1 Médico Veterinário - Mestre - Fac. de Veterinária da UFRGS 2 Médico Veterinário - Prof. Adjunto - Fac. de Veterinária, UFRGS
3 Médico Veterinário, Professor Adjunto, Av. Bento Gonçalves, 9090 - CEP 91540-000 - Setor de Suínos, Faculdade de Veterinária, UFRGS, Porto Alegre, RS. ivowentz@ufrgs.br
QUALIDADE DE SÊMEN SUÍNO RESFRIADO SOB A INFLUÊNCIA
DE DILUENTES, DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO
E DA INCUBAÇÃO PRÉVIA
(QUALITY OF COOLED SWINE SEMEN UNDER INFLUENCE OF EXTENDERS,
STORAGE TEMPERATURE AND PREVIOUS INCUBATION)
(INFLUENCIA DE LOS DILUYENTES, DE LA TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO
Y DE LA INCUBACIÓN PREVIA SOBRE LA CALIDAD DEL SEMEN SUINO REFRIGERADO)
L. H. KATZER
1; M. L. BERNARDI
2; F. P. BORTOLOZZO
3; I. WENTZ
3RESUMO
Foram realizados 2 experimentos para avaliar o efeito da incubação prévia, da temperatura de armazenamento e de diluentes sobre a viabilidade de sêmen suíno resfriado. Em ambos os experimentos doses de sêmen de 100 ml, com 3 bilhões deespermatozóides, foram mantidas sob resfriamento por 120h. A qualidade do sêmen foi avaliada pelos percentuais de motilidade (Mot), acrossomas normais (NAR) e membranas espermáticas íntegras (MI). Foram coletados 5 e 6 ejaculados de 8 e 4 machos, nos experimentos I e II, respectivamente. No experimento I, foram comparados o armazenamento em BTS, a 17ºC (T1), a 12ºC (T2), a 12ºC com incubação prévia de 24h a 17ºC (T3) e a 5ºC com incubação prévia de 24h a 17ºC (T4). Não houve diferença (P>0,05) entre T1 e T3, nem entre T2 e T3 na MOT, NAR e MI. O sêmen armazenado a 5ºC (T4) apresentou MOT, NAR e MI inferiores aos de T1, T2 e T3 (P<0,05). No experimento II, em experimento fatorial 2 x 3, foram avaliados 2 diluentes (BTS e Androhep) e três temperaturas de armazenamento (17º, 12º e 5ºC). Não houve efeito dos diluentes (P>0,05) na MOT, NAR e MI. Não houve diferença (P>0,05) na MOT, NAR e MI entre as temperaturas de 17 e 12°C. O sêmen armazenado a 5ºC apresentou viabilidade inferior (P<0,05) ao armazenado a 12 e 17°C. A incubação por 24h a 17°C, antes de armazenar o sêmen a 12°C, permite manter viabilidade espermática similar à do armazenamento a 17°C. Com base na viabilidade in vitro observada, a conservação de sêmen suíno, por até cinco dias, pode ser efetuada a 17°C ou a 12°C, em BTS ou Androhep. Os diluentes BTS e Androhep apresentam capacidade semelhante na manutenção da viabilidade do sêmen suíno armazenado a 5°C.
PALAVRAS-CHAVE: Diluentes. Espermatozóides. Sêmen. Suíno. Taxa de resfriamento.
SUMMARY
Two experiments were carried out to evaluate the effect of previous incubation, storage temperature and extenders on the viability of swine cooled semen. In both experiments, 100 ml semen doses, with 3 billion sperms, were cold-stored for a period of 120h. The parameters used for evaluating semen quality were percentages of motility (MOT), normal acrosomes (NAR), and intact membranes (MI). A number of 5 and 6 ejaculates were collected from 8 and 4 boars in experiments I and II, respectively. In experiment I, storage in BTS at 17ºC (T1), at 12ºC (T2), at 12ºC with previous incubation of 24h at 17ºC (T3), and at 5ºC with previous incubation of 24h at 17ºC (T4) were compared. There was no difference (P>0.05) between T1 and T3, neither between T2 and T3 in MOT, NAR and MI. Semen stored at 5ºC (T4) presented lower
MOT, NAR and MI (P<0.05) in comparison to T1, T2 and T3. In experiment II, two extenders (BTS and Androhep) and three storage temperatures (17º, 12º and 5ºC) were evaluated in a factorial 2x3 design. Extenders had no effect (P>0.05) on MOT, NAR or MI. No differences (P>0.05) in MOT, NAR and MI were observed between temperatures of 17 and 12°C. Semen stored at 5ºC had lower viability (P<0.05) as compared to that stored at 12 and 17°C. A 24h incubation at 17ºC, before storing semen at 12°C, results in spermatic quality similar to that observed in semen stored at 17°C. Based on the in vitro spermatic viability, cooling of swine semen, up to five days, may be performed at 17°C or at 12°C, in BTS or Androhep. BTS and Androhep extenders have a similar capacity to maintain the viability of swine semen at 5°C.
