TLC - Cromatografia de camada fina

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Química Analítica / JCM

TLC - Cromatografia de camada fina

Cromatografia de camada fina

TLC - Thin Layer Chromatography

planar / adsorção / zonal / analítica

possibilidade de desenvolvimento bidimensional e

de quantificação

Fases estacionárias

Adsorventes / diferentes de absorventes

actividade de um adsorvente é determinada pela sua área superficial, a sua natureza química e o arranjo geométrico dos átomos superficiais

propriedades de um adsorvente:

☺ não deve dissolver na fase eluente

☺ não deve reagir com a fase móvel

☺ não deve reagir com os solutos

☺ deve dar resultados reproductíveis

☺ o processo de adsorção deve ser reversível

☺ o adsorvente não deve ser muito caro

distância percorrida pelo soluto

R_f= --- distância percorrida pela frente do solvente

Camada de fase estacionária : 250 µµµµm Camada de fase estacionária : 250 µµµµm

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TLC - adsorventes

Polares

vários óxidos inorgânicos ( sílica, alumina, magnésia)

☺ ordem de eluição dos solutos segue a polaridade destes - solutos polares são fortemente retidos

hidrocarbonetos saturados < hidrocarbonetos aromáticos < éteres < ésteres

≈aldeídos ≈cetonas < álcoois ≈aminas < amidas < ácidos carboxílicos

Não-polares

carvão activado

☺ ordem de eluição segue a polarizabilidade das moléculas

MAIS RETIDOS - compostos aromáticos, homólogos de maior peso molecular, moléculas com átomos de halogénio ou enxofre

F o rte s M é d io s F r a c o s

s ilic a g e l h id ró x id o d e c á lc io ta lc o

a lu m in a c a rb o n a to d e c a lc io a m id o

c a rv ã o a c tiv a d o m a g n é s ia s u c ro s e

Ácidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa bases Ácidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa bases

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TLC - adsorventes

Sílica gel

suporte mais popular (5-10 µ ^m)

preparada por hidrólise do silicato de sódio seguida de condensação e polimerização

actividade resulta da presença dos grupos Si -- OH (silanol) à superfície

controlo da actividade por aquecimento durante a preparação

☺ activação recomendada (110º / 30 - 60 min)

Sílica gel é ligeiramente ácida

☺ esteróides, amino-ácidos, álcoois, hidrocarbonetos, lípidos e vitaminas

Preparação

50g / 60 ml água destilada - espalhar rapidamente / secar / activar

☺ H - sem impregnante

☺ G - com 13% de sulfato de cálcio

☺ F254 - com indicador fluorescente

impregnação com nitrato de prata (20%) - separação de compostos com duplas ligações (menos duplas > R

_f

)

O Si

O

OH OH

O O

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TLC - adsorventes

Alumina

Ainda muito comum

Preparada por condensação do hidróxido de alumínio hidratado

A actividade depende quer dos átomos de oxigénio quer dos de alumínio

☺ mais difícil de preparar dado que geralmente contem mais impurezas

o conteúdo de água é muito importante para obter resultados reproductíveis

☺ activação a 75 - 110 º / 30 - 60 min

Pode ser obtida com superfície ácida, neutra ou básica (a mais comum)

☺ separação de corantes, vitaminas e alcalóides

Preparação

30g / 40 ml de água destilada - espalhar rapidamente / secar e activar

☺ pode conter impregnantes e indicadores de fluorescência

Al Al Al O O O O O O O O

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TLC - adsorventes

Celulose

material orgânico

diferente da cromatografia de papel

☺ papel - apresenta espaços vazios onde se acumula o solvente - a difusão leva ao alargamento das manchas

☺ celulose - são usadas partículas pequenas / distribuição mais regular - menor difusão

Celulose é usada para separar compostos hidrofílicos tal como açúcares, aminoácidos, iões inorgânicos solúveis e ácidos nucléicos - soluções aquosas

☺ geralmente aderem muito fortemente à sílica e alumina

Tal como em papel o mecanismo é predominantemente de partilha

Preparação

400 mg amido / 10 ml água destilada + 90 ml de água a ferver + 20 g de celulose

☺ o grau de hidratação depende do tempo de agitação

☺ agitação durante muito tempo leva à formação de gel

espalhar rapidamente / secar a 110º

pode conter indicadores de UV

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Placas comerciais

Adsorventes

Sílica; alumina

Suportes

Vidro, alumínio ou plástico (tereftalato de polietileno)

