IAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANTIOXI-DANTE E CITOTÓXICA DE
EXTRA-TOS ETANÓLICOS DE Malvaviscus
arboreus Cav. (MALVACEAE)
Jhonatan da Cruz Ribeiro1 Marco Aurélio Sivero Mayworm2
Resumo: Malvaviscus arboreus pertencente à família Malvaceae, é utilizada em jardinagem, medicina popular e na culinária. Estudos anteriores demons-traram atividade moluscicida e alelopática de extrato das raízes; e atividade antitussígena, emoliente e sedativa de extrato das flores. Este trabalho visou avaliar as atividades antioxidante e citotóxica, e realizar triagem fitoquímica de extratos etanólicos produzidos a partir de segmentos de caule, folhas e flores de M. arboreus. A triagem fitoquímica avaliou a presença de fenóis to-tais, flavonoides, quinonas, saponinas, alcaloides e antocianinas. A atividade
1 Graduado em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo – UNASP. E-mail: 2 Doutor em Ciências Biológicas, Botânica pela Universidade de São Paulo – USP. E-mail:
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antioxidante foi avaliada utilizando-se solução etanólica de DPPH (2,2-dife-nil-1-picrilidrazila) e os valores de absorbância foram interpretados em per-centuais de atividade antioxidante (AA%). A atividade citotóxica foi avaliada através do teste de letalidade contra Artemia salina Leach. Demonstrou-se que todos os extratos apresentaram fenóis totais e flavonoides, porém somen-te o extrato de flores apresentou antocianinas. Quanto à atividade antioxidan-te, o extrato etanólico de folhas mostrou-se o mais ativo nas concentrações de 100 μg/mL, 50 μg/mL e 10 μg/mL, comparado aos demais extratos. Na avalia-ção citotóxica, o extrato de flores demonstrou maior toxicidade sobre Arte-mia nas duas concentrações testadas (1mg/mL e 0,5 mg/mL). Conclui-se que os extratos de caule, folhas e flores de Malvaviscus arboreus têm potenciais antioxidante e citotóxico nas concentrações testadas.
Palavras-chaves: Malvaviscus arboreus; Triagem fitoquímica; Atividade an-tioxidante; Atividade citotóxica.
PHYTOCHEMICAL SCREENING, AND EVALUATION
OF ANTIOXIDANT AND CYTOTOXIC ACTIVITIES
OF ETHANOLIC EXTRACTS OF Malvaviscus arboreus
Cav. (MALVACEAE)
Abstract: Malvaviscus arboreus (family Malvaceae), is used in gardening, folk medicine and in cooking. Previous studies have shown molluscicidal and al-lelopathic activity of the root extracts, antitussive, emollient and sedative ac-tivity from extracts of flowers. This study evaluated the antioxidant and cyto-toxic activities and performing phytochemical screening in ethanolic extracts
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from segments of stem, leaves and flowers of M. arboreus. The phytochemical screening aimed to evaluate the presence of total phenols, flavonoids, quinones, saponins, alkaloids and anthocyanins. The antioxidant activity was evaluated using ethanol solution of DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) and absor-bance values were interpreted as a percentage of antioxidant activity (AA%). The cytotoxic activity of the extracts was assessed using the lethality test against Artemia salina Leach. Was shown that all extracts showed total phenols and fla-vonoids, but only the flower extract showed anthocyanins. As the antioxidant activity, the leaves extract was found to be the most active in the concentrations of 100 μg/mL, 50 μg/mL and 10 μg/mL, when compared with other extracts. In the cytotoxic evaluation , the flower extract showed greater toxicity on Artemia in the two concentrations tested (1mg/mL and 0,5 mg/mL). It’s concluded that the extracts of stem, leaves and flowers of Malvaviscus arboreus have antioxi-dant and cytotoxic potential, at the concentrations tested.
Key-words: Malvaviscus arboreus; Phytochemical screening; Antioxidant activity; Cytotoxic activity.
Introdução
Malvaviscus arboreus é uma planta conhecida popularmente como hi-bisco-colibri, espécie do tipo arbusto lenhosa oriunda do México e Norte da América do Sul, muito utilizada na jardinagem como cercas-viva (LORENZI; SOUZA, 2001). Também pode ser usada tanto para fins medicinais quanto para fins culinários, por exemplo, na preparação de saladas, chás; produção de corante (vermelho), geleia, xarope e molhos leves (LIM, 2014). Não há muito conhecimento com relação a sua composição química, porém foi constatada
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a presença da pelargonidina (flavonoide) nas flores e beta-sitosterol (esterol) na raiz. O extrato metanólico das raízes mostrou atividades moluscicida e alelopática (BDMTM, 2009). Suas pétalas apresentam antocianosídeos deri-vados da cianidina, alcaloides isoquinolínicos (0,12%) e mucilagem, sendo os primeiros responsáveis pela ação sedativa e a mucilagem pode agir como antitussígeno e emoliente (IICA; CEDEMETRA, 2005).
