UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE DENTIFRÍCIO CONTENDO HIDROCOLÓIDE COMO SISTEMA DE
LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FLÚOR
VANESSA FEITOSA ALVES
João Pessoa - PB
2016
i VANESSA FEITOSA ALVES
AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE DENTIFRÍCIO CONTENDO HIDROCOLÓIDE COMO SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
DE FLÚOR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia – Área de Concentração em Ciências Odontológicas.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio
João Pessoa - PB
2016
ii
iii
iv AGRADECIMENTOS
A Deus e a Maria Santíssima, por todas as bênçãos e fortaleza em minha vida.
Por me cercar de anjos e pessoas do bem, a quem menciono abaixo.
Aos meus pais, Antonio e Rozângela, por serem fontes inesgotáveis de amor e força. Agradeço por toda a confiança depositada em mim.
Aos meus irmãos, Mateus e Lívia, por se fazerem presentes e cúmplices em mais essa etapa. Agradeço por todo amor e carinho.
Ao meu namorado, Matheus, por todo conforto, ajuda e incentivo. Agradeço por todo carinho e por estar sempre presente em minha vida.
A toda minha grande família, em especial as minhas tias Lúcia e Elizabete, por todo apoio e torcida por mim.
Ao meu orientador Prof. Fábio Sampaio, por toda contribuição para meu crescimento em minha vida profissional e acadêmica. Agradeço por toda confiança, paciência e incentivo, e por mostrar que a humildade e grandeza podem andar juntas.
Às minhas amigas de graduação, pós-graduação e da vida, Isabelle, Cínita, Rebeca e Maria Luísa por todos os momentos compartilhados na alegria e tristeza nesses sete anos de convivência.
Às companheiras, Vanderlúcia, Helene, Andréia e Luísa, por estarem sempre solícitas, por toda a ajuda e conforto. Obrigada por todas as nossas longas manhãs e tardes de HMDS regada a muita conversa e risadas.
A toda família Labial, em especial Morgana, Isabela, Consuelo, Jocianele, Lília, Carla, Fatinha e Fernanda, por esses dois anos de convivência e de muito aprendizado.
À Profa Andressa e Ingrid, por executarem com tanta maestria a fase in vitro.
Obrigada por sempre estarem dispostas a ajudar e orientar minhas dúvidas.
A todos os voluntários, sem os quais este trabalho jamais poderia ser realizado.
Agradeço por toda colaboração e por nossas conversas ao nascer do sol durante as coletas.
Ao meu amigo Emerson, a quem agradeço por todos os ensinamentos e por ser um grande incentivador em minha vida acadêmica.
A Alisson de Oliveira por sua contribuição na análise estatística dos dados.
A Maryana Fernanda por toda disponibilidade de me auxiliar na técnica
laboratorial.
v Aos professores Dr. Lúcio Roberto Cançado Castellano, André Ulisses Dantas Batista e Josinete Vieira Pereira integrantes da banca de qualificação, por todas as contribuições e sugestões para aprimoramento deste trabalho.
A todos colegas do mestrado PPGO-UFPB, pela convivência durante esses dois anos.
À empresa Savoy SA, pela colaboração e disponibilização de produtos para o desenvolvimento deste trabalho.
À Capes, pelo auxílio financeiro fornecido a mim durante o período do mestrado.
A todos os funcionários, em especial Dona Rita e Rebeca, por toda atenção e
ajuda nesse período.
vi
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais volta ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
vii RESUMO
Introdução: Os hidrocolóides são compostos naturais utilizados em sistemas de liberação controlada de drogas. A incorporação de hidrocolóide (goma tara) associado ao flúor (F) parece ser promissor frente aos desafios de substantividade dos dentifrícios fluoretados. Objetivo: Avaliar dentifrício experimental contendo hidrocolóide (goma tara) como sistema de liberação controlada de F quanto à capacidade remineralizante em lesão de cárie inicial in vitro e quanto à capacidade de retenção in vivo de F intraoral em biofilme e saliva após seu uso. Materiais e métodos: Os grupos de dentifrícios utilizados no estudo foram: 100-TGF (NaF associado a goma tara); 50-TGF (50% de NaF associado a goma de tara + 50% de NaF livre); CD (NaF livre); TG (com goma tara e sem F); placebo (sem goma tara e sem F). Todos os dentifrícios fluoretados continham 1100 mg/mL F. Para o modelo in vitro, 75 blocos de esmalte de dentes humanos foram distribuídos em 5 grupos. Inicialmente, foi realizada a desmineralização da subsuperfície do esmalte seguido da realização do modelo de ciclagem de pH a 37º durante 5 dias. O tratamento foi realizado sob agitação com o slurry dos dentifrícios (2x/dia, 1 minuto, à 37ºC). Os espécimes foram submetidos a valores de microdureza, a partir dos quais, calculou-se o percentual de remineralização da superfície (%SMH
R). Os dados foram analisados por meio de teste ANOVA seguido de Tukey. Para o modelo in vivo, realizou-se um estudo clínico randomizado cruzado triplo-cego com dezoito indivíduos residentes em João Pessoa (cidade sem fluoretação de águas). Após uso semanal dos dentifrícios, foram coletadas amostras de biofilme e saliva estimulada. Os tempos de coleta foram 1 e 12 horas (h) após a última escovação para biofilme e 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 minutos e 12h para saliva. As concentrações de F em saliva e no biofilme foram analisadas por eletrodo específico através da técnica de difusão facilitada por hexametildisiloxano (HMDS). Os dados foram analisados por teste de ANOVA de medidas repetidas seguido do teste Bonferroni. Área sob a curva (AUC) após 1h de uso dos dentifrícios foi calculado para os dados de saliva.
