UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA - UFPB CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS
LABORATÓRIO DE ENSAIOS TOXICOLOGICOS
EDLA JULINDA RIBEIRO COUTINHO ESPÍNOLA GUEDES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS NÃO CLÍNICOS DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DA WISSADULA PERIPLOCIFOLIA (L.) C.
PRESL
JOÃO PESSOA - PB 2016
EDLA JULINDA RIBEIRO COUTINHO ESPÍNOLA GUEDES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS PRÉ-CLÍNICOS DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DA WISSADULA PERIPLOCIFOLIA (L.) C.
PRESL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, para obtenção do título de Doutora em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos (Farmacologia- Toxicologia).
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Coorientadora: Profª. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
JOÃO PESSOA - PB 2016
EDLA JULINDA RIBEIRO COUTINHO ESPÍNOLA GUEDES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ENSAIOS TOXICOLÓGICOS NÃO CLÍNICOS DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DA WISSADULA PERIPLOCIFOLIA (L.) C.
PRESL
Tese aprovada em: 08 de Junho de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Orientador
Profª. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz Coorientadora
Profª. Dra. Liana Clébia de Morais Pordeus Examinador Interno
Profª. Dra. Temilce Simões de Assis Cantalice Examinadora Interna
Profª. Dra. Lindomar de Farias Belém Examinador Externo
Profª. Dra. Carolina Uchoa Guerra Barbosa de Lima Examinador Externo
À minha mãe amada que sempre esteve ao meu lado, estimulando nos estudos, nas pesquisas e a nunca parar no conhecimento. Ao meu marido Gilson, por todo amor, cumplicidade e dedicação e aos meus filhos Wilma e André, Andréia e Cícero, Rafaela e Jean, Gilson Neto e Flavinha e ao meu raio de luz João, que tanto me incentivaram com seu amor, carinho e sorrisos.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus pela sua presença constante, sua força e amor contínuos em minha vida e por nunca desistir de mim.
Ao meu grande amor e companheiro, Gilson E. Guedes Filho, àquele que sempre soube dividir problemas e multiplicar alegrias, que abriu caminhos na minha vida e soube ser luz no túnel. E que junto com nossos quatro filhos, nesses 32 anos de casamento tem sido meu porto seguro e baluarte de nossa família. Especialmente hoje, lhe agradeço pela paciência, amor, compreensão e torcida por completar mais uma etapa na minha vida.
Aos meus filhos Wilma e André, Andréia Julinda e Cícero, Rafaela Julinda e Jean, Gilson Neto e Flavinha e ao meu raio de luz João, que tanta paciência me dispensaram, muito me ajudaram e incentivaram com seu amor, carinho e sorrisos.
Aos meus pais, Francisco Leocádio Ribeiro Coutinho e Maria Julinda C. P. Ribeiro Coutinho (in memoriam) pelo imenso amor que me devotaram e por terem ajudado a formar o meu caráter, a firmarem os meus valores e sempre acreditado que eu tudo posso “Naquele que me fortalece”.
As minhas irmãs, Ana, Berenice, Flavia, Débora, Claudia e Grace, todas Julindas, pelo amor, apoio, união e compreensão que sempre tiveram.
Aos meus oito cunhados e em especial, a Luciano Mariz Maia que sempre me apoiou e incentivou a fazer e permanecer no doutorado.
Aos meus sogros Gilson e Wilma Guedes que sempre estiveram ao meu lado nesse percurso, sempre na torcida para que eu conseguisse aqui chegar. Meu agradecimento de todo coração.
Ao meu orientador Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, pelo apoio, paciência e confiança neste trabalho.
À minha coorientadora, Profª. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela admiração e confiança e por ser para mim sempre um modelo a seguir de profissional e ser humano.
À querida e batalhadora, Profª. Dra. Caliandra Maria Bezerra Luna Lima por sempre me apoiar e cobrar com sua meiguice além de estar sempre disponível.
À querida e batalhadora, Profª. Dra. Maria Fátima Vanderley Souza, minha mestra desde a graduação e que como coordenadora desse programa de doutorado esteve sempre pronta a ajudar e exortar. Ganhei uma amiga.
Ao professor Alexandre Rolim Paz, pelo grande auxílio nos exames histopatológicos.
À querida amiga de graduação e de trabalho, Kardilândia M. de Oliveira, pelo incentivo, pelo apoio e amizade.
Ao meu amigo, companheiro de doutorado e farmacêutico Josué Ramalho, pelo apoio durante todo o doutorado, juntamente com sua esposa Luciana Ramalho, também farmacêutica e doutoranda, aos quais tenho hoje com filho queridos.
Aos funcionários do Biotério/UFPB, José Crispim Duarte e Raimundo Nonato da Silva Filho, pelo importante papel na execução deste trabalho.
Aos amigos Yanna Teles, Liane Mangueira, Guilherme, Mateus, Andressa e Rodrigo, pelas demonstrações de amizade, pelas maravilhosas e divertidas horas de aula e estudo que compartilhamos e à importante colaboração durante todo esse estudo.
Aos queridos professores da graduação e pós-graduação, pelos bons momentos de aprendizado.
Aos companheiros e amigos de pós-graduação, pelos bons momentos compartilhados e a todos que contribuíram de alguma forma para a construção desta importante etapa da minha vida.
“Nada te perturbe, nada te espante tudo passa, a paciência tudo alcança”.
St. Tereza d’Ávila
RESUMO
GUEDES, Edla Julinda Ribeiro Coutinho Espínola. Avaliação da atividade anti- inflamatória e ensaios toxicológicos não clínicos do extrato etanólico das folhas da Wissadula Periplocifolia (L.) C. Presl. 2016. 95f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2016.
