  diferentes  cianotoxinas  que  estarão  presentes  no  meio  e  que  atenda  baixos  níveis  de  concentração  [30].  À  luz  deste  cenário,  são  utilizadas  duas  principais  metodologias:  as  análises  biológicas  e  as  químicas  (também  chamadas  de  métodos analíticos) [30], onde elas se diferem no princípio de detecção.   

Na  figura  3,  adaptada  de  Kaushik  e  colaboradores,  podemos  verificar,  de  maneira mais ampla, as principais ramificações de análises para a detecção de  cianotoxinas.      Figura 3. Métodos de análise de cianotoxinas, adaptada [30].    1.3.1 Análise Biológica      As análises biológicas e de toxicidade são testes simples e rápidos que 

análises biológicas  têm quando comparadas com as  análises químicas. Como  foi possível visualizar na figura 3, as análises biológicas são  divididas em  três  grandes grupos. 

  O  bioensaio  de  todos  os  organismos  é  a  maneira  mais  simples  dos  métodos  nesta  categoria,  porém,  sua  principal  limitação  está  na  baixa  especificidade  e  sensibilidade,  além  das  questões  de  ética  devido  ao  fato  dos  ensaios  serem  realizados  em  ratos  que  são  submetidos  à  dores  e  morte.  Normalmente este tipo de análise é direcionada para mensurar a toxicidade de  um blooming [30]. 

  As  análises  bioquímicas,  também  conhecidas  como  métodos  ELISA  (Enzyme­linked  immunosobert  assay),  estão  correlacionadas  com  as  inibições  causadas por cianotoxinas em algumas enzimas responsáveis pelos processos  de  fosforilação  [30],  [31].  E,  através  deste  processo,  é  possível  determinar  a  concetração de microcistinas mesmo em quantidades diminutas, por exemplo. A  principal limitação deste procedimento é que não é possível realizar a determinar  qual espécie de microcistina está presente no meio, além do fato de as enzimas  poderem ser inibidas por outras substâncias que não as cianotoxinas [31].     Ademais,  as  análises  imunológicas  são  testes  que  determinam  as  concentrações  utilizando  de  reações  dos  antígenos,  nestes  casos  seriam  as  toxinas, com os anticorpos. Estes ensaios conseguem atingir os limites máximos  de  concentração  de  microcistinas  em  águas,  como  foi  delimitado  pela  Organização Mundial da Saúde [11], [30].   

1.3.2 Análise Química   

  O principal ponto negativo das análises biológicas é a limitação sobre a  capacidade  de  identificar  os  diferentes  tipos  de  MCs  [32].  Em  contrapartida,  é  possível realizar esta diferenciação em algumas técnicas analíticas. Os métodos  analíticos  podem  serem  divididos  em  três  grandes  classes,  como  foi  possível  verificar na figura 3.  

  A  primeira  grande  área  é  a  análise  das  MCs  se  dá  pelas  técnicas  que  utilizam  detectores  de  espectrometria  de  massas,  o  que  inclui  as  análises  de 

 Desde  seu  desenvolvimento,  o  MALDI­TOF­MS  (Matrix­assisted  laser  desorption/ionization time­of­flight mass spectrometry). [33], é utilizado nas áreas  de pesquisa de peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos [32], onde todos tendem  a apresentar uma elevada massa.   As técnicas que utilizem métodos de espectrometria de massas apresentam  a capacidade de diferenciar as possíveis variantes de MCs presentes em uma  amostra,  devido  a  formação  dos  íons  fragmentos  que  podem  ser  gerados  na  técnica. Porém, a quantidade limitada de padrões comerciais tendem [34], [35] a  restringir as possíveis quantificações em procedimentos de monitoramento, por  exemplo. 

A principal limitação de aplicação destas técnicas, principalmente em áreas  com  uma  infraestrutura  limitada,  são  os  custos  inerentes  ao  uso  de  equipamentos como o LC­MS e o MALDI­TOF­MS.  

Por outro lado, dentro dos métodos analíticos, as formas de detecção óptica,  que  normalmente  são  acopladas  à  técnicas  de  separação  cromatográficas,  tendem a ser uma boa saída.   As MCs apresentam um padrão de absorção em 238 nm, onde a porção Adda  é responsável por este. Porém, caso estas apresentem o triptofano em uma das  posições que variam os aminoácidos, este perfil é levemente alterado [36] , como  é possível visualizar na imagem 4.    

A  principal  limitação  destas  técnicas  é  o  limite  de  quantificação.  Como  as  MCs  não  apresentam  uma  absorção  elevada,  por  conta  da  sua  estrutura,  em  concentrações  baixa,  onde  estas  já  podem  apresentar  alguma  toxicidade  ao  organismo, análises via detectores ópticos tendem a ser ineficientes.  

À  luz  deste  cenário,  um  procedimento  efetivo  para  melhorar  o  perfil  de  absorção  das  MCs,  tornando  as  metodologias  de  detecção  ópticas  mais  sensíveis e auxiliando o monitoramento destas toxinas em equipamentos mais  acessíveis, são as reações de derivatização.  

1.4  Derivatização    

Embora  a  necessidade  de  monitoramento  seja  evidente,  a  análise  das  MCs é um desafio analítico, pois a estrutura não apresenta um grupo cromóforo  na  região  do  UV,  exceto  a  porção  Adda  que  é  a  responsável  pelo  máximo  de  absorção  em  λ  238  nm  [4],  e  em  222  nm  quando  a  estrutura  apresenta  um  triptofano [7].  

O  estratagema  de  derivatização  desses  compostos,  visando  facilitar  as  análises  através  da  utilização  de  um  grupo  cromóforo,  é  a  forma  mais  prática  para  abordar  a  problemática,  pois  poderiam  ser  utilizados  equipamentos  mais  simples,  consequentemente  menos  sensíveis  para  realizar  a  quantificação  destas substâncias, causando uma redução nos custos operacionais.   