KEY-WORDS: Cooling rate. Extenders. Semen. Spermatozoa. Swine.
RESUMEN
Fueron realizados 2 experimentos para evaluar el efecto de la incubación previa, de la temperatura de almacenamiento y de diluyentes sobre la viabilidad del semen suino refrigerado. En ambos experimentos dosis de 100 mL de semen, con 3 billones de espermatozoides, fueron mantenidas bajo refrigeración durante 120 horas. La calidad del semen fue evaluada por los porcentajes de motilidad (MOT), acrosomas normales (NAR) y membranas espermáticas integras (MI). Fueron colectados 5 y 6 eyaculados de 8 y 4 machos, en los experimentos I y II, respectivamente. En el experimento I fueron comparados el almacenamiento en BTS, a 17ºC (T1), a 12ºC (T2), a 12ºC con incubación previa de 24 horas a 17ºC (T3) y a 5ºC con incubación previa de 24 horas a 17ºC (T4). No hubo diferencias (P>0,05) en los parámetros MOT, NAR o MI entre T1 y T3, ni entre T2 y T3. El semen almacenado a 5ºC (T4) presentó MOT, NAR y MI inferiores a los observados en T1, T2 y T3 (P<0,05). En el experimento II, modelo factorial 2x3, fueron evaluados 2 diluyentes (BTS y Androhep) y 3 temperaturas de almacenamiento (17º, 12º e 5ºC). No hubo efecto de los diluyentes (P>0,05) en MOT, NAR ni MI entre las temperaturas de 17 y 12ºC. El semen almacenado a 5ºC mostró viabilidad inferior (P<0,05) a la del almacenado a 12 y 17ºC. La incubación del semen durante 24 horas a 17ºC, antes de almacenarlo a 12ºC, permite mantener viabilidad espermática similar a la obtenida con el almacenamiento a 17ºC. Con base en la viabilidad in vitro observada, la conservación de semen suino, por hasta 5 días, puede ser efectuada a 17ºC o a 12ºC, en BTS ou Androhep. Los diluyentes BTS y Androhep tienen capacidad similar para mantener la viabilidad del semen suino almacenado a 5ºC.
PALABRAS CLAVE: Diluyentes. Espermatozoides. Semen. Suino. Tasa de enfriamiento.
INTRODUÇÃO
O sêmen suíno tem sido tradicionalmente armazenado em temperaturas entre 16 e 18ºC, após a diluição (LAFOREST & ALLARD, 1996). Essa temperatura, entretanto, é limitante para o sêmen armazenado por períodos prolongados, em virtude de não interromper totalmente o metabolismo dos espermatozóides, ocorrendo acúmulo de metabólitos, que podem interferir na motilidade espermática. Além disso, essa faixa de temperatura não impede a multiplicação bacteriana, a qual influencia na qualidade do sêmen, podendo limitar o período máximo de armazenamento (WEITZE, 1990).
A sensibilidade do espermatozóide suíno a temperaturas inferiores a 15°C resulta em diminuição da sobrevivência espermática (DE LEEUW et al., 1991; MAXWELL & JOHNSON, 1997). PURSEL et al. (1972ab/ 1973ab) demonstraram que os espermatozóides aumentam sua resistência ao choque térmico, quando incubados,
antes do resfriamento, por certo período, em temperaturas acima de 15ºC, o que resulta em maiores índices de motilidade e de acrossomas normais.
