1 UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
PATRÍCIA SIMER
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wingei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II
FRANCISCO BELTRÃO 2013
2 PATRÍCIA SIMER
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wingei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
Trabalho de Conclusão de curso apresentado ao Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho
Co-orientador: Profa. Dra. Alessandra Machado-Lunkes
FRANCISCO BELTRÃO 2013
3 FOLHA DE APROVAÇÃO
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wigei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
Por Patrícia Simer
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos, no Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
BANCA AVALIADORA
______________________________________________ Profª Dr. Alexandre Rodrigo Coelho
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR (Orientador)
______________________________________________ Profª Drª Alessandra Machado Lunkes
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR (Co-orientadora)
_______________________________________________ Prof. Dr. Hernan Vielmo
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR _______________________________________________
Prof. Dr. Cleusa Inês Weber
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR (Coordenador de curso)
Francisco Beltrão, Abril de 2013.
4
A
A
D
D
e
e
u
u
s
s
p
p
e
e
l
l
a
a
f
f
o
o
r
r
ç
ç
a
a
,
,
s
s
a
a
ú
ú
d
d
e
e
e
e
c
c
o
o
r
r
a
a
g
g
e
e
m
m
p
p
a
a
r
r
a
a
a
a
r
r
e
e
a
a
l
l
i
i
z
z
a
a
ç
ç
ã
ã
o
o
d
d
e
e
s
s
t
t
e
e
t
t
r
r
a
a
b
b
a
a
l
l
h
h
o
o
.
.
A
A
m
m
e
e
u
u
s
s
p
p
a
a
i
i
s
s
A
A
r
r
i
i
e
e
G
G
e
e
n
n
e
e
c
c
i
i
p
p
e
e
l
l
o
o
i
i
n
n
c
c
e
e
n
n
t
t
i
i
v
v
o
o
,
,
a
a
m
m
o
o
r
r
,
,
c
c
o
o
m
m
p
p
r
r
e
e
e
e
n
n
s
s
ã
ã
o
o
e
e
c
c
a
a
r
r
i
i
n
n
h
h
o
o
p
p
r
r
e
e
s
s
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
d
d
u
u
r
r
a
a
n
n
t
t
e
e
e
e
s
s
t
t
a
a
c
c
a
a
m
m
i
i
n
n
h
h
a
a
d
d
a
a
,
,
g
g
r
r
a
a
t
t
a
a
e
e
t
t
e
e
r
r
n
n
a
a
m
m
e
e
n
n
t
t
e
e
.
.
5 AGRADECIMENTOS À À DDeeuuss ppoorr ppeerrmmiittiirr qquuee eeuu cchheeggaassssee aaoo ffiimm ddee mmaaiiss uumm ddeessaaffiioo.. A Aoo PPrrooff.. DrDr.. AlAleexxaannddrree RoRoddrriiggoo CoCoeellhhoo pepellaa oorriieennttaaççããoo,, pepellooss enenssiinnaammeennttooss p paassssaaddooss,, pepelloo ccaarriinnhhoo,, inincceennttiivvoo ee atateennççããoo prpreessttaaddooss e e pprriinncciippaallmmeennttee ppeellaa opopoorrttuunniiddaaddee g
geerraaddaa,, sseemm ooss qquuaaiiss nnããoo sseerriiaa ppoossssíívveell aa rreeaalliizzaaççããoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo.. À À PPrrooffªª DDrrªª AAlleessssaannddrraa MMaacchhaaddoo LLuunnkkeess ppeellaa ccoollaabboorraaççããoo,, aappooiioo ee aammiizzaaddee.. A Aooss mmeemmbbrrooss ddaa bbaannccaa qquuee gegennttiillmmeennttee aacceeiittaarraamm oo ccoonnvviittee paparraa avavaalliiaaççããoo dedessttee t trraabbaallhhoo ddee ccoonncclluussããoo ddee ccuurrssoo.. À À UUnniivveerrssiiddaaddee TTeeccnnoollóóggiiccaa FFeeddeerraall ddoo PPaarraannáá.. A
Aooss ttééccnniiccooss llaabboorraattoorriissttaass CCaammiillaa,, CCrriissttiiaannee,, RRoonnaallddoo,, JJooããoo,, PPoolliiaannee ee TThhaaííss ppeellaa a ajjuuddaa eemm mmoommeennttooss ddee eessqquueecciimmeennttoo.. A Aooss cocolleeggaass dede llaabboorraattóórriioo,, esesppeecciiaallmmeennttee aaoo CiCirroo PoPorrtteess ppeellooss enenssiinnaammeennttooss p paassssaaddooss,, aa AAnnddrriieelleenn VV.. ddee OOlliivveeiirraa ee aaoo RRuubbeennss PP.. CCaalleeggaarrii.. A Aoo CoConnsseellhhoo NaNacciioonnaall dede DeDesseennvvoollvviimmeennttoo ee PPeessqquuiissaa--CCNNPPqq,, ppeellaa ccoonncceessssããoo dede b boollssaa.. À À PPrrooffaa.. DDrraa.. EElliissaabbeettee HH.. HHaasshhiimmoottoo ee aa tteeccnnóóllooggaa AAlleessssaannddrraa MM.. GGaassppeerriinnii ppeellaa d diissppoonniibbiilliizzaaççããoo ddee cceeppaass ddaa lleevveedduurraa uuttiilliizzaaddaa.. À À ttooddooss ooss cocolleeggaass ddoo cucurrssoo SSuuppeerriioorr eemm TTeeccnnoollooggiiaa eemm AAlliimmeennttooss,, eessppeecciiaallmmeennttee a ass ccoommppaannhheeiirraass ddee ttooddaass aass hhoorraass BBrruunnaa RRaaqquueell BBööggeerr,, CCaammiillaa BBaallddoo,, MMaarriilluuccii FFoorrtteess ee A Addrriiaannaa MMeenneeggaarroo.. A Aooss memeuuss papaiiss poporr totoddoo o o cacarriinnhhoo,, exexeemmpplloo,, amamoorr e e eessffoorrççooss rereaalliizzaaddooss ppaarraa a a m miinnhhaa ffoorrmmaaççããoo pprrooffiissssiioonnaall.. A Aoo mmeeuu iirrmmããoo ppeelloo aappooiioo pprreessttaaddoo.. A Aooss aammiiggooss,, tatammbbéémm coconnssiiddeerraaddooss cocommoo memeuuss papaiiss,, EErroonnii e e SSeellmmoo,, pepelloo grgraannddee c caarriinnhhoo ee aappooiioo.. À À ttooddaa aa mmiinnhhaa ffaammíílliiaa ppeellaa ffoorrççaa.. E Ennffiimm,, a atotoddooss ququee eueu nãnãoo titivveerr memenncciioonnaaddoo e eququee esesttiivveerraamm prpreesseenntteess dudurraannttee a a r reeaalliizzaaççããoo ddoo ttrraabbaallhhoo,, oo mmeeuu mmuuiittoo oobbrriiggaaddoo..
