USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INIBIÇÃO OU RETARDAMENTO DA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE ARROZ E FEIJÃO SUBMETIDAS AO TESTE DE SANIDADE EM MEIO ÁGAR-ÁGUA 1

USO DA RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INIBIÇÃO OU RETARDAMENTO DA

GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE ARROZ E FEIJÃO SUBMETIDAS

AO TESTE DE SANIDADE EM MEIO ÁGAR-ÁGUA

1_{Aceito para publicação em 12.11.2001; parte de Dissertação de Mestrado} do primeiro autor.

2_Engo _Agro_{, MSc., Depto. de Fitopatologia/UFLA, Cx. Postal 37,} 37200-000, Lavras-MG.

WIRTON MACEDO COUTINHO2_{, JOSÉ CRUZ MACHADO}3_{, MARIA GRAÇAS GUIMARÃES CARVALHO VIEIRA}4_, RENATO MENDES GUIMARÃES4 _{E DANIEL FURTADO FERREIRA}5

RESUMO - O experimento objetivou desenvolver um procedimento alternativo ao uso de 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio na inibição ou retardamento da germinação de sementes de arroz e feijão submetidas ao teste de sanidade pelo método de incubação em ágar-ágar, utilizando a técnica de restrição hídrica. Avaliaram-se os efeitos da restrição hídrica do substrato, induzida pela adição de cloreto de sódio, cloreto de potássio e manitol, em relação à germinação de sementes e comprimento de plântulas de arroz e feijão submetidas à análise sanitária. Avaliou-se também, nesses testes, a influência da restrição hídrica na detecção dos fungos associados às sementes ou plântulas Foram testados os níveis de restrição hídrica de -0,6 e -0,7MPa do meio ágar-água para sementes de feijão e de -0,8 e -0,9MPa para sementes de arroz. O crescimento micelial in vitro de alguns fungos que podem se associar às sementes de arroz (Drechslera oryzae, Gerlachia oryzae, Phoma sorghina e Pyricularia grisea) e feijão (Colletotrichum lindemunthianum, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina e Rhizoctonia solani) foi também avaliado em meio BDA osmoticamente modificado com os mesmos solutos e níveis de restrição hídrica utilizados nos testes de sanidade. A restrição hídrica do substrato induzida pelos solutos testados, nos níveis avaliados, inibiu ou retardou a germinação das sementes e o comprimento das plântulas e não interferiu na detecção dos fungosassociados às sementes. A restrição hídrica, nos níveis testados, não afetou o crescimento micelial in vitro dos fungos D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea C. lindemunthianum e R. solani. O potencial osmótico de -0,7MPa do meio ágar-água, induzido por NaCl, afetou o crescimento micelial do fungo M. phaseolina. O crescimento micelial de F. oxysporum f.sp. phaseoli é maior nos tratamentos com meio ágar-água osmoticamente modificados.

Termos para indexação: NaCl, KCl, manitol, Phaseolus vulgaris, Oryza sativa, teste de sanidade. WATER USE RESTRICTION IN THE INHIBITION OR RETARDATION OF SEED GERMINATION OF RICE AND COMMON BEAN SUBMITTED TO THE HEALTH TEST

BY AGAR-WATER MEDIUM INCUBATION

ABSTRACT - The experiment aimed to develop an alternative procedure to the use of 2,4-D in the inhibition or retardation of rice and common bean seeds germination submitted to the health test by the agar incubation method by utilizing the water restriction technique. The water restriction of the substrates effects on the germination, radicle elongation and mycoflora present in the samples tested of the seeds crops studied were evaluated by using sodium chlorite, potassium chlorite and mannitol incorporated into substrates. The water restriction of substrates levels of -0.6 and -0.7MPa were tested for common bean seeds, and -0.8 and -0.9MPa for rice seeds. The water restriction effects were also investigated on mycelial growth of some fungi transmitted by rice seeds

3_Engo _Agro_{, Ph.D., Prof. do Depto. de Fitopatologia/UFLA; e-mail:} machado@ufla.br

4_Engos _Agros_{, Dr., Profs. do Depto. de Agricultura/UFLA; e-mail:} mariagvc@ufla.br