Introdução: A espécie Wissadula periplocifolia (L.) C. Presl., da família das Malvaceae, conhecida como jangadeira ou malva-malva, possui uso popular como anti-inflamatória, antimicrobiana, além de relatos de uso contra picadas de insetos e de cobras. Objetivo:
Investigar o potencial anti-inflamatório assim como realizar o Estudo Toxicológico não clínico agudo e crônico com o extrato etanólico bruto das folhas da W. periplocifolia, de acordo com Guia para a condução de estudos não clínicos de Toxicologia e Segurança farmacológica necessários ao desenvolvimento de medicamentos da ANVISA, 2013.
Metodologia: Para avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizado o edema de pata, com ratos Wistar que receberam (v.o.), veículo (salina 0,9%.), o anti-inflamatório não esteroidal padrão indometacina e 3 diferentes doses de EEB de W. periplocifolia (25, 50 e 100 mg/kg). Logo em seguida foi medido o volume da pata do animal (t=0). Após 60’ foi induzido o processo inflamatório pela administração de 0,1µL de carragenina a 1% na região subplantar da pata posterior direita de cada animal. O volume da pata foi medido logo após a injeção de cg. e nas 4 horas posteriores com intervalos de 60’ com auxílio de um pletismômetro. Na toxicidade aguda foram utilizados ratos Wistar, n=6 de ambos os sexos, com dose de 2000 mg/kg, por via oral, do EEB administrado a um grupo tratado e o veículo a um grupo controle. Após a administração, foram observados os parâmetros comportamentais por 30', 60', 90', 120', 180' e 240 min., consumo de água e ração, parâmetros hematológicos e bioquímicos; e ocorrência de morte. Já na toxicidade crônica, a substância foi administrada diariamente, por um período de 90 dias em 6 grupos com n=10. Três grupos foram tratados diariamente com 3 doses do EEB, de 10, 30, 90 mg/kg. O quarto grupo, controle, foi administrado água, veículo utilizado na dissolução do EEB. O quinto e sexto grupos (satélites) receberam as doses de 30 e 90 mg/kg. Foram avaliados os efeitos da administração prolongada como manda a literatura. Resultados: Os resultados do presente estudo demonstraram que 25 e 50 mg/kg de EEB produziram atividade anti-inflamatória comparável à da indometacina, apesar de não ter sido dose-dependente. Não ocorreu óbito com a dose de 2.000 mg/kg indicando baixa toxicidade. A redução no consumo de ração no grupo dos machos tratados e a redução da creatinina observadas neste grupo indicou haver perda de massa muscular. Não houve alterações nos parâmetros hematológicos. Já no estudo crônico o EEB, promoveu uma diminuição significativa da contagem da série branca e da série plaquetária, apenas nos grupos machos tratados. Também houve diminuição do hematócrito tanto das fêmeas satélites como dos machos com aumento do CHCM, evidenciando toxicidade eritrocitária, que precisaria de mais estudos. Conclusão: Este estudo inédito de investigação farmacológica não clínica em ratos Wistar, apresentou potente atividade anti- inflamatória não dose dependente. No estudo de toxicidade aguda a DL foi superior à 2000 mg/kg, demonstrando haver baixa toxicidade e no estudo de toxicidade crônica, demonstrou a ocorrência de alterações importantes e significativas, que necessitam de estudos complementares.
Palavras-chave: Toxicidade. Wissadula periplocifolia. Rato wistar. Anti-inflamatório.
ABSTRACT
GUEDES, Edla Julinda Ribeiro Coutinho Espínola. Avaliação da atividade anti- inflamatória e ensaios toxicológicos não clínicos do extrato etanólico das folhas da Wissadula Periplocifolia (L.) C. Presl. 2016. 95f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2016.
Introduction: the species Wissadula periplocifolia (l.) c. Presl., the Malvaceae family, known as river Rafter or malva-Mallow, has popular use as anti-inflammatory, antimicrobial, in addition to reports of use against insect bites and snakes. Objective: to Investigate the potential anti-inflammatory as well as perform the non-Clinical Toxicology Study acute and chronic with crude ethanolic extract of leaves of w. periplocifolia, according to a guide for the conduct of non-clinical studies of Toxicology and safety pharmacology necessary to develop medicines from ANVISA, 2013. Methodology: For evaluation of anti-inflammatory activity was held the paw edema, with Wistar rats receiving (v.o.), vehicle (0.9% saline), anti- inflammatory steroidal default not indomethacin and 3 different doses of BSE of w.
periplocifolia (25, 50 and 100 mg/kg). Soon after it was measured the volume of the animal's paw (t = 0). After 60 ' was induced the inflammatory process by the administration of 0.1 µ L of the 1% carrageenan subplantar region posterior right foot of each animal. The volume of the Paw was measured immediately after cg injection. and in 4 hours with breaks of 60 ' with the aid of a pletismômetro. In acute toxicity were used, n = 6 Wistar rats of both sexes, with a dose of 2000 mg/kg, orally, of the BSE administered to a treated group and a vehicle control group. After administration, behavioral parameters were observed for 30 ', 60 ', 90 ', 120 ', ' 180 and 240 min., water consumption and haematological and biochemical parameters, feed;
and occurrence of death. Already in chronic toxicity the substance was administered daily for a period of 90 days in 6 groups with n = 10. Three groups were treated daily with 3 doses of BSE, of 10, 30, 90 mg/kg. The fourth group, control, water was administered, vehicle used in the dissolution of the BSE. The fifth and sixth groups (satellites) received doses of 30 and 90 mg/kg. We evaluated the effects of prolonged administration as literature. Results: the results of this study demonstrated that 25 and 50 mg/kg of BSE produced anti-inflammatory activity comparable to that of indomethacin, although not dose-dependent. No death occurred with a dose of 2,000 mg/kg, indicating low toxicity. The reduction in feed intake in the Group of males treated and creatinine reduction observed in this group indicated there is loss of muscle mass. There were no changes in haematological parameters. In the chronic study the BSE, promoted a significant decrease of the white count and platelet series, only in males treated groups. There was also a hematocrit decrease of both the satellite and the females males with increased MCHC, showing erythrocyte toxicity, which would need further study.