Os diluentes possuem várias funções, tais como a de aumentar o volume do total da amostra de sêmen, fornecer nutrientes para a produção de energia, proteger os espermatozóides contra o choque térmico, controlar a flutuação de pH, manter o balanço osmótico e inibir o desenvolvimento bacteriano (ALTHOUSE, 1997; LEVIS, 2000; JOHNSON et al., 2000). Na inseminação artificial (IA) de suínos, os diluentes utilizados têm sido tradicionalmente classificados em três grupos (LEVIS, 2000), com base no período de manutenção da viabilidade e da capacidade fecundante do espermatozóide: os de curta (1 a 2 dias); os de média (3 a 5 dias), e os de longa (mais de 6 dias) duração. Os principais diluentes de curta duração são o BTS e o Kiev. No Brasil, o diluente Kiev foi bastante utilizado até 1986, sendo em seguida substituído pelo BTS, especialmente devido ao menor custo e por
proporcionar um aumento no período de armazenamento do sêmen (SCHEID, 1991). O BTS, o Androhep e o MR-A são os diluentes mais utilizados no mundo, sendo seguidos pelo Modena e o Kiev (JOHNSON, 1998). Segundo LEVIS (2000), o BTS é o diluente mais utilizado pela facilidade de fabricação e baixo preço de comercialização. Os diluentes considerados como de longa duração são usados, principalmente, para evitar a realização de coletas e processamento de sêmen nos finais de semanas, além de possibilitar a diminuição no custo de transporte para o produtor, uma vez que um maior número de doses pode ser adquirido em uma única entrega (LEVIS, 2000).
Em vários trabalhos, tem sido comparado o efeito dos diluentes BTS e Androhep, no armazenamento de sêmen suíno em temperaturas de 15 a 17ºC, sobre a viabilidade espermática avaliada in vitro ou sobre a taxa de fecundação (LÜBBERT ZUR LAGE, 1991; BALTES, 1993; WABERSKI et al., 1994; KOZTIAS-BANDEIRA, 1999). Em temperaturas iguais ou inferiores a 12ºC, o BTS ou Androhep têm sido mais estudados isoladamente (WEBER, 1989; ALTHOUSE et al., 1998; Chun-Xia & Zeng-Ming, 2000; PAULENZ et al., 2000), com poucos trabalhos comparando o efeito desses diluentes no armazenamento do sêmen em baixas temperaturas (KOTZIAS-BANDEIRA, 1999).
O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da incubação do sêmen antes do resfriamento, dos diluentes BTS e Androhep e de diferentes temperaturas de armazenamento sobre os percentuais de motilidade, de membranas espermáticas íntegras e de acrossomas normais no sêmen suíno resfriado.
MATERIAL E MÉTODOS
A coleta de sêmen foi realizada pelo método da mão enluvada, com um manequim regulável, na sala de coleta. O sêmen foi coletado em saco plástico descartável protegido por recipiente térmico, previamente mantido a 38oC, contendo dupla camada de gaze, acoplada na sua
parte superior, para a separação da fração gelatinosa. Após a coleta foram avaliados a coloração, volume, aspecto e odor para fins de descarte das amostras de sêmen que não estivessem dentro dos parâmetros normais para essas características. O sêmen foi mantido em banho-maria a 32-34°C, enquanto era efetuada a avaliação microscópica do percentual de motilidade, do grau de aglutinação e da concentração espermática, esta última por fotocolorimetria (SpermaCue®). Uma alíquota do sêmen in natura (0,2 a 0,3 ml) foi colocada em 2ml da solução formol-citrato 2,94% para avaliação da morfologia
espermática. Quando coletado em Central de Inseminação, o sêmen foi diluído no local, envasado e transportado em embalagem isotérmica, a 22°C, até o laboratório de conservação e análise das doses. O período máximo de transporte, entre o local de coleta e o laboratório, foi de 2h.
Os critérios qualitativos utilizados para a escolha dos ejaculados a serem resfriados foram os de motilidade superior a 70% e de alterações morfológicas inferiores a 20%. A motilidade média do sêmen utilizado foi de 93% ± 2,4, com variação de 90a 95%.
O sêmen foi diluído para a produção de doses com 3 bilhões de espermatozóides em 100 ml. O sêmen foi envasado em bisnagas plásticas que foram mantidas por um período de duas horas em equilíbrio a 22ºC, sendo em seguida submetidas aos diferentes tratamentos, de acordo com os experimentos. Cada ejaculado foi fracionado e submetido a todos os tratamentos de cada experimento.