Espessura

0,25 mm / 0,5 mm / 1,0 mm / 2,0 mm

Maior amostra exige maior espessura (TLC preparativa)

Activação

15 minutos ao ar + 30 minutos a 110 ºC

Nalguns casos pode elevar-se a temperatura a 200 ºC (4 horas) para maior activação

Conservação

Após secagem / activação as placas devem ser guardadas num excicador

As placas de sílica desactivam-se muito rapidamente

☺ 50% de actividade perde-se em 3 minutos numa atmosfera com 50% de humidade

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TLC – outros adsorventes

Kieselguhr

Diatomite - terra de diatomáceas

☺ sílica com plâncton marinho (diatoms)

elevada porosidade e área superficial - muito usada como ajudante de filtração

muito usada como suporte de fase estacionária líquida - partilha

Sephadex

gel dextran - hidrofílico e neutro

habitualmente usado na filtração em gel - de acordo com os pesos moleculares

Fase reversa / inversa

a separação de soluto de polaridade semelhante é difícil com sílica gel mesmo para moléculas de pesos moleculares diferentes

é possível alterar a superfície da sílica (OH reagem com silanos orgânicos)

RP-2, RP-8 , RP-18

☺ a fase estacionária orgânica apresenta uma retenção preferencial dos compostos não- polares (fase reversa) e a separação depende dos pesos moleculares

a fase móvel é polar (acetonitrilo)

cromatografia de partilha

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TLC - fase eluente

Características - a fase móvel é o componente de mais fácil substituição

boa qualidade - a composição não deve variar de lote para lote

não reactiva - de outro modo os resultados seriam difíceis de interpretar

baixo ponto de ebulição - preferível para a secagem da placa

Alta pureza (Analar) e preço razoável !!

Escolha

a fase eluente deve ser activa ( retirar o soluto da fase estacionária) e selectiva (separar dois solutos diferentes)

actividade (capacidade de eluição) em relacção a sílica-gel

☺ água > metanol > etanol > propanol > propanona > triclorometano >

☺ diclorometano > benzeno > metilbenzeno > tricloroetileno > tetraclorometano >

☺ ciclohexano > hexano

Misturas de solventes

☺ o mais usual - capacidade de eluição não é proporcional à composição

amostra desconhecida

☺ usar sílica gel e um solvente pouco polar (pentano)

☺ acrescentar solvente polar (2, 4, 8, 16, 32%)

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Separação de pigmentos

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Série eluotrópica para adsorventes polares

A escala vai até cerca de 0,75 para uma placa de sílica

Tabela definida para placa de alumina

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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)

J.C. Touchstone (Practice of TLC)

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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)

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Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)

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Exemplo de fases móveis

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TLC - aspectos experimentais

Preparação

preparar a mistura eluente nas proporções adequadas ao ensaio

saturar a câmara - manter fechada e à temperatura do ensaio

evitar evaporação da mistura eluente - alteração da composição

controlar o grau de humidade da placa

Aplicação da amostra

usar micropipeta (1 -2 µ l) - não danificar o suporte

colocar a amostra a cerca de 1,5 cm da base - todas a amostras na mesma linha

a mancha deve ser de reduzidas dimensões (1,5 mm)

☺ no caso de amostras diluídas colocar por diversas vezas, secando após cada aplicação

evitar que a mancha toque a superfície do solvente (5 - 8 mm)

Desenvolvimento

manter a temperatura

deixar desenvolver o cromatograma até cerca de 3 cm do topo da placa

Revelação

usar luz UV (254 / 366 nm) ou revelador adequado (H

₂

SO

₄

)

determinar R

_f

, definir tamanho das manchas - quantificar se desejável

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Placa de TLC

Saturar a câmara / equilibrar a placa

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Efeito da insaturação da placa

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TLC - maus exemplos

Polaridade

soluto muito polar é retido na origem

Amostra em demasia / amostra mal seca

demasiada amostra cria tailing / amostra mal seca cria anéis

Câmara mal saturada

saturação insuficiente leva a demasiada evaporação da fase eluente

Colocação muito baixa / demasiada humidade

amostra baixa difunde-se na fase eluente / muita humidade leva a maior difusão das manchas

e também a uma separação deficiente

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TLC - reveladores

Métodos químicos / métodos físicos

Métodos não-destructivos

radiação visível e UV (254 nm e 366 nm)