(Drechslera oryzae, Gerlachia oryzae, Phoma sorghina and Pyricularia grisea) and common bean seeds (Colletotrichum lindemunthianum, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani), by using PDA amended with the osmotic solutes at the same potentials tested in the health tests. The water restriction tested at all levels inhibited or retarded germination and radicle elongation of common bean and rice seeds without affecting the detection of the fungi associated with seeds of the samples examined. The water restriction levels used not affect mycelial growth of D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea, C. lindemunthianum and R. solani. Water restriction at -0.7MPa induced by NaCl affected the mycelial growth of M. phaseolina. The mycelial growth of F. oxysporum f.sp. phaseoli was larger in the treatments with agar-water medium adjusted osmotically.

Index terms: NaCl, KCl, mannitol, Phaseolus vulgaris, Oryza sativa, health test.

INTRODUÇÃO

Existem vários métodos para detecção de patógenos em sementes, os quais diferem em sensibilidade e tipos de equi-pamentos utilizados. A escolha do método irá depender do(s) patógeno(s) a ser(em) detectado(s), da infra-estrutura dispo-nível no laboratório, do grau de treinamento de pessoal en-volvido na interpretação do resultado do teste, e do próprio objetivo do teste (ISTA, 1976 e Neergaard, 1979).

O método de incubação em meio contendo agar é um dos mais utilizados na detecção de patógenos associados a sementes. É utilizado quando as condições de outros méto-dos empregaméto-dos, como a incubação em papel de filtro ume-decido, não são adequadas para o crescimento vegetativo, esporulação de fungos e indução de sintomas nas sementes ou plântulas, ou quando se deseja detectar patógenos que pro-duzam colônias características em meio de cultura (Lucca-Filho, 1987). Este método consiste em distribuir as sementes em placas de Petri contendo meio agar apropriado para detecção do(s) patógeno(s) alvo. Os substratos mais utiliza-dos são os meios BDA (extrato de batata - dextrose - ágar), MA (extrato de malte - ágar) e AA (ágar-água) (Mathur & Singh, 1988).

Embora empregado na detecção de um grande número de patógenos associados a quase todos os tipos de sementes, como sementes de cereais, hortaliças, ornamentais e flores-tais, o método de incubação em meio agar pode ter sua práti-ca prejudipráti-cada na detecção de patógenos de algumas espéci-es vegetais, por causa da germinação rápida das sementespéci-es, que dificulta a identificação dos fungos associados às se-mentes ou plântulas, comprometendo a validade do méto-do pela possibilidade de contaminações secundárias entre as sementes e o exterior do recipiente. Em alguns casos, 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio é utilizado para inibir a germinação de sementes ou retardar o crescimento de

plântulas de espécies dicotiledôneas (Hargbog et al., 1950 e ISTA, 1976). No entanto, esse procedimento deve ser usado com cautela, pois, dependendo da concentração utilizada, o referido produto pode ser fungitóxico (Limonard, 1968 e Machado, 1980).

A técnica de restrição hídrica tem sido eficazmente utili-zada na inoculação de fungos em sementes (Amaral et al., 1996 e Carvalho, 1999). As sementes são colocadas em con-tato direto com o fungo desenvolvido em um meio de cultura apropriado, modificado osmoticamente pela adição de um soluto iônico ou não iônico, em um nível de restrição hídrica que não interfira no crescimento micelial do fungo, mas que seja suficiente para retardar a germinação das sementes por um período de tempo necessário para que ocorra o processo de infecção, que é aproximadamente sete dias.

O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um pro-cedimento alternativo ao uso de 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio na inibição ou retardamento da germinação de semen-tes de arroz e feijão em semen-tessemen-tes de sanidade, realizados pelo método de incubação em meio agar, utilizando a técnica de restrição hídrica.

Foram estabelecidos como objetivos específicos: avaliar os efeitos da restrição hídrica em relação à germinação, com-primento de plântulas e micoflora associada a sementes ou plântulas oriundas de sementes de arroz e feijão, submetidas aos testes de sanidade pelo métodos de incubação em ágar-água; avaliar os efeitos da restrição hídrica em relação ao crescimento micelial in vitro de alguns dos principais fungos que se associam às sementes de arroz e feijão.

