UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Tese
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de
criação extensiva, cronicamente infectados no Brasil
Nilton Azevedo da Cunha Filho
Pelotas, 2013
NILTON AZEVEDO DA CUNHA FILHO
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação extensiva, cronicamente infectados no Brasil
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: Medicina Veterinária Preventiva).
Orientadora: Profa Dra Nara Amélia da Rosa Farias
Pelotas, 2013
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
C972a Cunha Filho, Nilton Azevedo
Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação
extensiva, cronicamente infectados no Brasil / Nilton Azevedo Cunha Filho. – 67f. ; il. – Tese (Doutorado).
Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Área de concentração: Medicina Veterinária preventiva.
Universidade Federal de Pelotas. Faculdade de Veterinária. Pelotas, 2013. – Orientador Nara Amélia da
Rosa Farias.
1.Veterinária. 2.Transmissão vertical. 3.Bovinos.
4.Neospora caninum. 5.Transmissão horizontal. I.Farias, Nara Amélia da Rosa. II.Título.
CDD:
636.2
Banca examinadora:
Prof. Dr. Diego Moscarelli Pinto, (UFPEL)
Prof. Dr. Fabio Pereira Leivas Leite, (UFPEL)
Prof. Dr. Jerônimo Lopes Ruas, (UFPEL)
Profª. Drª. Nara Amélia da R. Farias, (UFPEL)
Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer a Deus por ter me proporcionado a vida e a oportunidade de completar esse ciclo muito importante em minha carreira acadêmica.
A minha orientadora Nara Amélia da Rosa Farias por todos esses anos de convívio e ensinamentos.
Aos integrantes do Laboratório de Parasitologia pelo auxílio na execução do trabalho, no qual foram indispensáveis.
Ao professor Doutor Ary Pappen e seu filho Felipe Geraldo Pappen pela disponibilidade da fazenda e dos animais para a realização desse experimento, pois sem a sua contribuição nada disso poderia ter sido feito.
A minha mãe, padrasto e irmão pelos incentivos e confiança que depositaram em mim.
A todos os meus familiares que de uma maneira ou de outra estão sempre ao meu lado.
A minha esposa (Cíntia) pela ajuda na realização desse estudo, pelo companheirismo e dedicação ao longo dessa e de muitas outras jornadas.
¨ Agradeço todas as dificuldades que enfrentei.
Não fosse por elas, eu não teria saído do lugar.
As facilidades nos impedem de caminhar.
Mesmo as críticas nos auxiliam muito. ¨ (Chico Xavier)
Resumo
CUNHA FILHO, Nilton Azevedo. Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação extensiva, cronicamente infectados, no Brasil. 2013. 67f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil.
Neospora caninum é causador de grandes perdas econômicas na bovinocultura, devidas ao aborto. Já foi demonstrado que a transmissão vertical de N. caninum
é a principal rota de infecção entre bovinos, seguida pela transmissão horizontal. Poucos estudos demonstram qual o resultado desse tipo de transmissão em rebanho criado a campo. O experimento 1 teve o objetivo de avaliar a ocorrência de transmissão vertical de N. caninum em matrizes de criação extensiva de gado de corte e verificar a relação entre soropositividade e aborto. Foi coletado sangue das matrizes no período pré-gestacional e, após, em mais três momentos do período gestacional, além de uma coleta de seus bezerros ao nascer. A soroprevalência nas matrizes, constatada na triagem foi de 32,2% (29/90). O índice de transmissão vertical foi de 75,8% e todas as matrizes avaliadas levaram a gestação a termo, demonstrando que N. caninum
está presente na propriedade estudada, com índices elevados de transmissão vertical, porém sem influência aparente no desempenho reprodutivo das matrizes. O experimento 2 objetivou demonstrar a importância da transmissão horizontal na manutenção de N. caninum nesse mesmo rebanho. Foram acompanhadas, através de exames sorológicos, 61 matrizes soronegativas durante os terços gestacionais e seus bezerros ao nascer (n=61) e durante o primeiro ano de vida (n=24). Não ocorreu soroconversão em nenhuma das matrizes. Nos bezerros, no entanto, ocorreu essa soroconversão, indicativa de infecção horizontal por N. caninum, em 12,5%, ao final dos 12 meses. Isso indica a interferência da transmissão horizontal nesse rebanho. O experimento 3 teve o objetivo de detectar a presença do DNA de N. caninum em cordão umbilical de bezerros soropositivos filhos de matrizes soropositivas. Coletou-se o cordão umbilical de 20 bezerros no momento do nascimento para os testes laboratoriais pela técnica de PCR. O DNA do parasito foi confirmado em 1/20 (5,0%) dos cordões umbilicais. Este é o primeiro relato da detecção de DNA de
N. caninum em cordão umbilical de bezerros pela técnica de PCR.
Palavras-chave: Transmissão vertical. Bovinos. Neospora caninum. Transmissão horizontal.