As principais formas de derivatização da toxina são: (i) oxidação da porção  Adda visando a geração do 2­metil­3­metoxi­4­ácidofenilbutírico (MMPB) [37] ou  reações  de  Diels­Alder  com  dienófilos  que  apresentem  estruturas  cromóforas  [38],  (ii)  realizando  adições  às  carbonilas,  utilizando  hidrazidas  derivadas  de  pirenos, que estariam presentes nos ácidos carboxílicos de cadeias laterais do  heptapeptídeo [39] e (iii) reações de adição 1,4 α­β insaturados na porção Mdha,  utilizado,  como  doadores  de  Michael,  grupos  tiós  para  análises  de  LC­MS  e  MALDI [6], [8], [40], como mostra a figura 5. 

Figura  5.  Esquema  sumarizando  os  tipos  de  derivatizações  mencionadas.  A:  adição  à  carbonilas;  B:  oxidação da MC para geração do MMPB; C: reação de Diels­Alder com dienófilo fluorescente; D: adição de  Michael na porção Mdha [7]. 

1.5 Reações Multicomponentes   

Em  um  cenário  onde  o  objetivo  é  produzir  uma  determinada  molécula,  com  uma  certa  complexidade,  existem  três  principais  formas  para  obter  esta:  síntese  linear,  conversões  [18],  [19]  ou  derivação  de  produtos  naturais  [41]  e  reações  multicomponentes  [42].  Cada  abordagem  tem  a  suas  vantagens  e  desvantagens  para  molécula  individualmente.  Tripolitsiotis  e  colaboradores  ilustraram de maneira bem clara as diferenças nas abordagens sintéticas, e esta  está exposta na figura 6 [42].  

Figura 6. Ilustração comparativa sobre as diferentes abordagens para obtenção da molécula alvo, [42]. 

Reações  multicomponentes  são  aquelas  que  utilizam  mais  de  três  materiais  de  partida  de  maneira  simultânea.  Neste  tipo  de  abordagem,  quase  todos  os  átomos,  dos  reagentes,  se  fazem  presente  no  produto  obtido  [43]  e,  devido a este fato, esta abordagem é considerado um procedimento convergente  [44].  

Quando  comparada  com  as  sínteses  lineares,  as  reações  multicomponentes apresentam vantagens operacionais. Por ser possível chegar  em  uma  estrutura  complexa  em  poucos  procedimentos,  há  uma  economia  considerável  em  todos  os  insumos  inerentes  ao  processo,  como  solventes  (utilizados  para  os  processos  de  purificação),  poder  gerar  uma  grande  quantidade  de  estruturas  diferentes  variando  poucos  reagentes,  tempo  de  instrumentos para caracterização de estrutura, entre outras [43] [45].  

E devido a estes, as reações multicomponentes estão ganhando cada vez  mais espaço dentro da comunidade acadêmica, como fica explícito pelo gráfico  presente na imagem 7, que mostra a crescente de publicações que sobre o tema  “Multicomponent reactions” no Web of Science nos últimos 25 anos. 

  Figura 7. Gráfico referente a quantidade de artigos presentes, no web of science, sobre "Multicomponent  reactions".     1.6 Reações de UGI     Em 1960, Ugi e colaboradores, publicaram os primeiros resultados de um  novo procedimento de reações para a condensação de aminas, compostos oxos  (cetonas  ou  aldeídos),  agentes  nuceofílicos  que  reagiam  bem  com  isonitrilas,  como  está  ilustrado  na  figura  8.  Estas  reações  eram  caracterizadas  por  altos  rendimentos reacionais e por serem exotérmicas [46].       Figura 8. Esquema da reação UGI­4CR.    Dentre as reações multicomponentes que são conhecidas, as reações de  UGI 4­Componentes apresentam um diferencial: os produtos por ela gerada tem  como característica serem peptóides (que serão melhor explicados no tópico 1.7)  onde  os  nitrogênios  apresentam  cadeias  laterais  diferentes  de  átomos  de  hidrogênio, que são comuns em peptídeos [43], [47].   

nucleofílico  da  isonitrila  à  imina  (base  de  Schiff)  (a)  e  subsequente  ataque  nucleofílico do íon carboxilato ao íon imínio resultante. Por fim, o α­aduto  intermediário  (b)  sofre  a  reação  de  acilação  intramolecular  denomina  de  rearranjo  de  Mumm,  o  que  leva  à  formação  do  produto  diamida  (c),  como  demonstrado na figura 9. Todas as etapas desta clássica proposta mecanística,  com exceção da etapa do rearranjo de Mumm, estão em equilíbrio. Ademais, o  único  subproduto  da  reação  é  uma  molécula  de  água  produzida  durante  a  formação da imina [46], [47]. 

Figura 9. Mecanismo para a reação de UGI­4CR. 

Observando  a  proposta  mecanística  é  possível  notar  que  dentre  as  diversas  etapas reacionais, apenas  uma delas tem a eliminação de átomos, o  restante, são reações de adição ou rearranjo, o que justifica a sua economia de  átomos  e  o  aproveitamento  quase  que  em  totalidade  dos  átomos  envolvidos,  uma característica marcante em reações multicomponentes. 

  Como fica ilustrado, há uma grande variabilidade possível de ser obtida  através das cadeias  laterais dos materiais  de partida (as aminas, os  aldeídos,  ácidos  carboxílicos  e  isonitrilas)  que  podem  ser  utilizados.  Esta  estratégia  é  utilizada para obter estruturas com diversas finalidades como  o desenvolvimento  de novas estruturas com características antileishimanial [48],  de estruturas com  características  para  inibidores  do  HIV  [49],  para  a  síntese  de  compostos  heterocíclicos  chaves  [50]–[56],  probes  para  análises  biológicas  [57]  e  em  processos de otimização de processos na indústria farmacêutica [43].  