MATERIAL E MÉTODOS

As sementes de arroz, cultivar Caiapó e as sementes de feijão, da cultivar Carioca, utilizadas neste trabalho foram produzidas na safra 1998/1999.

Foram comparados os métodos de incubação em ágar-água padrão (testemunha) e ágar-ágar-água com restrição hídrica, em relação à germinação das sementes, comprimento de plântulas e detecção dos fungos associados às sementes de arroz (Oryza sativa L.) e água padrão (testemunha), ágar-água 2% contendo 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio a 10µg.ml-1 _{e ágar-água com restrição hídrica, em relação à}

ger-minação das sementes, comprimento de plântulas e detecção dos fungos associados às sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.).

O meio ágar-água padrão foi preparado utilizando 20g de ágar em 1000ml de água destilada. No método de incuba-ção em ágar-água com restriincuba-ção hídrica, a água utilizada para preparar o meio ágar-água foi substituída por soluções osmóticas de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) e manitol. Foram testados os níveis de restrição hídrica de -0,6 e -0,7MPa, para sementes de feijão e de -0,8 e -0,9MPa para sementes de arroz. Para calcular as quantidades de NaCl, KCl e manitol, utilizadas na preparação das soluções nos ní-veis de potencial osmótico testados, foi utilizado o software SPPM (Michel & Radcliffe, 1995). Utilizou-se a temperatura de 20o_{C no cálculo das soluções osmóticas. As quantidades}

de solutos utilizados, em gramas/litro de água destilada, para obter cada nível de potencial osmótico testado estão apresen-tadas na Tabela 1.

de sementes de arroz e feijão germinadas e o comprimento das plântulas, após oito dias de incubação. Foram considera-das como sementes germinaconsidera-das aquelas com sinais visíveis de emissão de radícula (comprimento maior que 0,1cm). Uti-lizou-se uma régua com precisão de 0,1cm para medir o com-primento das plântulas. Mediram-se as plântulas de arroz da extremidade da radícula até o ápice do coleóptilo ou folíolo de maior tamanho, enquanto que as plântulas de feijão foram medidas da extremidade da radícula até a inserção dos cotilédones.

Na identificação e contagem dos fungos, as sementes e/ ou plântulas foram avaliadas individualmente em microscó-pio estereoscópico, após oito dias de incubação. Em alguns casos, a identificação foi confirmada pela visualização das estruturas morfológicas dos fungos em microscópio óptico.

Obtenção e multiplicação do inóculo - utilizaram-se

isolados fúngicos de Drechslera oryzae (Breda de Haan) Subram. & Jain, Phoma sorghina (Sacc.) Boerema, Dorenbosch & Van Kesteren, Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. e Gerlachia oryzae Gams, obtidos de sementes de ar-roz submetidas à análise sanitária pelo método de incubação

em papel de filtro com congelamento (-20o_{C) e de}

Colletotrichum lindemunthianum (Sacc. & Magn.) Bri. & Cav., Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. phaseoli Kendr. & Snyd., Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. e Rhizoctonia solani Kühn, obtidos de sementes de feijão submetidas à aná-lise sanitária pelo método de incubação em papel de filtro com 2,4-D. Os fungos cresceram em placas de Petri, de 9cm de diâmetro, contendo meio MA (extrato de malte - ágar) em

uma câmara de incubação com temperatura de 20±2o_{C e}

fotoperíodo de doze horas de luz negra (comprimento de onda próximo a ultravioleta), durante oito dias.

Crescimento micelial em meio de cultura osmotica-mente modificado - avaliaram-se os efeitos da restrição

hídrica em relação ao crescimento micelial dos fungos utili-zando-se meio BDA (extrato de batata - dextrose - ágar) osmoticamente modificado. Foram testados os níveis de -0,6 e -0,7MPa para os fungos C. lindemunthianum, F. oxysporum f.sp. phaseoli, M. phaseolina e R. solani, e os níveis de -0,8 e -0,9MPa para os fungos D. oryzae, P. sorghina, P. oryzae e G. oryzae. Os níveis de potencial osmótico desejados foram obtidos adicionando-se NaCl, KCl e manitol ao meio BDA. Para calcular as quantidades de NaCl, KCl e manitol adicio-nadas ao meio de cultura para atingir os níveis de potencial osmótico desejados, utilizou-se o software SPPM (Michel & Radcliffe, 1995), levando-se em consideração o potencial osmótico do meio BDA, que é aproximadamente -0,35MPa