Vapor de iodo

☺ evaporação / placa sem alteração

água

indicadores de pH (bromocresol / bromofenol)

Métodos destructivos

50% H

₂

SO

₄

/ 110 C

5% dicromato de potássio ou 5% ácido nítrico em 40% H

₂

SO

₄

seguido de aquecimento a 110 C

UV (vitaminas) / água (hidrólise - ésteres) / iodo (ácidos gordos poliinsaturados)

Reagentes específicos são conhecidos para quase todas as classes de compostos

NOTA: o uso de métodos destructivos é desaconselhado sempre que a quantificação seja o objectivo da separação cromatográfica

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TLC - amostras

Classificação (energias de adsorção)

Grupo 1: moléculas neutras - hidrocarbonetos

☺ forças de Van der Waal - físicas (não há formação de ligações químicas

☺ grupos metileno - não há separação por peso molecular

☺ separações boas e manchas redondas

Grupo 2: ligações polares (C - Cl / C - NO2)

☺ dipolo induzido - físicas / manchas redondas

Grupo 3: moléculas polares ( ácidos, álcoois)

☺ Grupos de superfície polar - nucleofílica

☺ interação com adsorvente via lig. H-H

☺ forte - possibilidade de “caudas” nas manchas

Grupo 4: ligações químicas (covalentes)

☺ ligações fortes - má separação

Energias de adsorção (sílica gel)

Grupo Qi interação R-CH3 +0.07 VdW R-CH2- -0.05 VdW R-Cl +1.32 dip. ind.

R-O-R +3.61 receptor H R-CHO +4.97 receptor H R-NO2 +5.71 dip.ind

R-CO2R +5.27 rec.H /dip.ind.

R-COR +5.27 rec.H/dip.ind.

R-OH +5.60 H-H

R-NH2 +8.00 H-H

R-CO2H +7.60 H-H

Cs

Cm

Cs

Cm

Cs

Cm A forma das manchas depende do equilíbrio

de concentrações estabelecido entre as fases móvel e estacionária

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Casos especiais

TLC preparativo

Colocar bandas largas de amostra e desenvolver a placa

Retirar a sílica de cada mancha e dissolver usando um solvente adequado

Analisar noutro equipamento (HPLC, LCMS, FTIR)

TLC bidimensional

Colocar a amostra no lado esquerdo da placa e desenvolver

Secar a placa e desenvolver de novo noutro eluente (colocar o lado esquerdo da placa para baixo)

Revelar

Separação de aminoácidos

F. estacionária: sílica gel

F. Móvel 1: tolueno:2-cloroetanol:piridina

F. Móvel 2: clorofôrmio:álcool benzílico:ac. Acértico

1: ac. Aspártico, 2: ac. Glutámico, 3: serina 4: alanina, 5: glicina, 6: alanina, 7: metionina, 8: valina, 9: isoleucina, 10: cisteina

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TLC - vantagens e desvantagens

Vantagens

Técnica simples e versátil - aplica-se a quase todas as classes de compostos

Pequenas quantidades de amostra – sem grande preparação

A separação pode ser obtida com custos razoáveis - bom adsorvente e solventes puros

As separações podem ser obtidas em tempos relativamente curtos

☺ começa a não ser vantagem em relação às pequenas colunas de HPLC

O processo de separação é “visível” e pode ser melhorado alterando suportes ou a fase eluente

☺ ao contrário do GC ou HPLC e que os solutos muito retidos podem passar despercebidos

Desvantagens

A preparação das placas é complicada

☺ está a cair em desuso (aquisição de placas preparadas)

A quantificação é possível mas implica um enorme custo financeiro

☺ por isso o TLC é a técnica de separação cromatográfica tipicamente qualitativa / semiquantitativa

Colocação de amostras em quantidades conhecidas e quantificação por comparação

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Resolução = X / 0,5 (d1 + d2); x - distância entre as manchas; d1 e d2 – diâmetros das manchas

R mínimo = 1 Rf = distância percorrida pelo soluto / distância percorrida pela frente do solvente

Distância percorrida pelo solvente

Distância percorrida pelo soluto A Distância percorrida pelo soluto B

Linha de frente do solvente

Linha de colocação das amostras

TLC - Cromatografia de camada fina