Abstract
CUNHA FILHO, Nilton Azevedo. Avaliação da transmissão vertical e horizontal de Neospora caninum (Long, 1990) em bovinos de criação extensiva, cronicamente infectados, no Brasil. 2013. 67f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil.
Neospora caninum is causing great economic losses in cattle, due to abortion. It has been shown that the transmission of N. caninum is the primary route of infection in cattle, followed by horizontal transmission. Few studies demonstrate the outcome of this type of transmission in herd raised in pasture cattle. The first experiment aimed to evaluate the occurrence of vertical transmission of N.
caninum in beef cattle and verify the relationship between seropositivity and abortion. Blood was collected from mothers in the pre-pregnancy and after, three more times in the gestation period, plus a sampling of calves at birth. The seroprevalence in the arrays found in the screening was 32.2% (29/90). The vertical transmission rate was 75.8% and all dams evaluated completed pregnancy, demonstrating that N. caninum is present on the property studied, with high transmission rates, but no apparent influence on the reproductive performance of dams. The second experiment aimed to demonstrate the importance of horizontal transmission in maintaining N. caninum in the same herd. Were accompanied by serological tests, 61 seronegative mothers during pregnancy thirds and their calves at birth (n = 61) and during the first year of life (n = 24). No seroconversion occurred in any of the dams. In calves, however, that seroconversion occurred, indicative of horizontal infection by N. caninum, 12.5% at the end of 12 months. This indicates that horizontal transmission interference occurred in this herd. The third experiment aimed to detect the presence of DNA of N. caninum in umbilical cord of calves positive of positive dams. Was collected the umbilical cord of 20 calves at birth for laboratory testing by PCR. The DNA of the parasite was confirmed by 1/20 (5.0%) umbilical cords. This is the first report of the detection of DNA from N. caninum in umbilical cord of calves by PCR.
Keywords: Vertical transmission. Cattle. Neospora caninum. Horizontal transmission.
Lista de Figuras
ARTIGO 3 Primeira identificação de Neospora caninum por PCR em cordão umbilical de bezerros de criação extensiva de gado de corte no Brasil
Figura 1 Gel de agarose com produtos de PCR para Neospora caninum de cordões umbilicais de bezerros nascidos de matrizes soropositivas, utilizando iniciadores Np6 e Np21, que produzem bandas aos 327 pares de base: Marcador de pares de base (1); bezerros negativos (2-4 e 6-8);
bezerro positivo (5); controle negativo (9) e controle
positivo (10)... 57
Figura 2 Bezerra com opacidade córnea, PCR positiva para N.
caninum, filha de matriz soropositiva com altos títulos de anticorpos no último terço gestacional em propriedade de criação extensiva de gado de corte do extremo sul do
Brasil... 57
Lista de Tabelas
ARTIGO 1 Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de criação extensiva do Brasil
Tabela 1 Ocorrência de anticorpos para N. caninum pela técnica de IFI em matrizes bovinas de corte, criadas extensivamente, número de gestações e fase gestacional... 36
Tabela 2 Distribuição, segundo o título de anticorpos para N.
caninum, de matrizes bovinas de criação extensiva de gado de corte, em diferentes momentos do ciclo reprodutivo no sul do Rio Grande do Sul, Brasil... 37
Tabela 3 Relação da soropositividade para N. caninum em pares mãe/filho de bovinos criados extensivamente no sul do Rio Grande do Sul, Brasil... 37
ARTIGO 2 Infecção horizontal por Neospora caninum em bovinos de criação extensiva no sul do Brasil
Quadro 1 Infecção pós-natal por N. caninum, ao longo do primeiro ano de vida de bezerros nascidos soronegativos, em propriedade de criação extensiva de gado de corte do Rio Grande do Sul, Brasil... 46
Sumário
1 Introdução... 11
2 Objetivos... 14
3 Artigos 15 3.1 ARTIGO 1 Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de criação extensiva do Brasil... 15
Resumo... 16
Introdução... 17
Material e Métodos... 19
Resultados e Discussão... 20
Referências... 27
3.2 ARTIGO 2 Infecção horizontal por Neospora caninum em bovinos de criação extensiva no sul do Brasil... 38
Abstract... 39
Resumo... 40
Introdução... 40
Material e Métodos... 41
Resultados... 42
Discussão... 43
Referências... 44
3.3 ARTIGO 3 Primeira identificação de Neospora caninum por PCR em cordão umbilical de bezerros de criação extensiva de gado de corte no Brasil... 47
Resumo... 48
Introdução... 49
Material e Métodos... 50
Resultados e Discussão... 52
Referências... 53
4 Conclusão Geral... 58 5 Referências... 59 Anexos... ... 61
1 INTRODUÇÃO
Neospora caninum foi observado pela primeira vez em filhotes de cães na Noruega causando sinais neurológicos (BJERKAS et al., 1984). Desde então, relatos da infecção por este agente têm sido feitos em várias espécies, incluindo ruminantes (DUBEY & LINDSAY, 1996). Este protozoário é um coccídio formador de cistos nos tecidos dos hospedeiros intermediários e responsável por causar falhas reprodutivas em bovinos (DUBEY et al., 2007).