Resultados: Os %SMH
Robservados foram: CD (3,49) > placebo (0,65) > 50-TGF (0,26) > 100-TGF (-1,59) > TG (-5,48). Nenhuma diferença estatística foi observada exceto para TG frente ao placebo e CD (p<0,05). Os níveis de flúor em biofilme e saliva foram maiores após uso de dentifrícios fluoretados quando comparados com valores de placebo e TG. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre a quantidade de flúor retido no biofilme em 1h e 12hs após a escovação nos grupos 100-TGF, placebo e TG (p>0,05). Os maiores valores de AUC foram para 50-TGF, 100-TGF e CD, respectivamente. Conclusão: Os dentifrícios experimentais contendo goma tara não mostraram efeito adicional na liberação de flúor no modelo in vitro. Os resultados do modelo in vivo indicaram a eficácia de dentifrícios contentdo a goma tara como sistema de liberação de F, promovendo a retenção de F mesmo após 12h da escovação.
Palavras-chave: Fluoretos, dentifrícios, hidrocolóide
viii ABSTRACT
Introduction: Hydrocolloids are natural products used as controlled drug delivery system. The addition of hydrocolloid (tara gum) associated with fluoride (F) can be a promising strategy for increasing the substantivity of fluoride dentifrices. Aim: To evaluate experimental dentifrices containing hydrocolloid (tara gum) as a controlled delivery system of F for remineralizing initial caries lesion in vitro and to investigate in vivo retention hability of F in biofilm and saliva after its use. Material and Methods: The dentifrice groups used in this study were: 100-TGF (All NaF associated to tara gum); 50-TGF (50% NaF associate to tara gum + 50% free NaF); CD (convencional dentifrice with NaF); TG (dentifrice with tara gum and without F); placebo (negative control, without F and without tara gum). All fluoride dentifrices had 1100 mg/mL F. For the in vitro model, 75 blocks of human teeth enamel were allocated in five groups. First, it was produced enamel demineralization lesion follow the pH cycling model for five days at 37ºC. The treatment was performed with the slurry of the dentifrice under agitation (twice a day, 1 minute, 37ºC). The blocks were submitted to surface microhardness mensuraments from which it was calculated the remineralization percentual (%SMH
R). The data were analyzed by ANOVA test followed by Tukey test. The in vivo model was a crossover randomized triple-blind trial with 18 individuals resident in João Pessoa (city without water fluoridation). After a week use, samples of biofilm and stimulated saliva were collected. The collection times were 1 and 12 hours (h) after the last brushing for the biofilm, and 0, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 minutes and 12h for the saliva. The F concentrations in these samples were analyzed by specific electrode through the acid-hexamethyldisiloxane (HMDS) diffusion method. The data were analyzed by the repeated measures ANOVA followed by Bonferroni test. Area under curve (AUC) after 1h of brushing was calculated for saliva data. Results: The %SMH
Robserved were: CD (3.49) > CN (0.65) > 50-TGF (0.26) > 100-TGF (-1.59) > TG (-5.48). No statistical difference was observed except for TG versus CD and CN (p<0.05). Biofilm and salivary F levels were highter after the use of fluoride dentifrices when compared to values of placebo and TG. No statistical difference between F retention on biofilm at 1h and 12h after the brushing for the 100-TGF, placebo and TG (p>0.05) was found. The highest AUC values were for 50-TGF, 100-TGF and CD, respectively.
Conclusion: The experimental dentifrices containing tara gum did not show additional effect on F release using this in vitro model. The in vivo outcomes indicates the efficacy of the dentifrice containing tara gum as a controlled delivery system of F in promoting F retention on the oral cavity even after 12 hours of brushing.
Keywords: Fluoride, dentifrice, hydrocolloid
ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitros µm micrômetro ºC Grau Celsius
CPO-D Dente cariado, perdido e obturado CD Dentifrício convencional
CN Controle negativo d magnitude de efeito d F Flúor
h Hora
HMDS Hexametildisiloxano M Molar
mM milimolar mg Miligrama min Minutos ml Mililitro mm Milímetros mmol Milimol n número amostral NaF Fluoreto de sódio NaOH Hidróxido de sódio pH Potencial Hidrogeniônico ppm Partes por milhão SD Standart deviation
SH
0Microdureza Superficial Inicial SH
1Microdureza Superficial 1 SH
2Microdureza Superficial 2 SMH
RPotencial de remineralização
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
100-TGF Dentifrício com fluoreto associado a goma tara
50-TGF Dentifrício com fluoreto associado a goma tara e fluoreto livre TG Dentifrício com goma tara sem fluoreto
UFPB Universidade Federal da Paraíba
x LISTA DE ILUSTRAÇÕES
INTRODUÇÃO
Figura 1. Estrutura química da goma tara ... 14
CAPÍTULO 1 Figure 1 ... 27
CAPÍTULO 2 Figure 1. Mean of F concentration in saliva (µM) over a period 12 hours (720 minutes) after brushing with the experimental dentifrices (n=18) ... 44
Figure 2. Relationship between [F] in the biofilm and saliva after use of placebo at the time 1 and 12 hours ... 44
Figure 3. Relationship between [F] in the biofilm and saliva after use of TG dentifrice at the time 1 and 12 hours ... 45
Figure 4. Relationship between [F] in the biofilm and saliva after use of CD dentifrice at the time 1 and 12 hours ... 45
Figure 5. Relationship between [F] in the biofilm and saliva after use of 50-TGF dentifrice at the time 1 and 12 hours ... 46
Figure 6. Relationship between [F] in the biofilm and saliva after use of 100-TGF dentifrice at the time 1 and 12 hours ... 46
Table 1. AUC fluoride concentrations in saliva within the period of 0-60 min and 1- 60 min after brushing with experimental dentifrices. (n=18) ... 47
Table 2. Mean (SD) of the F concentrations (mmol/kg) in biofilm 1h and 12h after the use of dentifrices (n=18) ... 47
METODOLOGIA Figura 1. Espécime de esmalte com 1/3 de superfície protegida com dupla cobertura de esmalte de unha. Fonte: Meira (2016) ... 51
Figura 2. Esquema demonstrativo do protocolo de ciclagem de pH in vitro ... 52
Figura 3. Esquema demonstrativo do delineamento da pesquisa in vitro ... 53
Figura 4. Esquema demonstrativo do protocolo do estudo in vivo ... 56
xi LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Cálculo amostral para estudo in vitro ... 50
Equação 2. Percentual de remineralização ... 53
Equação 3. Cálculo amostral para estudo in vivo ... 54
xii SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 10
2 CAPÍTULO 1 ... 16
3 CAPÍTULO 2 ... 28
4 METODOLOGIA ... 48
5 CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 59
6 CONCLUSÃO ... 61
REFERÊNCIAS* ... 62
ANEXO A – Certidão de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa (in vitro) ... 68
ANEXO B – Certidão de Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa (in vivo) ... 69
ANEXO C – Instruções aos autores da revista Brazilian Dental Journal ... 70
ANEXO D – Instruções aos autores da revista Archives of Oral Biology ... 75
ANEXO E – Submissão do artigo na revista Brazilian Dental Journal ... 85
APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ... 86
APÊNDICE B - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ... 87
APÊNDICE C - Ficha de Instruções ao Participante da Pesquisa ... 88
10 1. INTRODUÇÃO
A tecnologia de sistemas de liberação controlada de drogas tem apresentado ascensão nas últimas seis décadas.