Conclusion: this study previously unreleased non-clinical pharmacological research in Wistar rats, showed potent anti-inflammatory activity not dose dependent. In the acute toxicity study the DL was higher than the 2000 mg/kg, demonstrating there is low toxicity and chronic toxicity study, demonstrated the occurrence of significant changes, which require further studies.
Keywords: Toxicity. Wissadula periplocifolia. Wistar rat. Anti-inflammatory.
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária AST - Aspartato Amino Transferase
ALT - Alanina Amino Transferase
BNDES - Banco Nacional do Desenvolvimento
CHCM - Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média
EEB W. periplocifolia - Extrato Etanólico Bruto das folhas da Wissadula periplocifolia (L.) C.
presl.
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético FAL - Fosfatase Alcalina
FAPs - Fundação de Amparo as Pesquisas FDA - Food and Drug Administration
HULW - Hospital Universitário Lauro Wanderley HCM - Hemoglobina Corpuscular Média
IPeFarM - Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos LDH - Lactato Desidrogenase
LABETOX - Laboratório de Ensaios Toxicológicos MS - Ministério de Saúde
OMS - Organização Mundial de Saúde
PITCE - Política Industrial Tecnológica e de Comércio Exterior RDC - Resolução da Diretoria Colegiada
SINITOX - Sistema Nacional de Informações Tóxico-farmacológicas SUS - Sistema Único de Saúde
TOTG - Teste de Tolerância à Glicose VCM - Volume Corpuscular Médio WHO - World Health Organization
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Cascata do Ácido Aracdônico... 28
Figura 2- Wissadula periplocifolia (Linnaeus) C. Presl., – 1. Floração sucursal. 2. Flor. 3. Secção longitudinal do ovário. 4. Sépalas. 5. Fruto. 6. Sementes. 7. Os pêlos da folha estrelada da face axial... 32
Figura 3 - Estrutura química de 5,7-dihidroxi-8,4’-dimetoxiflavona (Wp3)... 33
Figura 4 - Estrutura química do Wp1(a) Sitosterol e Wp1(b) Estigmasterol... 33
Figura 5 - Canferol-3-O-β-D-(6’’-E-p-coumaroil) glicosídeo (Wp2)... 33
Figura 6 e 7 - Fotomicrografias dos parênquimas dos brônquios dos controles normais de macho e fêmea, demonstrando não haver nenhuma alteração... 71
Figura 8 e 9 - Fotomicrografia dos parênquimas dos brônquios de um macho e em seguida de uma fêmea dos grupos tratados com mucosas discretamente inflitradas,... 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Efeito das administrações oral das doses de 25, 50 e 100 mg/kg de EEB de W. periplocifolia a formação do edema de pata induzido por carragenina em ratos... 44 Tabela 02 - Consumo de Água e Ração de ratos Wistar, ambos os sexos, tratados com
a dose de 2000 mg/kg com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade aguda... 45 Tabela 03 - Parâmetros Bioquímicos dos animais de ambos os sexos, tratados com a
dose de 2000 mg/kg com o EEB durante o ensaio de toxicidade aguda... 46 Tabela 04 - Parâmetros hematológicos de ratos Wistar tratados com a dose de 2000
mg/kg com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade aguda... 48 Tabela 05 - Temperatura corporal (ºC) de ratos tratados com diferentes doses do EEB
de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico... 49 Tabela 06 - Consumo semanal de água por ratos durante os 90 dias de tratamento
crônico com diferentes doses do EEB de W.periplocifolia. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/
Tukey.*p0,05... 50 Tabela 07 - Consumo semanal de ração por ratos durante os 90 dias de tratamento
crônico com diferentes doses do EEB de W. periplocifolia... 53 Tabela 08 - Número de ambulações no experimento de campo aberto, em ratos
tratados com diferentes doses do EEB de W. periplocifolia durante o ensaio crônico... 56 Tabela 09 - Número de execuções de comportamento “levantar” no experimento de
campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do EEB de W.
periplocifolia durante o ensaio crônico... 56 Tabela 10 - Número de execuções de comportamento “limpeza” no experimento de
campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do EEB de W.
periplocifolia durante o ensaio crônico... 57 Tabela 11 - Número de bolos fecais no experimento de campo aberto, em ratos
tratados com diferentes doses do EEB da W. periplocifolia durante o ensaio crônico... 57 Tabela 12 - Tempo de permanência (em segundos) na barra giratória do aparelho
Rota-rod, de ratos durante o tratamento crônico com o EEB da W.