Cadore et al., (2010) estudando a ocorrência de anticorpos em amostras de soros fetais, detectaram 15% (39/260) de animais soropositivos para N. caninum. Neste estudo os autores observaram que tanto a imunoglobulina tipo G (IgG) como a imunoglobulina tipo M (IgM) podem servir de marcadores de infecção transplacentária em fetos bovinos. No entanto, os anticorpos da classe IgG foram detectados com maior frequência.
Estudos feitos na Austrália, Argentina, Brasil, Canadá, México, Holanda, Nova Zelândia, Espanha, Ucrânia e Estados Unidos da América em propriedades de criação de gado de corte e gado de leite demonstram que as perdas relacionadas a N. caninum podem chegar a 1,298 bilhões de dólares por ano, com cerca de 2/3 destas perdas sofridas pela indústria de gado de leite (842,9 milhões de dólares) e 1/3 pela indústria de gado de corte (455,4 milhões de dólares) (REICHEL et al., 2013).
No geral, é menor o conhecimento sobre as causas de aborto por N.
caninum no gado de corte do que no gado de leite, devido à dificuldade de encontrar fetos abortados durante o primeiro trimestre da gestação.
Consequentemente, torna-se mais difícil uma avaliação exata de perdas econômicas causadas por este agente no gado de corte (DUBEY, 2003).
N. caninum já foi descrito em diversos países da America Latina, como Uruguai, Brasil, Argentina, Chile, Paraguai e Peru (MOORE, 2005). Vazquez et al. (2009) estudando gado de corte no sul do México, observaram que este protozoário é comum nos trópicos mexicanos, com prevalências variando de 0
a 45% dependendo do município estudado. No pampa úmido, a maior área de produção agrícola e pecuária da Argentina, N. caninum também encontra-se infectando vacas de criação de gado de corte com soroprevalência de 17,3%
(MOORE et al., 2009).
Hall et al. (2005) observaram uma taxa de transmissão vertical de 75%
em gado leiteiro na Austrália, dados similares obtidos por Pappen et al. (2006) em bovinos leiteiros no Brasil. Este tipo de transmissão é muito importante, pois mantém o parasito na população sem a necessidade do hospedeiro definitivo (FIORETTI et al., 2003).
Trees e Willians (2005) sugeriram o termo infecção transplacentária (TPI) endógena, para caracterizar a transmissão fetal a partir de uma infecção materna recrudescente adquirida antes da prenhez e exógena (TPI) para definir a infecção fetal que acontece como resultado de uma infecção da matriz durante a gestação. De acordo com os autores estas duas situações são muito distintas para serem consideradas por um só termo (transmissão transplacentária), principalmente na sua estratégia de controle e implicações epidemiológicas.
Além da transmissão vertical observa-se também a ocorrência de transmissão horizontal, onde os bovinos se contaminam através da ingestão de oocistos esporulados em fezes de cães (Canis lupus familiares) que são os hospedeiros definitivos de N. caninum (McALLISTER et al.,1998). Os oocistos podem atingir pastagens e aguadas e por fim virem a contaminar os animais, entre eles os bovinos. Além do cão, observa-se outros canídeos fazendo parte desta epidemiologia, como é o caso do coiote (C. latrans) (GONDIM et al., 2004), do dingo (C. lu. dingo) (KING et al., 2010), que no continente australiano tem grande importância pois é nativo na região e convive com bovinos nas propriedades rurais (STOESSEL et al., 2003) e, mais recentemente, foi definido também como hospedeiro definitivo de N. caninum o gênero tipo deste grupo o lobo cinza (C. lupus) (DUBEY et al., 2011).
No presente trabalho, foram examinados soros de fêmeas bovinas em idade gestacional, para verificar quais os índices de transmissão vertical e horizontal de N. caninum em criação extensiva de gado de corte no sul do Brasil, e estabelecer qual a relação entre soropositividade e aborto.