Este  último  exemplo  pode  ser  ilustrado  pela  produção  do  praziquantel  (PZQ),  que  é  utilizado  no  tratamento  de  esquistossomose  [58]  e  teve  seu  primeiro report no final da década de 70 [59] e teve várias otimizações na sua 

Merck,  produtora  do  fármaco,  utiliza  da  rota  sintética  da  figura  10  para  prepará­lo. Porém, utilizando de uma abordagem multicomponente, como visto  na imagem 11, o PZQ pode ser obtido em uma  quantidade muito reduzida de  procedimentos,  além  de  ser  possível  a  produção  de  estruturas  análogas  variando poucos reagentes [61], [62].      Figura 10. Rota sintética utilizada pela Merck para a síntese do PZQ.      Figura 11. Rota sintética para o PZQ utilizando a UGI­4CR.    Com os exemplos supracitados, a praticidade [63] e a versatilidade para  se  obter  uma  quimioteca  com  pluralidade  estrutural  [43],  [48],  [64],  [65],  em  poucos  passos,  faz  com  que  esta  metodologia  seja  relevante  para  o  desenvolvimento do projeto. 

1.7 Peptóides   

  Peptóides é  uma classe de oligômeros, que  não  ocorrem  naturalmente,  que  se  assemelham  com  peptídeos  e  proteínas  naturais.  Esta  mimetização  é  derivada  do  fato  das  amidas,  presentes  nestas  estruturas,  apresentarem  substituições em seus nitrogênios [48], [65], como fica notório na imagem 12.    

Figura 12. (a) Representação de peptídeos (b) representação de peptóides. 

  Estas  estruturas,  são  os  esqueletos  gerados  pela  reação  de  UGI­4CR,  apresentam  algumas  características  que  as  tornam  relevantes.  Devido  a  substituição  nos  nitrogênios,  há  uma  redução  na  quantidade  de  interações  de  hidrogênio  disponíveis,  tornando  a  estrutura  menos  polar.  Com  isto,  a  sua  permeabilidade  em  membranas  de  difusão  passiva  é  facilitada  [48].  Outra  consequência  deste  padrão  de  substituição  é  a  resistência  aos  processos  de  proteólise em diversos organismos [48], [63], [65], o que é de extrema relevância  para o desenvolvimento de novos compostos com potenciais biológicos.  

1.  Objetivos    

  À luz do cenário supracitado, o foco do trabalho é a obtenção de um probe  com estrutura cromófora através de reações de UGI­4CR. Entretanto, para isso  é necessário cumprir alguns passos intermediários: 

•  Determinar  qual  é  a  melhor  metodologia  para  o  preparo  das  aminas  formiladas; 

•  Verificar se é possível realizar a síntese da isonitrila e utilizá­la “in situ” nas reações de UGI­4CR; 

•  Determinar, de maneira exploratória, quais seriam os melhores reagentes  para  utilizar  nas  reações multicomponentes, as chamadas “reações modelo”. Onde os critérios utilizados será a facilidade de análise em LC­ MS e RMN dos adutos reacionais;  •  Preparar um diácido carboxílico chave, obtido através da redução de uma  mercaptana e uma reação de adição a carbonila subsequente.  Com estas etapas intermediárias cumpridas, o probe com as características  ideais para a derivatização da MC, como ilustrado na figura 13, será sintetizado.        Figura 13. Estrutura do probe ideal obtido através da UGI­4CR seguido de um processo de redução.             

2.  Metodologia   

Para  melhor  entendimento  da  metodologia,  este  tópico  será  abordado  da  maneira  que  está  ilustrado  no  fluxograma  da  figura  14,  que  contempla  cada  etapa até as reações modelo.                                             Figura 14. Fluxograma dos procedimentos para as reações modelo.               

Em seguida, no  procedimento de síntese do  diácido carboxílico chave, e  a  síntese do probe ideal, o fluxograma da figura 15 foi seguido.       Figura 15. Fluxograma de procedimentos para o probe ideal.   

Para  todos  os  procedimentos,  foram realizadas  análises  para  a  elucidação  estrutural, como GC­MS, HPLC, LC­MS, RMN (1_H, 13_{C e os bidimensionais caso}  necessário). 

3.1 Materiais e reagentes utilizados   

Os  equipamentos  e  materiais  utilizados  foram:  vortex  (Vixar);  balança  analítica (Shimadzu); rotaevaporador (Büchi); pipetas ajustáveis de 100, 200 e  1000 μL (HTL); purificador de água (Elga); agitador magnético (Fisatom e Logen); microtubos de 1,5 e 2,0 mL (Axygen); ponteiras descartáveis (Axygen);  banho  de  ultrassom  (Quimis),  micro­ondas  (CEM),  tubos  para  micro­ondas  de  vidro de 10 mL e vidrarias (Satelit).  

Os solventes e reagentes utilizados foram: metanol P. A. (Vetec ou Synth);  acetato de etila P.A. (Synth); diclorometano P. A. e deuterado (Vetec ou Synth);  acetonitrila (grau HPLC, Scharlau ou J.T.Baker); metanol (grau HPLC, Scharlau  ou  J.T.Baker);  água  ultrapura;  formiato  de  amônio  99,995%  (Aldrich);  ácido  fórmico  PA  (Vetec);  ácido  sulfúrico  98%  (merck);  sulfato  de  magnésio  anidro  (Merk);  sulfito  de  sódio;  iodo  molecular  (Merk);  ácido  acético  glacial  (Vetec);  bicarbonato  de  sódio  (Merck);  trietilamina  (Sigma­Aldrich);  anilina  (Baxter);  p­ metoxi­anilina;  m­bromo­anilina;  trifenilfosfina  (Fluka);  p­cloro­benzaldeído;  2  ­ etil­fenilamina (Merck); mercaptoetanol, ácido octanóico.    3.2 Formilação das aminas    A necessidade de realizar esse procedimento é justificado pelo fato de as  isonitrilas comerciais serem reagentes caros. Além disso, ao preparar as próprias  isonitrilas,  seria  possível  ter  uma  gama  maior  de  materiais  de  partida  para  as  reações de UGI.  