6
“A menos que modifiquemos nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo”.
7 RESUMO
SIMER, Patrícia. Efeito de frações ultrafiltradas do cultivo de Hansenula wingei no controle de Penicillium expansum e Apergillus ochraceus. 2013. Trabalho de Conclusão de Curso (Curso Superior de Tecnologia em Alimentos). Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Francisco Beltrão.
O Brasil se classifica entre os quatro maiores produtores mundiais de frutas, juntamente com China, Índia e EUA. Porém, a competitividade das frutas frescas brasileiras no mercado internacional é bastante vulnerável. Isto ocorre devido a sua susceptibilidade à infecção fúngica no campo, assim como ataque durante o armazenamento, acarretando em consideráveis perdas econômicas. Aliado ao interesse dos consumidores por produtos naturais e mais saudáveis se faz necessário uma maior atenção quanto à qualidade das frutas frescas que serão exportadas, devido a sua exposição prolongada em condições propícias a proliferação de fungos deteriorantes/micotoxigênicos. Assim o biocontrole empregando leveduras antagonistas, com ênfase em linhagens killer, em função da baixa possibilidade de resíduos tóxicos, se mostra como uma relevante alternativa em relação ao tratamento químico tradicional, diminuindo a quantidade de fungicidas utilizados no tratamento de frutos na pós-colheita. Desta maneira, objetivou-se estudar o biocontrole de Aspergillus ochraceus e
Penicillium expansum (fungos filamentosos) pela levedura antagonista Hansenula wingei
(AM2-2). A levedura H. wingei mostrou-se killer positiva perante as leveduras sensíveis
Candida glabrata NCYC 366 (K3), C. albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). No
antifungigrama em meio líquido (caldo MPL) o sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2) (25°C/96 horas) inibiu 100% da germinação de esporos e do desenvolvimento de hifas de P.
expansum. Com a utilização da mesma levedura contra o fungo A. ochraceus observou-se
uma inibição no desenvolvimento de hifas de 59,26% (25°C/120 horas) e inibição na germinação de esporos de 90,92% (25°C/72 horas). A diferença entre os sobrenadantes obtidos do cultivo da levedura isoladamente e em interação com o fungo teste foi significativa (P < 0,05) na maioria dos ensaios. Quando da utilização das frações filtradas para a realização do antifungigrama em meio líquido observou-se 75,02% de inibição do desenvolvimento de hifas (membrana de 10kDa) e 90% de inibição da germinação de esporos (membrana de 5kDa) de A. ochraceus, sugerindo que possivelmente os compostos antifúngicos com maior ação sobre este fungo apresentam peso molar entre 3 e 10kDa. Já em relação ao desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum observou-se inibição total (100%) com a utilização de todas as frações, sugerindo-se assim que o composto antifúngico de maior ação para P. expansum tenha peso molecular inferior a 3kDa. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a aplicação de leveduras antagonistas constitui ferramenta promissora no controle biológico de P. expansum e A. ochraceus em pós-colheita de frutas.
8 ABSTRACT
SIMER, Patricia. Effect of ultrafiltradas fractions growing of Hansenula wingei in the control of Penicillium expansum and Apergillus ochraceus. 2013. Monography (College of Food Technology). Federal Technological University of Paraná. Francisco Beltrão.
The Brazil ranks among the four largest producers of fruit, along with China, India and USA. However, the competitiveness of Brazilian fresh fruit in the international market is very vulnerable. This is due to their susceptibility to fungal infection in the field, as well as attack during storage, resulting in significant economic losses. Allied to consumer interest in natural products and healthier is needed more attention on the quality of fresh fruit to be exported due to prolonged exposure to conditions conducive to proliferation of spoilage fungi / mycotoxigenic. So biocontrol using antagonistic yeasts with emphasis on killer strains, due to the low possibility of toxic residues, shown as a relevant alternative to the traditional chemical treatment, decreasing the amount of fungicides used in the treatment of post-harvest fruit. Thus, the objective was to study the biocontrol of Aspergillus ochraceus and Penicillium
expansum (filamentous fungi) by antagonistic yeast Hansenula wingei (AM2-2). Yeast H. wingei showed positive killer against sensitive yeasts Candida glabrata NCYC 366 (K3), Candida albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). In vitro antifungal susceptibility
in liquid (broth MPL) the culture supernatant of H. wingei (AM2-2) (25 ° C for 96 hours) 100% inhibited spore germination and hyphal development of P. expansum. With the use of the same yeast against the fungus A. ochraceus observed a reduction in the development of hyphae of 59.26% (25 ° C/120 hours) and inhibition of spore germination of 90.92% (25 ° C/72 hours). The difference in the supernatants obtained from the yeast culture alone and in interaction with the test fungus was significant (P <0.05) in most experiments. When using the fractions filtered to carry out the in vitro antifungal susceptibility liquid medium was observed 75.02% inhibition of the development of hyphae (10kDa membrane) and 90% inhibition of spore germination (5kDa membrane) A. ochraceus, possibly suggesting that the antifungal compounds with higher activity on this fungus have molecular weight between 3 and 10kDa. In relation to the development of hyphae and spores germination of P. expansum total inhibition was observed (100%) with the use of all fractions, thus suggesting that the antifungal compound of greater activity for P. expansum has a molecular weight below 3kDa. According to the obtained results, it is concluded that the application of antagonistic yeast is a promising tool for the biological control of P. expansum and A. ochraceus in postharvest fruit.