1Esses sistemas garantem a substantividade com menor concentração da droga, além de minimizar a toxicidade e prover maior eficácia terapêutica no sítio de atuação da mesma.
2Devido à crescente busca por novos materiais que operem como sistema de liberação controlada, significativos avanços no uso de materiais sintéticos e/ou naturais e em tecnologias de micro e nanoencapusalmento foram observados na área farmacêutica e cosmética.
3,4,5,6,7No campo da odontologia, os sistemas de liberação controlada também são alvos das pesquisas científicas. A manutenção da dose terapêutica de substâncias ativas no meio bucal por longos períodos não é uma tarefa fácil. O aumento da substantividade do flúor é ainda considerado o maior desafio dos dentifrícios fluoretados e obstáculo para redução da prevalência de cárie dentária.
8,9,10Duckwoth (2013)
11afirma que um dos objetivos dos pesquisadores é aumentar a eficiência do flúor para o maior controle da cárie, propondo uma melhor distribuição e retenção desse íon na cavidade bucal. No entanto, há necessidade de atenção, uma vez que o teor de flúor é também fator de preocupação para a fluorose dental.
Chen e Wang (2010)
12, em sua pesquisa sobre patentes com novas tecnologias para prevenção e tratamento da cárie dentária, mostraram que produtos com liberação lenta de flúor tem atraído a atenção dos pesquisadores pela capacidade de manter a concentração terapêutica de flúor intrabucal.
Formulações de dentifrícios com fosfopeptídeo de caseína-fosfato de cálcio amorfo (CCP-ACP)
13, fosfato tricálcico funcional (f-TCP)
14ou com baixo pH (acidulados)
15,16são exemplos de dentifrícios desenvolvidos com esse objetivo.
Os níveis de flúor intrabucal são resultado da interação complexa que
influencia a clearance e fatores que ajudam na retenção. Sjögren (2001)
17afirma
que a estratégia de melhorar a substantividade deve envolver os dois
mecanismos. A clearance salivar, processo pelo qual as substâncias são
removidas da cavidade bucal
18ocorre simultaneamente ao sistema de retenção.
19Por agirem assim, significa que as concentrações de flúor na cavidade bucal
11 estão em constante flutuação ao longo do dia por efeito modulador desses sistemas. A relação entre eles é influenciada por aspectos biológicos como fluxo salivar; aspectos comportamentais como frequência, duração e quantidade de dentifrício utilizada na escovação, além de aspectos relacionados às características do produto, como sua concentração de fluoretos.
20O uso de produtos fluoretados resulta no aumento de níveis de flúor em saliva, biofilme e mucosa.
21-24A farmacocinética do flúor na cavidade bucal é bem conhecida na literatura. Logo após o uso de produto fluoretado, os níveis de flúor intrabucal decaem rapidamente devido às forças físicas como movimentos de tecidos moles e, principalmente, deglutição e efeito de lavagem da saliva. A saliva, por sua vez, comporta-se como meio que transporta o íon flúor para os diversos reservatórios intrabucais. Além disso, o flúor presente nesse sítio está na forma livre e em constante contato com a superfície dentária o que favorece o mecanismo de remineralização. No entanto, a concentração é bastante lábil.
Diferentemente, o flúor encontrado no biofilme (peso seco) tem cerca de até 50 vezes mais flúor do que na saliva.
11O flúor presente no biofilme tem grande importância devido a liberação desse íon ao longo do tempo, além de ser área de intercâmbio de íons para o esmalte dental.
25Assim, a saliva, biofilme e fluido de biofilme são considerados biomarcadores de exposição de flúor. As concentrações de flúor retidas nesses sítios são de interesse para os estudos de potencialidade de ação no processo desmineralização e remineralização (Des-Re).
26,27Para Whitford (2002)
20, o potencial de reter íons na cavidade bucal por tempo prolongado deve estar fundamentada na capacidade deste íon permanecer por longo período no biofilme dental.
Na busca por materiais que apresentassem potencial de promover a retenção do flúor na cavidade bucal, a adição de produtos naturais em fármacos como sistema de liberação controlada atraiu a atenção dos pequisadores.
3,28,29,30,31Os produtos naturais são considerados a maior fonte de
agentes terapêuticos inovadores e eficientes ao longo da história do homem
32e
têm sido a base para desenvolvimento de novas substâncias químicas em
produtos farmacêuticos, alimentícios e cosméticos.
33,34Essa expansão vem
12 acompanhando o crescimento da parcela da população que busca um estilo de vida mais saudável.
35A escolha por produtos naturais não está relacionada apenas as suas vantagens, mas também com a possibilidade de minimizar os efeitos colateriais, toxicidade, contaminação do meio ambiente e alto custo de produtos sintéticos
3,29,36.
