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Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas

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Academic year: 2021

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(1)

Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Agronomia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências: Fruticultura de Clima Temperado.

Orientador: Valmor João Bianchi Co-Orientador: José Antonio Peters

Co-Orientador: Maria do Carmo Bassols Raseira

Pelotas/RS, 2010

(2)

Dados de catalogação na fonte:

(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)

B214c Bandeira, Juliana de Magalhães

Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas/Juliana de Magalhães Bandeira; orientador Valmor João Bianchi; co-orientadores José Antonio Peters e Maria do Carmo Bassols Raseira. - Pelotas, 2010. -120f.; il..- Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Faculdade de Agro- nomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2010.

1. Prunus salicina 2. Cultivo in vitro 3.Polinização controla- da I Bianchi, Valmor João (orientador) II. Título.

CDD 634.22

(3)

Banca examinadora:

__________________________ __________________________

Dr. Elizete Beatriz Radmann Dr. Leonardo Ferreira Dutra Universidade Federal de Pelotas Embrapa Clima Temperado

__________________________ __________________________

Dr. Márcia Wulff Schuch Dr. Paulo Vitor Dutra de Souza Universidade Federal de Pelotas Universidade Federal do Rio Grande do Sul

__________________________

Valmor João Bianchi

Orientador

(4)

Aos meus pais, Celso e Ieda,

Aos meus irmãos, Rafael, Carolina, Letícia e Felipe

Dedico.

Ao meu namorado, Sérgio Renato

Ofereço.

(5)

Em primeiro lugar, agradeço a minha família pelo apoio, incentivo e compreensão em todos os momentos da minha vida;

A minha avó Ieda de Magalhães por ser o alicerce de uma família tão grande quanto a nossa, mantendo-nos unidos, sempre com o espírito alegre e batalhador, servindo de exemplo a todos nós;

A todos os meus familiares pelo apoio, educação, base familiar e valores morais, através dos quais pude formar meu caráter. Agradeço, em especial, aos meus pais Celso e Ieda, e irmãos (Rafael, Carolina, Letícia e Felipe) por sempre terem acreditado em mim, me incentivando e vibrando a cada conquista. Aos meus tios Ariano Martins de Magalhães Jr. e Airton José Rombaldi pelo apoio, incentivo e acima de tudo por serem pessoas maravilhosas, grandes pesquisadores e ótimos exemplos a serem seguidos;

Ao meu namorado Sérgio Renato pelo companheirismo, apoio, garra, incentivo, compreensão, se fazendo presente durante todas as etapas desta caminhada;

À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) pela oportunidade de realizar o curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, em especial ao Departamento de Botânica e à Embrapa Clima Temperado pela oportunidade e disponibilização de suas dependências físicas para o desenvolvimento deste trabalho;

Ao Prof Dr. Valmor João Bianchi pela imprescindível orientação,

profissionalismo, colaboração, incentivo, auxílio e amizade, assim como aos

professores co-orientadores Dr. José Antônio Peters e Drª. Maria do Carmo

(6)

À Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga e ao Prof. Dr. Marcos Antonio Bacarin pela colaboração, apoio, incentivo, disposição e amizade;

Aos demais professores e pesquisadores do curso de Pós-Graduação em Agronomia, concentração em Fruticultura de Clima Temperado que fizeram parte do meu crescimento profissional, Andrea de Rossi Rufato, Caroline Marques Castro, Flávio Herter, Márcia Wulff Schuch e José Carlos Fachinello devido ao profissionalismo e ensinamentos transmitidos, imprescindíveis à realização do curso de doutorado;

Aos colegas e amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas pelo apoio e incentivo. Em especial à Carina da Silva, Daiane Benneman, Elizete Radmann, Ilda da Silva, Isabel Rodrigues, Letícia Benitez, Letícia Barbosa, Luciane Arantes, Luciana Nogueira, Luis Willian Arge, Márcia Ribeiro, Monalize Mota, Rodrigo Danielowski e Simone Wendt, os quais tornaram este período muito mais prazeroso e agradeço em especial, à bolsista Liane Bahr Thurow pela dedicação, apoio, amizade e incansável ajuda;

Aos funcionários, pesquisadores, colegas e estagiários, mas, sobretudo amigos, do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, da Embrapa Clima Temperado, Gisely Correia, Daiana Finkenauer, Diego Borges Duarte, Everton Pederzol, José Martins Pereira, Luciane Leitzk, Maicon Bonemann, Maria de Fátima Tavares da Silveira, Marcelo Couto, Patrícia Einhardt, Rodrigo Franzon e Tiago da Silveira, por terem me recebido gentilmente na Embrapa, pelo apoio, dedicação e amizade;

Aos demais colegas e amigos do curso de Pós-Graduação em Agronomia pelo apoio, dedicação e cooperativismo André de Souza, Andressa Comiotto, Cari Timm; Cláudia Lima, Doralice Fischer, Evandro Schneider, Fernanda Azevedo, Fernando Hawerroth, Ivan Pereira, Juliano Shimitz, Mateus Pasa, Poliana Francescatto, Luciano Picolotto, Simone Galarca, Thaís Cappellaro, Tânia Pelizza e Zeni Tomaz, por mais breve que tenha sido o nosso convívio, valeu a pena cada momento;

Aos meus amigos que muitas vezes sem entender as preocupações que

me acercavam, sempre estiveram presentes me auxiliando, apoiando e vibrando

a cada conquista, amenizando os percalços desta caminhada;

(7)

Saibam que eu carrego comigo um pouquinho de cada um de vocês.

Muito obrigada a todos!

(8)

“... Porque se a estrada me cobra, pago seu preço E desabrigo o caminho pra o meu sustento Mesmo que o mundo desabe num tempo feio Sei o que as asas do poncho trazem por dentro...”

Gujo Teixeira E Luiz Marenco

“... Carrego nas costas meu mundo E junto umas coisas que me fazem bem

Fazendo da minha janela

Imenso horizonte, como me convém ...”

Luiz Marenco

“A vida é curta, A arte é longa, A oportunidade fugaz, A experiência falaciosa,

O julgamento difícil.”

Hipócrates

(9)

BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas. 2010. 120f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.

A ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) tem papel de destaque na fruticultura mundial. Possui grande importância no mercado brasileiro e vem ganhando adeptos à sua produção, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as condições de inverno favorecem o seu cultivo. Porém, existem alguns problemas enfrentados pelos produtores e melhoristas que limitam o aumento da produção nacional de ameixeiras, entre esses, destacam-se a autoincompatibilidade gametofítica, devido à presença de um loco multialélico (contendo os denominados alelos-S) e a suscetibilidade à

Xillela fastidiosa

Wells, que afeta a qualidade do material propagativo. Frente a esses problemas, o objetivo da realização deste trabalho foi identificar fisiologicamente os alelos-S de seis cultivares de ameixeira japonesa e desenvolver um protocolo de micropropagação para a cv. América. Desta forma, foram realizados experimentos de polinização controlada nos campos experimentais da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) e polinização in vivo, em laboratório, de seis cultivares copa de ameixeira japonesa (América, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel e Santa Rosa), onde foram avaliados a frutificação efetiva e o crescimento do tubo polínico (CTP), respectivamente. Também foram realizados experimentos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (UFPel/RS), visando identificar um protocolo adequado para a micropropagação da cv. América. Nos estudos de compatibilidade reprodutiva, a frutificação efetiva foi muito baixa para todos os cruzamentos, sendo observado maior valor na autopolinização da

‘Reubennel’ (8,41%). ‘América’ somente apresentou frutificação quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa e Reubennel, sendo que essa última apresentou compatibilidade mútua com a cv. América. ‘Amarelinha’ e ‘Rosa Mineira’ mostraram-se compatíveis com o pólen da ‘Rosa Mineira’ e ‘Reubennel’.

Houve interação significativa para o grau de CTP e o pólen utilizado para polinizar cada um dos genitores femininos, sendo que os cruzamentos entre ‘América’ x

‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ foram incompatíveis enquanto que a cv.

América apresentou-se autoincompatível. Alguns cruzamentos que não

apresentaram polinização e frutificação no campo, atingiram o óvulo (grau 6) ou o

ovário (grau 5) durante a polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x ‘Rosa Mineira’;

(10)

‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’, e ‘Santa Rosa’ x

‘América’. Estes resultados, juntamente com os dados moleculares dos alelos-S, permitem um melhor entendimento a respeito da biologia reprodutiva de

P. salicina.

Nos experimentos de micropropagação verificou-se que o estabelecimento in vitro de explantes basais da cv. América em meio MS, é superior ao de explantes apicais.

Concentrações de BAP entre 0,25 e 0,50mg dm

-3

são mais adequadas para sua multiplicação enquanto que o meio MS suplementado com 1,0mg dm

-3

de AG

3

e 2,0g dm

-3

de carvão vegetal é o mais adequado para o alongamento in vitro de suas brotações. A metade da concentração dos sais e vitaminas do meio MS com a adição de 1,0mg dm

-3

de AIB é o mais eficiente para o enraizamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa, cv. América, por períodos inferiores a 20 dias, atingindo 88% de sobrevivência após 30 dias de aclimatização.

Palavras-Chave:

Prunus salicina

. Cultivo in vitro. Polinização controlada.

(11)

General Abstract

BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Reproductive compatibility and micropropagation of Japanese plum. 2010. 120p. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.

The Japanese plum (

Prunus salicina

Lindl.) has an important role in the horticulture worldwide. It has great importance in Brazilian market and is gaining fans for its production, especially in Rio Grande do Sul and Santa Catarina where winter conditions are propicious to its cultivation. However, there are some problems faced by farmers and breeders, which limit the increase in domestic production of plum trees, among these, there are the gametophytic self-incompatibility, due to the presence of a codominant multi-site (containing the so-called S-alleles) and susceptibility to

Xillela fastidiosa

Wells, which affects quality of propagation material. In face of these problems, the objective of this work was to identify physiologically S- alleles of six cultivars of Japanese plum and develop a micropropagation protocol for the cv. America. Thus, experiments of controlled pollination were carried out in experimental fields at Embrapa Clima Tempreado (Pelotas/RS) and the in vivo pollination were carried out in the laboratory of six cup cultivars of Japanese plum (America, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel and Santa Rosa), to evaluate the fruit set and pollen tube growth (CTP), respectively. Additionaly, were also performed experiments of micropropagation in the Laboratory of Plant Tissue Culture (UFPel/RS) to identify an appropriate protocol for micropropagation of cv.

America. In studies of reproductive compatibility, the fruit set was very low for all crosses, with the larger value had occur in the autopollination of 'Reubennel' (8.41%).

'America' only formed fruit when pollinated with the cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa and Reubennel, these last one had mutual compatibility with cv.

America. 'Amarelinha' and 'Rosa Mineira' proved to be compatible with the pollen of

'Rosa Mineira' and 'Reubennel'. There was significant interaction for CTP level and

pollen used to pollinate each female parents, and the crosses between 'America' x

'Pluma 7' and 'Rosa Mineira' x 'Santa Rosa' were incompatible while cv. America is

self-incompatible. Some crosses that showed no pollination and fruiting in the field,

hit the egg (level 6) or ovary (level 5) during in vivo pollination, such as 'Reubennel' x

'Rosa Mineira', 'Rosa Mineira' and 'Amarelinha' x 'America' and 'Amarelinha' and

'Pluma 7', and 'Santa Rosa' x 'America'. These results, together with the molecular

data of S-alleles, allow a better understanding of the reproductive biology of

P. salicina

.

In the micropropagation experiments we found that the in vitro establishment of basal

(12)

explants of cv. America in MS medium is higher than the apical explants. BAP concentrations between 0.25 and 0.50mg dm

-3

are more appropriate for the multiplication while MS medium supplemented with 1.0mg dm

-3

GA

3

and 2.0g dm

-3

of vegetal charcoal is the most appropriate to in vitro elongation of their shoots. Half of concentration of salts and vitamins of MS medium with the addition of 1.0mg dm

-3

of IBA is the most efficient for the in vitro rooting of Japanese plum, cv. America, during periods of less than 20 days, reaching 88% survival after 30 days of acclimatization.

Keywords:

Prunus salicina

. In vitro cultivation. Controlled pollination.

(13)

Lista de Figuras

Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa

Figura 1 Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’

(c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 35 Figura 2 Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das

cultivares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), após 120h das polinizações controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g).

Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 36 Figura 3 Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do

percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas (

Prunus salicina

Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’

(c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média.

Emrapa/Pelotas/RS, 2010... 38

(14)

Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro da ameixeira japonesa, cv. América

Figura 1 Comprimento médio das brotações (cm), número médio de folhas e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais (a) e aspecto das brotações iniciais de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, a partir de explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 53 Figura 2 Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa

(

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro, em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm

-3

). As barras representam o erro padrão da média. ns

*

equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 54 Figura 3 Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das

brotações de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv.

América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0;

0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm

-3

). As barras representam o erro padrão da média. ns

*

equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 55 Figura 4 Brotações de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv.

América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido de citocininas (BAP e 2iP) em diferentes concentrações (0;

0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm

-3

). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 56 Figura 5 Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira

japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição de citocininas (BAP e 2iP) (a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm

-3

) (b).

As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 58 Figura 6 Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de

gemas e de brotações por explante (b); média da massa seca

das brotações (mg) (c); aspecto geral das brotações de

ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 40

dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de

cultura. As barras representam o erro padrão da média. UFPel,

Pelotas/RS, 2010... 59

(15)

Figura 7 Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações (b) de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição AG

3

nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm

-3

, acrescido de 2,0mg dm

-3

de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 61 Figura 8 Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de

ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com AG

3

nas concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm

-3

na presença ou ausência de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 62 Capítulo 3 Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira

japonesa cv. América

Figura 1 Percentagem de enraizamento, de formação de raízes secundárias, de primórdios radiculares e de calos (a), e número de raízes por brotação (b) de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm

-3

). As barras representam o erro padrão da média.

UFPel, Pelotas/RS, 2010... 71 Figura 2 Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização

(a); volume (cm

3

) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto geral das plantas (c) de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0;

0,5 e 1,0mg dm

-3

) , após 120 de aclimatização. As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 72 Figura 3 Número de raízes por brotação (a) e percentagem de

enraizamento de brotações de ameixeira japonesa (

Prunus

salicina

Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm

-3

). As barras representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 74 Figura 4 Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira

japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm

-3

).

As barras representam o erro padrão da média. ns

*

equação de

regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS,

2010... 75

(16)

Figura 5 Plantas de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv.

América, após 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j) (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm

-3

). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 76 Figura 6 Percentagem de sobrevivência após 20 (a) e 30 (b) dias de

aclimatização de plantas de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0;

0,5 e 1,0mg dm

-3

). UFPel, Pelotas/RS, 2010... 78

(17)

Lista de Tabelas

Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa

Tabela 1 Genótipos de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) utilizados para a polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 29 Tabela 2 Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico

através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 30 Tabela 3 Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos

controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) da Embrapa Clima Temperado,

no ano de 2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010... 32 Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de

ameixeira japonesa, cv. América

Tabela 1 Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes com gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in

vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/RS, 2010... 51

(18)

Sumário

Resumo Geral ...8

General Abstract ...10

Lista de Figuras...12

Lista de Tabelas ...16

Sumário...17

Introdução Geral...19

Capítulo 1 - Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa...24

1.1 Introdução ...25

1.2 Material e Métodos...28

1.3 Resultados e Discussão...31

1.4 Conclusão ...43

Capítulo 2 - Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa, cv. América ...44

2.1 Introdução ...45

2.2 Material e métodos ...48

2.2.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv. América...48

2.2.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América...49

2.2.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv. América ...50

2.3 Resultados e discussão ...51

(19)

2.3.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.

América...51

2.3.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América...53

2.3.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv. América ...60

2.4 Conclusão ...64

Capítulo 3 - Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv. América...65

3.1 Introdução ...66

3.2 Material e Métodos...69

3.3 Resultados e Discussão...70

3.4 Conclusão ...79

Considerações Finais ...80

Referências...81

Apêndices ...100

Apêndice A – Capítulo 1...101

Apêndice B – Capítulo 2...107

Apêndice C – Capítulo 3...112

Anexos ...115

Anexo A ...116

Anexo B ...117

Anexo C ...119

Anexo D ...120

(20)

Introdução Geral

Dentre as plantas lenhosas cultivadas, as espécies frutíferas apresentam um importante papel econômico no Brasil, pois contribuem significativamente para manter o país como terceiro maior produtor de frutas do mundo, depois da China e da Índia (PORTOCARRERO, 2005). Em 2007 os pomares brasileiros produziram 43.112.804 toneladas de frutas, em uma área plantada de 2.260.154ha (IBGE, 2009). Devido ao potencial de geração de emprego e renda, a fruticultura ocupa hoje posição estratégica na expansão do agronegócio brasileiro. A base agrícola da cadeia produtiva gera 5,6 milhões de empregos, ou seja, 27% do total da mão-de- obra agrícola ocupada no País (PORTOCARRERO, 2005).

Dentre as frutíferas exploradas no mundo, várias espécies do gênero

Prunus

(

P. persica

L. Bastch,

P. salicina

Lindl. e

P. domestica

L.) são largamente cultivadas por apresentarem grande aceitação pelos consumidores e por sua rentabilidade, fatos que têm contribuído para uma notável expansão da produção e também consumo de frutas no Brasil. Como essas espécies são originárias de locais de clima temperado, a adaptação ocorre de forma mais fácil nas regiões mais frias do país, principalmente nos estados do Sul e Sudeste, como Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Sul de Minas Gerais, que apresentam condições edafoclimáticas favoráveis ao cultivo e graças ao uso de cultivares próprias para microclimas dessas regiões (SEGANFREDO, 1995; BIASI, 2004).

A ameixeira pertence à família

Rosaceae

, subfamília

Prunoidae

, gênero

Prunus

,

que compreende mais de 20 espécies (WEINBERGER, 1975). As espécies mais

importantes são

P. salicina

Lindl. (ameixeira japonesa),

P. domestica

L. (ameixeira

européia),

P. insititia

Linn. (ameixeira européia) e

P. cerasifera

Ehrn. (ameixeira

mirabolão) (JOLY, 1993).