9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico de Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS (2012)... 19 Figura 2 - a) deterioração em maçã por Penicillium expansum; b) imagem de P.
expansum por microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES
(2012)... 19
Figura 3 - Exemplos de células de leveduras e sua reprodução por brotamento originando novas células. Fonte: NIHS (2012)... 20 Figura 4 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H. wingei/P.
expansum no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum (105
esporos), após 12 horas/25°C... 35 Figura 5 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H.wingei/A.
ochraceus no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (105
esporos), após 12 horas/25°C... 36 Figura 6 - Efeito inibitório do sobrenadante de H. wingei (AM2-2) (S + A) e das frações filtradas (F + A) sobre o desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A.
ochraceus (105 esporos), após 12 horas/25°C. ... 39
10 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas... 17 Tabela 2 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei e da interação levedura/P. expansum... 34
Tabela 3 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2) e da interação levedura/A. ochraceus... 34 Tabela 4 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra A. ochraceus... 38 Tabela 5 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 OBJETIVOS ... 14 2.1 Objetivo geral ... 14 2.2 Objetivos específicos ... 14 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 15
3.1 PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS ... 15
3.2 DETERIORAÇÃO DE FRUTAS ... 16 3.3 PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS ... 17 3.4 CONTROLE DE FUNGOS ... 19 3.4.1 Controle biológico ... 20 3.5 ATIVIDADE KILLER... 24 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 27 4.1 Fungo teste ... 27
4.2 Análise do Potencial Killer ... 27
4.3 Cura da levedura Killer... 28
4.4 Obtenção do extrato bruto ... 29
4.5 Antifungigrama em Meio Líquido ... 29
4.6 Purificação parcial de composto antifúngico ... 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 33
CONCLUSÃO ... 41
12 1 INTRODUÇÃO
No Brasil, a agricultura apresenta-se como uma das bases mais potentes de economia com fornecimento contínuo garantido de cereais, hortaliças, oleaginosas, frutas e derivados processados (COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003). A exportação brasileira de frutas frescas vem aumentando no decorrer dos últimos anos, sua produtividade supera os 41 milhões de toneladas, classificando o país entre os quatro maiores produtores mundiais juntamente com China, Índia e EUA. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente melão, manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012).
Entretanto, aproximadamente 30% do total de frutas frescas produzidas no Brasil nunca chegam ao consumidor final devido a grande susceptibilidade das mesmas à infecção fúngica (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Sendo que, de modo geral a infecção fúngica geralmente está correlacionada a fatores ambientais como temperatura e umidade e a danos mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e estocagem (SILVEIRA et al., 2005).
Dentre os deteriorantes mais comumente encontrados em frutas frescas estão os fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. As espécies de Penicillium principalmente são as mais importantes deterioradoras de frutas in natura, além de produção de micotoxinas (BATISTA; FREITAS, 2000), que são substâncias nocivas à saúde humana e animal. Porém para a realização do controle destes fungos utilizam-se fungicidas, de modo a aumentar ainda mais a quantidade de químicos presentes no organismo humano.
Certas espécies de leveduras apresentam habilidade de produção de compostos antimicrobianos, como por exemplo, a toxina killer, que tem ação sobre outras espécies de leveduras, fungos filamentosos e bactérias podendo causar a morte dos mesmos (ROSA, 2009). Assim uma alternativa ao tradicional tratamento químico (utilização de fungicidas) pós-colheita de doenças em frutos, destaca-se o controle biológico com a utilização de leveduras antagonistas, principalmente as das linhagens killer, devido a sua baixa possibilidade de resíduos tóxicos e mostrando-se inócua perante processos fermentativos (COELHO et al., 2011).
Assim de acordo com o pressuposto, este trabalho objetivou avaliar a inibição de
Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum por toxina killer produzida pela levedura H. wingei (AM2-2), bem como realizar ultrafiltração com o intuito de se purificar parcialmente
13 substâncias killer de amplo espectro de ação para aplicação no controle biológico de pragas e doenças que diminuem a qualidade de frutas na pós-colheita.
14 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a inibição do crescimento dos bolores deteriorantes Aspergillus ochraceus e
Penicillium expansum por frações ultrafiltradas obtidas do cultivo de Hansenula wingei
(AM2-2).
2.2 Objetivos específicos
- Determinar se há expressão de caráter killer pela levedura Hansenula wingei (AM2-2). - Avaliar possível diminuição de produção da toxina killer após realização de tratamento térmico.
- Avaliar o antagonismo da levedura killer no desenvolvimento dos bolores P. expansum e A.
ochraceus, por meio de análise microscópica, observando-se a atuação sobre o
desenvolvimento de hifas e sobre a porcentagem de germinação de esporos.
- Purificar parcialmente o composto antifúngico com maior potencial antagônico, pela levedura, por meio de etapas de ultrafiltração.
15 3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS
Observando-se as condições climáticas e extensão territorial, grandemente favorável, o Brasil apresenta condições ótimas de modo a se tornar um dos maiores polos produtivos para o mercado mundial de frutas, se beneficiando da onda “naturalista” que vem sendo observada no mundo todo (NACHREINER; SANTOS; BOTEON, 2003).
A exportação brasileira de frutas frescas vem aumentando no decorrer dos últimos anos, sua produtividade supera os 42,6 milhões de toneladas (2010) em uma área de 2,2 milhões de hectares, classificando o país em 3° lugar na produção mundial, perdendo para 1° China e 2° Índia e seguido pelos Estados Unidos (BRAZILIAN FRUIT, 2012), como pode-se observar no Gráfico 1. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente melão, manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012).
Gráfico 1: Produção mundial de frutas no ano de 2010. Fonte: FAO (2012) modificado.
Porém, da produção brasileira de frutas, apenas uma pequena parcela é exportada, sendo a grande parte ainda destinada ao mercado interno. Estima-se que do total produzido,
16 53% destina-se ao mercado interno in natura, 46% a indústria processadora e apenas uma pequena parcela é destinada à exportação, menos de 2% do total de frutas frescas produzidas, mesmo assim, a cadeia produtiva das frutas é considerada um dos setores do agronegócio nacional com maior potencial (INTEC, 2005; IBGE, 2012). As frutas frescas tiveram aumento na exportação no decorrer dos anos, porém após um pico de exportação em 2007 com 918 mil toneladas, observou-se um queda constante chegando em 2010 a 759 mil toneladas exportadas, diminuição em 3 anos de 17% das exportações (IBRAF, 2012; IBGE, 2012).