periplocifolia, quinzenal... 57
Tabela 13 - Parâmetros hematológicos obtidos do sangue de ratos wistar tratados com o EEB de W. periplocifolia, durante o ensaio de toxicidade crônica... 59 Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com
o EEB de W. periplocifolia, durante o ensaio de toxicidade crônica... 64
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 01 - Consumo de Ração dos animais machos tratados com a dose de 2000 mg/kg com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste “t” de Student/Mann-Whithey.*p0,05... 45 Gráfico 02 - Creatinina dos animais machos tratados com a dose de 2000 mg/kg com
o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste “t” de Student/Mann-Whithey.*p0,05... 47 Gráfico 03 - Fosfatase Alcalina dos animais machos tratados com a dose de 2000
mg/kg com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste “t” de Student/Mann-Whithey.*p0,05... 47 Gráfico 04 - Temperatura de ratos Wistar tratados com o EEB de W. periplocifolia
durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 49 Gráfico 05 - Temperatura de ratas Wistar tratados com o EEB de W. periplocifolia
durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 50 Gráfico 06 - Consumo de Água de ratos Wistar tratados com o EEB de W.
periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05.. 51 Gráfico 07 - Consumo de Água de ratos Wistar tratados com EEB de W.
periplocifolia durante a primeira semana do ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 51 Gráfico 08 - Consumo de Água de ratos Wistar tratados com o EEB de W.
periplocifolia durante a quarta semana do ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 51 Gráfico 09 - Consumo de Água de ratas Wistar tratadas com o EEB de W.
periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/
Tukey.*p<0,05... 52 Gráfico 10 - Consumo de Água de ratas Wistar tratadas com o EEB de W.
periplocifolia durante a décima semana do ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/ Tukey.*p<0,05... 52
Gráfico 11 - Consumo de Água de ratas Wistar tratadas com o EEB de W.
periplocifolia durante a décima primeira semana do ensaio de toxicidade crônico.Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 52 Gráfico 12 - Consumo de Água de ratas Wistar tratadas com o EEB de W.
periplocifolia durante a décima segunda semana do ensaio de toxicidade crônicoOs valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 53 Gráfico 13 - Consumo de Ração de ratos Wistar tratados com o EEB de
W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônicoOs valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 54 Gráfico 14 - Consumo de Ração de ratas Wistar tratadas com o EEB de
W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico.Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 54 Gráfico 15 - Evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o EEB de
W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico.Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 55 Gráfico 16 - Evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o EEB de
W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 55 Gráfico 17 - Número de execuções de comportamento “levantar” no experimento de
campo aberto de ratos Wistar tratados com o EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 56 Gráfico 18 - Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do 4°Rota–
Rod de ratos Wistar tratados com o EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 58 Gráfico 19 - Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota–Rod
de ratos Wistar tratados com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 58 Gráfico 20 - Hematócritos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o EEB de
W.periplocifolia (durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 60
Gráfico 21 - CHCM obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o EEB de W.
periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 61 Gráfico 22 - Número de Leucócitos em ratos Wistar tratados com diferentes doses do
EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 61 Gráfico 23 - Número de Neutrófilos em ratos Wistar tratados com diferentes doses do
EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 62 Gráfico 24 - Número de Plaquetas em ratos Wistar tratados com diferentes doses do
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 62 Gráfico 25 - Monócitos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o EEB de W.
periplocifolia (durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 63 Gráfico 26 - Hematócritos obtidas do sangue de ratas Wistar tratadas com o EEB de
Wissadula periplocifolia (L.) C. Presl durante o ensaio de toxicidade crônico.Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 63 Gráfico 27 - CHCM obtidas do sangue de ratas Wistar tratadas com o EEB de
Wissadula periplocifolia (L.) C. Presl durante o ensaio de toxicidade crônico.Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05………... 63 Gráfico 28 - Dosagem de Ácido Úrico no soro de ratos Wistar tratados com
diferentes doses do EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m.
(n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 66 Gráfico 29 - Dosagem de Cálcio no soro de ratos Wistar tratados com diferentes
doses EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica.
Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 66 Gráfico 30 - Dosagem de Sódio no soro de ratos Wistar tratados com diferentes doses
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). Anova múltipla comparação.*p0,05... 67
Gráfico 31 - Dosagem de HDL obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 67 Gráfico 32 - Dosagem de Proteínas Totais obtidos do sangue de ratos Wistar tratados
com o EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 68 Gráfico 33 - Dosagem de Albumina obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o
EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 68 Gráfico 34 - Dosagem de Uréia obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com EEB
de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05...