2 OBJETIVOS
Geral
Determinar a importância da transmissão vertical e horizontal na epidemiologia de Neospora caninum em rebanho bovino de corte do sul do Rio Grande do Sul, Brasil.
Específicos
- Detectar a ocorrência de anticorpos para N. caninum em fêmeas bovinas em idade reprodutiva de criação extensiva de gado de corte.
- Avaliar os índices de transmissão vertical de N. caninum e estabelecer a relação entre soropositividade e aborto.
- Verificar os níveis de transmissão horizontal de N. caninum durante o primeiro ano de vida de bezerros nascidos desse rebanho.
- Diagnosticar N. caninum por PCR em cordões umbilicais de bezerros nascidos de matrizes soropositivas.
3 ARTIGOS
3.1 Artigo 1
Título: Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de criação extensiva do Brasil
Autores:
Nilton Azevedo da Cunha Filho;
Plínio Aguiar de Oliveira;
Fernando Caetano de Oliveira;
Felipe Geraldo Pappen;
Luis Fernando Pita Gondim;
Nara Amélia da Rosa Farias.
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Acta Parasitologica (ISSN 1230-2821 online)
Estudo da transmissão vertical de Neospora caninum em bovinos de criação extensiva do Brasil
Nilton A. da Cunha Filho1*; Plínio Aguiar de Oliveira2; Fernando Caetano de Oliveira2; Felipe Geraldo Pappen3; Luis Fernando Pita Gondim4, Nara Amélia da R. Farias2. 1*. Programa de Pós Graduação em Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Brasil. E-mail: niltonacfilho@hotmail.com
2. Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, Brasil.
3. Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, Concórdia, SC, Brasil.
4. Departamento de Patologia e Clínicas, Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil.
Resumo
Neospora caninum é causador de grandes perdas econômicas na pecuária de vários países, inclusive o Brasil. O estudo buscou avaliar a importância da transmissão vertical de N. caninum em rebanho bovino de criação extensiva do Brasil, através do índice de aborto, da probabilidade de transmissão vertical e sua relação com os títulos de anticorpos das matrizes. Foi realizado inquérito sorológico por imunofluorescência indireta, com ponto de corte 1:100, em 90 matrizes, que foram monitoradas durante a gestação. Foi coletado sangue dos bezerros filhos dessas matrizes, antes de ingerir o colostro, para a realização da prova sorológica com ponto de corte 1:25. Observou-se que, no rebanho total, 32,2% (29/90) das vacas eram soropositivas para N. caninum.
Não observou-se diferença estatisticamente significativa entre matrizes com menos de duas gestações em comparação com aquelas que tinham três ou mais gestações, assim
como a diferença entre as prevalências para N. caninum nos terços gestacionais analisados. A probabilidade de transmissão vertical foi de 75,8% sendo o maior título encontrado nos animais adultos, no período pré-gestacional o de 3200. N. caninum esta presente na propriedade estudada com índices elevados de transmissão vertical, porém não teve influência aparente no desempenho reprodutivo das matrizes.
Palavras-chave: Neospora caninum, transmissão vertical, bovinos, bezerros, sorologia.
Introdução
Desde seu surgimento na década de 80 Neospora caninum vem sendo responsável por desordens neurológicas em filhotes de cães e problemas reprodutivos em bovinos (Dubey, 2003). Estudos têm demonstrado que cães (Canis lupus familiares) (McAllister et al. 1998), coiotes (C. latrans) (Gondim et al. 2004), dingos (C. lu. dingo) (King et al.
2010) e o lobo cinza (C. lupus) (Dubey et al. 2011) são os hospedeiros definitivos deste parasito.
Em bovinos a rota vertical é considerada a mais importante, quando esta ocorre no primeiro terço da gestação (70-100 dias) geralmente se observa morte embrionária, e, no segundo terço, o aborto (Bartley et al. 2012). Quando a infecção se dá no último terço dificilmente ocorrem mortes fetais e abortos, mas sim o nascimento de bezerros clinicamente normais, porém persistentemente infectados (PI) (Bartley et al. 2004 e Almeria et al. 2011).
Inquéritos soroepidemiológicos de N. caninum em propriedades de criação de gado de leite e gado de corte demonstram que o agente encontra-se disseminado no rebanho. No Brasil, os dados desta parasitose em rebanhos de gado de corte e de leite foram relatados
em estudos de prevalência realizados nos estados de Goiás (Melo et al. 2001), Paraná (Locatelli-Dittrich et al. 2001), Minas Gerais e Rio Grande do Sul (Ragozo et al. 2003), São Paulo (Sartor et al. 2003), Mato Grosso do Sul (Andreotti et al. 2004), Rio de Janeiro (Munhoz et al. 2006), com taxas de prevalência que variaram de 6 a 58 %.