A exportação de frutas brasileiras apresenta fatores limitantes de competitividade relacionados à qualidade, como preços praticados, condições de armazenamento, falta de organização dos produtores, falta de apoio do governo e alta perecibilidade. Outro fator determinante é a variação de ano para ano do volume de frutas exportadas, implicando em baixa confiabilidade na exportação brasileira em relação à regularidade de fornecimento frente a importadores estrangeiros (LACERDA; LACERDA; ASSIS, 2004) e a ausência de suprimentos regulares, consistentes e de boa qualidade, o que ainda dificulta o desenvolvimento a longo prazo da indústria de frutas (INTEC, 2005).
3.2 DETERIORAÇÃO DE FRUTAS
Aproximadamente 30% da produção de frutas nunca chegam ao consumidor final, devido a perdas no campo e pós-colheita, sendo que para algumas em especial como, por exemplo, a banana e morango os valores são ainda mais relevantes atingindo 38 e 40% respectivamente (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Frutas são produtos considerados altamente perecíveis, principalmente pós-colheita onde são susceptíveis a doenças de ordem microbiológica (CHAN; TIAN, 2005). Estas doenças estão ligadas ao fato de que após a colheita diferente dos produtos de origem animal, as frutas e hortaliças continuam vivas, mantendo seus processos biológicos vitais ativos (CASA et al., 2006).
Os países em desenvolvimento são fortemente afetados, com grandes perdas devido a instalações, armazenamento e transporte inadequados (EL GHAOUTH; WILSON; WISNIEWSKI, 2004). A deterioração das frutas tem seu início durante a colheita, assim quanto mais cuidados forem tomados perante os procedimentos, menor será o processo de deterioração nas etapas seguintes. Devido à composição nutricional das frutas estas são
17 capazes de sustentar o desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras, contudo, o seu pH desfavorece o crescimento bacteriano, de modo que sua ampla faixa de pH facilita o crescimento de bolores e leveduras propiciando que estes atuem realizando alterações em frutas (PARIZ, 2011).
Consideráveis perdas nos cultivos de importância econômica são resultado da vulnerabilidade das frutas à infecção fúngica geralmente ligada a fatores ambientais como temperatura e umidade e a danos mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e estocagem (FAZIO, 2009). Os gêneros com espécies produtoras de patulina e ocratoxina A demonstram certa tendência a preferir substratos constituintes de frutas frescas (MOAKE; PADILLA-ZAKOUR; WOROBO, 2005), como se observa na tabela 1.
Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas.
Gênero Alterações em frutas
Alternaria spp Putrefação mofosa negra em figo, uva, banana,
maçã e tâmara.
Aspergillus spp Podridão negra em frutas cítricas.
Botrytis spp Putrefação cinzenta em grande parte das frutas.
Colletotrichum spp Putrefação antrocnósica em frutas cítricas, banana e abacate.
Fusarium spp Podridão marrom em cítricos e abacaxis, além de
alteração peduncular.
Penicillium spp Podridão azul e verde em cítricos, e azul em maçã,
uva, pera e banana. Além de causar podridão marrom em abacaxi.
Rhyzopus spp Putrefação mole em vários tipos de frutas.
Fonte: Evangelista (2008) modificado.
3.3 PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS
As micotoxinas, origem das palavras gregas mikes e toxina que significam respectivamente fungo e veneno, são compostos produzidos quando a fase de crescimento atinge a sua fase final e durante a fase estacionária do bolor ( CASTILHO et al., 2007).
Uma grande variedade de fungos produz metabólitos secundários, podendo apresentar potencial toxigênico (produção de micotoxinas) tendo representatividade na contaminação de alimentos de consumo humano e animal (CELLI, 2006) como forma direta ou indireta, através de tecidos de animais, leite e ovos (UEKANE; BANDEIRA; SILVA,
18 2010), vindo a causar desde uma simples náusea, alucinações, dermatites, carcinomas ou até mesmo a morte (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008). As micotoxinas também podem causar a neoplasia maligna, por serem elementos carcinogênicos (ASTOVIZA; SUÁREZ, 2005).
A contaminação dos alimentos por micotoxinas resulta, geralmente, da infecção do alimento por fungos toxigênicos durante fases distintas da produção como o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e processamento desses alimentos (ASAE, 2009) bem como, sempre que condições básicas favoráveis de umidade, temperatura e pH, estiverem presentes (NUNES, 2008). Mas, é importante se observar que nem todas as cepas de uma mesma espécie são toxigênicas, ou seja, a presença de microrganismos patogênicos representa uma possibilidade de contaminação, não confirmando a presença efetiva de micotoxinas (DUARTE, 2010). Os gêneros mais importantes de fungos micotoxigênicos são Aspergillus,
Penicillium e Fusarium, com contaminação de alimentos em várias etapas da cadeia alimentar
(BRYDEN, 2007).
Fatores como a umidade, temperatura, co-cultura, disponibilidade de nutrientes e a atmosfera de crescimento, podem ser considerados como os principais fatores relacionados ao aparecimento de toxinas fúngicas em alimentos, sendo necessária a adoção de medidas que zelem pela manutenção desses fatores, impedindo a presença dessas toxinas garantindo um aproveitamento melhor desses alimentos (BAPTISTA; HORII; BAPTISTA, 2004).
Mais de 300 substâncias já foram identificadas como micotoxinas, seu estudo tem elevada importância devido à gravidade das doenças causadas, caracterizando-se assim como um problema de saúde pública (PERREIRA; SANTOS, 2011). Há uma variada gama de micotoxinas, mas apenas algumas são mais frequentes e de importância à segurança alimentar como, por exemplo, as aflatoxinas, a ocratoxina A, tricotecenos, patulina, zearalenona e as fumonisinas (ASAE, 2009).
A gravidade dos efeitos gerados pelas micotoxinas é dependente da sua toxicidade, grau e tempo de exposição, idade e do estado nutricional do indivíduo, entre outros fatores (NOGUEIRA; OLIVEIRA, 2006). Devido a grande variedade de fungos no meio ambiente, as micotoxinas podem ser consideradas como contaminantes inevitáveis de alimentos e rações assim, portanto, necessitando-se de medidas eficazes no estabelecimento de níveis razoáveis de ingestão para se garantir a manutenção da saúde pública (XU et al., 2006).