Para se estudar a atividade de compostos químicos oriundos de vege-tais é necessário primeiramente determinar a natureza química dos mes-mos, portanto a triagem fitoquímica é um recurso que permite determinar qualitativamente os principais metabólitos presente em um material vege-tal, e a partir disso orientar a interpretação da ação do mesmo material em avaliações farmacológicas (SHARAPIN, 2000).
A atividade antioxidante é determinada quando certos tipos de subs-tâncias apresentam hidroxilas livres e ao estarem frente a radicais livres (que apresentam um elétron não pareado, sendo instável e altamente reati-vo, quando presente no organismo), sedem íons de hidrogênio (SANTI et al., 2014; SALVADOR; HENRIQUES, 2004). Lima et al. (2012) afirma que polpas de frutas ricas em compostos fenólicos, como o açaí, apresentam atividade antioxidante. A Atividade antioxidante dos ácidos fenólicos e de polifenóis é devida a capacidade de tais compostos em ceder o hidrogênio da hidroxila e formar radicais estáveis (SANTI et al., 2014). De modo geral, quanto maior o número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de hidrogênio e de elétrons (ALVES et al., 2007, p. 2).
O DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) é um radical estável que pode ser usado para medir a capacidade de uma amostra em ceder hidrogênios, havendo proporcionalidade de presença de hidroxilas na amostra, com a ação antioxidante da mesma (ALVES et al., 2007). Este método é “um dos mais utilizados, pois ele é considerado um método rápido, prático e com boa
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estabilidade” (SUCUPIRA et al., 2012, p. 266).O radical DPPH é de nitrogê-nio orgânico, com coloração violeta e absorção entre 512 a 520 nm, usado em avaliações de atividade antioxidante de compostos específicos ou de extratos (SUCUPIRA et al., 2012). Alguns estudos com Malváceas já foram realizados utilizando O DPPH, confirmando a atividade antioxidante das mesmas (BHASKAR et al., 2011; BEGHDAD et al., 2014; ZAHID et al., 2014)
A atividade citotóxica pode ser determinada com base na avaliação de letalidade em Artemia, utilizada como um biomonitoramento simples e rápido durante o fracionamento de extratos (LHULLIER et al., 2006). Este bioensaio permite correlaciona-lo com a triagem fitoquímica dos extratos em análise em busca de moléculas bioativas (NASCIMENTO et al., 2008). O modelo de ava-liação estabelecido é baseado em Meyer et al. (1982) que propôs o uso de Ar-temia salina Leach em bioensaio com testes de substâncias naturais com pos-síveis propriedades farmacológicas, devido a facilidade da criação e rapidez da eclosão dos ovos como também os baixos custos na aquisição dos mesmos para pesquisa. Tais estudos já foram realizados com malváceas (COSTA et al., 2009; MUHIT et al., 2010; Al-MAMUN et al., 2011). O presente trabalho visou rea-lizar triagem fitoquímica e avaliar os potenciais antioxidante e citotóxico em extratos etanólicos produzidos a partir de segmentos de caule, folhas e flores de Malvaviscus arboreus Cav. (MALVACEAE).
Material e Métodos
Foram coletadas amostras de caule, folha e flor (80 g P.F.) de Malvavis-cus arboreus Cav. de vários exemplares presentes no Campus I do Centro Universitário Adventista de São Paulo (UNASP-SP), localizado na Estrada de Itapecerica, na cidade de São Paulo. Em seguida foram fragmentadas
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submersas em etanol P.A. O solvente foi trocado a cada 7 dias, perfazendo um total de 21 dias de extração. As extrações foram feitas a temperatura ambiente e protegidas de luz, a fim de evitar a fotooxidação dos compostos. Os filtrados de cada extração foram reunidos, constituído os extratos eta-nólicos brutos, os quais foram concentrados em banho-maria a 60ºC, a fim de se obter concentrações a 1%, sendo armazenados entre 4 a 8ºC.
A triagem fitoquímica dos extratos visou avaliar a presença de fenóis totais, alcaloides, saponinas, quinonas e flavonoides, segundo Matos (1997).