  A  etapa  de  formilação  foi  amplamente  estudada  durante  o  decorrer  do  período  trabalhado.  Foram  consideradas  diversas  rotas  sintéticas  para  obter  estruturas  de  interesse  [66]–[68].  Realizando  esta  abordagem,  foi  possível  verificar  as  diferenças  entre  cada  uma  e  ponderar  qual  seria  o  melhor  estratagema para uso (Figura 16).  

Figura  16.  Esquema  referente  às  principais  aminas  utilizadas  para  os  processos  de  formilação. 

  Todos  os  procedimentos  utilizaram  o  excesso  de  ácido  fórmico  (4  equivalentes de ácido para 1 de amina) para a realização da reação. Entretanto,  as  principais  diferenças  entre  os  procedimentos  estão  correlacionadas  com  a  forma de fornecer energia, via aquecimento comum  [66] ou a utilização de um  reator  de  micro­ondas  [68],  ao  sistema  e  ao  uso  ou  não  de  formiato  de  sódio  como catalizador [67].  

  No  procedimento  1,  em  4  mmol  de  ácido  fórmico  foi  solubilizado,  sob  agitação magnética, 1 mmol da amina. A reação foi levada à 60ºC via banho de  óleo ou areia. 

  No procedimento 2, a mesma quantidade de reagentes era adicionada ao  frasco. Porém, diferente da anterior, foi solubilizado 20% de equivalente molar à  amina  de  formiato  de  sódio,  o  qual  seria  o  catalisador.  E  não  foi  utilizado  aquecimento. 

  No  procedimento  3,  a  mesma  proporção  de  amina  e  ácido  foram  adicionados ao um tubo de 10 mL e encaminhados para o reator de microondas.  Nesta,  a  potência  e  o  tempo  de  reacional  variavam  de  40­80  minutos  e  200­ 300W.  

Em todos os procedimentos, após o término da reação, foi adicionado 30  mL  de  acetato  de  etila,  ou  diclorometano,  para  pausar  a  reação.  Após  isso,  a  fase orgânica era  lavada com porções de água destilada (3x 20mL) e solução  saturada de bicarbonato de sódio (1x 20mL). Após isto, era adicionado agente  secante à fase orgânica, sulfato de magnésio anidro ou sulfato de sódio, e em  seguida, era realizada a devida filtração e rotaevaporação do solvente.  

3.3  Síntese das isonitrilas   

  As  isonitrilas,  ou  isocianetos,  são  intermediários  sintéticos  altamente  reativos e que, por apresentarem características nucleofílicas e eletrofílicas, são  considerados  intermediários  chaves  para  diversas  reações.  Além  de  seus  processos  de  síntese  serem  consideradas “robustas”, ou seja, passível de realização sem muitos interferentes [69]. 

  Da mesma forma que nos processos das fomilações, foram consideradas  mais de uma metodologia para a síntese das isonitrilas em questão [69], [70]. 

A  metodologia  1  [69]  esquematizada  na  figura  17,  se  baseava  na  solubilização de 1 mmol de amina formilada e 1,5 mmol de iodo molecular em  10mL  de  diclorometano  e  a  solução  era  agitada.  Em  seguida,  após  a  total  solubilização,  1,5  mmol  de  trifenilfosfina  era  adicionada  ao  meio.  Após  solubilização, era adicionado gota a  gota 3 mmol de trietilamina. A  reação era  acompanhada via CCD até a sua estabilização.  

Figura 17. Esquema de síntese das isonitrilas    

  A  segunda  metodologia  (Figura  18)  [70],  foi  baseada  na  utilização  de  microondas.  Em  um  tubo  para  reator  de  microondas,  eram  adicionados,  em  banho  de  gelo,  1  equivalente  da  amina  formilada,  3,3  de  trietilamina  e  3  de  cloreto cianúrico (TCT) junto com o agitador magnético. Em seguida os materiais  eram  solubilizados  em  7  mL  de  diclorometano.  O  tubo  era  encaminhado  ao  microondas onde era aquecido a 50 ºC por 3 minutos.  

  Figura 18. Metodologia 2 de síntese das isonitrolas.    Devido sua elevada reatividade, a purificação de materiais como a isonitrila  é um processo complexo e estas tendem a serem degradadas. Desta forma, o  desenvolvimento de uma metodologia de síntese “in situ” das isonitrilas ganha  destaque.  Este  procedimento,  até  o  momento,  não  está  descrito  na  literatura  para o uso subsequente em reações de UGI­4CR.    3.4  Reações de UGI­4CR modelos      A realização das reações modelo é crucial no escopo do projeto. Isto se  deve ao fato de que nesta etapa foram analisadas diversas formas de abordar  essa reação. E esta análise engloba tanto procedimentos operacionais e até as  melhores  escolhas  de  materiais  de  partida  para  que  as  análises,  de  comprovação de obtenção das estruturas, fossem facilitadas.  

À luz deste cenário, foi adotado o procedimento onde as isonitrilas, utilizadas  nestas  reações,  não  sofressem  nenhum  processo  de  purificação  para  a  realização  da  reação  multicomponente,  pois,  desta  forma,  utilizando  uma  estratégia “one­pot” minimiza a perda de material em processos de extração e  até mesmo em purificação, além de reduzir a quantidade de insumos utilizados  durante  esses  procedimentos,  gerando  assim,  maior  economia.  Este  procedimento está contemplado na figura 19.  

Além disso, foram considerados diversas formas operacionais para realizar  esta etapa do projeto, desde a utilização de micro­ondas [71]–[73], visando um  menor  tempo  de  reação,  utilizando  ácidos  de  Lewis  como  catalisadores  da  reação [47], [64], [74], o uso de banho de ultrassom e, por último, agitação em  temperatura ambiente [43], [48], [75].  

Na  prática  laboratorial,  as  reações  de  UGI  foram  iniciadas  em  paralelo  às  sínteses  das  isonitrilas.  Em  um  balão,  o  aldeído,  ácido  carboxílico  e  a  amina  eram adicionadas em quantidades equimolares (porém com 10% de excesso em  relação à isonitrila utilizada) em metanol e em agitação magnética.  