(21)

Muitos botânicos indicam a ameixeira como núcleo central de divergência do gênero

Prunus

que, por sucessivas variações, originou as diferentes frutíferas da família

Rosaceae

. A maioria das cultivares de interesse comercial pertence ao grupo das ameixeiras japonesas, diplóides (2n=16), originárias do Extremo Oriente, e das ameixeiras européias, hexaplóides (2n=48), originárias da região do Cáucaso, da Turquia e da Pérsia (CASTRO et al., 2008a).

As cultivares de ameixeira japonesa são as mais exploradas no Brasil por possuírem variedades com menor exigência em frio, as quais foram introduzidas e/ou selecionadas de acordo com as condições climáticas das regiões com potencial para sua produção. Por outro lado, as ameixeiras européias são pouco cultivadas, devido à alta exigência em frio para a superação da dormência, no entanto, apresentam grande importância econômica em outros países (REVERS;

MACHADO, 2005).

Em virtude das várias espécies existentes e do resultado de hibridações ocorridas ao longo do desenvolvimento da cultura, principalmente pelo plantio de variedades selecionadas, a ameixeira é considerada uma das frutíferas arbóreas que mais se difundiu pelo mundo (CASTRO et al., 2008a). Entretanto, a produção brasileira de ameixa japonesa é pequena e insuficiente para suprir a demanda do mercado interno e destina-se, na quase totalidade, ao consumo in natura. Os frutos prestam-se também ao aproveitamento industrial, em forma de passas, geléias, licores e destilados. Em 2008, o país importou cerca de 18.367.942Kg de ameixas in natura, ocupando terceiro lugar de fruta fresca mais importada, logo após a pêra e a maçã (IBRAF, 2009). O volume médio de ameixeira comercializado no país entre 2002 e 2007, de acordo com a CEAGESP/SP, foi de 1.904,33t ano

-1

(INSTITUTO FNP, 2007).

Dentre os fatores associados à baixa produção e produtividade da maioria das cultivares de ameixeira japonesa no Brasil encontra-se a autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica (GSI - gametofitic self incompatibility) (SCHIFINO- WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004; TAKAYAMA;

ISOGAI, 2005) e a suscetibilidade à escaldadura das folhas, causada pela bactéria

Xillela fastidiosa

Wells, que afeta a qualidade do material propagativo (SILVEIRA et al.,

2003), sendo que uma das principais formas de disseminação desse patógeno é por

meio da propagação de material contaminado.

(22)

A autoincompatibilidade reprodutiva (SI - self-incompatibility) é um dos maiores problemas no manejo das culturas que apresentam esta característica e em programas de melhoramento genético de várias espécies frutíferas, podendo comprometer significativamente a frutificação efetiva e a produtividade dos cultivos.

No sistema de incompatibilidade gametofítica o determinante feminino é uma RNAse - a S-RNAse - que se expressa exclusivamente no pistilo e suas proteínas são localizadas principalmente na parte superior do estilete onde atuam inibindo ou degradando o RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (SCHIFINO-WITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005;

BRUCKNER et al., 2006).

Dentre as espécies pertencentes à família

Rosaceae

, a qual inclui mais de 110 gêneros e 2.000 espécies, a maioria das cultivares de

P. salicina

apresentam o sistema de GSI (SAPIR et al., 2004). Desta forma, a identificação dos alelos-S é importante para o estabelecimento de pomares com cultivares compatíveis reprodutivamente e, assim, reduzir perdas no campo, devido a baixa frutificação efetiva.

Considerando a importância econômica desta cultura para o país, deve-se procurar compreender melhor o mecanismo reprodutivo que envolve a combinação entre cultivares polinizadoras, para obtenção de uma produção satisfatória de frutas (RASEIRA, 2003), utilizando plantas livres de patógenos. Deste modo, metodologias que permitam avaliar antecipadamente a compatibilidade genética entre cultivares são de grande interesse, na medida que permitem selecionar previamente cultivares totalmente compatíveis (MOTA; OLIVEIRA, 2005).

Por meio de ensaios de polinização controlada a campo e in vivo, e avaliação molecular dos alelos-S das cultivares, é possível tornar o processo de seleção de uma polinizadora muito mais eficiente (BROOTHAERTS et al., 1995;

ISHIMIZU et al., 1999; YAEGAKI et al., 2001).

Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade

de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. A introdução de

novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas sadias

contribuem para o aumento da eficiência do sistema produtivo. A muda de qualidade

potencializa a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na redução de

custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade (OLIVEIRA et al.,

2004).

(23)

A micropropagação tem sido desenvolvida para inúmeras espécies frutíferas, como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de uma célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al., 2004; ERIG; SCHUCH, 2005a), com a finalidade de multiplicar plantas com as mesmas características genéticas da planta-matriz, livres de patógenos, independente da época do ano (SCHUCH; ERIG, 2005), permitindo a produção de matrizes com qualidade genética e sanitária comprovadas, quando comparado aos métodos convencionais de enxertia e estaquia (ERIG; SCHUCH, 2005b; GRIMALDI et al.,2008).

A propagação in vitro permite o controle de variáveis responsáveis pelo desenvolvimento da planta, produzindo material vegetal clonal homogêneo e com elevada qualidade sanitária (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006;

SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2008).

Além disso, esse método de propagação pode ser utilizado para vários estudos biotecnológicos, a exemplo da transformação genética para características de interesse. Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas, principalmente prunoídeas, requer domínio da tecnologia de propagação in vitro, o qual é o resultado de estudos realizados com os fatores que afetam o crescimento e o desenvolvimento para cada espécie e/ou cultivar, entre eles, a constituição do meio de cultura, tipo e concentração de reguladores de crescimento (ERIG et al., 2002; DONINI et al., 2008b).

Dentre as cultivares adaptadas a região sul do país, a ameixeira japonesa (

P.

salicina

) cv. América é considerada uma das preferidas do mercado sul-brasileiro, devido às suas características organolépticas, porém, é uma cultivar autoincompatível, que apresenta grande flutuação na produtividade e exige polinização cruzada para que ocorra a frutificação (RASEIRA, 2003). É uma das cultivares recomendadas para o plantio no Rio Grande do Sul, considerada região de clima ameno, já que exige cerca de 500 a 600 horas de acúmulo de frio (temperaturas inferiores a 7,2ºC) e suas principais polinizadoras são as cultivares Reubennel e Rosa Mineira (CASTRO et al., 2008a).