A atividade antioxidante foi avaliada utilizando-se solução etanó-lica de DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) a 0,004 %, diluindo 0,004 g de DPPH em 100 mL de etanol P.A. Para cada extrato em concentrações de 1 %, 0,5 % e 0,1 % foram preparados em triplicata tubos de ensaio A (amostra): contendo 2,0 mL DPPH e 20 μL de extrato; e três tubos de ensaio B (branco): contendo 2,0 mL de etanol e 20 μL de extrato. Foi preparado um tubo de ensaio C (controle) contendo 2,0 mL de DPPH. Os tubos foram mantidos no escuro e após 30 minutos foi realizada a leitura das amostras em espectrofotômetro a 517 nm. Os valores de absorbância foram interpretados em percentuais de atividade antioxi-dante (AA %) conforme Mensor et al. (2001):
(AA %) = 100 — { [ ( Abs A — Abs B ) x 100 ] / Abs C }
A atividade citotóxica foi realizada com o bioensaio de letalidade para larvas de Artemia com base na metodologia descrita por Meyer et al. (1982) com mo-dificações. Para criação de Artemia salina, foi montado um aquário com água similar à do mar (20 gramas de sal sem iodo para cada 1 L de água filtrada) sob aeração, em seguida acrescentado duas gotas de um alcalinizador (Alcali — Lab-con) para adequar o pH da água entre 8 e 9. A temperatura foi regulada (20-30ºC)
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sob a luz. Após a preparação do meio, os ovos de A. salina (Maramar Aquacul-tura Com. Imp. Exportação Ltda.) foram colocados respeitando a proporção de aproximadamente 3 gramas dos ovos para 1 L de água salgada. Após 48 horas de incubação, as larvas foram retiradas para o ensaio.
Foram preparados tubos de ensaio em triplicata para cada extrato de Mal-vaviscus arboreus Cav. e controle com álcool etílico P.A. Em uma primeira bate-ria de testes utilizou-se 0,5 mL de cada extrato e em uma segunda batebate-ria 0,25 mL. Os tubos de ensaio com os extratos foram aquecidos em banho-maria (50-70°C) até total evaporação do solvente. Com o auxílio de uma pipeta automática, foram adicionados 2,0 mL de água salina a todos os tubos de ensaio, seguido de homo-geneização do solvente com o extrato seco, e adição de mais 2 mL de água salina. Com um capilar e uso de uma lupa foram transferidas 10 larvas para cada tubo. O volume de cada tubo foi completado com água salina para 5 mL.
Após 24 horas em contato com a suspensão dos extratos nos tubos de ensaio, realizou-se a contagem do número de larvas sobreviventes com o auxílio de uma lupa. E para cada extrato de acordo com a concentração, foi calculada em porcentagem a taxa de mortalidade.
Resultados e Discussão
Tabela 1: Triagem fitoquímica de extratos etanólicos de M. arboreus
Compostos
Secundários Caule Folhas Flores
Fenóis totais + +++ +
Antocianinas - - ++
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Quinonas - -
-Alcaloides - -
-Saponinas - -
-(+): presença de componente químico; (-) ausência do componente químico A Tabela 1 apresenta a triagem fitoquímica de extratos etanólicos de M. arboreus. Observaram-se maiores teores de fenóis totais e flavonoides no extrato de folhas. Antocianinas só foram evidenciadas no extrato de flores. O extrato de caule apresentou baixos teores de fenóis totais e flavonoides. Tais resultados eram esperados visto que as flores e folhas são órgãos de síntese de compostos secundários, enquanto o caule é geralmente um órgão principalmente de transporte entre a parte aérea e a subterrânea da planta. Segundo Lim (2014), as flores de M. arboreus apresentam ácidos fenó-licos (ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido sinapínico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido clorogênico); e flavonoides (rutina, miricetina, quercetina, kaempferol, apigenina) (LIM, 2014). Prova-velmente tais compostos podem estar presentes nas folhas e caules também conforme o resultado obtido na triagem fitoquímica aqui realizada.
Iica e Cedemetra (2005) relatam que as pétalas de M. arboreus Cav. apresentam antocianinas, alcaloides isoquinolínicos e mucilagem. Da mes-ma formes-ma observou-se neste trabalho a presença de antocianinas apenas nas flores (Tabela 1), porém não houve reação positiva para alcaloides. Pos-sivelmente, caso estivessem presentes, a sua concentração no extrato não permitiu o seu evidenciamento pela metodologia utilizada.
Estudos fitoquímicos de outras malváceas foram realizados recen-temente e constatou-se também a presença de fenóis totais, flavonoides e antocianinas. Flavonoides foram encontrados: nas folhas de Malva sylves-tris (GIOMBELLI et al., 2012); folhas, frutos e sementes de Abelmoschus
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esculentus (OLIVEIRA et al., 2011); flores de Hibiscus rosa-sinensis (BHASKAR et al., 2011); folhas e caule de Malva parviflora L. (RAMMAL et al., 2012). Fenóis totais foram encontrados em flores de Hibiscus rosa sinensis (BHASKAR et al., 2011); folhas e caule de Malva parviflora L. (RAMMAL et al., 2012); extrato etanólico e extrato aquoso de Sida rhom-bifolia Linm (RAMACHANDRAN et al., 2013). Antocianinas foram en-contradas em extrato etanólico de cálices de flores de Hibiscus Sabdariffa L. (SHOWANDE et al., 2013); flores de Malva sylvestris L. (JAYALAKSHIMI et al., 2011). Tais resultados corroboram a triagem fitoquímica realizada neste trabalho.