Aguiar et al. (2006) observaram em Rondônia uma prevalência em bovinos de corte de 9,5% e em bovinos de leite de 11,6%, sendo que em 100% das propriedades de corte havia pelo menos um animal infectado. Neste mesmo estudo os autores demonstraram que o tamanho da propriedade rural e o número de bovinos por propriedade são importantes fatores de risco para a infecção por N. caninum.
Marques et al. (2011) verificaram através da técnica de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), em matrizes de gado de corte da raça zebuína abatidas em matadouros no estado do Paraná, que 15,1% dos bovinos reagiram positivamente para N. caninum. Sorologia positiva foi observada em 14,4% das vacas prenhes, enquanto que nos animais não gestantes esta prevalência foi de 15,8%. Apesar de uma prevalência maior nos animais que não estavam gestando a análise estatística não demonstrou diferença significativa nessas prevalências. Durante esse estudo 83 fetos foram recolhidos para avaliação sorológica, e em apenas 1,4% desses foram detectados anticorpos para N. caninum.
Dados de transmissão vertical de N. caninum em bovinos de criação extensiva de gado de corte, naturalmente infectados não tem sido muito estudados, principalmente devido à dificuldade da obtenção de soros de bezerros sem a interferência de anticorpos colostrais nesse tipo de rebanho, o que os torna muitas vezes subestimados. Portanto os dados de transmissão vertical em bovinos de criação extensiva de gado de corte ainda são insuficientes. Assim o objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de
transmissão vertical de N. caninum em matrizes de criação extensiva de gado de corte e verificar a relação entre soropositividade e aborto.
Material e Métodos
Área de estudo e amostragem
O experimento foi realizado em propriedade de criação extensiva de gado de corte localizada no sul do Rio Grande do Sul, Brasil. Foram avaliadas 90 matrizes da raça Braford, em idade reprodutiva, para a determinação do status sorológico para N.
caninum. A amostra foi composta de matrizes primíparas e multíparas, sendo que a sua maioria composta por animais que já haviam gestado seis vezes (25 matrizes). Dessas matrizes foram coletadas amostras de sangue antes da prenhez, e após, trimestralmente no período de dezembro de 2010 a setembro de 2011. O sangue dos bezerros foi coletado no momento do nascimento antes da ingestão do colostro. Para isso as matrizes foram acompanhadas diariamente, na época de parição (setembro a dezembro de 2011).
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil, sob o código nº CEEA 8682.
Detecção de anticorpos para N. caninum
Os anticorpos para N. caninum foram identificados por imunofluorescência indireta (IFI) conforme Björkman e Uggla (1999). Lâminas sensibilizadas com taquizoítos da Cepa Nc-Bahia foram utilizados conforme descrito por Gondim et al. (2001). Os soros dos bovinos adultos foram diluídos inicialmente a 1:100 (Aguiar et al. 2011) e os soros dos bezerros a 1:25 (Wouda et al. 1997). Os soros positivos nesses títulos foram diluídos seriadamente na base dois até a máxima diluição reagente. Soros controles
negativos e positivos foram incluídos em cada reação. Foi utilizado conjugado anti-IgG bovino (molécula inteira) produzida em coelhos, marcado com fluoresceína, conforme recomendado pelo fabricante (Sigma-Aldrich, Brasil).
Analise Estatística
Os dados foram organizados em planilhas no programa Excel do Windows (Microsoft).
Avaliou-se, diretamente a ocorrência da transmissão vertical de N. caninum através da fórmula P=X/(X + Y), na qual X corresponde à frequência de bezerros positivos nascidos de vacas positivas e Y corresponde à frequência de bezerros negativos nascidos de vacas positivas (Oliveira et al. 2010). As variáveis foram avaliadas utilizando-se o teste de associação Two by Two do programa Statistix 9.0 (Analytical Software, Tallahasee, FL) com intervalo de confiança de 95%. Este teste expressa os resultados com base nos valores de Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher. A associação foi considerada significativa quando o valor de p foi ≤ 0,05.
Resultados e Discussão
Soroprevalência para N. caninum
A soropositividade para N. caninum nas matrizes no período pré-gestacional foi de 32,2% (29/90) (Tabela 1). Frequências similares foram encontradas por Melo et al.