TABELA 1. Quantidade de produto utilizado para pre-paração das soluções de NaCl, KCl e manitol, nos diferentes níveis de potencial osmótico testados.

g.l-1 de água destilada Potencial osmótico

(MPa) NaCl KCl Manitol

- 0,6 7,71 9,94 44,88

- 0,7 9,02 11,65 52,33

- 0,8 10,33 13,36 59,75

- 0,9 11,64 15,08 67,23

As sementes, em número de duzentos (25 sementes/pla-ca) e duas placas por repetição, foram distribuídas em placas de Petri de 15cm de diâmetro, contendo 30ml de meio ágar-água (padrão ou ajustado aos potenciais osmóticos testados) previamente esterilizado. As sementes foram incubadas em câmara com temperatura de 20±2o_{C e fotoperíodo de doze}

horas de luz negra (comprimento de onda próximo a ultravioleta), durante oito dias. Avaliaram-se a porcentagem

(Sommers et al., 1970 e Wearing & Burgess, 1979). Utilizou-se a temperatura de 25o_{C no cálculo dos níveis de potencial}

osmótico testados. As quantidades dos solutos utilizados, em gramas/litro de meio BDA, para obter cada nível de potenci-al osmótico avpotenci-aliado, estão apresentadas na Tabela 2.

O meio BDA ajustado aos níveis de potenciais osmóticos desejados, após esterilização, foi distribuído em placas de Petri de 9cm de diâmetro, utilizando 15ml por placa. No centro de cada placa foi colocado um disco de 0,5cm com micélio dos fungos a serem testados. As placas com inóculo dos fungos foram mantidas em câmara do tipo BOD com fotoperíodo de doze horas e temperatura de 25o_{C, por um período de oito}

dias. O diâmetro médio das colônias foi mensurado em centímetros, a cada dois dias, e o índice de crescimento micelial (ICM) determinado pela fórmula descrita por Oli-veira (1991):

sendo: ICM = índice de crescimento micelial; C₁,C₂, C_n = crescimento micelial das colônias na primeira, segunda e úl-tima avaliação; N₁, N₂, N_n = número de dias.

Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualisado com quatro repetições para cada tratamento. Ex-cetuando-se as avaliações de germinação e comprimento de plântulas de sementes de arroz, cuja análise estatística foi re-alizada por métodos não-paramétricos (teste de Kruskal-Wallis), em razão de os resíduos dessas avaliações apresenta-rem distribuição binomial, todos os dados das demais avalia-ções foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05), utilizan-do-se o procedimento GLM do sistema estatístico SAS® _(SAS

Institute, 1992).

TABELA 2. Quantidade de NaCl, KCl e manitol uti-lizada para ajustar o meio BDA em dife-rentes níveis de potencial osmótico.

g.l-1 de meio BDA Potencial osmótico ajustado

do meio BDA (MPa) NaCl KCl Manitol

- 0,6 3,10 4,00 18,42 - 0,7 4,40 5,61 25,73 - 0,8 5,71 7,32 33,10 - 0,9 6,91 8,93 40,44 C₁ + C₂ + ... + C_n N₁ + N₂ + ... + N_n ICM = RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados referentes à germinação das sementes e comprimento de plântulas em relação ao arroz e ao feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (testemunha), ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hídrica, induzida pela adição de NaCl, KCl e manitol ao substrato, nos potenciais osmóticos testa-dos, estão apresentados nas Tabela 3 e 4 e nas Figuras 1 e 2.

TABELA 3. Valores médios de germinação (G) e compri-mento de plântulas (CP) de um lote de sementes de arroz, cultivar Caiapó, subme-tidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica.

Tratamentos Germinação

(%)

CP (cm)

Ágar-ágar (testemunha) 80a 1,3a

Ágar-ágar + NaCl (-0,8MPa) 0 b 0,0 b

Ágar-ágar + NaCl (-0,9MPa) 0 b 0,0 b

Ágar-ágar + KCl (-0,8MPa) 0 b 0,0 b

Ágar-ágar + KCl (-0,9MPa) 0 b 0,0 b

Ágar-ágar + Manitol (-0,8MPa) 0 b 0,0 b

Ágar-ágar + Manitol (-0,9MPa) 0 b 0,0 b

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis (P ≤ 0,05).