O substrato não é o que determina singularmente o desenvolvimento satisfatório de um determinado grupo fúngico e consequente produção de micotoxinas, mas também há
19 relação com as características da espécie predominante (COELHO, 2005). Sendo assim, maior ênfase é dada aos gêneros Aspergillus (Figura 1) e Penicillium (Figura 2) devido a sua preferência na participação da deterioração e consequente produção de micotoxinas em frutas.
Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico de
Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS (2012).
Figura 2 - a) deterioração em maçã por P. expansum; b) imagem de P. expansum por microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES (2012).
3.4 CONTROLE DE FUNGOS
Buscando-se a redução das podridões pós-colheita, várias tecnologias têm sido utilizadas como, por exemplo, “controle químico (inibidores de amadurecimento, fungicidas sistêmicos e protetores), controle biológico (antagonistas), controle físico (tratamento térmico,
a
b
c
20 radiação, atmosfera controlada e modificada) e indução de resistência (elicitores bióticos e abióticos)” (SILVEIRA et al., 2005). Visando assim um planejamento mais sustentável do sistema agroindustrial, diminuindo impactos ao meio ambiente.
O uso de fungicidas sintéticos ainda é um dos controladores pós-colheita mais utilizados em frutas (CASTORIA et al., 2001). Entretanto, o uso indiscriminado dos mesmos vem acarretando um aumento da resistência microbiana ao tratamento, bem como, riscos a saúde humana e ecossistema (SUGAR; SPOTTS, 1999; KORSTEN; BEZUIDENHOUT; KOTZE, 1988). Assim, para a obtenção de um produto com o mínimo possível de contaminantes, bem como o acúmulo dessas substâncias tóxicas no ambiente (CAMILO et al., 2000; SILVEIRA et al., 2005), tem-se iniciado a aplicação do controle biológico, com ênfase em pesquisas relacionadas ao antagonismo de leveduras killer, buscando-se a solução para este problema sem perdas de qualidade do produto final (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002).
As leveduras (figura 3) são fungos unicelulares não-filamentosos, apresentados caracteristicamente sob formas esféricas ou ovais, com reprodução assexuada por brotamento ou fissão e formação de colônias com aspectos pastosos ou cremosos (ICB/UFMG, 2012). Elas preferem para sua sobrevivência substratos açucarados e ricos em água como os frutos, por exemplo, também em sucos de frutos danificados, podendo também se desenvolver em condições extremas (BECZE, 1955).
Figura 3 - Exemplos de células leveduras e sua reprodução por brotamento originando novas células. Fonte: NIHS (2012)
3.4.1 Controle biológico
Atualmente, produtores e pesquisadores se deparam com o desafio da substituição do uso de produtos químicos por produtos alternativos de controle, substâncias estas livres de
21 resíduos tóxicos ou através da tecnologia do biocontrole (ROSA, 2009), ou seja, utilização de agentes naturais para controlar pragas ou patologias de plantas (BLEVE et al., 2006). O controle biológico tem elevada importância devido ao seu significativo potencial, tanto em termos de questões ambientais e econômicas, quanto para incorporação de sistemas de produção orgânicos e convencionais de frutas (BHARAT, 2011).
Segundo Cook e Baker (1983) controle biológico é definido como “a redução da soma de inóculo ou atividades determinantes da doença provocada por um patógeno, realizada por um ou mais organismos que não o homem”. Em geral, o controle biológico mostra-se como uma forma de combate as doenças, tanto no campo como também na pós-colheita, substituindo ou com ação conjunta aos agroquímicos, tornando a produção de alimentos mais sustentável e ecológica (ROSA, 2009).
A utilização de organismos no controle de outros que estejam causando danos a culturas diferenciadas, seja por antibiose, predação, indução a resistência, competição por nutrientes, é denominado controle biológico (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002; ARAÚJO, 2007). Métodos de controle biológico constituem, quando comparados aos químicos tradicionais, alternativas viáveis de aplicação pós-colheita principalmente por não deixarem resíduos tóxicos no alimento (WILSON; WISNIEWSKI, 1994). De acordo com Wilson e Wisniewski (1994), o método de utilização pós-colheita de leveduras antagonistas é o melhor e mais prático no controle biológico em frutas e vegetais. Para Janisiewicz e Korsten (2002), as condições de meio que favorecem tanto o agente patogênico, quanto o agente com potencial antagonista, devem ser as mesmas ou muito semelhantes para a obtenção de um controle eficaz.
A utilização de leveduras antagonistas tem sido muito estudada para aplicação no controle biológico em frutos, devido às características adequadas das mesmas para este papel (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002), já que em sua maioria apresentam requisitos nutricionais simples, podendo colonizar superfícies secas por períodos elevados de tempo, sendo relevantes na seleção de novos controladores (CHANCHAICHAOVIVAT et al., 2007; EL-TARABILY; SIVASITHAMPARAM, 2006).
Já é possível encontrar no mercado a presença de biopesticidas, composto por microrganismos antagonistas ativos, mesmo que o maior uso desta tecnologia ainda se concentre em laboratórios de pesquisas (ROSA, 2009). Um destes mecanismos de controle biológico é o BIOSAVE(Ecoscience, Worcester, MA), à base de estirpes de Pseudomonas
22 de P. expansum e Botrytis cinerea com aplicação em maçãs e peras armazenadas (SUGAR; SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Há também um fungicida israelense, o ASPIRE (Ecogen, Langhorne, PA), com base na estirpe I-182 de Candida oleophila, registrado no controle pós-colheita de P. expansum em peras e maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999; BENBOW; SUGAR, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008).
Há alguns anos houve o desenvolvimento de um novo produto, o YIELD PLUS (Ancor Yest, Cape Town, Solth Africa) constituído de Cryptococcus albidus e com utilização no controle pós-colheita de maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Resultados como os citados, vêm reforçando o biocontrole como método alternativo ao tradicional tratamento químico, necessitando-se apenas melhoria e redução de custos para melhor viabilidade (TAVARES, 1996).
Chanchaichaovivat e Ruenwongs (2008) na utilização de 4 leveduras antagonistas isoladas de frutas e verduras tailandesas obtiveram inibição do crescimento de Colletotrichum
capsici de 66 a 93%. Scherm et al. (2003) em trabalho visando a inibição de P. expansum em
maçãs por cepas da levedura Candida guillermondii obteve 100% de eficácia, na aplicação da levedura sozinha ou mesmo na presença de aditivos.