As  reações  ocorriam  durante  48h,  sendo  as  duas  primeiras  horas  sem  a  adição da isonitrila ao meio, visando  formar o intermediário necessário.  Todas  as reações foram conduzidas em temperatura ambiente e em nenhuma houve a  utilização de catalisadores.  

Após o término da reação, o solvente foi rotaevaporado, purificado e depois  encaminhado para as análises de elucidação estrutural necessárias. 

Durante  a  fase  qualitativa  das  reações  modelo,  as  reações  ocorriam  em  escalas de 0,1 mmol. Após esta escala reacional foi elevada para 5 mmol, que  seria  o  suficiente  para  realizar  a  quantificação,  confiável,  dos  compostos  e  os  ensaios de caracterização.  

3.5  Síntese do diácido carboxílico   

  Após o aperfeiçoamento das condições operacionais construídas durante  os  ensaios  com  as  reações  modelo,  o  probe  de  interesse  começou  a  ser  elaborado. Um composto chave para isso é um diácido carboxílico  idealizado,  sintetizado partindo de uma mercaptana. Analisando o cenário proposto, foram  vislumbradas duas possibilidades de processos para realizar a redução dos tiois  ao dissulfeto de interesse [7], [76], [77], como mostrado na figura 20.          

Na primeira metodologia, o tiol (5 mmol) foi solubilizado em 1 mL de água.  Em outro frasco, foi dissolvido o ferricianeto de potássio (5,5 mmol) em 7 mL de  água. A solução do tiol foi adicionada ao ferricianato de potássio e encaminhado  para  o banho de ultrassom por 4  horas. Além de acompanhar o  progresso da  reação via CCD, pode­se verificar a alteração da cor da solução, onde ela passa  de castanho para verde. Após finalizada,  foram adicionados 20 mL de acetato  de etila e este era lavado com solução saturada de cloreto de sódio (3x 10mL).  Em seguida, ao meio era adicionado sulfato de magnésio anidro. Em seguida,  filtrado e concentrado.   A segunda metodologia consiste na solubilização do tiol (1 mmol) em 20  mL de acetato de etila e iodeto de sódio (0,01 mmol). Em seguida, foi adicionado,  em quantidade equimolar ao tiol, a solução de 30% de água oxigenada, sem a  necessidade de aquecimento. A reação era acompanhada via CCD. Quando o  equilíbrio foi atingido, 15 mL de uma solução saturada de sulfito de sódio foram  adicionados à reação. Em seguida, foram realizadas extrações com acetato de  etila  (3x  15mL)  e,  à  fase  orgânica  resultante,  adicionado  sulfato  de  magnésio  anidro. Após esta etapa, a solução era filtrada e a solução concentrada.  

Ambos  os  procedimentos  não  necessitam  de  processos  de  purificação  e  foram encaminhados para análises estruturais.  A partir deste composto, o diácido chave foi obtido através da utilização de  um anidrido succínico em solução de acetato de etila utilizando trietilamina como  base [78], como fica elucidado da figura 21.      Neste procedimento, o dissulfeto foi solubilizado, sob agitação magnética, em  acetato de etila, junto com a trietilamina e o anidrido succinico, e, em seguida,  Figura 21. Reação para preparação do diácido carboxílico. 

extraída  com  éter  (1x  10mL).  Em  seguida,  a  fase  aquosa  foi  acidificada  com  solução de 1 mol/L de ácido sulfúrico, até o pH estar próximo à 3. Em seguida,  a fase aquosa era extraída com éter (3x 10mL) e à esta era adicionada sulfato  de magnésio, filtrado e encaminhado para evaporar o solvente.   4  Resultados e discussões    4.1 Formilação das aminas   

Durante  os  procedimentos,  os  procedimentos  1  e  2,  com  o  uso  de  aquecimento  e  sem  aquecimento,  porém  com  uso  de  catalisador,  respectivamente, apresentam boas taxas de conversões e forneceram produtos  puros, comprovados via análises de RMN, GC­MS, como pode serem vistos nas  figuras 28 a 34 no apêndice, mesmo sem processos de purificação, como coluna  cromatográfica.  Em  contrapartida,  como  pode  ser  analisada  na  tabela  1,  a  estratégia 3, onde foi utilizado o reator de micro­ondas, apresentou uma grande  amplitude na faixa de rendimento obtido.     Tabela 1. Tabela sumarizando desempenho de diferentes metodologias     

Esta  grande  faixa  de  rendimento  foi  obtida  durante  a  tentativa  de  otimização  do  processo  através  de  métodos  quimiométricos  (Desing  of  experiments), variando potência e tempo de reação dentro do reator. Porém, não  foi possível determinar com clareza qual das duas variáveis influenciam mais no 

diferentes valores de rendimento, como pode ser visto na tabela 6 no apêndice,  tendo  em  vista  que  não  foi  realizado  nenhum  procedimento  de  extração  e  purificação, e que a quantificação foi realizado via análises de GC­FID utilizando  triplicatas de curvas de calibração (20­4000 μmol.mL­1_{) com limites de detecção}  e quantificação onde todas as amostras eram quantificadas com confiabilidade.  A figura 22 mostra a curva de nível do sistema, e a tabela de sumarização de  dados referente ao sistema de modelagem utilizado, para realizar as análises de  efeitos das variáveis operacionais, estão destacados. E neste último, analisando  o valor de r2_{=0,17584 (Tabela 2) para o sistema de modelagem, fica nítido que}  os experimentos de otimização não foram efetivos.       Figura 22. Curva de nível obtida para o sistema de modelagem em análises quimiométricas.                 

Tabela 2. Tabela sumarizando os valores obtidos para o sistema de modelagem      .    Na tabela 3, estão sumarizados os aspectos físicos dos compostos que  foram obtidos durante as formilações.     Tabela 3. Tabela com aspectos físicos das formamidas obtidas. 