68
Gráfico 35 - Dosagem de Ácido Úrico obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com o EEB de W.periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 68 Gráfico 36 - Dosagem de AST obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com o EEB
de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 69 Gráfico 37 - Dosagem de Albumina obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 69 Gráfico 38 - Dosagem de Sódio obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com o
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 69 Gráfico 39 - Dosagem de Potássio obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com o
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 70 Gráfico 40 - Dosagem de Cálcio obtidos do sangue de ratas Wistar tratadas com o
EEB de W. periplocifolia durante o ensaio de toxicidade crônico. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=10). One-way ANOVA/Tukey.*p<0,05... 70
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 19
2 OBJETIVOS... 24
2.1 Objetivo Geral... 24
2.2 Objetivos Específicos... 24
3 REFERENCIAL TEÓRICO... 25
3.1 Inflamação... 25
3.2 Toxicidade... 29
3.3 Wissadula Periplocifolia (L) C. Presl... 31
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 36
4.1 Local da Pesquisa... 36
4.2 Materiais... 36
4.2.1 Material botânico... 36
4.2.1.1 Obtenção do extrato... 36
4.2.2 Animais... 37
4.2.2.1 Ratos Wistar... 37
4.2.3 Aparelhagem... 37
4.3 Metodologia... 38
4.3.1 Edema de pata induzido por carragenina... 38
4.3.2 Ensaio Toxicológico não clínico agudo... 38
4.3.2.1 Análise laboratorial do sangue... 39
4.3.3 Ensaio toxicológico não clínico crônico... 40
4.3.3.1 Temperatura... 41
4.3.3.2 Consumo de água e alimento e avaliação ponderal... 41
4.3.3.3 Avaliação comportamental... 42
4.3.3.4 Avaliação laboratorial do sangue... 42
4.3.3.5 Exame anatomopatológico... 43
4.3.3.6 Grupos satélites... 43
5 RESULTADOS... 44
5.1 Edema de Pata e Atividade Anti-inflamatória... 44
5.2 Ensaio Toxicológico não Clínico Agudo... 44
5.2.1 Avaliação comportamental... 44
5.2.2 Evolução ponderal... 45
5.2.3 Consumo de água e alimentos... 45
5.2.4 Análise laboratorial do sangue... 46
5.3 Ensaio Toxicológico não Clínico Crônico... 48
5.3.1 Temperatura... 48
5.3.2 Consumo de água e ração... 50
5.3.3 Variação da evolução ponderal... 54
5.3.4 Avaliação comportamental (Teste do Campo Aberto) e motora (Teste de Rota-Rod)... 55
5.3.5 Avaliação laboratorial do sangue... 58
5.3.6 Estudo anatomopatológico... 70
6 DISCUSSÃO... 72
7 CONCLUSÃO... 77
REFERÊNCIAS... 78
ANEXOS... 84
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, especialmente na última década, avanços importantes na área de pesquisa e de desenvolvimento de medicamentos. Dentre outros aspectos, podemos mencionar a consolidação da Pós-graduação brasileira, como uma das melhores do mundo, a aprovação da lei de patentes, a criação da ANVISA, o surgimento dos medicamentos genéricos no final da última década, a criação das FAPs e dos fundos setoriais, o surgimento de várias unidades de pesquisa clínica capacitadas para desenvolver estudos clínicos de medicamentos dentro do padrão FDA, o surgimento do PROFARMA através do BNDES, a aprovação da Lei de Inovação, a criação da Política Industrial Tecnológica e de Comércio Exterior (PITCE), o aumento ainda que modesto da interação universidade empresa, estabelecimento de política governamental visando incentivar a contratação de doutores nas empresas, a queda dos juros e da inflação, a criação da lei de subvenção econômica para apoiar as empresas na área de inovação, etc. O reflexo direto dessas políticas já começa a ser notado na área de Pesquisa e Desenvolvimento no setor farmacêutico brasileiro. Assim, vários laboratórios de capital nacional começam a investir em Pesquisa e Desenvolvimento, principalmente com apoio dos fundos setoriais e do BNDES. Entres outros pontos, pode ser mencionada a pouca visibilidade das leis regulatórias na área farmacêutica no Brasil, o que tem limitado os investimentos de Pesquisa e Desenvolvimento no setor farmacêutico nacional. As atuais dificuldades impostas à aquisição no exterior de reagentes e de equipamentos para pesquisa têm propiciado prejuízos irreparáveis para o setor de Pesquisa e Desenvolvimento de maneira geral, e em particular no setor farmacêutico. Esse último aspecto torna nossos laboratórios de pesquisas pouco competitivos quando comparados aos existentes nos países desenvolvidos. A Lei de Inovação aprovada recentemente necessita ser urgentemente regulamentada para facilitar a necessária interação entre as universidades e as empresas. Outro aspecto da maior importância é a necessidade do governo utilizar o poder de compra do Estado para estimular as inovações no setor farmacêutico brasileiro, dando preferência para compra de produtos desenvolvidos por empresas brasileiras. Essa política tem sido utilizada com muito sucesso em vários países desenvolvidos. Além disso, seria desejável que os laboratórios estatais na área farmacêutica existentes no Brasil fossem modernizados, especialmente no que concerne a sua gestão e na contratação de pessoal científico qualificado para estabelecer parcerias efetivas com o setor privado (CALIXTO, J B.; SIQUEIRA Jr., 2008).
No ano de 2011, o mercado farmacêutico brasileiro ocupava a oitava posição no ranking internacional de vendas globais da indústria farmacêutica. Mesmo com o predomínio das grandes empresas multinacionais que dominam o mercado nacional em diferentes segmentos e classes terapêuticas, houve aumento na participação de empresas nacionais no mercado ao longo da década de 2000. Estima-se que a participação das empresas de capital nacional no total do mercado farmacêutico brasileiro entre 2003 e 2010 tenha aumentado de 32,5% para mais de 50%. Em termos gerais, o panorama atual da indústria de base química e biotecnológica em saúde no Brasil pode ser analisado a partir dos seguintes pontos, o Complexo Econômico Industrial da Saúde como um todo e a indústria de base química e biotecnológica em particular contam com elevada participação relativa no produto interno bruto, sobretudo na produção de fármacos (insumos farmacêuticos ativos); a retomada recente no crescimento do setor farmacêutico, fomentada pela expansão do mercado de genéricos, viabilizou o fortalecimento das empresas farmacêuticas nacionais, mas também tem constituído um forte estímulo para a entrada dos grandes laboratórios farmacêuticos multinacionais no mercado brasileiro por meio da aquisição de empresas locais; a estrutura produtiva em saúde no Brasil conta com o papel destacado desempenhado pelos laboratórios oficiais na Política Nacional de Saúde, na produção de medicamentos para o Sistema Único de Saúde (SUS), no suporte à regulação ou no processo de ampliação da capacitação tecnológica nacional; forte assimetria da concentração da estrutura produtiva industrial na distribuição da infraestrutura cientifica e tecnológica ligada ao esforço de pesquisa, desenvolvimento e inovação em saúde. Um dos principais reflexos da fragilidade da produção em saúde no âmbito da indústria de base química e biotecnológica no Brasil reside no crescimento acelerado do déficit na balança comercial de fármacos e medicamentos desde os anos 2000. Apesar do dinamismo recente do mercado farmacêutico brasileiro, houve uma expansão acelerada das importações de fármacos e medicamentos. Tal fato resultou em desequilíbrio estrutural da balança comercial, particularmente nos segmentos mais intensivos em conhecimento da indústria farmacêutica. Finalmente, as PDP visam prioritariamente internalizar a tecnologia de produção de fármacos e medicamentos estratégicos nos laboratórios públicos por meio de processos de transferência de tecnologia (VARGAS et al., 2012).