O aumento do consumo de produtos naturais leva a maior comercialização deste tipo de produto e, assim, os tornam alvos do marketing das empresas de oral care.
35Sabendo que o dentifrício é o produto de autoadministração tópica mais utilizada em todo o mundo
37e seu uso aliado a remoção mecânica do biofilme através da escovação é considerado a forma mais eficaz de prevenção da cárie,
38as indústrias mostram uma tendência para desenvolvimento de dentifrícios naturais conhecidos como dentifrícios herbais.
39Os dentifrícios herbais são assim chamados por adição de produtos naturais como substitutos de produtos sintéticos em suas formulações. Na década de 70, eles tornaram-se mais conhecidos com o aumento da população vegetariana
40. Um dos argumentos para incorporar produtos naturais em dentifrícios é a possibilidade de adicionar uma substância farmacêutica benéfica com menor risco de efeitos colaterais.
33,41No entanto, os dentifrícios são considerados os produtos mais complexos entre aqueles de cuidado pessoal.
10Dessa forma, um dos primeiros desafios dos dentifrícios herbais é a manutenção do produto estável quimica e fisicamente.
36Durante a escovação, os componentes orgânicos do dentifrício herbal podem sofrer alteração pelo pH salivar, diluição pelos fluidos, interação com outras substâncias do meio bucal e até serem inativados.
42Apesar de ser consenso sobre a ação do flúor como principal agente preventivo de cárie, algumas marcas comerciais tem colocado no mercado dentifrícios herbais sem flúor.
40O uso de produtos naturais que vise aprimorar as propriedades cariostáticas do flúor é considerado uma estratégia promissora de novos e potentes produtos anticárie
32. No entanto, são poucas as evidências encontradas na literatura sobre dentifrícios herbais. Em sua maioria, os estudos são voltados para avaliação antimicrobiana in vitro e indicam potencial em cárie, gengivite e halitose, principalmente.
35,36,43,44,45,46Estudos clínicos controlados ainda são
poucos e em sua maioria limitados a fase II, principalmente.
47Até o momento, a
13 aplicabilidade de produtos naturais (ex. hidrocolóides) nos dentifrícios não envolve a ação carreadora de substância ativa, sistema de liberação ou até mesmo de substância ativa.
As gomas naturais são exemplos de produto natural pertencentes a família dos hidrocolóides com potencial ação na odontologia. Ainda são pouco exploradas, mas mostram-se promissoras devido às suas características e ao crescente interesse da indústria em polímeros naturais.
3,29,31Elas são empregadas em vários setores da indústria e, na odontologia, o uso de gomas está voltado para a adição em dentifrícios como substitutos de materiais sintéticos como a carboximetilcelulose utilizada como espessante.
10,48A goma de xantana é exemplo encontrado nas formulações de dentifrícios que age como aglutinante no intuito de impedir a separação dos componentes líquidos e sólidos proporcionando estabilidade do produto ao longo do tempo, além de viscosidade adequada. Outras gomas como a goma de carragerina e de celulose também são empregadas com a mesma função.
48Caracterizadas como polissacáridos extraídos do endosperma de sementes de plantas, arbustos e árvores da Família Leguminosae e Febaceace, as gomas consistem de múltiplas unidades de açúcar ligadas entre si formando grandes moléculas.
49Apresentam-se úteis como agentes de suspensão, emulsionantes, gelificante e espessantes. Além disso, são usadas na microencapsulação de produtos, em revestimentos de comprimidos e sistemas bioadesivos.
3,6,29,30,31,50A indústria de alimento é a principal consumidoras de gomas, porém é na
indústria farmacêutica e cosmética que, recentemente, tem tido destaque como
novos materiais para sistemas de liberação controlada.
3,6,51Na área cosmética,
elas estão presentes em várias formulações como xampus, filtro solar, máscara
para cílios, hidratantes e produtos antienvelhecimento. Em xampus, a ação dos
polímeros é de conferir características residuais sobre as superfícies lavadas com
o produto. Tal procedimento assemelha-se ao que acontece com agentes anti-
caspas em xampus que são depositados e retidos no couro cabeludo após a
lavagem garantindo ação do produto por mais tempo.
52De forma semelhante, os
hidrocolóides tem sido utilizados na área farmacêutica como sistema de liberação
14 controlada em fármacos tais como o paracetamol, diclofenaco, amoxicilina e propanolol.
29A goma tara também conhecida como alfarroba peruana é obtida do endosperma de semente da árvore Caelsapinia spinosa. Esse polímero é amplamente utilizado na medicina tradicional devido suas propriedades antimicrobianas.
6,49,53O componente principal da goma tara é um polímero semelhante aos principais componentes de guar e gomas de alfarroba, consiste de uma cadeia principal linear de unidades de 1,4-β-d-manopiranose, com resíduos de 1,6-α-d-galactopiranose na proporção de 3:1
6,51(Figura 1).
Figura 1. Estrutura química da goma tara. Fonte: Prajapati et al (2013)
31.
Na indústria alimentícia, a goma tara tem tido seu grande destaque utilizada como conservante, espessante, estabilizante de emulsão e aumento de vida útil de prateleira.
49,50,54Esse hidrocolóide tem habilidade de formar soluções de alta viscosidade em pequenas concentrações, sendo pouco afetadas pelo pH, íons, e processamentos térmicos.
55Recentemente, esse polímero foi usado como microencapsulante de sucos industrializados como alternativa para aumentar a estabilidade dos componentes bioativos.
56Além de suas características, outro fator que contribui para seu amplo uso na indústria é o baixo custo, pois a planta tem curto ciclo de vida.
50A reivindicação de patentes sobre o uso do hidrocolóide goma tara como
um agente de liberação controlada de drogas (comprimidos e emulsões) em
fármacos como cloridrato de metformina, cloridrato de ciprofloxacina, nimodipina,
nifedipina, carvedilol e clozapina,
6despertou para o benefício da adição desse
hidrocolóide em dentifrícios. A incorporação da goma tara em dentifrícios é
interessante, pois além de agir como aglutinante, funcionaria como delivery de
substâncias ativas no meio bucal . Dessa forma, a goma tara teria importante
15 efeito sobre o principal desafio dos dentifrícios: a substantividade de componentes ativos intrabucal.