Composto  Aspecto  Faixa de fusão (ºC)  Literatura (ºC) 

C1  Sólido bege  44­45  46,3­47,8 [79]   C2  Sólido bege  61­62  63­65 [80]  C3  Sólido roxo escuro  77­79  78­80 [80]    4.2 Síntese das isonitrilas   

  Os  procedimentos  sintéticos  das  isolinitrilas,  inicialmente,  envolviam  processos de extração e purificação. Porém, foi contemplado que seria possível  do  preparo  destas  “in situ”,  acarretando  os  benefícios  que  esta  abordagem  carrega, pois os subprodutos reacionais formados não atrapalhariam na reação  multicomponente, como foi possível verificar.      Ambas as estratégias de síntese apresentaram resultados satisfatórios.  Porém, a estratégia 1, que não utiliza o reator de microondas como na 2, teve  resultados mais prolíficos, pois isso se justifica pela escala reacional que foram  realizados os procedimentos. Com a limitação do volume do tubo de reação no  microondas,  seriam  necessários  repetidos  procedimentos  para  que  fossem  obtidas  as  mesmas  quantidades  satisfatórias  de  produto.    Devido  a  isso,  a  metodologia 1 foi selecionada como a principal rota sintética.  

4.3 Reações modelo    Esta etapa acontecia logo em seguida das reações de síntese de isonitrilas.  Entretanto, para a formação  dos adutos reacionais, é necessário que ocorra a  formação de uma base de Schiff, uma imina, como produto intermediário para  que ocorra uma sequência de reações e rearranjos ocorram para a obtenção do  peptóide  final  da  UGI­4CR.  Desta  forma,  enquanto  a  preparação  da  isonitrila  acontecia,  já  era  iniciado  a  reação  de  UGI  com  a  amina,  aldeído  e  ácido  carboxílico. Com a isonitrila formada, o solvente reacional foi rotaevaporado e o  sólido solubilizado em metanol e adicionado, sem nenhum tratamento prévio, na  reação multicomponente.  

O  objetivo  desse  procedimento  era  justamente  verificar  o  potencial  do  procedimento,  analisando  se  os  subprodutos  da  síntese  da  isonitrila  iriam  interferir  no  processo  de  obtenção  dos  adutos  reacionais  da  UGI­4CR.  Além  disto, como supracitado, verificar quais seriam os melhores materiais de partida,  visando  uma  análise  comprobatória  mais  simples.  A  principal  forma  de  determinar  isto  era  através  de  ensaios  de  LC­MS.  A  tabela  3  sumariza  os  resultados obtidos, onde as metodologias de síntese de isonitrila, materiais de  partida e os resultados obtidos.  

Analisando os resultados, fica evidenciado que a metodologia de síntese de  isonitrila que utiliza trifenilfosfina e iodo, em temperatura ambiente, apresenta um  melhor desempenho, quando comparado com a metodologia que utiliza o reator  de micro­ondas e tricloro triazida, para a formação dos peptóides de interesse.  

Ademais,  durante  os  ensaios  em  LC­MS,  foi  evidenciado  que  as  metodologias que utilizaram aldeídos com um átomo de cloro como substituinte  no anel aromático apresentaram uma facilidade maior na identificação. Isto se  deve ao padrão isotópico do cloro, como é possível verificar na tabela 4, pois há  uma baixa possibilidade de serem obtidos falsos positivos. Uma vez que há uma  baixa  probabilidade  de  serem  obtidos  clusters  com  a  mesma  massa  e  com  o  mesmo  padrão  de  picos  observados  nos  produtos  obtidos  na  reação  multicomponente.  

Tabela  5.  Tabela  com  espectros  de  massas  de  produtos  com  átomos  de  cloro  em  sua  composição  molecular. 

Com os produtos que apresentavam esse perfil, foram realizados ensaios  de  LC­MS/MS  visando  verificar  quais  seriam  os  fragmentos  obtidos.  Na  figura  23, são expostos os espectros de massas dos ensaios de fragmentação. Através  destes, foi possível observar que o cloro acaba atuando como indicador de qual  parte  da  estrutura  foi  perdida  na  fragmentação.  Isso  é  justificado  pela  manutenção  do padrão isotópico  do  cloro em  alguns fragmentos, o que indica 

                                      244.0903 286.1016 314.0953 444.2061 GB-51_1-3_01_14306.d: +MS2(444.2061), 20.0eV, 8.6min #1530 279.0940 300.0790 421.1667 429.1348 314.0951 443.1480 244.0894 286.1001 GB-43_1-6_01_14294.d: +MS, 9.8-10.0min #1589-1605 244.0878 279.0919286.0975 314.0933 407.1509 429.1335 GB-42_1-7_01_14295.d: +MS, 9.7-9.9min #1622-1640 314.0948 429.1345 244.0884 GB-37_1-9_01_14297.d: +MS, 9.7-9.9min #1642-1650 0 1 2 3 4 x10 Intens. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 4 x10 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 2 4 6 4 x10

  Na imagem 24 é ilustrado os fragmentos, junto com suas massas, formados  a partir das estruturas supracitadas.       Figura 24. Fragmentos observados durante os ensaios de fragmentação.    A partir destes resultados, foram consideradas satisfatórias as condições  obtidas (realizações de reações em temperatura ambiente, síntese de isonitrilas  in situ, utilização de materiais de partida com a presença de cloro) e assim houve  um  aumento  na  escala  reacional  para  que  os  produtos  fossem  isolados,  quantificados e caracterizados.  

Os  compostos  isolados,  e  seus  rendimentos,  estão  contemplados  na  figura 25 e suas características físicas estão presentes na tabela 6. Nesta tabela  não estão contemplados valores de referência para os pontos de fusão pois os  produtos são inéditos na literatura. Os espectros de massas e RMN (1 e 2D), dos  compostos presentes na figura 25 estão no apêndice (figuras 35­60).   

Figura 25. Produtos de reações modelo e rendimentos reacionais. 

Tabela 6. Aspectos físicos dos compostos obtidos nas reações modelo. 