Santos, Sanchez e Marquina (2004) relataram a inibição de Botrytis cinerea por
Pichia membranifaciens utilizando-se tanto células íntegras (diâmetro de inibição de 32 mm),
com a toxina killer pura. Entretanto, Zhang et al. (2005) não obtiveram resultados satisfatórios quando da utilização do sobrenadante cultivo de Cryptococcus laurenti, no controle de B. cinerea, embora obtivesse o controle total ao utilizar suspensão de células íntegras,
constatando-se ação por competição de nutrientes.
Na Argentina Robiglio et al. (2011) em estudo buscando a redução pós-colheita de P.
expansum e Botrytis cinerea em pêras armazenadas à frio, apresentaram maior eficácia no
controle biológico utilizando as leveduras Aureobasidium pullulans e Rhodotorula mucilaginosa do que uma levedura comercial. Vários mecanismos têm sido relatados como operadores do biocontrole, incluindo antibiose (JANISIEWICZ; ROITMAN, 1988), resistência induzida (EL-GHAOUTH; WILSON; WISNIEWSKI, 1998), parasitismo (WINIEWSKI et al., 1991), bem como competição por espaço e nutrientes (WILSON; WISNIEWSKI, 1989).
O modo de ação de influência que microrganismos antagonistas exercem na presença de patógenos ainda não está bem esclarecido (SHARMA; SINGH; SINGH, 2009), isto
23 decorre, devido às poucas tentativas de trabalhos que tentem explicar estes mecanismos para melhorar o controle na pós-colheita (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002).
Um método alternativo para redução da quantidade de inoculo utilizado para o controle de fungos deteriorantes é a integração da atividade antimicrobiana de antagonistas com cálcio, análogos de açúcar e compostos nitrogenados, desenvolvendo-se assim novos produtos para a proteção de frutos (EL GHAOUTH et al., 2001). Zhang et al. (2005) após estudo relataram que obtiveram maior eficiência com aplicação de Cryptococcus laurentii
contra fungo deteriorante de peras, B. cinerea quando em associação com 2% de CaCl2, após
7 dias de incubação a 25ºC.
Em testes realizados por Droby et al. (1997) observou-se a inibição significativa de
Penicillium digitatum em uvas quando da aplicação da interação de Pichia guilliermondii e
cloreto de cálcio. Wan e Tian (2005) mostraram efetividade na redução de P. expansum e
Alternária alternata no controle pós-colheita de peras, com a utilização do aditivo molibdato
de amônio (NH4Mo) juntamente com a levedura antagonista Rhodotorula glutinis. Na
utilização do biocontrolador, Candida sp em suspensão com sorbato de potássio, Karabulut, Lurie e Droby (2001), obtiveram considerável controle do decaimento de qualidade de doces de cerejas.
Controle efetivo também foi obtido por Janisiewicz et al. (2003), quando da combinação de M. pulcherrima T5-A2 com aquecimento dos frutos (38ºC por 4 dias) contra
Colletotrichum acutatum e P. expansum em maçãs. Em estudo realizado por Calegari, et al
(2012) com a utilização das leveduras H. wingei e S. cerevisiae PF23 aplicadas em sinergismo
com o fungicida Tecto® em baixa dosagem em maçãs, foram eficientes no controle in vivo de P. expansum, indicando a possibilidade de aplicação no controle pós-colheita. Oliveira et al. (2011) obteve 100% de positividade para o fator killer quando do isolamento de 24 leveduras a partir de morango tradicional e orgânico contra ao menos uma das leveduras sensíveis padrão utilizadas.
Estudos realizados por Coelho (2005) e Coelho et al. (2011) mostraram a inibição de 58,15% da germinação de esporos de Penicillium expansum com sobrenadante do cultivo de
Candida guilliermondii obtido após 72 horas a 25oC, enquanto que Pichia ohmeri (25oC/48 horas) inibiu o desenvolvimento de hifas do mesmo fungo em 64,37%, ambos associados ao fator killer. Walker et al. (1995) observaram que leveduras killer mostraram grande potencial de inibição do crescimento micelial de Heterobasidion annosum, Rhizoctonia solani,
24 Em trabalho realizado por Portes (2011) de 41 leveduras isoladas, 24 (58,5%) apresentaram inibição contra P. expansum, 25 (61,0%) contra A. ochraceus A152 e 25 (61,0%) contra F. verticillióides 103F em antifungigrama em meio sólido. Sendo que no antifungigrama em meio líquido, a cepa PF413, identificada como Kluyveromyces sp.,
controlou significativamente tanto a germinação de esporos como o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus, quando comparado ao controle, com inibição da germinação dos esporos de P. expansum e A. ochraceus de 93,33 e 86,44% respectivamente (96horas/25°C).
A constatação da letalidade do fator killer por certas leveduras contra fungos filamentosos tem ampliado ainda mais, no biocontrole de bolores deteriorantes em alimentos e fitopatógenos, as perspectivas de aplicação (JACOBS; VAN VUOREN, 1991). Em suma, o emprego de procedimentos, para uma prevenção precoce da proliferação/invasão de agentes deteriorantes/micotoxigênicos, na superfície das frutas não afetando assim suas características internas bem como sua qualidade nutricional, seria de grande valia para a saúde humana (COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003).
Antagonistas, sejam integrados através de misturas de leveduras, integração do controle químico/biológico ou integração do controle físico/biológico podem melhorar a eficácia do controle (ARAÙJO, 2007), de modo a tornar ainda mais promissora a utilização dos mesmos.
3.5 ATIVIDADE KILLER
Alguns microrganismos antagonistas podem produzir substâncias com capacidade de inibição do crescimento e multiplicação de outros microrganismos denominando-se assim um mecanismo de antagonismo (ROMEIRO, 2007), como por exemplo, a toxina killer que tem ação sobre outras espécies de leveduras, bolores e bactérias podendo levar as outras a morte (ROSA, 2009). Estas substâncias, denominadas metabólitos secundários, são produzidas pelos fungos durante o abrandamento de seu crescimento (MAIN, 2000), ou fase estacionária de crescimento.