Diante do exposto, a caracterização fisiológica da compatibilidade

reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa é de grande valia para a

confirmação da caracterização molecular dos alelos-S, a qual foi realizada

previamente no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da UFPel (MOTA,

2008), além de possibilitar seu uso como subsídios para programas de

(24)

melhoramento genético, já que estudos relacionados a caracterização fisiológicas da compatibilidade reprodutiva das cultivares de ameixeira japonesa adaptadas a região sul do país são bastante escassos e desatualizados em virtude das mudanças climáticas.

Por outro lado, a técnica de micropropagação permite a multiplicação clonal de plantas em larga escala, com alta qualidade genético-sanitária para a formação de pomares, além de fornecer material para experimentos de regeneração, que é uma etapa crucial para o melhoramento via transformação genética, almejando selecionar novos genótipos com características de interesse.

Dentre as características desejadas para a ameixeira está a obtenção de plantas autoférteis, que pode ser obtida por meio do silenciamento gênico via RNAi (RNA de interferência), responsável pela degradação dos RNAs homólogos no citosol, impedindo, desta forma, que ocorra a tradução do RNA alvo (VAUCHERET etal., 2001), podendo promover, neste caso, o bloqueio da tradução dos alelos-S envolvidos na incompatibilidade reprodutiva. Para este estudo foi eleita a cv.

América por ser bem adaptada a região sul do país, com boa produção e aceitação

do mercado consumidor, além de ser categoricamente autoincompativel

reprodutivamente.

(25)

Capítulo 1

Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs.

copa de ameixeira japonesa

(26)

Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa

1.1 Introdução

Dentre as espécies de ameixeira,

Prunus salicina

Lindl. (2n=18), também conhecida como ameixeira japonesa, é a mais cultivada no Brasil por possuir genótipos com menor exigência em frio, os quais foram introduzidos e/ou selecionados de acordo com as condições climáticas das regiões aptas para o cultivo (REVERS; MACHADO, 2005). Entretanto, as cultivares de ameixeira japonesa apresentam diferentes graus de compatibilidade reprodutiva, determinada por um loco multialélico, contendo os denominados alelos-S (TAKAYAMA; ISOGAI, 2005), necessitando de plantio de cultivares polinizadoras durante a instalação do pomar, a fim de garantir a fecundação e níveis de produção aceitáveis economicamente.

É indicada a implantação de pelo menos uma planta polinizadora para cada quatro produtoras (CASTRO et al., 2008a), com compatibilidade e período de floração total ou parcialmente sincronizadas (CARVALHO; RASEIRA, 1989; SAPIR et al., 2004). O uso de mais de uma cultivar polinizadora também é recomendável para se ter maior garantia de cobertura de todo o período de floração da cultivar principal (DALBÓ; FELDBERG, 2009).

O sucesso da polinização cruzada é influenciado por fatores genéticos de incompatibilidade, pela ação de insetos polinizadores (SPIERS, 1983; HARDER;

THOMSON, 1989; GOLDWAY et al., 1999), fatores ambientais (chuva,vento, baixas

temperaturas após a floração, carência de acúmulo de frio durante o período de

dormência, alternância de temperatura após a polinização), além de possíveis

deficiências de caráter fisiológico, conforme verificado em outras culturas, como por

(27)

exemplo em macieira (WHILLIAM; MAIER, 1977; PETRI; PASCOAL, 1981;

SCHRAMM, 1985; SOLTÉSZ et al., 1997). De acordo com os mesmos autores, esses fatores afetam o crescimento e a penetração do tubo polínico até o óvulo.

Para que ocorra a polinização e a fecundação, o grão de pólen deve ser transportado adequadamente até o estigma, onde emitirá o tubo polínico através do pistilo, fertilizando o óvulo. Alterações em qualquer um destes processos poderão impedir a formação do fruto (SANZOL; HERRERO, 2001), reduzindo significativamente a frutificação efetiva ou fruit set.

A velocidade de crescimento do tubo polínico (CTP) até o ovário é variável em angiospermas, podendo ser de poucas horas a dias. Em

Acacia retinodes

Schltr. o crescimento do tubo até o ovário leva em torno de 11 horas, enquanto que em

Banksia coccinea

R.Br. pode levar até seis dias. Pound et al. (2003) verificaram que em

Eucalyptus nitens

(Deane & Maiden) o pólen alcançou o óvulo duas semanas após a polinização.

Em ameixeiras o CTP é relativamente lento, cerca de 120h (CARVALHO, 1989). A velocidade de crescimento é de extrema importância para o sucesso reprodutivo da planta, pois quanto mais rápido minimiza-se os danos por fatores desfavoráveis (TANGMITCHAROEN; OWENS, 1997), os quais podem provocar a abscisão do estilete, antes da fecundação (CARVALHO, 1989).

A identificação da região do pistilo onde o CTP é interrompido pode evidenciar o sistema de autoincompatibilidade atuante. Este mecanismo é considerado um dos sistemas mais importantes, estando presente na maioria das angiospermas para evitar a autofecundação, produzindo e mantendo a diversidade dentro das espécies (DE NETTANCOURT, 1977; RICHARDS, 1986; BARRETT, 1988).

De acordo com Bittencourt Júnior. et al. (2003), no sistema de incompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítico os tubos polínicos incompatíveis têm o seu desenvolvimento cessado no estilete. Por possuir como determinante feminino uma RNAse - a S-RNAse - a qual segrega junto com os alelos-S e se expressa exclusivamente no pistilo. Estas proteínas estão presentes desde a superfície das papilas estigmáticas até o ovário, mas localizam-se principalmente na parte superior do estilete (HARING et al., 1990; DE NETTANCOURT, 2000;

SHIFINOWITTMANN; DALL’AGNOL, 2002), onde atuam inibindo ou degradando o

RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (ZISOVICH et al.,

(28)

2004; ZUCCHERELLI et al., 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005; BRUCKNER et al., 2006).

Este sistema de incompatibilidade é considerado o mais distribuído nas angiospermas, a exemplo das famílias Rosaceae, Solanaceae, Papaveraceae, Liliaceae, dentre outras (GIBBS, 1986), constituindo uma das principais barreiras para programas de melhoramento genético que buscam a obtenção de novas cultivares, bem como para o manejo reprodutivo dos pomares.