Trabalho in vivo, ainda não publicado, avaliou a eficácia de dentifrício e enxaguatório contendo goma tara, flúor e cloreto de zinco no controle químico e mecânico na formação dos compostos sulfurados voláteis na halitose matinal de indivíduos saudáveis após quatro dias de uso. Para tanto, realizou-se aferição de sulfetos através de monitor portátil de sulfetos e teste organoléptico. Essas formulações mostraram-se significativamente eficazes na redução de compostos sulfurados voláteis quando comparadas a placebo e não apresentaram diferenças estatísticas entre si.
58Mais recente, Meira (2015)
59realizou a avaliação de dentifrício contendo goma tara associada ao flúor por análise direta de flúor por potenciometria (eletrodos de flúor específicos). A presença do hidrocolóide foi considerada interferente na difusão de íons e, consequentemente, na obtenção de resultados por potenciometria. De forma semelhante às amostras ricas em enzimas e proteínas, há bloqueio da membrana de lantânio do eletrodo impedindo a conexão entre o meio e os sensores internos.
Outros estudos sobre goma tara na Odontologia não foram encontrados.
Dessa forma, o presente estudo é considerado pioneiro na análise de eficácia
anticárie da adição da goma tara em dentifrícios com flúor. Sabendo que o
dentifrício é o principal veículo para exposição diária de flúor a cavidade bucal e
que o efeito preventivo da cárie é limitado devido à baixa retenção de flúor no
meio oral, a avaliação da adição de goma tara em dentifrício como sistema de
liberação controlada de flúor se faz importante. Assim, o objetivo desse trabalho
foi avaliar dentifrício experimental contendo hidrocolóide (goma tara) como
sistema de liberação controlada de flúor em modelos in vitro e in vivo.
16 2. CAPÍTULO 1
O artigo a seguir foi submetido para publicação como Short Communication no
periódico “Brazilian Dental Journal”.
17
In vitro enamel remineralization by dentifrice with hydrocolloid as controlled deliverysystem of fluoride
Herbal dentifrice for remineralization
Ingrid Andrade Meira
a, Vanessa Feitosa Alves
a, Nayanna Lana Soares Fernandes
a, Juliane Rolim de Lavôr
a, Andressa Feitosa Bezerra de Oliveira
b, Fábio Correia Sampaio
aa
Departamento de Clínica e Odontologia Social, UFPB – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;
bDepartamento de Morfologia, UFPB – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brasil.
Correspondente: Vanessa Feitosa Alves. Rua: Desembargador Aurélio M. Albuquerque,
252 – Jardim Cidade Universitária, João Pessoa - PB, 58052-160 Telefone: (83) 99829-
6302. E-mail: vanessafalves@hotmail.com
18
In vitro enamel remineralization by dentifrice with hydrocolloid as controlled deliverysystem of fluoride
Herbal dentifrice for remineralization
The aim of this study was to evaluate the remineralizing capacity of dentifrices with tara gum as controlled delivery system of fluoride (F) in initial carious lesions. It was a randomized double-blind
in vitro study. Human enamel blocks were selected by surfacehardness and randomized into five groups (n=15): CN (negative control, without F and tara gum); 100-TGF (tara gum with NaF); 50-TGF (50% NaF associate to tara gum + 50% free NaF); CD (convencional dentifrice with NaF); TG (dentifrice with tara gum and without F). All fluoride dentifrices had 1100 mg/mL F. After development of artificial carious lesions, the blocks were submitted to remineralization pH cycling and daily treatment with dentifrice suspensions (1 minute twice daily) during five days at 37ºC and more two days in remineralization solution. The percentage of surface remineralization (%SMH
R) was calculated by the difference of microhardness before and after the pH cycle. The %SMH
Robserved were: CD (3.49) > CN (0.65) > 50-TGF (0.26) > 100-TGF (-1.59) > TG (-5.48).
No statistical difference was observed except for TG versus CD and CN (p<0.05). The experimental dentifrices containing tara gum did not show additional effect on F release using this
in vitro model. In fact, tara gum may compromise the remineralization processof initial carious lesions since fluoride might not be released immediately.
Key words: dentifrice, fluoride, natural products, gum.
19 Introduction
Several sustainable and controlled delivery systems by which fluoride can be released constantly in the oral cavity have been investigated using dental materials, tablets and membranes (1,2). In dentifrices, the intraoral fluoride depends on duration of brushing and fluoride concentration (3). Hence, new strategies for sustainable levels of intraoral fluoride can be an interesting approach.
Natural gums can be incorporated into dentifrices without compromising its characteristics. Hydrocolloids are natural gums considered as promissing polymers.
Among their properties, they act as thickening and/or gelling agent of aqueous solutions, stabilizing, emulsifying and in dentifrices, they are used as binders such as xanthan and guar gum (4,5).
The tara gum is a hydrocolloid from the seed endosperm of the Caelsapinia spinosa that has not been investigated in dentistry. Recently, it has received great attention from the pharmaceutical and cosmetic industry due its potencial to act as system of control of active release of drugs (tablets and emulsions) (6,7). This aroused to the potential benefit of this hydrocolloid in fluoride dentifrices, acting simultaneously as a binder and as delivery system of fluoride (F).
The use of fluoride dentifrice in toothbrushing is considered the most effective method of controlling dental caries because there is combination of topical exposure of fluoride and mechanical removal of dental biofilms (8). However, the maintanining of optimum intraoral F concentration is not an easy task due to the rapid clearance of oral fluids (9). Therefore, the development of formulations that promotes a controlled release of fluoride might indicate a higher clinical efficacy compared to regular free fluoride formulations (10). In addition, natural compounds may increase the anticaries effect due to its action directly on dental biofilms (11). Thus, the aim of this study was to evaluate the remineralizing capacity of dentifrices with a type of hydrocolloid (tara gum) as controlled delivery system of fluoride in initial carious lesions.