TABELA 4. Valores médios de germinação (G) e com-primento de plântulas (CP) de um lote de sementes de feijão, cultivar Carioca, subme-tidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica.

Tratamentos G

(%)

CP (cm)

Ágar-ágar (testemunha) 82a 14,5a

Ágar-ágar + 2,4-D (10µg.mL-1) 75a b 1,9 bc Ágar-ágar + NaCl (-0,6MPa) 50 bc 1,3 c Ágar-ágar + NaCl (-0,7MPa) 36 c d 1,1 c Ágar-ágar + KCl (-0,6MPa) 34 c d 1,5 bc Ágar-ágar + KCl (-0,7MPa) 34 c d 1,2 c Ágar-ágar + Manitol (-0,6MPa) 44 c d 2,4 b Ágar-ágar + Manitol (-0,7MPa) 18 d 1,3 c

CV (%) 25 7,5

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05).

FIG. 1. A - Sementes de arroz submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em água padrão (a) e ágar-água com restrição hídrica (-0,9MPa) (b); B - Plântulas oriundas de sementes de arroz submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a) e ágar-água com restrição hídrica (-0,9MPa) (b).

Fotos: Ana Regina Nogueira.

FIG. 2. A - Sementes de feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a), ágar-água com 2,4-D (b) e ágar-água com restrição hídrica (-0,7MPa) (c); B - Plântulas oriundas de sementes de feijão submetidas à análise sanitária pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (a), ágar-água com 2,4-D (b) e ágar-água com restrição hídrica (-0,7MPa) (c).

Fotos: Ana Regina Nogueira.

Na avaliação da germinação e comprimento de plântulas oriundas de sementes de arroz (Tabela 3), constataram-se efei-tos de tratamenefei-tos (P ≤ 0,05). Houve 80% de germinação com um comprimento médio de plântula de 1,3cm no trata-mento-testemunha. Nos tratamentos em que se utilizaram so-luções osmóticas nos potenciais testados, para substituir a água destilada na preparação do meio ágar-água, as sementes não germinaram.

Na avaliação das sementes de feijão, verificaram-se efei-tos significativos de tratamenefei-tos (P ≤ 0,05), tanto na

germi-nação de sementes quanto no comprimento de plântulas (Ta-bela 4), sendo os valores de germinação, observados nos tra-tamentos em que se utilizaram soluções osmóticas de NaCl, KCl e manitol, inferiores ao observado no tratamento teste-munha (ágar-água padrão). Excetuando-se o tratamento em que se utilizou solução osmótica de NaCl no potencial de -0,6MPa, todos os demais tratamentos inibiram ou retarda-ram a germinação das sementes mais eficazmente do que o tratamento em que se utilizou 2,4-diclorofenoxiacetato de sódio a 10µg.ml-1_{, que é o procedimento convencional}

utili-zado para inibir ou retardar a germinação de sementes de es-pécies dicotiledôneas em testes de sanidade. Na avaliação de comprimento médio de plântulas, os valores observados tan-to no tratamentan-to em que se utilizou 2,4-diclorofenoxiacetatan-to de sódio a 10µg.ml-1 _{quanto nos tratamentos em que se}

utili-zaram soluções osmóticas de NaCl, KCl e manitol, nos po-tenciais testados, foram inferiores à testemunha (ágar-água padrão).

O prolongamento das fases que antecedem a germina-ção de sementes em substratos osmoticamente modificados com solutos iônicos e não iônicos tem sido atribuído à dimi-nuição do metabolismo das sementes em função da menor disponibilidade de água para digestão das reservas e translocação dos produtos metabolizados. O estresse hídrico atua geralmente reduzindo a velocidade e restringindo a por-centagem de germinação, além de afetar o elongamento celu-lar e a síntese de parede (Wenkert et al., 1978 e Adegbuyi et al., 1981). Ainda segundo esses autores, para cada espécie existe um valor de potencial hídrico abaixo do qual a germi-nação não ocorre.