O experimento I foi executado com delineamento inteiramente casualizado. Foram utilizados 8 machos sexualmente maduros, de linhagens comerciais, dos quais foram coletados 5 ejaculados de cada, com intervalo de cinco dias. Após o período de equilíbrio, as amostras foram submetidas aos seguintes tratamentos:
Tratamento 1 (T1): armazenamento a 17°C, em BTS; Tratamento 2 (T2): armazenamento a 12°C, em BTS; Tratamento 3 (T3): incubação a 17°C por 24h e posterior armazenamento a 12°C, em BTS;
Tratamento 4 (T4): incubação a 17°C por 24h e posterior armazenamento a 5°C, em BTS.
O experimento II foi um fatorial 2 X 3, no qual foi avaliado o efeito de dois diluentes (BTS e Androhep) e de três temperaturas de armazenamento (17, 12 e 5ºC). Nesse experimento foram coletados 6 ejaculados de cada um dos 4 machos híbridos e sexualmente maduros, submetidos ao manejo de uma coleta semanal. Cada ejaculado foi dividido em 2 frações, sendo uma diluída em BTS e a outra em Androhep. As amostras diluídas foram mantidas por 2h a 22°C, antes de serem distribuídas nos seguintes tratamentos:
- Tratamento 1 (T1): armazenamento em BTS a 17°C. - Tratamento 2 (T2): armazenamento em BTS a 12°C, após incubação a 17°C por 24h.
- Tratamento 3 (T3): armazenamento em BTS a 5°C, após incubação a 17°C por 24h.
- Tratamento 4 (T4): armazenamento em Androhep a 17°C.
- Tratamento 5 (T5): armazenamento em Androhep a 12°C, após incubação a 17°C por 24h.
- Tratamento 6 (T6): armazenamento em Androhep a 5°C, após incubação a 17°C por 24h.
foram mantidas sob resfriamento por um período de 120h. As temperaturas finais de armazenamento utilizadas foram 17 ± 1°C, 12 ± 1ºC e 5 ± 1°C, conforme os diferentes tratamentos de cada experimento. A temperatura de armazenamento foi monitorada diariamente, com termômetro de máxima e mínima, presente no interior da conservadora.
Curvas de resfriamento foram obtidas pela medida da temperatura com termômetro digital Full Gauge® (com precisão de 0,1°C e limite operacional de –25 a +70°C), cujo sensor foi introduzido no centro de amostras de 100 ml de sêmen diluído, envasado em bisnagas plásticas, com o fim específico de medir a temperatura. A temperatura foi medida de 10 em 10 minutos, em três repetições, para cada faixa de temperatura estudada.
A velocidade de queda da temperatura foi de 0,06 e 0,02ºC/min nas primeira e segunda horas de resfriamento, respectivamente, nos tratamentos cuja temperatura de armazenamento foi de 17ºC ou naqueles em que a incubação foi efetuada nessa temperatura. Após a incubação a 17ºC, a queda foi de 0,06 e 0,16ºC/min, na primeira hora, e de 0,01 e 0,04ºC/min, da segunda a quarta hora, no sêmen armazenado a 12ºC e 5ºC, respectivamente. No sêmen armazenado diretamente a 12ºC, a queda foi de 0,13 e 0,33ºC/ min nas primeira e segunda horas de resfriamento, respectivamente.
A qualidade do sêmen foi avaliada pelos percentuais de motilidade (Mot), de acrossomas morfologicamente normais (NAR) e de membranas espermáticas íntegras (MI). A Mot e MI foram avaliadas nas 48, 72, 96 e 120h de armazenamento, enquanto os índices de NAR foram avaliados nas 120h, em ambos os experimentos.
Para avaliar a motilidade foi obtida uma alíquota de 1ml de sêmen, de cada amostra, após sua remoção da incubadora, a qual foi mantida a 37ºC por 10 minutos. O percentual de espermatozóides móveis foi avaliado entre lâmina e lamínula, pelo método subjetivo, em microscópio de campo claro, com aumento de 100x.
O percentual de acrossomas morfologicamente normais foi determinado a partir da mistura de uma alíquota de 40mL de sêmen resfriado com 1ml de solução formol-citrato 2,94%. Uma gota dessa mistura foi depositada entre lâmina e lamínula, para avaliar a morfologia do acrossoma (PURSEL et al., 1972a) de 200 células espermáticas, em microscópio ótico de contraste e fase (1000x).