Material and Methods
This was a randomized double-blind in vitro study that it was approved by a Brazilian Ethics Committee for Research with Human Beings (CAAE:
45917915.6.0000.5188). Seventy-five (n=75) blocks of human tooth enamel (4x4x2 mm)
were allocated according inicial surface hardness (SH
0) and divides in five groups (n=15)
20 of dentifrices: CN (negative control, without F and without tara gum); 100-TGF (All NaF associated to tara gum); 50-TGF (50% NaF associate to tara gum + 50% free NaF); CD (convencional dentifrice with NaF); TG (dentifrice with tara gum and without F). All fluoride dentifrices had 1100 mg/mL F. The amount of tara gum in the experimental dentifrices reached a maximum of 6% of the formulation. All dentifrices had the same characteristics (packing, flavor, color, consistency) and were identified by an independent researcher.
The enamel blocks were immersed in 32 mL/block of demineralizing solution at 37ºC for 16 h to produce a enamel demineralization lesion (12). Enamel blocks were submitted to pH cycling model for five days at 37ºC and after this they were kept just in a remineralization solution for 2 days, according to Vieira and co-workers (13). The blocks were kept in a remineralizing solution for 18 hours and demineralization solution for 6 hour. The dentifrice were diluted (1:3 w/w) in deionized water. The treatment was performed twice a day (before and after a demineralization) under agitation (2 mL/block).
The pH cycling solutions were changed daily.
The surface microhardness was determined using a Vickers hardness tester (Shimadzu HMV - AD Easy Test Version 3.0, Tokyo, Japan) under load of 100 g for 10 s.
After desmineralization of enamel (SH
1) and pH cycling (SH
2) was determined a microhardness trought three indentations. The percentage of surface hardness recovery was calculated according Hirata and co-workers (14). [%SMR
R= ((SH
2- SH
1)/(SH
0- SH
1)) x 100].
The Kolmogorov-Smirnov test was applied to evaluate the normality of data.
Statistical analysis was performed using the ANOVA test followed by Tukey, considering a statistical difference when α <0.05.
Results and discussion
This study used well-established
in vitro pH cycling model and close to similarconditions of oral cavity except for the fact that no salivary enzimes were included in the
system. In addition, this was a closed system which did not consider renovation of saliva
for the blocks. Despite these limitations, this protocol can indicate the behavour of many
fluoride dentifrices and it is suitable to evaluate new F-dental products (12,15).
21 The mean (SD) of %SMR
Rin the differents groups showed that highest to lowest values were: CD (3.49±4.81) > CN (0.65±2.95) > 50-TGF (0.26±3.3) > 100-TGF (- 1.59±4.53) > TG (-5.48±8.16). A high value of %SMR
Rfor the CD (free NaF) was expected because it is similar to other studies. The surprising values observed were the low values of %SMR
Rfor 50-TGF and 100-TGF. Moreover, the CN low value of %SMR
Rindicates that the remineralization periods in the pH cycle were effective. No statistical difference was observed except for TG versus CD and CN (p<0.05) (Figure 1).
It must be pointed out that using this pH-cycling model, the fluoride ions were effective as a remineralizing agent. The difference between the values of CD (positive control, free NaF) and CN (negative control, dentrifrice without tara gum and without F) indicate the net gain in remineralization due to the presence of NaF in the tested dentifrice.
Hence, the weak remineralization observed in CN is expected and can be directly related to the pH-cycling model used characterized by greater remineralization cycles than demineralization (12).
The most surprising results were observed for the experimental dentifrices with tara
gum associated with fluoride and without fluoride. There was a loss of surface
microhardness of the enamel exposed to these experimental dentifrices and it was
significant for the TG dentifrice. It is interesting to point out that a dose-effect could be
observed according to the concentration of free NaF in the formulation (Figure 1). The
subtle remineralization of 50-TGF is a clear indication that in spite of having 50% of free
NaF the mineral gain was lower than expected. The values of %SMR
Rare in accordance
of a similar result of a low fluoride dentifrice. It must be emphasized that all F-dentifrices
of this study have a total of 1100 ppm of fluoride. The presence of fluoride in the
dentifrices regardless the formulation were measures by diffusion technique (HMDS night
diffusion) (16) (data not shown). Hence, the most important result of this experimental
study is the understanting that a fluoride-hydrocolloid system may not represent an
additional benefit for the remineralization process. It can be hypothetized that once
fluoride is associated to hidrocoloids it might not be promptly released. Moreover, salivary
enzimes may contribute to the F-realease and the lack of saliva in this in vitro system could
have compromised the remineralization performance of the experimental dentifrices with
F-tara gum system. A modified
in vitro experimental study and an in vivo trail mayprovide good insights on this respect.
22 The inconsistent remineralizing behavior of the experimental dentifrices may also be linked to the mechanical characteristics of the tara gum, such as: viscosity (7), adhesive capacity and the ability to form filter and /or films on surfaces (17). Thus, the fluoride ions could not be incorporated into the enamel due this gum physical barrier. The presence of a physical barrier is likely to have contributed to the weak remineralization potential of the experimental dentifrices. Such effect is also observed when ion specific electrodes (ISEs) show erratic readings due to the blocking barrier that separated the analyte and the sensing membrane of the electrode. In fact, to reduce the risk of errors with ISEs a list of interferences is displayed for laboratory precautions. Among these interferents it can be found: herbal medication, natural products, surfactants (18).
A very important observation of this study is also regarded to herbal dentifrices.
New formulations are proposed without appropriate evaluation of their claims as anti- caries produtcs. In this study, the results of the TG dentifrice showed the significant loss of mineral of the enamel and the risk for use of the herbal dentifrice without fluoride. Even that the saliva has a remineralizing action, in this case, it not be able to act effectively to prevent the loss of mineral.