Composto  Aspecto  Faixa de fusão (ºC)  C4  Sólido amarelado  155.6­156,5  C5  Sólido amarelado  153,8­154,5  C6  Óleo castanho  ­  C7  Sólido amarelado  148,6­149,6  C8  Óleo branco  ­    4.3  Síntese do diácido carboxílico    Com o avanço nas reações multicomponentes, seria necessário o início da  produção do diácido carboxílico chave. O início desse processo é com a redução  do grupo tiol presente no mercaptoetanol.  

mudando  de  cor,  saindo  de  um  vermelho  alaranjado  e  chegando  a  um  verde  escuro,  além  da  perda  do  odor  característico  das  mercaptanas.  Na  figura  60,  presente  no  apêndice,  pode  ser  verificado  o  cromatograma  obtido  referente  deste produto, assim como as análises de RMN, figuras 62 e 63. 

Com a mesma mentalidade da escolha da metodologia multicomponente, a  metodologia principal tornou­se a segunda, que utiliza peróxido de hidrogênio e  catalisada  com  iodeto  de  sódio.  Isto  é  justificado  pelo  fato  de  a  reação,  em  comparação  com  a  metodologia  anterior,  devido  não  necessitar  um  grande  volume  de  solvente  para  ser  executada,  apresentar  um  tempo  reduzido,  não  utilizar banho de ultrassom como fonte de energia e ter valores de rendimentos  próximos.  

A síntese do diácido seria seguida da obtenção do dissulfeto. Esta reação,  assim  como  as  anteriores,  também  não  apresentou  grandes  dificuldades  para  ser  executada  e  apresentou  rendimentos  elevados,  como  é  possível  ver  na  tabela 5.   Em relação às caracterizações estruturais, é possível verificar as análises de  RMN (1 e 2D) e de LC­MS que foram feitas do composto nas figuras 64 a 68 no  apêndice. As características físicas dos compostos estão presentes na tabela 8,  porém, como o diácido carboxílico é inédito, não é possível comparar valores de  ponto de fusão com a literatura.  Tabela 7. Rendimentos reacionais nas etapas de síntese do diácido chave.   

Tabela 8. Características físicas dos compostos 

Composto  Aspecto  Faixa de fusão (ºC) 

C9  Óleo transparente  ­  C10  Sólido branco  109,9­110,3    4.5 Síntese do probe ideal      Ao passo que todas as condições foram estabelecidas, e o diácido chave  obtido e caracterizado, foi possível realizar a síntese de algumas estruturas que  tendem  ao  probe  ideal.  Com  isto,  a  reação  contemplada  na  figura  26  foi  realizada.  

Figura 26. Esquema de síntese do probe ideal 

  O  mesmo  procedimento  que  foi  estabelecido  nas  reações  modelo,  que  utilizavam  as  isonitrilas  preparadas  em  “in situ”,  foi  utilizado  nesta  reação.  As  análises de LC­MS (figura 27) mostram que houve a conversão para o produto  de interesse. No entanto, não foi possível isolar o composto para determinar o  rendimento reacional.         

Figura 27. Cromatogramas e espectros de massas do composto C11 

5. Análises de elucidação estrutural    5.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC­UV/Vis)    As análises por cromatografia líquida de alta eficiência foram realizadas  em um sistema cromatográfico UFLC Prominence (Shimadzu) que é composto  por  desgaseificador  DGU­20A,  bomba  quaternária  LC­20AT,  auto­injetor  SIL­ 20ACHT, forno de coluna CTO­20A, detector UV­Vis (PDA) SPD­M20A, detector  de fluorescência (RF) RF­10AXL e módulo controlador CBM­20A.  

Dois métodos analíticos foram desenvolvidos até o momento para avaliar  a  formação  dos  produtos  das  reações  de  UGI­4CR.  Os  dois  métodos  desenvolvidos  utilizam  as  fases  móveis:  solução  de  formiato  de  amônio  20  mmol/L grau LC­MS (Canal A), acetonitrila grau HPLC (Canal B), metanol grau  HPLC (Canal C) e água Mili­Q (Canal D); a coluna Phenomenex Luna C­18 [150  x 4,6mm e 5μm]; fluxo da fase móvel de 1,5 mL/min; e temperatura do forno em  60 °C. O primeiro método utiliza apenas o detector PDA (em 254 nm) e apresenta  o gradiente: de 20 a 80% de C em 6 minutos; 80% de C isocrático por 2 minutos;  de 80 a 20% de C em 30 segundos; e 3 minutos e 30 segundos de 20% de C  isocrático; totalizando então 12 minutos.   Já o segundo método utiliza o detector PDA (em 254 nm) e RF (excitação  em 260 nm e emissão em 450 nm [45]), apresentando o gradiente: de 20 a 80%  de C em 6 minutos; 80% de C isocrático por 7 minutos; de 80 a 20% de C em 30  segundos; e 3 minutos e 30 segundos de 20% de C isocrático; totalizando então  17 minutos.    5.2 Análises via espectrometria de massas (LC­MS)   

As  análises  de  LC­HRMS  foram  realizadas  em  um  espectrômetro  de  massas  micrOTOF­QII  equipado  com  uma  fonte  de  electrospray  Apollo  II 

  Neste equipamento, eram injetados 1 μL de cada amostra para que fosse realizada uma separação cromatográfica prévia, onde era utilizada uma coluna  de fase reversa Luna C18 (150x2.0mm 3 μm) e, como fase móvel, uma mistura  gradiente de solução de ácido fórmico 0,1% em água ultrapura e acetonitrila grau  HPLC (Sigma Aldrich, St Louis, USA). Para uma análise otimizada, a  fonte de  ESI foi programada para operar com: 2 bar de pressão do gás nebulizador; dry  gas  com  uma  vazão  de  8.0  L/min;  a  temperatura  de  secagem  a  180ºC;  e  a  voltagem à 4,5kV. A razão massa/carga foi escaneada com uma janela de 50­ 1200 Da, nos modos positivo e negativo. Para a calibração do equipamento, foi  utilizado  uma  solução  de  formiato  de  sódio  em  álcool  isopropílico,  onde  os  clusters  eram  analisados  com  a  mesma  janela  de  razão  massa  carga  anteriormente mencionada.  