Além do efeito osmótico, vários pesquisadores atribuem a redução de germinação e vigor de sementes submetidas ao estresse hídrico aos efeitos tóxicos dos solutos utilizados. Solutos como manitol e NaCl interferem na germinação de sementes tanto pelo efeito osmótico quanto pela penetra-ção em níveis tóxicos nas células (Van Der Moezel & Bell, 1987 e Braccini et al., 1996). Campos & Assunção (1990) atribuíram uma maior redução da germinação de semen-tes de arroz pelos sais NaCl e Na₂S0₄, quando compara-dos ao polietileno glicol 6000, a uma aparente inibição da síntese e/ou atividade de enzimas hidrolíticas necessárias à germinação das sementes, provocada pelos sais em altas concentrações.

As diferenças verificadas entre os solutos utilizados, em relação à eficácia em inibir ou retardar a germinação das se-mentes, neste estudo, podem estar relacionadas, além das di-ferenças de toxidez desses solutos, às didi-ferenças de potencial hídrico de equilíbrio, específico entre a semente e o meio externo, que, segundo Heydecker et al. (1975) e Bradford (1986), podem variar amplamente em função das caracterís-ticas das sementes de cada espécie e cultivar e, possivelmen-te, entre lotes de um mesmo cultivar.

Os resultados referentes à incidência dos fungos detec-tados nos lotes de sementes de arroz e feijão pelos métodos de incubação em ágar-água padrão (testemunha) ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hídrica induzida por

NaCl, KCl e manitol nos potenciais osmóticos de -0,6 e -0,7MPa (feijão) e -0,8 e -0,9MPa (arroz), estão apresentados nas Ta-belas 5 e 6. Foram detectados os fungos D. oryzae e P. sorghina, associados às sementes de arroz, e Fusarium semitectum Berk. Rav. e M. phaseolina, associados às semen-tes de feijão.

TABELA 5. Incidência (porcentagem média de ocorrên-cia) de fungos em um lote de sementes de arroz, cultivar Caiapó, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incubação em ágar-água (testemunha) e ágar-água com restrição hídrica. Incidência (%) Tratamentos Drechslera oryzae Phoma sorghina

Ágar-água (testemunha) 50a 12a

Ágar-água + NaCl (-0,6MPa) 42a 15a

Ágar-água + NaCl (-0,7MPa) 52a 18a

Ágar-água + KCl (-0,6MPa) 51a 18a

Ágar-água + KCl (-0,7MPa) 47a 10a

Ágar-água + Manitol (-0,6MPa) 52a 15a Ágar-água + Manitol (-0,7MPa) 57a 14a

CV (%) 17 40

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05).

TABELA 6. Incidência de fungos em um lote de sementes de feijão, cultivar Carioca, submetidas ao teste de sanidade pelos métodos de incuba-ção em ágar-água (testemunha), ágar-água com 2,4-D e ágar-água com restrição hí-drica. Incidência (%) Tratamentos Fusarium semitectum Macrophomina phaseolina Ágar-água (testemunha) 83 a 5 a Ágar-água + 2,4-D (10µg.mL-1) 83 a 2 a Ágar-água + NaCl (-0,6MPa) 87 a 5 a Ágar-água + NaCl (-0,7MPa) 88 a 3 a

Ágar-água + KCl (-0,6MPa) 89 a 6 a

Ágar-água + KCl (-0,7MPa) 88 a 7 a

Ágar-água + Manitol (-0,6MPa) 89 a 5 a Ágar-água + Manitol (-0,7MPa) 89 a 7 a

CV (%) 5 93

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05).

Diferenças estatísticas entre tratamentos na detecção dos fungos associados às sementes de ambas espécies testadas não foram verificadas. A restrição hídrica induzida pela adi-ção de NaCl, KCl e manitol, nos níveis testados, não interfe-riu na detecção dos fungos associados às sementes.