O reconhecimento do pólen incompatível opera no nível de interação proteína-proteína dos dois determinantes (masculino e feminino), sendo que a resposta de autoincompatibilidade ocorre quando ambos determinantes estão carregados com o mesmo alelo-S (BATLLE et al., 1995; BROOTHAERTS et al., 1995; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005). Os grãos de pólen mostram expressão independente, segregando 1:1, e assim os cruzamentos podem ser compatíveis - quando os alelos do grão de pólen e do pistilo são diferentes; semicompatíveis - quando pelo menos um alelo-S do grão de pólen é idêntico ao do pistilo e, desta forma, metade dos grãos de pólen germinam e desenvolvem o tubo polínico normal;

ou totalmente incompatíveis - quando os dois alelos-S do grão de pólen são idênticos aos do pistilo (RICHARDS, 1986).

A análise da fertilidade do grão de pólen é indispensável para o melhoramento genético clássico. Portanto, dados sobre a viabilidade e o desenvolvimento de grãos de pólen são fundamentais para os estudos da biologia reprodutiva e para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético (FLANKLIN et al., 1995).

A viabilidade do pólen pode ser determinada por diferentes métodos: através da utilização de corantes, germinação in vitro, germinação in vivo e percentagem de frutificação efetiva (DAFNI, 1992; KEARNS; INOUYE; 1993; LEITE; SOUZA, 2003).

A avaliação das plantas polinizadoras envolve polinizações controladas a

campo, combinadas com análises laboratoriais, para determinar a viabilidade dos

grãos de pólen (SOUZA; RASEIRA, 1998). Além disso, técnicas de microscopia

permitem analisar características associadas à germinação dos tubos polínicos e

suas taxas de crescimento, servindo também para analisar hibridações efetivas em

programas de melhoramento genético e, assim, elucidar características referentes a

incompatibilidade reprodutiva (KEARS; INOUYE, 1993), sendo considerado um teste

de grande valia, já que elimina resultados falsos de incompatibilidade por não ser

(29)

influenciados pelos fatores ambientais, os quais, a polinização realizada a campo está sujeita.

Com base no que foi exposto, a realização deste trabalho teve por objetivo a caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de ameixeira japonesa, por meio da avaliação da frutificação efetiva e do crescimento do tubo polínico (CTP), após a polinização in vivo, a fim de confirmar alguns dados da caracterização molecular dos alelos-S destas cultivares, realizada previamente em nosso laboratório, além de possibilitar seu uso como subsídio para programas de melhoramento genético.

1.2 Material e Métodos

Para as análises de caracterização fisiológica dos alelos-S foram utilizadas cultivares de

P. salicina

(Tab. 1, Anexo A e B) do Campo Experimental da Embrapa Clima Temperado (CPACT) (Pelotas/RS), tanto para os experimentos realizados a campo quanto para aqueles realizados em laboratório. As polinizações foram executadas no momento em que os genótipos a serem polinizados possuíam número suficiente de flores em estádio de balão para compor os tratamentos.

Durante a hibridação controlada, realizada a campo, para garantir que o pólen fosse inoculado no período de receptividade máxima do pistilo, as polinizações foram realizadas repetidamente durante o período de floração. Desta forma, botões florais foram emasculados e a polinização foi realizada manualmente, passando-se levemente o dedo indicador contendo o pólen de interesse sobre o estigma. Os ramos foram ensacados com tecido não tecido (TNT) branco e devidamente identificadas com fitas plásticas. Após cada cruzamento, as mãos foram lavadas com álcool 70% para evitar a contaminação de um pólen com o outro. Como controle, foi realizada a autopolinização das cultivares produtoras, onde os botões florais foram emasculados e polinizados com o pólen da própria cultivar.

Para verificar a percentagem de fecundação foram polinizadas 150 flores,

em estádio de balão para cada cruzamento, conforme metodologia descrita para

gramíneas, por Wilson e Brown (1957), adaptada para frutíferas como ameixeira,

pereira, pessegueiro e damasqueiro (CARVALHO, 1989; GONÇALVES, 2008). Após

uma semana da polinização retirou-se o TNT para permitir o crescimento normal dos

ramos e desenvolvimento dos frutos, os quais foram contados após 40 dias da

(30)

polinização, determinando-se a percentagem de frutificação efetiva em relação ao número de flores polinizadas e ensacadas (fruit set).

Tabela 1 – Genótipos de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) utilizados para a polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010

Genitores femininos Genitores masculinos

América Rosa Mineira Pluma 7 Amarelinha Reubennel Santa Rosa América

The First Reubennel América Reubennel

Rosa Mineira Reubennel América Amarelinha Amarelinha

Rosa Mineira América Reubennel Rosa Mineira Amarelinha Rosa Mineira

Santa Rosa*

América Pluma 7

Pluma 7 América Santa Rosa

Santa Rosa**

* Cruzamento realizado apenas in vivo, no laboratório.

** Cruzamento realizado apenas a campo.

A determinação do ponto onde ocorreu a interrupção do CTP foi avaliada por

meio da polinização in vivo e testes de CTP, utilizando o método empregado por

Wilson e Brown (1957), com algumas adaptações. Quatro ramos de cada planta-

mãe foram coletados a campo, de acordo com a disponibilidade de ramos contendo

dez flores em estádio de balão. Os mesmos foram levados para o laboratório, à

temperatura ambiente (18-20ºC), e mantidos com a base submersa em água para

evitar a desidratação. As flores foram emasculadas e polinizadas manualmente com

o pólen de interesse, conforme as combinações descritas na tab. 1.

(31)

Os pistilos foram coletados 120 horas após a polinização, colocados em frascos contendo solução fixativa composta por formol, ácido acético e álcool etílico (1:1:8) e armazenados em geladeira (4ºC) para, posteriormente, avaliar o CTP por meio de coloração histoquímica.