A integridade das membranas foi avaliada pelo método de HARRISON & VICKERS (1990). Uma solução contendo 475μL de sêmen resfriado em BTS, 10μL de Diacetato de Carboxifluoresceína (20mM), 5μL de Iodeto de Propídio (7,3mM) e 10μL de paraformaldeído (1,7mM) foi incubada por 8 minutos a 30oC em banho-maria. Após
a incubação, foi examinada uma alíquota de 4μL, entre lâmina e lamínula, em microscópio de epifluorescência (filtro EX/DM/BF= 450-490/510/520nm), em aumento de 1000x. Foram avaliadas 300 células espermáticas, em cada amostra, classificadas conforme ORTMAN & RODRIGUEZ-MARTINEZ (1994). Foram considerados com as membranas íntegras os espermatozóides totalmente corados em verde.
As variáveis submetidas à análise estatística foram Mot, NAR e MI. A análise da Mot e MI foi efetuada com o procedimento MIXED (SAS, 1999) para análises repetidas, sendo considerado o efeito dos tratamentos, da data de coleta, dos machos, do tempo de armazenamento das amostras e a interação dupla entre os fatores, que permaneceram no modelo, quando significativos. No experimento II foram considerados os efeitos dos fatores temperatura de armazenamento e diluente, bem como a interação entre eles. As médias foram comparadas pelo teste Tukey com nível de significância de 5%. O procedimento GLM (SAS, 1999) foi usado para a análise dos dados de NAR e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey.
RESULTADOS EXPERIMENTO I
A interação entre macho e tratamento não apresentou efeito significativo (P>0,05) sobre as variáveis analisadas, mas o efeito macho foi mantido no modelo estatístico por ter sido significativo (P<0,05). Não houve diferença significativa (P>0,05) na Mot, MI e NAR entre as amostras armazenadas a 17ºC e as que foram incubadas por 24h a 17ºC e, posteriormente, armazenadas a 12ºC (Tabelas 1 e 2). A colocação direta a 12ºC resultou em motilidade similar (P>0,05) à do sêmen previamente incubado, mas apresentou NAR e MI inferiores aos do sêmen armazenado a 17°C. O armazenamento a 17ºC e 12ºC resultou em maiores percentuais de motilidade (P<0,05), em comparação a 5ºC (Tabela 1). Os índices de MI foram inferiores (P<0,05), para o sêmen armazenado a 5°C, em todos os momentos de avaliação, em relação ao sêmen armazenado a 17ºC e aquele armazenado a 12°C, após incubação por 24h a 17°C (Tabela 2).
EXPERIMENTO II
Não houve efeito significativo dos machos doadores de sêmen, nem da interação destes com a temperatura ou o diluente (P>0,05), em nenhuma das variáveis avaliadas. Não houve efeito do diluente (BTS ou Androhep), nem da interação entre diluente e temperatura (P>0,05) sobre os percentuais de Mot, MI e NAR, ao longo do armazenamento. Dessa forma, os dados
Tabela 1 - Percentuais de motilidade (média ± desvio-padrão) de sêmen suíno resfriado em BTS, no experimento I.
a, b, c na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
T1= 17ºC/120h; T2= 12°C/120h; T3= 17°C/24h + 12°C/96h; T4= 17°C/24h + 5°C/96h.
Tabela 2 - Percentuais de membranas íntegras e de acrossomas normais (média ± desvio-padrão) de sêmen suíno resfriado
em BTS, no experimento I.
a, b, c na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
T1= 17ºC/120h; T2= 12°C/120h; T3= 17°C/24h + 12°C/96h; T4= 17°C/24h + 5°C/96h.
Tabela 3 - Percentuais de motilidade de sêmen suíno (média ± desvio-padrão) armazenado em BTS ou Androhep, em
diferentes temperaturas, no experimento II.
a, b na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
Tabela 4 - Percentuais de membranas íntegras e de acrossomas normais (média ± desvio-padrão) de sêmen suíno
armaze-nado em BTS ou Androhep, em diferentes temperaturas, no experimento II.
a, b na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
Em cada temperatura, foram agrupados os dados dos diluentes BTS e Androhep. dos dois diluentes foram agrupados, sendo apresentado
o efeito da temperatura de armazenamento.