Os fungos que invadem as sementes requerem para o seu desenvolvimento um conteúdo de água em equilíbrio com a umidade do ar de 65 a 85% (“fungos de armazenamento”) e de 90 a 95% (“fungos de campo”) (Christensen & Kaufmann, 1965), que correspondem a teores de água de 15 a 20% (base seca) e 22 a 25% (base seca), para sementes de arroz, respec-tivamente, e 15 a 24% (base seca) e 27 a 32% (base seca), para sementes de feijão, respectivamente, em ambientes com temperatura de 20o_{C (Roa & Rossi, 1976 e Rossi & Roa,}

1980).

Neste estudo, os teores de água nas sementes de feijão submetidas aos testes de sanidade estavam acima dos limites críticos necessários ao crescimento de ambos os grupos de fungos, pois a água contida no substrato utilizado (meio ágar-água) foi suficiente para que as sementes atingissem a fase III do processo germinativo. Carvalho & Nakagawa (1988) reportam que a fase III de germinação, que é caracterizada pelo crescimento visível do eixo embrionário, é alcançada quando sementes endospermáticas, como as de arroz, e cotile-donares, como as de feijão, atingem teores de água de 54 a 67% (base seca) e 100 a 150% (base seca), respectivamente. As sementes de arroz submetidas aos tratamentos com restri-ção hídrica não atingiram a fase III do processo germinativo, no entanto o teor de água contidos nas sementes foi suficien-te para o crescimento dos fungos associados às semensuficien-tes.

Os resultados referentes aos índi-ces de crescimento micelial dos fun-gos D. oryzae, P. sorghina, P. grisea, G. oryzae, C. lindemunthianum, F. oxysporum f.sp. phaseoli, M. phaseolina e R. solani em meio BDA e em meio BDA modificado com NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos testados, estão apresentados nas Tabelas 7 e 8.

Em relação aos fungos G. oryzae,

P. sorghina, P. grisea, C.

lindemunthianum e R. solani, não fo-ram verificadas diferenças estatísticas entre os tratamentos. A restrição hídrica induzida pela adição dos solutos NaCl,

KCl e manitol ao meio BDA, nos níveis de potencial osmótico testados, não interferiu no crescimento micelial desses fun-gos.

Verificaram-se diferenças estatísticas significativas en-tre tratamentos (P ≤ 0,05) em relação aos fungos D. oryzae, F. oxysporum f.sp. phaseoli e M. phaseolina. Com relação ao fungo D. oryzae, constataram-se diferenças estatísticas sig-nificativas apenas entre os tratamentos que se utilizaram NaCl no potencial osmótico de -0,9MPa e manitol no potencial osmótico de -0,8MPa, cujos índices de crescimento micelial foram os menores e maiores, respectivamente. Na avaliação do fungo F. oxysporum f.sp. phaseoli, com exceção do trata-mento que se utilizou NaCl no potencial osmótico de -0,6MPa, todos os demais tratamentos diferiram da testemunha. Nes-ses tratamentos, verificaram-se índices de crescimento micelial superiores ao da testemunha. Na avaliação do fungo M. phaseolina, o tratamento que se utilizou NaCl no potencial osmótico de -0,7MPa diferiu estatisticamente da testemunha (BDA padrão), sendo o índice de crescimento micelial, ob-servado nesse tratamento, inferior ao da testemunha.

O índice de crescimento micelial diferenciado desses fungos pode estar relacionado aos efeitos combinados de permeabilidade seletiva de membranas e compatibilidade ou toxidez de solutos, tanto externamente quanto internamente à membrana celular. O crescimento micelial de fungos em meios de cultura ajustados osmoticamente é variável para cada espécie (Duniway, 1979). O maior crescimento micelial de alguns desses fungos em meio de cultura ajustado osmotica-mente com manitol pode estar também relacionado à utiliza-ção desse açúcar como fonte adicional de energia pelos

fun-TABELA 7. Índice de crescimento micelial (ICM) in vitro de alguns dos princi-pais fungos que se associam às sementes de arroz, em potenciais osmóticos de -0,8 e -0,9MPa, promovidos pela adição de NaCl, KCl e manitol ao meio BDA.