For instance, the
in vivo potencial benefit of a gum tooth barrier given by theseexperimental dentifrices may compromise its ability to remineralize carious lesions.
Therefore, a “pure” natural herbal dentifrice without fluoride but with such binders can be a serious problem for individuals with caries activity.
Finally, it concluded that the fluoride-hydrocolloid system of the experimental
dentifrices did not represent any advantage in the remineralization process of
in vitroartificial carious lesions. The carrier fuction and release of fluoride did not occur under
this in vitro pH cycling model. Actually, the presence of hydrocolloid may interfere in the
remineralization process. However, the effect of this system must be evaluable in vivo
study. A system that promotes the more retention of fluoride intraoral and the retention for
high period of time present as a key role in mechanism of demineralization and
remineralization and, thus, acting in the control of caries.
23 Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade remineralizante de dentifrícios contendo goma tara como sistema de liberação lenta de (F) em lesões de cárie inicial. Realizou-se um estudo
in vitro randomizado duplo-cego. Os blocos de esmalte humano foramselecionados pela microdureza superficial e randomizados em cinco grupos (n=15): CN (controle negativo, sem F e sem goma tara); 100-TGF (goma tara com NaF); 50-TGF (50%
NaF associado a goma tara + 50% NaF livre); CD (dentifrício convencional com NaF); TG (dentifrício com goma tara e sem flúor). Todos os dentifrícios fluoretados continham 1100 mg/mL F. Após o desenvolvimento de lesão inicial de cárie artificial, os blocos foram submetidos a modelo de ciclagem de pH remineralizante e tratamento diário com as suspensões dos dentifrícios (1 minuto, 2X/dia) durante cinco dias à 37ºC e mais dois dias em solução remineralizadora. A porcentagem de remineralização (%SMH
R) foi calculada pela microdureza antes e depois da ciclagem de pH. A %SMH
Robservados foram: CD (3,49)> CN (0,65)> 50-TGF (0,26)> 100-TGF (-1,59)> TG (-5,48). Não houve diferença estatística, exceto para TG com CD e CN (p<0,05). Os dentifrícios experimentais contendo goma tara não apresentaram efeito adicional na liberação de F neste modelo
in vitro. Agoma tara pode comprometer o processo de remineralização das lesões de cárie inicial uma vez que o fluoreto pode não ser liberado imediatamente.
Acknowledgements: The authors thank Prof. Rosângela Marques Duarte for her collaboration and the Savoy SA for providing the toothpastes for this study.
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26 Figure 1. Net gain of remineralization presented as mean (SD) of %SMH
Rof initial caries lesions treated with different experimental dentifrices containing fluoride associated with tara gum.
* Mean values represented by each group.
a
Different letters indicate statistical difference between groups. ANOVA test followed by
Tukey test (p <0.05).
27 Figure 1.
CN
CD
50-TGF
100-TGF
TG - 1 5
- 1 0 - 5 0 5 1 0
%SMR
0.65a
3.49a
0.26a,b
-1,59a,b -5,48b
28 3. CAPÍTULO 2
O artigo a seguir será submetido para publicação no periódico “Archives of Oral
Biology”.
29 Highlights
First work about the natural product as a release system of fluoride in dentifrice
The hydrocolloid promoting fluoride retention on the oral cavity
Retention of fluoride even after 12 hours of brushing
High AUC values in saliva for the dentifrices containing hydrocolloid.
Dentifrice herbal without fluoride may be prejudical
30 A randomized, triple-blind crossover trial of dentifrice containing
hydrocolloid as a controlled release system of fluoride
Running title: Release system of fluoride in dentifrice
Vanessa Feitosa Alves*, Vanderlúcia Gomes Moreira, Andréia Felix Soares, Luísa Simões de Albuquerque, Helene Soares Moura, Alisson de Oliveira Silva, Fábio Correia Sampaio
*Corresponding author:
Vanessa Feitosa Alves
Departament of Clinical and Social Dentistry, Federal University of Paraiba, João Pessoa – PB. Castelo Branco, s/n. 58051-900. Telephone: +55 83 998296302.
Email: vanessafalves@hotmail.com
31 A randomized triple-blind crossover trial of dentifrice containing
hydrocolloid as a controlled release system of fluoride
Vanessa Feitosa Alves
a*, Vanderlúcia Gomes Moreira
a, Andréia Felix Soares
a, Luísa Simões de Albuquerque
a, Helene Soares Moura
a, Alisson de Oliveira Silva
b, Fábio Correia Sampaio
aa
Departament of Clinical and Social Dentistry, Federal University of Paraiba, João Pessoa – PB, 58051-900, Brazil.
bLauro Wanderley University Hospital, Federal University of Paraiba, João Pessoa – PB, Brazil.
ABSTRACT
Objective: To evaluable the retention of intraoral fluoride in biofilm and saliva by the use of experimental dentifrice containing hydrocolloid (tara gum) as a controlled release system of fluoride (F).
Design: It was a crossover randomized triple-blind trial in which eigthteen individuals used different dentifrices during a week: 100-TGF (NaF associate to tara gum - 1100 mg/mL); 50-TGF (50% NaF associate to tara gum + 50% free NaF - 1100 mg/mL); CD (free NaF - 1100 mg/mL); TG (with tara gum and without F); placebo (without F and tara gum). After 7th day, it was collected biofilm and saliva samples with 1 and 12 hours after the last toothbrusing. The F concentrations was determined by physico-chemical analysis of fluoride by the hexamethyldisiloxane-facilitated diffusion technique. Data were submitted to two- way ANOVA (repeated measures) and Sperman correlation coefficient (p <0.05).
Results: Biofilm and salivary F levels were highter after the use of fluoride dentifrices when compared to values for placebo and TG. Not found statistical difference between F retention on biofilm at 1h and 12h after the toothbrushing for the 100-TGF, placebo and TG (p>0.05). The highest AUC values were for 50- TGF, 100-TGF and CD, respectively.
Conclusion: The outcomes indicates the efficacy of the dentifrice containing tara gum as a controlled release system of F in promoting F retention on the oral cavity even after 12 hours of brushing.