Não foi detectada diferença significativa (P>0,05) nos índices de Mot, MI e NAR entre o sêmen armazenado a 12 e 17°C, durante todo o período de armazenamento (Tabelas 3 e 4). Por outro lado, os valores dessas variáveis foram inferiores (P<0,05), no sêmen mantido a 5ºC, em todas as avaliações efetuadas.
DISCUSSÃO
ALTHOUSE et al. (1998) compararam diferentes temperaturas de armazenamento (8ºC, 10ºC, 12ºC, 14ºC e 17°C) no sêmen diluído em Androhep e observaram motilidade superior a 75% no sêmen armazenado a 17ºC, 14ºC e 12°C, durante 48h de armazenamento, mas motilidade inferior a 70% no sêmen mantido a 10ºC e 8ºC, sugerindo que a temperatura crítica para o armazenamento do sêmen suíno estaria em torno de 12ºC. Com base nesta informação e nos relatos de que os espermatozóides aumentam sua resistência ao choque térmico quando incubados previamente por certo período, em temperaturas acima de 15ºC (PURSEL et al., 1972ab/1973ab; TAMULI & WATSON 1992/1994; MAXWELL & JOHNSON, 1997), o armazenamento do sêmen a 12oC, com ou sem incubação
prévia a 17ºC, foi um dos aspectos avaliados no experimento I.
Estudos prévios demonstraram que a incubação do sêmen foi benéfica para a motilidade ou para a integridade do acrossoma (PURSEL et al., 1973b; WEBER, 1989; KATZER, 2002) de espermatozóides suínos armazenados a 5ºC. No presente estudo, o efeito benéfico da incubação prévia para o sêmen armazenado a 12ºC foi confirmado pelos percentuais de acrossomas normais e de membranas íntegras semelhantes aos do sêmen armazenado a 17ºC (Tabelas 1 e 2). Esse resultado pode
ser atribuído à velocidade de resfriamento, uma vez que as amostras colocadas diretamente a 12ºC apresentaram queda de temperatura inicial de 0,13ºC/min em comparação a 0,06ºC/min, nas amostras com incubação prévia de 24h a 17ºC. Armazenando sêmen suíno a 10ºC, Paulenz et al. (2000) observaram, nas 96h de armazenamento, redução significativa na motilidade (78 para 43%) e nos acrossomas normais (96 para 68%), provavelmente pelo fato de essa temperatura estar abaixo dos 12ºC e pela ausência de um período prévio de incubação.
Os índices de motilidade e de membranas íntegras para o sêmen armazenado a 12ºC, após incubação, foram superiores a 60%, mesmo após conservação por 120h, demonstrando a viabilidade do armazenamento nessa temperatura. Nas 48h de armazenamento, a motilidade foi de 82%, semelhante aos valores relatados por Althouse et al. (1998). Esses autores verificaram que o uso de sêmen armazenado em Androhep a 12ºC, por até 60h, sem período prévio de incubação, resultou em taxas de parto e tamanho de leitegada semelhantes aos obtidos com o emprego de sêmen armazenado a 17ºC.
Durante todo o período de armazenamento e nas três temperaturas estudadas, a viabilidade espermática (percentuais de motilidade, de membranas íntegras e de acrossomas normais), no experimento II (Tabelas 3 e 4), foram semelhantes para os diluentes BTS e Androhep, embora o segundo seja considerado como prolongador da viabilidade espermática in vitro (LEVIS, 2000). Apesar de BTS e Androhep serem considerados diluentes com diferente duração da manutenção da viabilidade espermática, resultados semelhantes para os dois diluentes, têm sido observados, na viabilidade espermática
in vitro, com sêmen armazenado próximo de 17ºC
(LÜBBERT ZUR LAGE, 1991; BALTES, 1993; LAFOREST & ALLARD, 1996; ALTHOUSE, 1997) ou a 5ºC (KOTZIAS-BANDEIRA, 1999). Em alguns trabalhos, foram observadas taxas de fecundação (LÜBBERT ZUR LAGE,
1991), taxas de parto e tamanho de leitegada (LAFOREST & ALLARD, 1996) semelhantes para esses dois diluentes. Embora seja sugerido que a presença de macromoléculas como a albumina sérica bovina, no Androhep, poderia exercer maior proteção contra o choque térmico (ALTHOUSE et al., 1998), no presente estudo, não houve interação entre o diluente e a temperatura de armazenamento. Segundo WEITZE (1991), a qualidade do sêmen ao ser diluído é de grande importância na duração da sua viabilidade, podendo ser de maior relevância que o tipo de diluente utilizado. KUSTER & ALTHOUSE (1999), ao pesquisarem o efeito do período de armazenamento do sêmen sobre a taxa de parição e o tamanho de leitegada, evidenciaram que a duração da viabilidade está na dependência da utilização de sêmen com alta qualidade, que deverá ter um controle desde a coleta até o momento da inseminação.