(2006) em Goiás (29,6%). A frequência de 32,2% encontrada no presente estudo foi superior as observadas por Ragozzo et al. (2003) no Rio Grande do Sul (21,4%), Hasegawa et al. (2004) em São Paulo (15,6%) e Bañales et al. (2006) em Montevidéu, Uruguai, (13,6%) em bovinos de corte e Chanlun et al. (2007) na Tailândia (12%) em bovinos de produção leiteira. Estudos de N. caninum no Brasil e em outros países
demonstram que o agente encontra-se disseminado nos rebanhos bovinos com diferentes prevalências, essas comparações entre diferentes estudos, devem ser realizadas com cautela, devido a diferenças nos pontos de corte das reações, das técnicas de diagnósticos utilizadas e dos tipos de rebanhos avaliados (Dubey e Schares 2006).
Minervino et al. (2008) observaram em gado de corte da maior região produtora de carne bovina do estado do Pará, prevalência de 19,2% (23/120) e os títulos dos animais variaram de 100 (26,7%) a 1600 (6,7%), sendo o título 200 (33,3%) o mais frequente.
No presente estudo observou-se que, durante a triagem pré-gestacional, 58,6% (17/29) das matrizes soropositivas apresentavam títulos baixos de anticorpos (≤ 200), sendo o título mais frequente (10/29), o de 100 (34,5%), e o mais elevado o de 3200, constatado em dois animais (6,9%). No último terço gestacional ocorreu um pico de anticorpos em 34,5% (10/29) das matrizes, que atingiram ou ultrapassaram o título 1600, não verificado durante os terços gestacionais iniciais (Tabela 2). Portanto, apesar de os dados de prevalências encontrados no Pará terem sido inferiores aos do presente estudo, a variação nos títulos de anticorpos foram similares. Animais soropositivos para N.
caninum geralmente apresentam títulos variáveis, entretanto níveis elevados e crescentes de anticorpos podem indicar um risco maior de aborto do que animais com títulos baixos (Kashiwazaki et al. 2004; López-Gatius et al. 2005).
A prevalência de anticorpos para N. caninum foi mais elevada em matrizes com menos de duas gestações, demonstrando tendência à significância em comparação com aquelas que tinham três ou mais gestações, sendo de 42,9% (15/35) e de 25,5% (14/55) respectivamente (Tabela 1). A ocorrência de animais positivos se manteve similar durante os terços gestacionais avaliados, sendo de 15,6% (14/90) no primeiro e segundo
terço e de 20% (18/90) durante o terceiro terço gestacional. Apesar deste pequeno aumento na prevalência, essa diferença não foi estatisticamente significativa (Tabela 1).
Transmissão vertical de N. caninum
Foi constatado que 75,8% (22/29) dos bezerros nascidos de vacas soropositivas tinham anticorpos para N. caninum ao nascer, indicando a ocorrência de transmissão intrauterina (Tabela 3). Outros estudos tem sido realizados em bovinos de leite, em animais que vão para abate ou com infecções experimentais, sendo constatadas taxas de transmissão que variam de 73 a 95% (Paré et al. 1996 e Davison et al. 1999).
Moré et al. (2009) observaram em bovinos de leite da Argentina, frequência de transmissão vertical de 37% (52/140), considerada baixa, como demonstrado por Paré et al. (1996), diferente do encontrado no presente estudo, esta diferença pode ser atribuída ao ponto de corte utilizado na reação de IFI, pois no estudo acima citado a diluição inicial utilizada foi a 200.
A probabilidade de transmissão vertical foi maior em matrizes com até dois partos (86,7%, 13/15) do que naquelas com mais de três partos (64,3%, 9/14), essa diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05), demonstrando que animais mais velhos têm indícios de imunidade adquirida. Paré et al. (1996) relataram que uma baixa taxa de transmissão vertical pode ser causada por uma estimulação contínua do sistema imune materno, e, portanto, animais mais velhos seriam mais expostos ao agente, tendo como consequência uma maior capacidade de proteção à progênie por imunidade natural.
Cardoso et al. (2012) observaram, em estudo longitudinal em três fazendas produtoras de leite do Estado de São Paulo, índices de transmissão vertical de 83,3%, esses autores demonstraram que existe um alto grau de correlação entre taxa de transmissão vertical e
a prevalência de animais positivos. No presente estudo, a soroprevalência geral das matrizes foi similar (32,2%) ao citado anteriormente (28,6 a 37,1%), assim como a probabilidade de transmissão vertical (75,8%), no entanto, no presente estudo, o risco de uma vaca soropositiva transmitir o agente à progênie, foi independe da prevalência no rebanho.
O nascimento de bezerros positivos, filhos de vacas positivas (transmissão vertical) foi estatisticamente maior (p < 0,01) do que os de matrizes soronegativas, demonstrando que vacas soropositivas têm mais chances de terem filhos soropositivos do que matrizes soronegativas, visto que nenhum animal soronegativo transmitiu o agente à progênie (Tabela 3).