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas na medicina tradicional pelo homem desde a antiguidade. O homem primitivo, no meio de tentativas e erros, teve de adquirir conhecimentos e, através destes, observar quais as plantas poderiam ser utilizados como
alimentos, medicamentos e ainda destacar as que fossem venenosas ou perigosas. Com o passar do tempo, o poder curativo das plantas tornou-se muito importante para ser esquecido, e o homem começou a sistematizar o seu uso (SILVA, 2002).
Em quase todos os registros médicos da Antiguidade, como os de Hipócrates, na Grécia em torno de 400 a.C.; os de Avicena na Pérsia em 1010 d.C. e posteriormente, os de Paracelsus em 1480 d.C.; as plantas já eram citadas como terapêuticas. O nome Fitoterapia vem do grego Phiton (planta) e Therapeia (terapia). Esse termo deve-se ao médico francês Henri Zeclerc, que fez inúmeras experiências com plantas nos anos de 1950 (ASSUMPÇÃO, 2007). O primeiro livro sobre Fitoterapia que se tem notícia foi escrito em 2800 a.C., pelo célebre Imperador Amarelo chinês Neijing.
Nas últimas décadas, cerca de 80% da população do mundo em desenvolvimento depende, exclusivamente, de plantas medicinais para a prestação de cuidados de saúde primários (OMS; WHO, 2005). Além disso, há uma aceitação generalizada de plantas medicinais, mesmo nos países desenvolvidos, como complementação da medicina convencional (NARAHARI et al., 2008). No passado recente, houve uma escalada mundial no uso de plantas medicinais (FRASS et al., 2012; OMS; WHO, 2005). Este aumento foi atribuído ao elevado custo da medicina moderna, da pronta disponibilidade de remédios de plantas medicinais e da inclinação da população mundial para a automedicação (OMS; WHO, 2005). Também ao redor do mundo existe uma revolução verde, que se refletiu na crença de que os remédios à base de plantas são mais seguros e menos prejudiciais para o corpo humano do que as drogas sintéticas e com isso as plantas medicinais veem sendo documentadas para terem maior dados sobre o uso e características das mesmas. É à luz do acima referido que a Organização Mundial de Saúde reconheceu o papel do tradicional como uma alternativa / complemento da medicina popular e tem incentivado os países membros a desenvolverem políticas nacionais apropriadas para cada situação.
Entretanto algumas pessoas pensam erradamente que ervas, como são alternativas naturais, não contém produtos químicos e não as reconhecem como compostos bioativos. E assim sendo, consideram as plantas medicinais, como sendo seguras, por serem natural e clinicamente confiáveis, com base em seu tempo de utilização e por estas virem sendo testadas por séculos, o que constitui um grande erro. Ademais, apenas um pequeno número de espécies de plantas medicinais, seus extratos ou formulações foram validados farmacologicamente e toxicologicamente (EZEJA et al., 2014).
Grande parte da comercialização de plantas medicinais é feita em farmácias e lojas de produtos naturais, onde preparações vegetais são comercializadas com rotulação industrializada. Em geral, essas preparações não possuem certificado de qualidade e são produzidas a partir de plantas cultivadas, o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza, quase sempre, plantas da flora nativa. Nos países em desenvolvimento, bem como nos mais desenvolvidos, os apelos da mídia para o consumo de produtos à base de fontes naturais aumentam a cada dia. Os ervanários prometem saúde e vida longa, com base no argumento de que plantas usadas há milênios são seguras para a população (VEIGA; PINTO, 2005).
Entretanto, para que se possa fazer uso adequado das plantas medicinais, além da qualidade, terá de haver garantia de segurança em relação a efeitos tóxicos e conhecimentos sobre efeitos secundários, interações, contraindicações e mutagenicidade. Además deve haver, primordialmente, a existência de ensaios farmacológicos e a experimentação clínica que demonstrem eficácia para esse tipo de medicamento (CUNHA, 2014).
A OMS classifica 250 medicamentos como essenciais e básicos. Dentre estes, 11% são exclusivamente obtidos de plantas medicinais, e um número significativo é de fármacos sintéticos obtidos a partir de fonte natural. Apesar desta cifra, das cerca de quase 550.000 espécies de plantas existentes no mundo, apenas uma pequena parte tem sido objeto de estudo fitoquímico e farmacológico; e menos de 2500 foram caracterizadas com relação aos metabólitos secundários. Atualmente apenas 17% desse total foram devidamente validados farmacologicamente e toxicologicamente (TELES, 2015). Esses dados exemplificam como ainda é alto o potencial das plantas, como fonte de pesquisa para novos medicamentos, com novos modos de ação, bem como com alta seletividade e atividade e que ainda são precariamente explorados. No entanto, já existem diversos estudos para identificar os componentes ativos de cada planta em utilização, sua indicação médica, dosagem terapêutica segura, reações adversas e efeitos colaterais. Existe um relativo número de estudos que relataram os efeitos tóxicos dos medicamentos à base de plantas (TAZIEBOU et al., 2008).