Os índices de viabilidade espermática com o armazenamento a 12ºC, após incubação prévia, mostram que o sêmen suíno suporta a redução da temperatura até esse limite. Isto indica que, em casos de desregulagem da incubadora de sêmen para temperaturas abaixo de 17ºC, sobretudo em épocas de baixas temperaturas ambientais, provavelmente não haveria prejuízo à conservação de sêmen, se a queda de temperatura for até 12ºC. Além disso, foi evidenciado que há desaceleração do crescimento bacteriano nessa temperatura, pois KATZER et al. (2001) observaram que o percentual de amostras de sêmen com mais de 300 unidades formadoras de colônias aumentou progressiva e significativamente ao longo do armazenamento, nas amostras mantidas a 17ºC, enquanto o aumento foi mais tardio, entre 48 e 120h, nas amostras mantidas a 12ºC.
Embora índices de motilidade superiores a 60% tenham sido observados nas amostras de sêmen submetidas a um período de incubação, antes de serem armazenadas a 5ºC, nas 72h e 120h de armazenamento, nos experimentos I e II, respectivamente (Tabelas 1 e 3), os resultados evidenciaram que o protocolo de resfriamento para essa temperatura ainda não permitiu a obtenção de viabilidade semelhante à observada com armazenamento a 17ºC ou 12ºC.
CONCLUSÕES
· Um período de incubação de 24h a 17°C, antes de armazenar o sêmen a 12°C, permite manter a viabilidade espermática da mesma forma que o armazenamento a 17°C. · Com base nos índices de motilidade, de membranas íntegras e de acrossomas normais observados, a
conservação de sêmen suíno, por até cinco dias, pode ser efetuada a 17°C ou a 12°C, em BTS ou Androhep.
· Os diluentes BTS e Androhep apresentam capacidade semelhante na manutenção da viabilidade do sêmen suíno armazenado a 5°C.
ARTIGO RECEBIDO: Fevereiro/2004 APROVADO: Julho/2004
REFERÊNCIAS
ALTHOUSE, G.C. Comparison of currently used semen extenders in the swine industry.The compendium, p.777-782. 1997.
ALTHOUSE, G.C., WILSON, M.E., KUSTER, C., PARSLEY, M. Characterization of lower temperature storage limitations of fresh-extended porcine semen.
Theriogenology, v.50, p.535-543. 1998.
BALTES, T. J. Plasma membrane evaluation with
fluorescent stains, and computer- measured motility as indicators of in vitro aging of boar spematozoa. Hannover,
Alemanha. 1993. 102 p. Tese (Doutorado) Tierärztliche Hochschule.
CHUN-XIA, Z. & ZENG-MING, Y. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculated boar semen during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology, v.53, p.1477- 1488. 2000.
DE LEEUW, F.E., COLENBRANDER, B., VERKLEIJ, A. J. The role membrane damage plays in cold shock and freezing injury. Reproduction in Domestic Animals, Suppl. 1, p.95– 104. 1991.
HARRISON, R.A.P., VICKERS, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v.88, p.343-352, 1990.
JOHNSON, L.A. Current developments in swine semen: preservation, artificial insemination and sperm sexing. In: CONGRESS INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY. 15., Birmingham, England,1998, Proceedings..., p.225-229.
JOHNSON, L.A; WEITZE, K.F; FISER, P; MAXWELL, W.M.C. Storage of boar semen. Animal Reproduction
KATZER, L.H., BERNARDI, M.L., SILVA, L.E., SCHWARZ, P., CARDOSO, M., BORTOLOZZO, F.P., PADILHA, A.P., WENTZ, I. Comportamento de populações bacterianas presentes no sêmen suíno resfriado em diferentes temperaturas. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, 10., Porto Alegre, RS, 2001. Anais... p.247-248. KATZER, L.H. Resfriamento de sêmen suíno: efeito da temperatura de armazenamento, incubação prévia, taxa de resfriamento e diluentes. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2002. 70f. KOTZIAS-BANDEIRA, E. Influência de diferentes diluentes e temperaturas de refrigeração sobre a qualidade de sêmen suíno. Brazilian Journal of Veterinary
Research and Animal Science, v.36, n.4, p.194-198. 1999.
