Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão
Procedimentos de Bancada Para
Identificação de Bacilos Gram Negativos
Fermentadores de Glicose
“Enterobacteriaceas”.
&
Anexos Sobre Alguns Bacilos Gram
Negativos Não Fermentadores de Glicose.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Teste para Identificação Manual da Família Enterobacteriaceae
Todas as Enterobactérias necessariamente apresentam bom crescimento em Ágar Mac Conkey, motivo que elege este meio como de escolha para identificação deste gênero bacteriano.
Após a observação do crescimento em Ágar Mac Conkey, e desenvolvimento de colônias não fermentadoras de Lactose é de protocolo que seja realizado a prova da Oxidase bacteriana, o que poderá ser executado através de fitas e/ou discos comercialmente vendidos impregnados com o este elemento.
A identificação do gênero bacteriano de BGN é baseada em uma série de reações bioquímicas que podem ser manipuladas de formas manuais, semi automatizadas e até mesmo automatizadas onde teremos como reação os principais testes descritos à seguir:
Tríplice Açúcar ferro (TAF), Citrato,
Malonato, Uréia, Lisina,
Fenil Alanina,
Motilidade, Indol e Ornitina (Mio),
Vermelho de Metila e Volgues – Proskauer (VM-VP)
Método de Inoculação das Provas Bioquímicas Procedimento Manual (Provas Bioquímicas) 1. Prova da Citocromo oxidase:
1.1. Procedimento: devem ser utilizados discos comerciais impregnados com reativos secos nos quais se estende uma porção da colônia suspeita proveniente de Ág MacConckey LAC NEG com auxílio de um bastão de madeira, plástico ou de vidro (não utilizar alça de platina, cromo ou níquel cromo para esse procedimento);
1.2. Aguardar de dois a três minutos para que ocorra a reação;
1.3. Interpretação: as colônias bacterianas que possuem atividade de Citocromo oxidase desenvolvem em 10 segundos uma cor azul escura, roxa ou negra no local de inoculação, e as colônias bacterianas que não possuem a ação dessa enzima não desenvolve coloração alguma.
1.4. Controle Positivo: Pseudomonas aeruginosa; 1.5. Controle Negativo: Escherichia coli
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão 2. Tríplice Açúcar Ferro (T.A.F.)
2.1. Princípio: o T.A.F. contém:
Glicose, Lactose e Sacarose (carboidratos fermentáveis), Vermelho de fenol (indicador de pH), e
Íons férricos adicionados ao Tiossulfato de Sódio.
Após a confecção deste meio e plaqueamento em tubo, ele apresenta a característica de um meio sólido com superfície inclinada.
2.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação capte uma colônia isolada do Ágar MacConckey e faça:
Dois piques sendo um no fundo, um no meio e Uma estria na superfície;
2.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 às 24h para que ocorram as reações;
2.4. Interpretação:
2.4.1. A cor inicial do meio é de coloração Laranja;
2.4.2. A formação de H2S é demonstrada pela reação com o Sulfato Ferroso que enegrece o meio TAF após a reação;
2.4.3. A produção de CO2 é demonstrada pela produção de bolhas e / ou rachaduras no meio TAF;
2.4.4. A fermentação de açúcares poderá ser evidenciada e interpretada conforme a tabela abaixo:
Condição do TAF após incubação Superfície Meio Base
Fermentador glicose Vermelho Vermelho Amarelo
Fermentador lactose Vermelho Amarelo Vermelho
Fermentador de sacarose Amarelo Vermelho Vermelho
Produção de H2S Formação de pontos negros no meio Produção de CO2 Formação de bolhas ou rachaduras no meio
3. Meio Motilidade – Indol – Ornitina (M.I.O.)
3.1. Princípio: o meio MIO é um meio semi sólido de coloração roxa que deverá ser condicionado na posição vertical após confecção;
3.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação, capte uma colônia isolada do Ágar MacConckey e semeie até a metade do tubo de MIO, marque na parte exterior até o local onde foi inoculado;
3.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 às 24h para que ocorram as reações;
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão 3.4.1. Motilidade: verifique na parte externa do tubo de MIO se houve turbidez e/ou
crescimento abaixo da linha de inoculação.
Se houver tido turbidez interpretar como um LAUDO POSITIVO para MOTILIDADE;
Um LAUDO NEGATIVO para MOTILIDADE será evidenciado pela não turbidez do meio;
3.4.2. Indol: adicione de 03 a 05 gotas de Reativo de Kovac’s ou Reativo de Erlich ou Reativo de James (cor inicial amarela).
Se imediatamente após a adição houver a formação de coloração avermelhada interpretar como LAUDO POSITIVO para INDOL;
Um LAUDO NEGATIVO será observado pela não formação de um halo vermelho e sim amarelo
3.4.3. Ornitina: observe a coloração do fundo do tubo após a incubação do meio. Um LAUDO POSITIVO para ORNITINA será observado pela cor acentuada/turbidez do fundo do tubo.