  Além  deste,  foi  utilizado um  espectrômetro  de  massas  triplo­quadrupolo  LCMS­8030 (Shimadzu), que conta com uma fonte de ionização do tipo eletrospray,  e o UFLC Prominence (Shimadzu), composto pelo degaseificador DGU­20A, duas  bombas LC­20AD, amostrador automático SIL­20ACHT, forno de coluna CTO­20A,  detector UV­Vis SPD­M20A e módulo controlador CBM­20A. Utilizou­se acetato de  etila e metanol grau HPLC 1:1 para confirmar a formação de produto da reação de  UGI­4CR modelo. O equipamento utilizado foi do Laboratório de Organocatálise e  Síntese Orgânica (LOCSín) do Professor Doutor Alcindo Aparecido dos Santos no  Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ­USP).    5.3 Análises via cromatografia gasosa (GC­MS e GC­FID)   

As  análises  por  cromatografia  gasosa  foram  realizadas  em  um  cromatógrafo  gasoso GC­2010 (Shimadzu), acoplado ao espectrofotômetro de  massas  CGMS­QP2010  Plus  (Shimadzu),  com  auto­injetor  AOC­20i  utilizando  hélio como gás de arraste.  

As  análises  foram  feitas  em  um  método  de  análise  de  compostos  orgânicos. A rampa de aquecimento utilizada foi: de 80 a 250°C em 13 minutos;  250ºC por 17 minutos, totalizando 30 minutos de corrida. O fluxo total de 60,2  mL/min com pressão de 75,0 kPa. As análises de massas foram feitas no modo 

temperatura  da  fonte  de  ionização  de  200°C  e  temperatura  da  interface  de  250°C. 

As  análises  por  cromatografia  gasosa  com  detector  de  ionização  por  chama (FID) foram realizadas em um cromatógrafo gasoso 5890 Series II (HP),  utilizando o gás nitrogênio como gás de arraste.  

As análises foram realizadas em um método desenvolvido especialmente  para os ensaios. Onde a temperatura do injetor era de 300ºC e uma rampa de  aquecimento  que  ia  de  130ºC  à  250ºC  com  uma  variação  de  15ºC/min,  totalizando 10 minutos de corrida. O detector era setado com a 300ºC. 

5.4 Análises via ressonância magnética nuclear (RMN)   

As análises por ressonância magnética nuclear (1_H, 13_{C e bidimensionais}  quando  necessários)  foram  realizados  na  frequência  de  300  MHz  em  um  espectrômetro Ultrashield 300 (Bruker), com console Advance III 300, conectado  a  um  computador.  O  clorofórmio  deuterado  (CDCl3)  e  o  metanol  deuterado  (CD3OD) foram utilizados como solventes e os deslocamentos químicos foram  dados em ppm, utilizando­se tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência  interna                         

Composto C1      GC­MS: m/z (%) = 121 (100), 93 (80)    Composto C2      1_{H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ = 8.57 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.24 –  7.12 (m, 4H), 2.34 (s, 3H).  GC­MS m/z (%) = 135 (65), 106 (100).     Composto C3      1_{H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ = 8.31 (s,1H), 8.02 (s, 1H), 7.46 (d, J = 9 Hz, 1H),  7.05 (d, J = 9 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 9 Hz, 2H), 3.8 (d, J = 6 Hz, 3H)  13_{C NMR (75 MHz, CDCl} 3) δ = 163.08, 156.74, 129.49, 121.81, 121.72, 114.91,  114.24, 55.56, 55.49.

Composto C4      1_{H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ = 8.5 (s, 1H), 8.01 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.6­7.53 (m,  2H), 7.47 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 9 Hz, 5H), 7.22 (d, J = 6 Hz, 1H), 7.18 (s,  1H), 7.11­7.09 (m, 4H), 6.7 (s, 2H), 5.91 (s, 1H), 3.60 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.77 (s,  1H), 2.43 (s, 1H), 2.2 (s, 3H)  13_{C NMR (75 MHz, CDCl} 3) δ = 173.31, 171.21, 135.70, 134.79, 133.53, 133.42,  130.57, 130.29, 130.16, 129.21, 129.03, 128.70, 128.56, 128.47, 126.74, 126.66,  126.50, 125.31, 122.64, 60.42, 35.78, 29.70, 17.89.

MS  (ESI)  m/z:  calculado  para  C30H27O2N2Cl  [M]+:  483.176;  encontrado:  [M]+_:483.1783 

Composto C5 

(d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.01 (s, 1H), 3.58 (t, J = 7.8 Hz, 2H),  2.79 (s, 1H), 2.47 (s, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.13 (s, 3H). 13_{C NMR (75 MHz, CDCl} 3) δ =173.31, 167.88, 137.52, 132.83, 132.80, 132.48,  132.34, 130.90, 130.58, 129.36, 128.89, 128.77, 128.72, 128.55, 126.85, 126.69,  125.68, 123.18, 63.51, 50.03, 35.86, 21.67, 17.76.  

MS  (ESI)  m/z:  calculado  para  C25H25O2N2Cl  [M]+:  421.1681;  encontrado:  [M]+_:421.1693.    Composto C6      1_{H NMR (300 MHz, CDCl} 3) δ = 8.21 (d, J = 23.6 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 9.3 Hz, 1H),  7.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.21 (s, 2H), 7.19 (d, J = 1.7  Hz, 1H), 4.81 (s, 1H), 3.89 – 3.81 (m, 2H), 3.71 (t, J = 4.6 Hz, 5H), 3.58 (dd, J =  13.2, 6.6 Hz, 1H), 3.40 (dd, J = 11.4, 5.6 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.84  (t, J = 7.0 Hz, 1H), 2.69 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 2.57 – 2.51 (m, 2H), 2.50 (s, 1H), 2.49  – 2.44 (m, 3H) 

MS  (ESI)  m/z:  calculado  para  C24H30O3N3Cl [M]+:  444,198;  encontrado:  [M]+:  444.2096