KUSTER, C.E.; ALTHOUSE, G.C. The fecundity of porcine semen stored for 2 to 6 days in Androhep and X-CellTM
extenders. Theriogenology. v.52, p.365-376. 1999. LAFOREST, J.P., ALLARD,D. Comparison of four extenders for long-term storage of fresh boar semen.
Reproduction in Domestic Animals, v.31, p.275-276. 1996.
LEVIS, D. Liquid boar semen production: current extender technology and where do we go from here! In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION. 4., Beltsville, Maryland USA, 2000.
Proceedings... p.121-128.
LÜBBERT zur LAGE, W. EinfluB des Spermienalters auf
Brefruchtungsrate und akzessorische Spermienzahl unter Berücksichtingung des Ovulationszeitpunktes bei der Frischspermabesamung des Schweines. Hannover,
Alemanha. 1991. 103 p. Tese (Doutorado) Tierärztliche Hochschule.
MAXWELL, W.M.C., JOHNSON, L.A. Membrane status of boar spermatozoa after cooling or cryopreservation.
Theriogenology, v.48, p.209-219. 1997.
ORTMAN, K.; MARTINEZ- RODRIGUEZ, H. Membrane damage during dilution, cooling and freezing-thawing of boar spermatozoa packaged in plastic bags. Journal of
Veterinary Medicine, v.41, p.37- 47.1994.
PAULENZ, H.; KOMMISRUD, E.; HOFMO, P.O. Effect of long-term storage at different temperatures on the quality of liquid boar semen. Reproduction in Domestic Animals, v.35, p.83-87. 2000.
PURSEL, V.G.; JOHNSON, L.A ; RAMPACEK, G.B. Acrossome morphology of boar spermatozoa incubated before cold shock. Journal of Animal Science, v.34. n.2, p.278-283. 1972a.
PURSEL, V.G.; JOHNSON, L.A.; SCHULMAN, L.L. Interaction of extender composition and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. Journal
of Animal Science, v.35, n.3, p.580-584. 1972b.
PURSEL, V.G.; JOHNSON, L.A..; SCHULMAN, L.L. Effect of dilution, seminal plasma and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. Journal of
Animal Science, v.2, n.2, p.528–531, 1973a.
PURSEL, V.G.; SCHULMAN, L.L., JOHNSON, L.A. Effect of holding time on storage of boar spermatozoa at 5ºC.
Journal of Animal Science, v.37, n.3, p.785-789, 1973b.
SAS INSTITUTE. SAS/STAT User´s Guide. Version 8, Cary, 1999. 1464p.
SCHEID, I.R. Commercial Swine Artificial Insemination in Brazil: development and current use. Reproduction in
Domestic Animals, Suppl. 1, p.299-301. 1991.
TAMULI, M.K., WATSON, P.F. Effect of temperature of incubation on the development of resistance to cold stress and hyposmotic stress in boar spermatozoa incubated for up to 24 hours. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON ANIMAL REPRODUCTION, 12,Hague, Netherlands, 1992, Proceedings..., v.3, p.1484-1486.
TAMULI, M.K., WATSON, P.F. Cold resistance of live boar spermatozoa during incubation after ejaculation.
Veterinary Record, v.135, n.7, p.160-162. 1994.
WABERSKI, D. WEITZE, K. F.; LIETMANN, C.; zur LAGE LÜBBERT, W.; BORTOLOZZO, F.P.; WILLMEN, T.; PETZOLDT, R. The initial fertilizing capacity of longterm-stored líquid boar semen following pre-and postovulatory insemination. Theriogenology, v.41, p.1367-1377, 1994. WEBER, H. Zur Kälteschockempfindlichkeit von
Eberspermien; Einflub von Verdünnermedium, Inkubation und Abkühlrate. Hannover, Alemanha, 1989,
103p. Tese (Doutorado) Tierärztliche Hochschule. WEITZE, K.F. The use of “long-term extender” in pig AI– a view of the international situation. Pig News and
WEITZE, K.F. Long-term storage of extender boar semen.
Reproduction in Domestic Animals, Suppl.1, p.231-253.