Também no Rio Grande do Sul, Hein et al. (2012) observaram, em sorologia pareada entre mães e filhas, alta associação (p ≤ 0,0001) entre sorologia positiva das mães e transmissão vertical, sustentando a hipótese de que a transmissão vertical é uma importante via de manutenção do N. caninum nos rebanhos, independente do tipo de exploração da propriedade. Björkman et al. (1996) obtiveram resultados similares e afirmam que esse fato pode manter a infecção por diversas gerações.
Nos animais avaliados não observou-se a presença de abortos, natimortos nem mortalidade neonatal, independente do status sorológico das matrizes. Innes et al.
(2002) descreveram, em um trabalho sobre perspectivas para a produção de uma vacina, que a imunidade adquirida seria importante na proteção contra o aborto mas insuficiente para prevenir a transmissão vertical do parasita completamente. Essa hipótese foi comprovada no presente estudo, em animais com imunidade naturalmente adquirida.
Oliveira et al. (2010) observaram soroprevalência geral de 32,7% para N. caninum, em bovinos de central de transferência de embrião. Ao serem avaliados exclusivamente aqueles com histórico de aborto, essa taxa foi de 75%, indicando relação entre a
infecção pelo agente e problemas reprodutivos no rebanho. Paz et al. (2007) realizaram um estudo em novilhas receptoras de embrião criadas em sistema extensivo no Mato Grosso do Sul, e observaram soropositividade para N. caninum de 29,5%. Os autores não constataram diferença estatística entre as taxas de prenhez destes animais em relação às fêmeas soronegativas da mesma categoria, assim como o observado no presente estudo. Dados similares também foram obtidos por Dijkstra et al. (2002), não sendo detectada associação entre sorologia positiva para N. caninum e aborto. Os autores atribuíram esse fato à possível baixa virulência da cepa de N. caninum com a qual o rebanho estaria infectado. Cepas pouco virulentas foram demonstradas por Rojo- Montejo et al. (2009) em camondongos BALB/c na Espanha. Também na Espanha García-Melo et al. (2010) identificaram oito isolados de N. caninum obtidos a partir de bezerros saudáveis infectados congenitamente. Nenhum dos isolados teve patogenicidade capaz de causar quaisquer sinais clínicos da doença nos modelos biológicos utilizados para o teste (camondongos BALB/c). Essa situação pode ter ocorrido também no rebanho avaliado no presente estudo, ja que na propriedade estudada o número de matrízes na reprodução é mantido por animais do própio rebanho, sugerindo que devido a sucessívas passagens da mesma cepa de N. caninum nos animais, essa ja poderia estar atenuada, porém mais trabalhos sobre virulências de cepas e identificação de isolados de N. caninum são necessários para que se possa ter certeza desse fato. Além disso, seria importante salientar as boas condições sanitárias e de condição corporal do rebanho estudado, o que poderia ter contribuído para a proteção dos animais contra N. caninum. Esse agente pode ser oportunista, causando perdas em rebanhos mal nutridos e/ou infectados por bactérias ou vírus que deprimam imunológicamente o hospedeiro, contribuindo assim para o desencadeamento ou reagudização da neosporose (Melo et al. 2004). Essa hipótese é confirmada pelos
resultados de Silva et al. (2008) em bovinos de leite. Os autores observaram que propriedades com soroprevalência mais elevada para N. caninum tinham animais com estado nutricional classificado como ruim, enquanto que, naquelas em que os animais apresentavam estado nutricional regular, a soroprevalência era menor.
Durante o último terço de gestação, 62,1% (18/29) das matrizes tiveram níveis de anticorpos inferiores ou iguais aos detectados durante a triagem pré-gestacional, enquanto que em 37,9% (11/29) esses títulos foram aumentados. A taxa de transmissão vertical foi de 100% nas vacas que tiveram aumento do título de anticorpos, e de 61,1%
nas que mantiveram ou tiveram redução desse título. Essa diferença é significativa (p ≤ 0,05) e sugere uma recrudescência da infecção pré-existente e consequente transmissão do agente ao feto. Outros autores também constataram que fêmeas persistentemente infectadas, e que apresentam aumento no nível de anticorpos específicos durante a gestação, tem uma maior probabilidade de transmitir N. caninum ao feto (Stenlund et al.
1999 e Guy et al. 2001).