Tabela 2: Percentual de atividade antioxidante de extratos etanólicos de M. arbo-reus sobre DPPH.
Atividade antioxidante Caule Folhas Flores
10 μg/mL 6,95% 23,98% 6,65%
50 μg/mL 6,69% 72,82% 17,41%
100 μg/mL 8,86% 94,4% 33,94%
A Tabela 2 apresenta a atividade antioxidante de extratos etanólicos de M. arboreus. O extrato de folhas (100 μg/mL e 50 μg/mL) apresentou alta atividade antioxidante (94% e 73%, respectivamente), o extrato de flores (100 μg/mL) mostrou atividade moderada, o extrato de caule apresentou baixa atividade, em todas as concentradas testadas. Esses resultados são su-portados, em parte, pela triagem fitoquímica (Tabela 1), a qual evidenciou teores relativamente elevados de fenóis totais e flavonoides no extrato de folhas, compostos com reconhecida atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007). A moderada atividade antioxidante do extrato de flores (100 μg/mL)
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foi gerada pela presença de teores intermediários de fenóis, flavonoides, e entre estes últimos, as antocianinas, só evidenciadas neste extrato (Tabela 1). A baixa atividade antioxidante do extrato de caule estaria possivelmente relacionada aos menores teores de compostos fenólicos e flavonoides obser-vados entre os três extratos avaliados.
O potencial antioxidante no extrato etanólico de flores de Hibiscus rosa sinensis L. foi creditado a maior taxa de compostos fenólicos e flavo-noides encontrados nesses órgãos (BHASKAR et al., 2011). Neste trabalho, além de fenóis totais e flavonoides, também se observou a presença de an-tocianinas, compostos com atividade antioxidante (SANTOS et al., 2014).
Beghdad et al. (2014) através do método de DPPH, demonstrou que folhas de Malva sylvestris L. apresenta maior atividade antioxidante em comparação ao caule, flores e sementes já que as mesmas possuem maior teor de flavonoides. A ação antioxidante com o método de DPPH foi tam-bém demonstrada em extratos metanólicos de flores e folhas de Hibiscus schizopetalus (Mast) Hook (ZAHID et al., 2014), corroborando os resul-tados encontrados neste trabalho.
Tabela 3: Taxa de mortalidade em A. salina com extratos etanólicos de M. arboreus
Concentração Controle Caule Folhas Flores
1mg/mL 0% 30% 36,67% 56,6%
0,5mg/mL 0% 25% 26,3% 35%
A tabela 3 apresenta a taxa de mortalidade em A. salina com extratos etanólicos de M. arboreus Cav. O extrato de flores demonstrou maior toxi-cidade sobre Artemia nas duas concentrações testadas. Observou-se uma
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taxa de mortalidade de 56,6% quando em contato com o extrato na concen-tração de 1mg/mL e 35% de mortalidade com o extrato a 0,5 mg/mL.
De maneira geral, os extratos mostram baixa toxicidade sobre A. sali-na, com exceção do extrato de flores (1 mg/mL). Diferentemente do extrato clorofórmico de folhas de Abutilon indicum (0,025mg/mL), outra espécie de Malvaceae, que apresentou 100% de letalidade. Segundo os autores, tal ação foi devida a presença de alcaloides e flavonas que se dissolvem melhor em solventes apolares (MUHIT et al., 2010). Em continuidade o extrato me-tanólico de Frutos de Hibiscus Sabdariffa também apresentou alta taxa de letalidade comparada aos resultados deste trabalho, pois na concentração de 0,1mg/mL obteve 100% de mortes. (Al-MAMUN et al., 2011).
Conforme Nguta et al. (2012) os testes citotóxicos realizados em Ar-temia salina com o uso de 45 extratos brutos pertencentes a 31 espécies de plantas demonstrou que a mortalidade foi proporcional ao aumento da concentração do extrato, o que também foi observado neste trabalho. Dentre os Extratos brutos clorofórmico e metanólico (orgânicos), 51 % apresentaram forte ação citotóxica (< de 0,1 mg/mL) contra A. salina en-quanto que 20% dos extratos brutos aquosos apresentaram forte ação ci-totóxica (NGUTA et al., 2012).
Considerações finais
Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que os extra-tos etanólicos de segmenextra-tos de caule, folhas e flores de Malvaviscus arboreus Cav. (MALVACEAE) apresentaram potenciais antioxidante e citotóxico, nas concentrações testadas. A partir disso, novos estudos podem ser desenvolvidos com base nesses resultados a fim de se isolar
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compostos com reconhecida atividade antioxidante e citotóxica em Malvaviscus arboreus.
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