Key-words: Dentifrice, Fluoride, Natural Product, Tara gum.
32 Introduction
The preventive effect of fluoride (F) for controlling dental caries is highly dependent on the clearance rate of saliva. A long lasting F retention in the oral cavity after toothbrushing with F dentifrice is probably the highest challenge for F bioavailability related to dental product (Duckworth, 2013; Duckworth & Jones, 2015). The monitoring of intraoral F levels in the oral cavity can contribute to the understanding of the F behavior after the exposure to dental fluoride products.
Hence, the monitoring of biomarkers such as biofilm and saliva can indicate anticaries efficacy of dental products (Buzalaf, Pessan, Honório & Ten Cate, 2011).
Different approaches have been developed for mantaining F dentifrice efficacy with minimal risk for dental fluorosis (Pessan et al, 2010; Karlins & Pfarrer, 2012; Kongo et al, 2015; Oliveira et al, 2016) and the development of controlled release systems can be a strategy. The pharmaceutical industry has very sucessful in exploring mechanisms and techniques for increasing the half life time of the drugs, for assisting drugs in crossing physiological barriers as well as for developing controlled delivery systems based in natural products (Siegel &
Rathbone, 2012). The incorporation of natural products have been regarded as a very interesting strategy for caries control (Jeon, Rosalen, Falsetta & Koo, 2011).
Nevertheless, natural products incorporated into dentifrices are explored only due to their antimicrobial properties (Verkaik et al, 2011; Abhay, Dinnimath & Hullati, 2014; Ledder et al, 2014; Smolarek et al, 2015).
Hydrocolloids are common components of many cosmetic and pharmaceutical products (Goswami & Naik, 2014; Khathuriya et al, 2015; Kumar et al, 2015). Tara gum is a hydrocolloid derived from seed endosperm of the Caelsapinia spinosa that has not been explored in dentistry. However, it has been frequently used as matrix for preparing controlled release systems (Avachat, Dash
& Shrotriya, 2011). The rather stability of this material can make it apppropriate for
formulations that needs viscosity and good consistency. In addition, the use of
natural product as the gums have gained good aceptance by consumers due to
potential low risk or irritability of tissues with low side effects (Khathuriya et al,
2015; Smolarek et al, 2015).
33 Thus, the aim of this study is to evaluable the F retention in saliva and biofilm after the use of experimental dentifrices containing hydrocolloid (tara gum) as a controlled release system of F. The alternative hypothesis was the F-tara gum system would have the hability to promote the F retention on the oral cavity even after 12 hours of brushing.
Material and methods Ethical aspects
This study was approved by the Research Ethics Committee of Health Sciences Center, Federal University of Paraiba (CAAE:457807154.0000.5188). All participants were informed and signed the consent form before the study began.
This clinical trial was registered at US National Institute of Health (ClinicalTrials.gov) #NCT02809014.
Study Design
It was a crossover randomized triple-blind trial to evaluable the bioavailability of fluoride intraoral in biomarkers of exposure (biofilm and saliva) after using experimental fluoride dentifrices during a week with wash-out periods in between. The biofilm was collected at 1h and 12h after toothbrushing and saliva during 1h (t1, t5, t10, t15, t20, t30, t45 e t60min) and 12h. The data was obtained by potenciometry (ion selective electrode) for fluoride in these samples. The pilot test was performed with three participants before de beginning of study.
Study Population
The sample size was determined by sample calculation (Zhong, 2009), according previous studies (Pessan et al, 2008), α=5% e β= 10% and droup-out ratio of 10%. Eighteen individuals of 20-25 years old of both males and females participated in this study. The elegibility criteria was DMFT≤6, absence systemic impairment and living in a city without water fluoridation (<0.05 μg/mL F).
Individuals who used drugs that interfere in the biofilm formation and salivary flow or fluoride products in the last four weeks; that used orthodontic appliance;
presence caries lesions and/or periodontal disease were excluded.
34 Experimental dentifrices
The participant were allocated randomly for toothbrusing the teeth with the follow experimental dentifrices: Placebo (without F and without tara gum); 100- TGF (NaF associate to tara gum - 1100 mg/mL F); 50-TGF (50% NaF associate to tara gum + 50% free NaF - 1100 mg/mL F); convencional dentifrice (free NaF - 1100 mg/mL F); TG (with tara gum and without F) (Savoy SA – São Paulo, Brazil).
All dentifrices were packed in similar tubes (60g) and had the same color, flavor and abrasive system. They were coded by an independent researcher not involved in the trial.
Simple randomization was carried out taking into account a crossover design. The unit of randomization was “dentifrice”. Hence, all dentifrices had the same chance to be selected. The planning design was done for each participant and, for each new planned draw, the chances of selection was renewed.
Clinical Procedures
First, the participants were submitted to dental prophylaxis to remove all biofilms and dental calculus. They used a placebo dentifrice for 7 days. Then,
it followed the protocol by Whitford et al. (2002, 2005) and Pessan et al. (2006, 2008). Briefly, subjects were instructed to brush their teeth 3 times/day for 1 min (transversal technique). They also rinsed their mouth after brushing with 10 mL of water. In the seventh day, subjects were oriented to brush only the occlusal surfaces and did not use dental floss to allow biofilm accumulation on buccal surfaces. After going to bed, they refrained from eating or drinking anything except water and did not brush their teeth. In the following morning, after 12 hours of the last toothbrusinhg and in a fasting, the first stimulated saliva and biofilm samples (right side of mouth) were collected. Then, volunteers brushed the occlusal surfaces for 1 min and rinsed with 10 mL of tap water.Soon after that saliva samples were collected at the following times: t1, t5, t10, t15, t20, t30, t45 e t60 minutes. Later (1 hour after brushing), biofilm samples (left side) were collected.
Stimulated saliva (chewing on a rubber band) was collected for 2 min.
Biofilm was collected from all buccal and lingual tooth surfaces using a hollenback