Segundo Sallen et al. (2010) mais de 300 metabólitos antimicrobianos naturais tem sido relatados, sendo que dentre eles estão os carotenoides e polipeptídeos, geralmente isolados de plantas e microrganismos, os quais apresentam ampla atividade antimicrobiana
25 (SENTER, 2010). O uso destas substâncias antimicrobianas, isoladas de alguns microrganismos, se aplica não somente no tratamento humano (penicilina entre outros), mas também podem ser empregadas no combate de algumas pragas, que causam milhões em danos na agricultura, consumindo parte considerável do total produzido no mundo todo (OLIVEIRA, 2009).
A capacidade de produção de toxina killer foi descrita pela primeira vez em linhagens de Saccharomyces cerevisiae, em que cepas de S. cerevisiae foram classificadas em três fenótipos: killer, sensível e neutra. Quando as células killer e sensíveis cresciam em um mesmo meio de cultura, certa quantidade das células de leveduras sensíveis era destruída, sendo que as células neutras não matavam células sensíveis e não eram mortas por células
killers (BRITES, 2003). Observou-se então que o efeito “killer” era causado por uma proteína
extracelular que se apresentava sensível ao calor e ação de proteases, além de depender de condições de pH e oxigênio (WOODS; BEVAN, 1968; VAZ et al., 2002).
O fenômeno killer é amplamente difundido entre muitos gêneros de leveduras, como
Sacchamomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Williopsis, Zygosacchoromyces, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia, Rhodothorula, Schwanniomyces, Torulopsis, Trichosporon, Ustilago e Zigowillopsis
(MORACE et al., 1984; CHEN et al., 2000; FAZIO, 2009).
Muitas toxinas produzidas por leveduras são glicoproteínas formadoras de prótons capazes de originar canais iônicos, causando desestabilização do potencial eletroquímico da membrana podendo causar morte celular (MARTINAC et al., 1990, GOLUBEV, 1998).
As toxinas killer são compostas de um peptídeo tóxico, produzido em nível extracelular, com capacidade de inibição de crescimento outros microrganismos (COELHO et al., 2009; SENTER, 2010). Algumas linhagens de leveduras killer matam outras leveduras sensíveis a ela, através da secreção de uma toxina de caráter protéico (ROSA, 2009). As toxinas killer em sua maioria possuem massa molar que varia de 18 a 300 kDa, dependendo da espécie de levedura correspondente (SOARES e SATO, 2000).
Mesmo com a investigação extensiva da atividade killer em leveduras desde 1963, quando foi descoberta por Bevan e Makower (BEVAN; MAKOWER, 1963), pouco se sabe ainda sobre seu mecanismo de ação (RADLER et al., 1993). Evidências indicam que há uma atuação na membrana de células sensíveis, diminuindo o pH intracelular com consequente extravasamento de íons potássio e ATP (MARTINAC et al., 1990). Sua ação também pode estar baseada em diferentes modos como hidrólise, inibição de síntese da β1-3 glucana,
26 principal componente da parede celular, ou até mesmo causando a saída de íons pelo rompimento da membrana plasmática (KAGAN, 1983).
A inibição da síntese da β1-3 glucana foi descrita por Rosa (2009), em que na composição da parede celular, de 80 a 90% são carboidratos, estando entre eles a quitina e a β-1,3-glucana bem como algumas proteínas e lipídios, possibilitando assim que o organismo antagonista, produtor de enzimas como quitinase e β-1,3-glucanase, torne-se capaz de atuar inibindo e controlando o desenvolvimento fúngico. Masih e Paul (2002) observaram a produção da enzima β-1,3-glucanase pela levedura Pichia membranifaciens, com ação sobre o fungo B. cinerea, e notaram que a enzima causou coagulação e rompimento citoplasmático das hifas fúngicas.
27 4 MATERIAL E MÉTODOS
A levedura H. wingei (AM2-2), previamente isolada de 15 amostras de milho em trabalho realizado por Gasperini (2011) a partir de uma cooperativa do município de Francisco Beltrão – PR foi analisada em relação à presença de fator killer, resistência do fator ao tratamento térmico e inibição por produção de compostos extracelulares bioativos em relação a P. expansum e A. ochraceus.
O antifungigrama em meio líquido foi realizado por se tratar de um teste sensível, tornando possível uma quantificação na germinação de esporos e no desenvolvimento das hifas fúngicas (JANISIEWICZ; TWORKOSKI; SHARER, 2000).
4.1 Fungo teste
Os micélios fúngicos de Penicillium expansum n. 2 e Aspergillus ochraceus, foram isolados a partir de maçã e frutos de café respectivamente no laboratório de Microbiologia do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UEL (Universidade Estadual de Londrina), sendo provenientes de cultura monospórica (NELSON; TOUSSON; MARASAS, 1983), consistiram de cepas básicas utilizadas frente ao efeito de antagonistas, quanto a inibição de crescimento.
Os fungos foram mantidos em Ágar Batata Dextrose - BDA inclinado a 4oC na ausência de luz, e o inoculo padronizado com auxílio de câmara de Newbauer (105 esporos/mL) para os testes subsequentes.
4.2 Análise do Potencial Killer
A levedura promissora no controle biológico de Penicillium expansum e Aspergillus
ochraceus foi caraterizada quanto ao fator killer. A levedura sensível, foi previamente
28 x 106 células), e então plaqueada por profundidade em placas de Petri contendo 20 mL de ágar Sabouraud adicionado de 0,003% de azul de metileno (POLONELLI et al., 1983).
Após a solidificação do ágar, foi inoculada uma alçada de leveduras teste, previamente cultivadas em tubos de Ensaio com ágar Sabouraud glicose, formando pequenos pontos (2,0 mm de diâmetro) na superfície do meio. A leitura foi realizada após incubação a 20o C por 72 horas, a presença de fator killer se representou pela formação do halo de inibição em torno das leveduras teste (WALKER et al., 1995).
O controle positivo utilizado como cultura padrão consistiu de Saccharomyces
cerevisiae NCYC-738 e as padrões sensíveis utilizadas para a caracterização do fator killer
consistiram de Candida glabrata NCYC-366, C. glabrata NCYC-388, Candida albicans-12A, Pichia kluyveri CAY-15 e Saccharomyces cerevisiae NCYC-1006.