Para o preparo das lâminas e visualização do CTP, os pistilos, previamente fixados, foram lavados três vezes em água destilada e submersos em uma solução de NaOH (8N) por 24h, à temperatura ambiente, para o amolecimento dos tecidos, sendo novamente lavados três vezes com água destilada e transferidos para uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, durante 10 minutos, para descoloração dos tecidos. A seguir, foram novamente lavados em água destilada e imersos em solução aquosa do corante diferencial Lacmóide (Resorcina azul) 1%, por 10 minutos, lavados uma vez com água destilada para retirar o excesso de corante dos tecidos, para finalmente proceder a montagem da lâmina. O pistilo foi posicionado em lâmina de vidro, em seguida, acrescentou-se uma ou duas gotas de solução Lacmóide diluída em água (1:2). Posteriormente, foi coberto com uma lamínula, a qual foi levemente pressionada, para que rompesse os tecidos do pistilo, permitindo a visualização do CTP no interior do mesmo.

Após o preparo das lâminas, as mesmas foram visualizadas em microscópio óptico (Carl Zeiss Ind Brasileira) com ocular de 10x e objetiva de 40x. Foram observadas 20 lâminas para cada combinação de cruzamento, avaliando-se a percentagem de grãos de pólen germinados e o grau de desenvolvimento do tubo polínico. Para esta última variável foram atribuídas notas de 1 a 6, baseado na classificação de Fraken et al. (1988), com algumas alterações, conforme ilustrado na tab. 2.

Tabela 2 – Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010

* Adaptado de Fraken et al., 1988.

Notas* Grau de desenvolvimento do tubo polínico 1 Tubo polínico no estigma, sem penetrar no estilete 2 Tubo polínico no 1º terço do estilete

3 Tubo polínico no 2º terço do estilete

4 Tubo polínico no 3º terço do estilete

5 Tubo polínico no interior do ovário

6 Tubo polínico próximo ao óvulo

7 Tubo polínico no óvulo

(32)

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições de cinco flores. As médias foram submetidas à análise de variância e comparação de médias pelo teste de Duncan com 5% de probabilidade de erro, por meio do software WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003). Os dados da variável percentagem de grãos de pólen germinados foram transformados para (x/100)

1/2

enquanto que os graus de desenvolvimento do tubo polínico foram transformados para log (x), onde x, em ambos os casos, representa o valor observado.

1.3 Resultados e Discussão

Os resultados das polinizações controladas encontram-se na tab. 3, onde é possível verificar que a maior percentagem de frutificação efetiva foi obitdo na autopolinização da cv. Reubennel (8,41%), enquanto que todos os demais cruzametos apresentaram valores inferiores a 3,5%. De acordo com Van e Bester (1979), na polinização livre, apenas 5% de frutificação efetiva em cultivares de ameixeira seria suficiente para assegurar uma boa produção comercial. Embora estes autores tenham realizado o trabalho em regiões tipicamente de clima temperado, onde a floração é mais abundante e uniforme do que no Brasil, verifica- se que ’Reubennel’ é mais adaptada às condições de inverno ameno, do que as demais cultivares e não é totalmente autoincompatível. Mesmo assim, quando a floração não é abundante, a pesquisa recomenda o uso de uma cultivar polinizadora.

Em todas as combinações, a autopolinização foi realizada manualmente, utilizando o pólen da própria cultivar, ao invés de apenas o ensacamento dos botões florais, o que permitiu depositar grande quantidade de grãos de pólen no estigma, pois segundo Stephenson e Bertin (1983), Bawa e Webb (1984) e Waser e Price (1991) em polinizações naturais, o número de grãos de pólen alocados no estigma nem sempre é suficiente para que haja penetração do tubo polínico no óvulo.

No presente trabalho, durante a autofecundação, obteve-se frutificação

somente nas cvs. Reubennel e Rosa Mineira (Tab. 3), sendo um indicativo de que

são autocompatíveis reprodutivamente. Tal resultado está de acordo com Raseira

(2003), a qual afirma que ambas cultivares são moderadamente compatíveis,

podendo produzir uma boa colheita comercial, mesmo sem a utilização de

(33)

polinizadora, desde que haja um florescimento abundante e condições climáticas favoráveis.

Tabela 3 – Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (

Prunus salicina

Lindl.) da Embrapa Clima Temperado, na safra de 2007/2008.

Embrapa/Pelotas/RS, 2010

Genitores femininos Genitores masculinos Frutificação efetiva (%)

América 0

Rosa Mineira 0,66

Pluma 7 0

Amarelinha 0,63

Reubennel 2,44

Santa Rosa 1,33

América

The First 0

Reubennel 8,41

América 0,68

Reubennel

Rosa Mineira 0

Reubennel 3,47

América 0

Amarelinha 0

Amarelinha

Rosa Mineira 1,28

América 0

Reubennel 3,47

Rosa Mineira 1,28

Rosa Mineira

Amarelinha 0

América 0

Pluma 7 Pluma 7 0

América 0

Santa Rosa

Santa Rosa 0

Nos cruzamentos realizados a campo, ‘América’ apresentou frutificação

quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira (0,66%), Amarelinha (0,63%), Santa

Rosa (1,33%) e Reubennel (2,44%), sendo que esta última apresentou

compatibilidade mútua com ‘América’ (0,68%). As cvs. Amarelinha e Rosa Mineira se

mostraram compatíveis com ‘Rosa Mineira’ e ’Reubennel’, apresentando 1,28% e

3,47% de frutificação efetiva em ambos cruzamentos, para cada genitora feminina,

respectivamente (Tab. 3). Nos demais cruzamentos não houve frutificação. Mesmo

assim não é possível afirmar que a falta de frutificação tenha ocorrido devido à

autoincompatibilidade reprodutiva, já que existem inúmeros fatores ambientais que

podem influenciar no sucesso da frutificação.

(34)

Além da incompatibilidade reprodutiva existente entre as cultivares, as condições climáticas no momento da polinização (WEINBERGER, 1975) e após o florescimento, tais como chuva, vento, geadas, seca, entre outros, também podem ocasionar variação na polinização efetiva (THOMPSON; LIV, 1973; BARBOSA, 2006). A pseudocompatibilidade também pode ocorrer, influenciada por fatores ambientais e fisiológicos que permitem ou não a ocorrência de fertilização entre cultivares, neste caso, não existe influência de fatores genéticos para a fecundação (LARSEN, 1983; WHILLIAM; MAIER, 1977; EGEA; BURGOS, 1996).