Fungos (ICM) Tratamentos Drechslera oryzae Gerlachia oryzae Phoma sorghina Pyricularia grisea

BDA - testemunha (-0,35MPa) 2,52a b 2,46a 2,54a 0,99a

BDA + NaCl (-0,8MPa) 2,50a b 2,46a 2,55a 0,89a

BDA + NaCl (-0,9MPa) 2,48 b 2,39a 2,44a 0,95a

BDA + KCl (-0,8MPa) 2,53a b 2,51a 2,62a 0,96a

BDA + KCl (-0,9MPa) 2,51a b 2,44a 2,59a 0,98a

BDA + manitol (-0,8MPa) 2,61a 2,51a 2,60a 1,03a

BDA + manitol (-0,9MPa) 2,52a b 2,50a 2,55a 1,03a

CV (%) 0,7 1,0 0,4 5,7

TABELA 8. Índice de crescimento micelial (ICM) in vitro de alguns dos principais fungos que se associam às sementes de feijão, em potenciais osmóticos de -0,6 e -0,7MPa, promovidos pela adição de NaCl, KCl e manitol ao meio BDA.

Fungos (ICM) Tratamentos Colletotrichum lindemunthianum Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli Macrophomina phaseolina Rhizoctonia solani

BDA - testemunha (-0,35MPa) 1,02 a 1,68 b 3,75a b 3,53a

BDA + NaCl (-0,6MPa) 0,97 a 1,72 a b 3,52 bc 3,54a

BDA + NaCl (-0,7MPa) 0,94 a 1,76 a 3,42 c 3,53a

BDA + KCl (-0,6MPa) 1,00 a 1,80 a 3,68a bc 3,52a

BDA + KCl (-0,7MPa) 1,00 a 1,76 a 3,65a bc 3,48a

BDA + manitol (-0,6MPa) 0,98 a 1,86 a 3,82a 3,58a

BDA + manitol (-0,7MPa) 1,04 a 1,88 a 3,79a b 3,54a

CV (%) 8,2 1,6 2,7 1,1

Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05).

gos. Gao & Shain (1995) constataram um maior crescimento micelial de Cryphonectria parasitica em meio de cultura ajus-tado osmoticamente com sacarose do que em meios de cultu-ra ajustados com NaCl, KCl e a mistucultu-ra dos sais NaCl, KCl e NaSO₄ (5:3:2) em potenciais osmóticos semelhantes. Além da utilização da sacarose como fonte adicional de energia pelo fungo, esses autores atribuíram o crescimento diferenciado de C. parasitica aos efeitos tóxicos dos sais utilizados, prin-cipalmente em potenciais osmóticos mais negativos. Alam et al. (1996) também constataram os efeitos tóxicos dos sais NaCl, KCl, CaCl₂ e Na₂SO₄, utilizados isoladamente ou em mistura, para ajustar o potencial osmótico de meios de cultu-ra utilizados no crescimento dos fungos Alternaria alternata e Botrytis cinerea. Em ambos os estudos, os sais foram tóxi-cos em potenciais osmótitóxi-cos mais negativos que -1MPa.

Na avaliação dos efeitos da restrição hídrica em relação a F. oxysporum f.sp. phaseoli, houve um maior crescimento micelial desse fungo nos tratamentos que se utilizaram solutos para ajustar osmoticamente o meio de cultura, o qual que pode estar relacionado a um melhor ajuste osmótico da célula fúngica propiciado pela absorção dos solutos, permitindo maior turgor para extensão celular.

CONCLUSÕES

! A restrição hídrica induzida por NaCl, KCl e manitol, nos potenciais osmóticos testados, inibe ou retarda a germina-ção e o comprimento de plântulas oriundas de sementes de arroz e feijão submetidas à análise sanitária pelo método de incubação em ágar-água, e não interfere na detecção dos fungos associados às sementes ou plântulas;

! a restrição hídrica do meio BDA, nos potenciais osmóticos testados, não afeta o crescimento micelial in vitro dos fun-gos D. oryzae, G. oryzae, P. sorghina, P. grisea C. lindemunthianum e R. solani;

! o potencial osmótico de -0,7MPa do meio ágar-água indu-zido por NaCl afeta adversamente o crescimento micelial in vitro do fungo M. phaseolina;

! o crescimento micelial in vitro do fungo F. oxysporum f.sp. phaseoli é maior nos tratamentos em que o meio ágar-água é osmoticamente modificado com NaCl, KCl e manitol.

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AGRADECIMENTO

Ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio concedido para a con-dução deste trabalho.

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