No caso do Brasil, este se encontra em posição privilegiada, pois é o país com a maior diversidade vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA; NODARI, 2003). Com a consagração, por uma importante parcela da população, do uso das plantas como medicamentos, ainda são muito poucos os estudos científicos existentes que confirmam a ausência de toxicidade e/ou justifiquem o uso terapêutico dessas plantas (DINIZ, 2000). É nesse panorama que apresentamos nosso estudo de avaliação anti-inflamatória e de toxicidade não clínica do
extrato etanólico bruto das folhas da espécie Wissadula periplocifolia (L) C. Presl., pertencente a família das Malvaceae.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar o potencial anti-inflamatório assim como realizar o Estudo Toxicológico não clínico agudo e crônico com o extrato etanólico bruto das folhas da Wissadula periplocifolia (L) C. Presl., de acordo com Guia para a condução de estudos não clínicos de Toxicologia e Segurança farmacológica necessários ao desenvolvimento de medicamentos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2013.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a atividade anti–inflamatória da Wissadula periplocifolia (L) C.
Presl.;
Avaliar a toxicidade aguda com o extrato etanólico bruto das folhas da Wissadula periplocifolia (L) C. Presl., através da observação de parâmetros comportamentais, ponderais, hematológicos e bioquímicos;
Avaliar a toxicidade crônica com o extrato etanólico bruto das folhas da Wissadula periplocifolia (L.) C. Presl., através da observação de parâmetros comportamentais, ponderais, temperatura, hematológicos, bioquímicos e anatomopatológicos.
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Inflamação
A primeira defesa do organismo a um dano tecidual é a resposta inflamatória, um processo biológico complexo que envolve componentes vasculares, celulares e uma diversidade de substâncias solúveis, além de apresentar como sinais clínicos característicos:
rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional. A finalidade desse processo é remover o estímulo indutor da resposta e iniciar a recuperação tecidual local (ABBAS, A. K.;
LICHTMAN, A.H., 2003).
Durante a inflamação, vários sistemas bioquímicos, como cascata do Sistema Complemento (SC) e da coagulação, são ativados, auxiliando no estabelecimento, evolução e resolução do processo. Adicionalmente, substâncias solúveis de meia-vida curta são liberadas, exercem sua ação e são degradadas. Em geral, o sucesso na remoção do estímulo desencadeador leva ao término da resposta aguda e reparo tecidual (CRUVINEL, W. M. et al., 2010).
Os mediadores da resposta inflamatória são variados e derivam de precursores plasmáticos e celulares, podendo ser classificados de acordo com suas propriedades bioquímicas em: aminas vasoativas, peptídeos vasoativos, produtos de clivagem do SC, mediadores lipídicos, citocinas, quimiocinas e enzimas proteolíticas. Os mediadores lipídicos derivados do ácido araquidônico são produzidos pela ativação de fosfolipases que clivam os fosfolipídios constituintes da membrana celular, gerando prostaglandinas, leucotrienos e PAF (fator ativador de plaquetas). As prostaglandinas têm funções inflamatórias como febre, hiperalgesia e vasodilatação, potencializando edema e contração ou relaxamento da musculatura lisa. Esses mediadores também atuam em processos fisiológicos, como na manutenção da integridade do epitélio das mucosas, manutenção da função renal, reprodução (sobrevivência do feto, implante de ovo, contração do útero durante o parto) proliferação e morte celular (TSELEPIS, A.D.; CHAPMAN, M. J., 2002).
A inflamação fornece sinais fundamentais para ativação de Linfócitos T e Linfócitos B, iniciando, assim, a resposta imune específica e contribuindo para a integração entre imunidade inata e adquirida.
As quimiocinas podem ser constitutivas ou induzidas. As constitutivas são normalmente produzidas em vários tecidos e recrutam leucócitos, principalmente linfócitos,
na ausência de inflamação. As quimiocinas induzidas (ou inflamatórias) são produzidas por várias células em resposta a estímulos inflamatórios e recrutam leucócitos para locais de inflamação (CYSTER, J.G., 1999). As quimiocinas aumentam a afinidade das integrinas (leucócitos) pelos ligantes de integrinas no endotélio. A adesão consiste em que leucócitos migram através da parede do vaso até o local de infecção, seguindo o gradiente de quimiocina. Já a migração e o acúmulo de leucócitos no local de infecção, a vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular é denominado inflamação propriamente dita.
A cascata do ácido araquidônico é uma via metabólica do organismo humano que usa o ácido araquidônico para a síntese de uma grande variedade de mediadores lipídicos de grande importância tanto no processo inflamatório quanto na patologia e fisiologia humanas.
São denominados de eicosanóides entre os quais se encontram: as prostaglandinas, os tromboxanos e os leucotrienos. O ácido araquidônico é um um derivado de um ácido graxo essencial: o ácido linoléico. A cascata do ácido araquidônico depende da oxidação deste composto lipídico e é divisível em duas vias principais: a dependente da ciclooxigenase (COX) e a dependente da lipo-oxigenase (LOX), (BAYNES, J. W.; DOMINICZAK, M. H., 2005).