4.3 Cura da levedura Killer
A cura da levedura foi realizada com o intuito de associar o caráter killer quanto a possibilidade da perda de atividade antagônica, ou seja, indicando se a toxina killer é codificada por genes plasmidiais ou cromossomais, conforme descrito por Petering et al. (1991).
O processo de cura consistiu no pré-cultivo da levedura a 25oC overnight em meio YPD “Yeast Peptone Dextrose” (extrato de levedura 1,0%, peptona bacteriológica 2,0%, glicose 2,0%, ágar 2,0%) com posterior padronização na escala n.o 1 de McFarland, procedendo-se diluições decimais seriadas de 10-1 até 10-4. Então uma alíquota de 0,1 mL (aproximadamente 3,0 x 102 células) foi semeada na superfície de placas contendo meio YPD, seguido de incubação sob tratamento térmico de 37 e 40oC por 48 horas.
Após a realização da cura as cepas termorresistentes foram novamente submetidas ao teste killer e ao antifungigrama em meio líquido, para observar se a levedura manteve suas propriedades inibitórias.
29 4.4 Obtenção do extrato bruto
Para o pré-inóculo, uma alçada de levedura foi transferida para Erlenmeyer com 25 mL de Caldo Meio Para Levedura (Caldo MPL - glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, cloreto de sódio 1%, sulfato de amônio 0,5% e fosfato de sódio monobásico 0,23%) e incubado a 25ºC por 24 horas. O inóculo foi preparado baseando-se na escala de McFarland para bactérias (INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS-ITAL, 1995) adaptada para leveduras, recalculando-se para obter os valores de 3 x 107 (escala nº 1) a 3 x 108 leveduras/mL (escala nº 10), considerando que o tamanho de uma levedura equivale a 10 vezes ao bacteriano (LEVY, 2003). A seguir 3,0 x 106 células de leveduras (100 L) foram inoculadas em 5 Erlenmeyers contendo 50 mL de Caldo MPL e em 5 Erlenmeyers contendo 50 mL do mesmo caldo com 105 esporos de P. expansum e em 5 Erlenmeyers contendo 50 mL do mesmo caldo com 105 esporos de A. ochraceus. Após 24, 48, 72, 96 e 120 horas a 25ºC, os cultivos foram centrifugados (6.500 x g/15 min., 10ºC) e o extrato bruto obtido.
4.5 Antifungigrama em Meio Líquido
O antifungigrama em meio líquido foi baseado essencialmente nas metodologias descritas por Janisiewicz, Tworkoski e Sharer (2000) e Chen et al. (1999), seguido de análise microscópica. O extrato bruto filtrado (membrana “Millipore” 0,20 μm) foi inoculado em volume igual (1,0 mL) de Caldo MPL previamente inoculado com 105 esporos de fungo teste. Os tubos de Ensaio foram incubados a 25oC e analisados em microscópio após 12 horas, determinando-se a germinação dos esporos e tamanho das hifas. Paralelamente preparou-se o controle (branco), inoculando-se 105 esporos de fungo em tubos de ensaio contendo 1,0 mL de Caldo MPL e 1,0 mL de água destilada estéril.
30
Fluxograma 1 - Quantificação de atividade fúngica por meio da porcentagem de germinação de esporos e comprimento de hifas de A. ochraceus e P. expansum em relação ao sobrenadante de levedura. Fonte: Coelho modificado (2005).
Ativação Caldo MPL/25°C/24 h. Escala McFarland nº 1 100 L (3,0 x 106 células) 25°C 24, 48, 72, 96, 120 horas 50 mL Caldo MPL (Controle) 50 mL Caldo MPL + A. ochraceus (105 esporos) 6500 x g/15 min., 10°C Filtração (Micropore 0,22 m) 1,0 mL sobrenadante + 1,0 mL MPL + 105 esporos P. expansum 25°C/12 horas MICROSCOPIA Germinação esporos (%) 100 células
Hansenula wingei (AM2-2)
50 mL Caldo MPL + P. expansum (105 esporos) 1,0 mL sobrenadante + 1,0 mL MPL + 105 esporos P. expansum 25°C/12 horas Comprimento de Hifas (m) 40 células
31 Os resultados foram obtidos perfazendo-se três repetições cada, constituída de quatro dados para a porcentagem de esporos germinados e 40 para a determinação do tamanho de hifas. A determinação do comprimento das hifas foi realizada por meio da medida de 40 hifas selecionadas ao acaso, e a média aritmética utilizada para a comparação. A porcentagem de germinação dos esporos foi baseada na contagem de 100 células, incluindo-se os esporos germinados e os não germinados.
Os dados da atividade antifúngica exercida pelas leveduras antagonistas sobre a germinação de esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram analisados pelo programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de Tukey (P < 0,05).
4.6 Purificação parcial de composto antifúngico
A substância inibitória, produzida pela levedura potencialmente antagônica, foi extraída a partir do sobrenadante dos cultivos da levedura. Para tanto o mesmo foi submetido a etapas de ultrafiltração como descrito por Coelho (2005) utilizando-se membranas de exclusão molecular de 30, 10, 5 e 3 kDa (celulose, “Millipore”) e as frações ultrafiltradas submetidas ao ensaio antifúngico em meio líquido conforme item 4.5, sendo que as mesmas foram codificadas conforme Fluxograma 2.
Os dados da atividade antifúngica das frações ultrafiltradas sobre a germinação de esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram analisados pelo programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de Tukey (P < 0,05).
32
Fluxograma 2 – Purificação parcial do composto antifúngico da levedura para posteriores análises. Ativação Caldo MPL/25°C/24 h. Escala McFarland nº 1 100 L (3,0 x 106 células) Incubação 25°C/96horas 10 Erlenmeyer com 50 mL de Caldo MPL Total de 1000mL de cultivo 6500 x g/15 min., 10°C Filtração (Micropore 0,22 m)
Hansenula wingei (AM2-2)
Ultrafiltração 10°C Membrana de 30kDa FRAÇÃO I congelamento e acondicionamento ≥ 30 mL Ultrafiltração 10°C Membrana de 10kDa Ultrafiltração 10°C Membrana de 5kDa Ultrafiltração 10°C Membrana de 3kDa FRAÇÃO II congelamento e acondicionamento ≥ 30 mL
FRAÇÃO III congelamento e acondicionamento ≥ 30 mL
FRAÇÃO IV congelamento e acondicionamento ≥ 30 mL