Ademais, a emasculação, realizada durante os cruzamentos dirigidos, pode causar injúria no pistilo devido à delicada constituição das flores de ameixeira (THIELE; STRYDROM, 1964), sendo um importante fator associado à baixa frutificação observada nos cruzamentos dirigidos.

Diferenças de frutificação efetiva e pegamento do fruto são bastante comuns de um ano para o outro, sendo influenciado pelas condições ambientais no momento da polinização e após o florescimento (WEINBERGER, 1975).

Segundo Nava et al. (2009), recentemente tem sido verificada baixa taxa de frutificação efetiva e/ou irregularidades de produção nos pomares brasileiros de ameixeiras, pessegueiros, e nectarineiras, principalmente em algumas áreas da região sul do Brasil. Ressaltam que dentre os possíveis motivos para este acontecimento está a antecipação do florescimento devido a elevada temperatura durante o período que antecede a floração, acarretando no retardamento do desenvolvimento do gametófito feminino e na formação de anomalias dos gametófitos masculinos. Estes fatores promovem redução da viabilidade do grão de pólen e baixa produção de sacos embrionários viáveis, resultando na falta de sincronia no processo de fecundação, reduzindo, desta forma, a frutificação efetiva.

Portanto, esta pode ter sido outra razão para a baixa frutificação efetiva nos cruzamentos realizados no presente estudo, uma vez que na safra 2007/2008 nos pomares de ameixeira da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) foram muito prejudicados devido ao rápido aquecimento, no final do inverno, após o acúmulo de frio hibernal, além da incidência de chuvas no período de florescimento, entre os meses de agosto a início de novembro.

De acordo com o Laboratório de Agrometeorologia da Embrapa Clima

Temperdo (CPACT) (Pelotas/RS) houve acúmulo de 700h de frio, entre os meses de

maio a setembro de 2007, apresentando em média 4h de frio por dia no mês de

(35)

maio, 8h nos meses de junho e julho, e 3h no mês de agosto, a partir deste mês as temperaturas começaram a subir, iniciando, desta forma, a floração de diversas cultivares, enquanto que no mês de setembro o acúmulo de horas de frio foi de 13h em apenas três dias do final do mês, causando a queima de diversos botões florais que já haviam florecido. Quanto ao índice pluviométrico foi verificado que durante a época de floração houve um acúmulo de precipitação de 206mm no mês de agosto, no início do florescimento, 148,1mm em setembro, 149,3mm em outubro e 76,9mm em novembro, as chuvas foram bem distribuídas ao longo de cada mês, prejudicando a polinização controlada, realizada a campo (Anexo C).

Em relação aos cruzamentos in vivo, realizados no laboratório, foi observada uma elevada percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática do pistilo, entre 60-100%, exceto para o pólen da cv. Santa Rosa (21,67%) e para a cv. Rosa Mineira (40,23%) quando utilizada para polinizar as cvs.

Rosa Mineira e Reubennel, respectivamente. Entretanto, ‘Santa Rosa’ apresentou 70,56% de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. América (Fig. 1), demonstrando que os grãos de pólen utilizados, quando polinizados nos pistilos das respectivas genitoras femininas, estavam viáveis e foram capazes de germinar.

De acordo com a análise de variância houve diferença significativa pelo teste de Duncan para a percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática da planta-mãe apenas entre os cruzamentos realizados com as genitoras femininas

‘América’, ‘Reubennel’ e ‘Rosa Mineira’ (Fig. 1, ilustração na Fig. 2b).

Na genitora feminina ‘América’ o pólen da cv. Amarelinha teve 100% de germinação, diferindo das cultivares Rosa Mineira (71,61%), Santa Rosa (70,56%), América (67,86%) e Reubennel (60%) (Fig. 1a, Apêndice A1). Dentre os cruzamentos realizados com a cv. Amarelinha, a ‘Rosa Mineira’ apresentou 100% de germinação dos grãos de pólen na região estigmática, diferindo apenas do cruzamento com ‘América’ (88,89%) (Fig. 1b, Apêndice A2). Já, em relação à cv.

Reubennel houve diferença na percentagem de germinação do grão de pólen no estigma entre os três cruzamentos realizados, com maior percentagem de germinação do pólen da cv. América (94,66%) e menor da cv. Rosa Mineira (40,23%) (Fig. 1c, Apêndice A3). Nos cruzamentos realizados na ‘Rosa Mineira’ os grãos de pólen da própria cultivar e das cvs. Amarelinha e Reubennel apresentaram 100% de germinação no estigma diferindo apenas do pólen da ‘Santa Rosa’

(21,67%) (Fig. 1d, Apêndice A4).

(36)

Figura 1 – Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas genitoras femininas

‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.

Nos cruzamentos realizados nas cultivares ‘Pluma 7’ e ‘Santa Rosa’ não houve diferença significativa, apresentando média de 78,20% e 75,35% dos grãos de pólen germinados na região estigmática, respectivamente (Fig. 1e, 1f e Apêndices A5 e A6, respectivamente).

Genitor feminino cv. América

90,65

70,56 60 67,86 71,61

84,23 100

0 20 40 60 80 100 120

Amarelinha The First

Rosa Mineira Pluma 7

América Santa Rosa

Reubennel cultivares doadoras de pólen

Gos de len germinados no estigma (%)

Genitor feminino cv. Amarelinha

97,27 97,69 100

88,9

0 20 40 60 80 100 120

Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América cultivares doadoras de pólen

Gos de len germinados no estigma (%)

Genitor feminino cv. Reubennel

80,46 94,66

40,23

0 20 40 60 80 100 120

Rosa Mineira América Reubennel

cultivares doadoras de pólen Gos de len germinados no estigma (%)

Genitor feminino cv. Rosa Mineira

100 89,29

21,67 100 100

0 20 40 60 80 100 120

Reubennel Amarelinha Rosa Mineira América Santa Rosa cultivares doadoras de pólen

Gos de len germinados no estigma (%)

71,42

85

0 20 40 60 80 100 120

Pluma 7 x América Pluma 7 x Pluma 7

Gos de len germinados no estigma (%) 80,14

70,56

0 20 40 60 80 100 120

Santa Rosa x América América x Santa Rosa Gos de len germinados no estigma (%)

c d

a b

e f

Referências

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