A importância da cascata do ácido araquidônico radica no conjunto de funções desempenhadas pelos seus produtos, os eicosanóides, na bioquímica das células humanas. O sua função mais importante será o de via pró-inflamatória e de alvo terapêutico dos fármacos anti-inflamatórios não esteróides, como a aspirina. Não obstante, o papel dos eicosanóides estende-se além das propriedades pró-inflamatórias: são hormonas autócrinas e parácrinas em vários tecidose possuem um papel importantíssimo na hemostasia e termorregulação e ainda na transmissão neuronal.
A enzima responsável pela libertação do ácido araquidônico das membranas celulares é a fosfolipase A2 (DEVLIN, T., 2006).
O ácido araquidônico pode ser oxidado pela enzima COX dando origem aos prostanóides, ou seja, às prostaglandinas e aos tromboxanos. Porém, nem todas as prostaglandinas e tromboxanos têm como percursor o ácido araquidônico. Existem três isoenzimas da COX: a COX-1 , COX-2e a COX-3. A COX-1 é constitutiva da maioria dos tecidos humanos, mas com especialmente na mucosa gástrica, no endotélio vascular, no parênquima renal e plaquetas. Já a COX-2 é uma enzima de expressão induzível por mediadores pró-inflamatórios (como a IL-1, o PAF ou o LPS) em macrófagos e monócitos (DEVLIN, T., 2006).
Existem duas fases de ativação das prostaglandinas. A precursoras é a PGG2 que se converte pelo Glutatião na PGH2. Esta por sua vez origina a Prostaglandina D2 (PGD2), a Prostaglandina E2 (PGE2), a Prostaglandina F2 (PGF2) e a Prostaglandina I2 (PGI2 ou prostaciclina). Elas por sua vez ativadas quando ativas suas ações são diversificadas, agindo em diferentes tecidos-alvo e ações diferentes num mesmo tecido, mediadas por receptores diferentes.Uma das suas ações que mais vai nos interessar é o recrutamento de leucócitos na resposta inflamatória (PGE2 e PGF2 ).
Já na segunda via da cascata do ácido araquidônico, a via LOX, os produtos são os ácidos monohidroperoxidoeicosateraenoicos (HPETEs), os ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs) e os leucotrienos (LTs), que, à semelhança dos prostanóides, são mediadores lipícos.
A principal ação estudada dos produtos desta via é a sua ação pró-inflamatória (DEVLIN, T., 2006).
Existem 3 isoformas da LOX que atuam nas várias posições da cadeia do ácido araquidônico com ligações covalentes duplas: 5, 12 e 15; que se denominam respectivamente de 5-LOX, 12-LOX e 15-LOX. A reação consiste na adição de um grupo hidroperóxido à molécula do ácido aracdônico,formando assim os HPETEs respectivos. Cada um deles gera um subproduto, assim demonstrados:
5-HPETE: é o principal produto em basófilos, leucócitos polimorfonucleados, macrófagos, mastócitos e qualquer tecido envolvido numa resposta inflamatória;
12-HPETE: é o principal produto em plaquetas, ilhéus pancreáticos, músculo liso vascular e células glomerulares;
15-HPETE: é o principal produto em reticulócitos, eosinófilos, linfócitos T e epitélio respiratório.
Os HPETEs são percursores instáveis que rapidamente dão origem a novos compostos.
A maioria dos HPETEs reduzem-se espontaneamente ou são reduzidos pela acção de uma peroxidase aos respectivos ácidos hidroxieicosatetraenoicos ou HETEs (5-HETE, 12-HETE e 15-HETE). O principal papel dos HETEs é a regulação da resposta inflamatória:
são quimiotáxicos, estimulam a adenil ciclase e medeiam a desgranulação dos leucócitos polimorfonucleados, por exemplo (DEVLIN, T., 2006).
Quanto aos leucotrienos, estes são uma outra classe de eicosanóides derivados exclusivamente do 5-HPETE. Igualmente do que acontece com a COX, a 5-LOX tem uma acção enzimática bivalente: além da componenete deoxigenase que permite a conversão de ácido araquidónico em 5-HPETE, possui actividade dehidrase que permite transformar este último em leucotrieno A4 (LTA4). Através da leucotrieno B4 sintetase, o LTA4 pode ser convertido a leucotrieno B4 (LTB4) ou, na presença de glutatião reduzido, a leucotrieno C4 (LTC4). Enzimas com ação de dipeptidase podem actuar sobre o LTC4, removendo glutamato e produzindo leucotrieno D4 (LTD4) e sobre este último, removendo glicina e produzindoleucotrieno E4 (LTE4).
Os leucotrienos são em geral substâncias pró-inflamatórias. Estão associados à estimulação da acção dos leucócitos - complementando o papel dos HETEs -, à contracção do músculo liso - principalmente a nível brônquico e grastro-intestinal - e ao aumento da permeabilidade vascular - explicando o edema que acompanha uma resposta inflamatória. Desregulações das vias de acções dos leucotrienos têm sido associadas a patologias como a asma e alergia. Sabe-se também que a substância de reacção lenta da anafilaxis (SRS-A) libertada pelos mastócitos é na realidade uma amalgama de LTC4, LTD4 e LTE4 (BAYNES, J. W.; DOMINICZAK, M. H., 2005).
Figura 1 - Cascata do Ácido Aracdônico
Fonte: <http://www.hipertrofia.org/forum/profile/31754-lourensini/?do=content&type=forums_topic_post&page=4>.