Não houve problemas reprodutivos no rebanho estudado, já que todas as matrizes, soropositivas ou não, levaram a gestação a termo. Waldner et al (1998) também constataram que o aumento de títulos de anticorpos para N. caninum durante a prenhez, não teve relação com a ocorrência de aborto em bovinos. Níveis elevados de anticorpos podem ocorrer devido à infecção horizontal com altas doses de oocistos e multiplicação eficiente do parasito no hospedeiro, que parece não ter sido o caso do presente estudo, já que todas as matrizes soropositivas avaliadas já tinham esse status no início do experimento e nenhuma das soronegativas soroconverteu positivamente. Nesse trabalho, foram avaliados bovinos persistentemente infectados.
Os títulos de anticorpos para N. caninum nas matrizes durante o último terço da gestação, e em seus bezerros ao nascer, demonstrou que vacas com altos títulos de
anticorpos (≥ 800) obtiveram maior índice de transmissão vertical (91,7%, 11/12), do que naquelas com títulos inferiores (64,7%, 11/17), embora essa diferença não seja estatisticamente significativa (p = 0,1). Moore et al. (2009), na Argentina, também observaram que vacas com altos títulos de anticorpos tiveram mais chances de infectar os filhos do que mães com títulos mais baixos. Paré et al. (1996) observaram vacas que apresentaram altos níveis de anticorpos durante o final da gestação ou um aumento na sua quantidade entre o 3º e o 8º mês e detectaram uma maior probabilidade de transmissão do agente à progênie, quando comparadas com aquelas com baixos níveis de anticorpos ou com níveis decrescentes desses.
Os resultados do presente trabalho demonstram que N. caninum está presente na região estudada, parasitando cerca de 1/3 das matrizes de corte, que apresentam, em sua maioria, títulos baixos (≤ 200) de anticorpos. Essa infecção não afeta os índices de prenhez nem de natalidade do rebanho, talvez devido à baixa virulência da cepa presente, ou ao elevado índice nutricional dos bovinos.
A transmissão vertical é a principal forma de manutenção do agente no rebanho estudado, e a análise sorológica das matrizes no período pré-gestacional, pode indicar sua capacidade de transmitir N. caninum à progênie, pois essa transmissão ocorreu em mais de 75% das soropositivas e em nenhuma soronegativa. A elevação do título de anticorpos das matrizes durante a prenhez aumenta a probabilidade de transmissão vertical, assim como nas matrizes com até duas gestações, mas não o risco de aborto.
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Tabela 1 – Ocorrência de anticorpos para N. caninum pela técnica de IFI em matrizes bovinas de corte, criadas extensivamente, número de gestações e fase gestacional.
Variáveis Positivos (%) Negativos (%) Total P OR
Nº de gestações
Até duas 15 (42,9%) 20 (57,1%) 35 0,06a 2,19
> duas 14 (25,5%) 41 (74,5%) 55
Total 29 (32,2%) 61 (67,8%) 90
Trimestre da Gestação
Primeiro 14 (15,6%) 76 (84,4%) 90 0,28b 0,74
Segundo 14 (15,6%) 76 (84,4%) 90
Terceiro 18 (20,0%) 72 (80,0%) 90
* Teste Exato de Fisher
a Um grau de liberdade
b Dois graus de liberdade
Tabela 2 - Distribuição, segundo o título de anticorpos para N. caninum, de matrizes bovinas de criação extensiva de gado de corte, em diferentes momentos do ciclo reprodutivo no sul do Rio Grande do Sul, Brasil.
Título de Anticorpos
Número de Matrizes Positivas (%) Total de Positivas (%) Período Pré-gestacional 1º Terço 2º Terço 3º Terço
100 10 (34,5) 3 (16,7) 4 (22,2) 3 (16,7) 20 (24,1)
200 7 (24,1) 7 (38,9) 8 (44,4) 2 (11,1) 24 (28,9)
400 4 (13,8) 6 (33,3) 5 (27,8) 1 (5,6) 16 (19,3)
800 5 (17,2) 2 (11,1) 1 (5,6) 2 (11,1) 10 (12,0)
1600 1 (3,4) 0 (0) 0 (0) 5 (27,8) 6 (7,2)
3200 2 (6,9) 0 (0) 0 (0) 2 (11,1) 4 (4,8)
6400 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (16,7) 3 (3,6)
Total 29 (100) 18 (100) 18 (100) 18 (100) 83 (100)
Tabela 3 – Relação da soropositividade para N. caninum em pares mãe/filho de bovinos criados extensivamente no sul do Rio Grande do Sul, Brasil.
Animais
Bezerro
Total Soropositivo (%) Soronegativo (%)
Matriz soropositiva 22 (75,8%) 07 (24,2%) 29
Matriz soronegativa 0 (0%) 61 (100%) 61
Total 22 (24,4%) 68 (75,6%) 90
Teste Exato de Fisher P < 0,01