Um LAUDO NEGATIVO para ORNITINA será evidenciado pelo desenvolvimento da coloração AMARELADA no fundo do tubo;
Condição do MIO após incubação Adição de Reativos Leitura da Prova - Positiva
Motilidade Não Turbidez após marca externa
Indol Sim – Reativo Kovac’s Halo vermelho
Ornitina Não Turbidez no fundo do tubo
4. Meio Citrato segundo Simmons:
4.1. Principio: o Meio Citrato é um meio sólido de superfície inclinada e coloração inicial verde;
4.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação, capte uma colônia isolada de Ágar MacConckey e faça uma estria na superfície do meio (tome as devidas precauções para não perfurar o mesmo);
4.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 às 24h para que ocorram as reações;
4.4. Interpretação: um LAUDO POSITIVO para CITRATO é observado pelo desenvolvimento de COLORAÇÂO AZUL ou AZUL ESVERDEADO em todo o meio.
Um LAUDO NEGATIVO para CITRATO é observado por uma inalteração na coloração inicial.
4.5. OBS: o CITRATO poderá desenvolver em até 48h a cor azul, portanto o aparecimento de uma tonalidade azulada nas primeiras 24h requer mais um período de 24h para positivação do teste e evitar um resultado falso-positivo no laudo final.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Condição do Citrato após incubação Positivo Negativo
Meio inicial verde Coloração Azul Bic Coloração Inalterada. 5. Meio Uréia:
5.1. Princípio: o Meio Uréia é um meio sólido de superfície inclinada e coloração inicial amarelo podendo variar ao laranja conforme o fabricante;
5.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação capte uma colônia isolada de Ágar MacConckey e faça uma estria na superfície do meio (tome as devidas precauções para não perfurar o mesmo);
5.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 à 24h para que ocorram as reações;
5.4. Interpretação: a degradação rápida da uréia, ou seja, um LAUDO POSITIVO para URÈIA deverá ser evidenciado pelo desenvolvimento de uma coloração ROSA INTENSO - PINK em todo o meio.
Uma ausência de degradação da uréia, ou seja, um LAUDO NEGATIVO para URÉIA será evidenciado por um não desenvolvimento de cor no meio após 48h de incubação.
5.5. OBS: a UREIA poderá desenvolver em até 48h a cor rosa intensa, portanto o aparecimento de uma tonalidade rosada nas primeiras 24h requer mais um período de 24h para positivação do teste e evitar a liberação de um resultado falso-positivo como laudo final.
Condição da Uréia após incubação Positivo Negativo
Meio inicial amarelo ou laranja Coloração Rosa Pink Coloração Inalterada.
6. Meio Fenilalanina Desaminase (PHE-ALA):
6.1. Princípio: o Meio PHE-ALA é um meio sólido de superfície inclinada e coloração inicial transparente (incolor);
6.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação capte uma colônia isolada de Ágar MacConckey e faça uma estria na superfície do meio (tome as devidas precauções para não perfurar o mesmo);
6.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 à 24h para que ocorra as reações;
6.4. Interpretação: após o período de incubação adicione de 03 a 05 gotas de Cloreto Férrico a 10% em cima da estria de inoculação (este reativo apresenta coloração amarelada), um LAUDO POSITIVO para PHE-ALA será observado por um desenvolvimento de COR VERDE de imediato sobre a colônia no meio.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Um LAUDO NEGATIVO para PHE-ALA será observado pela cor do próprio reativo adicionado (amarelo).
Condição do PHE-ALA após incubação
Adição de Reativos Leitura da Prova - Positivo Meio PHE-ALA incolor Clorato Férrico a 10% Cor Verde Intenso
7. Meio Malonato:
7.1. Princípio: o Meio Malonato é um meio líquido de coloração inicial verde. 7.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação capte uma
colônia isolada de Ágar MacConckey e semeie lentamente na parede do tubo homogeneizando bem o meio.
7.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 à 24h para que ocorra as reações;
7.4. Interpretação: um LAUDO POSITIVO para MALONATO é observado pelo desenvolvimento de COLORAÇÂO AZUL em todo o meio.
Um LAUDO NEGATIVO para MALONATO é observado por uma inalteração na coloração inicial.
Condição do Malonato após incubação Positivo Negativo
Meio inicial verde Coloração Azul Bic Coloração Inalterada.
8. Meio Volgues Proskauer (VP):
8.1. Princípio: o Meio Volgues Proskauer é um meio líquido de coloração inicial beje ou amarela palha conforma fabricante.
8.2. Forma de Inoculação: com auxílio de uma agulha de inoculação capte uma colônia isolada de Ágar MacConckey e semeie lentamente na parede do tubo homogeneizando bem o meio.
8.3. Incubação: coloque em estufa bacteriológica por um período de 18 à 24h para que ocorram as reações;
8.4. Interpretação: após o período de incubação transferir 1,0mL do meio para um tubo limpo e estéril.
Adicionar 400 uL de Reativo de KOH a 40% e 600 ul de Reativo de Alphanaftol a 5% e aguardar 15 minutos.
Um LAUDO POSITIVO para VP será evidenciado pelo desenvolvimento de uma COLORAÇÂO VERMELHO no meio.
E um LAUDO NEGATIVO será evidenciado por ausência de mudança na coloração inicial
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Condição do VP após incubação Adição de Reativos Leitura da Prova - Positivo
Meio VP 400ul KOH a 40%
600ul Alphanaftol
Cor Vermelha
Bastonetes Gram Negativos Fermentadores de Glicose
A) Grupo Escherichia Escherichia coli
Escherichia coli inativa Lactose positiva, imóvel e anaerogênica.
Escherichia fergusoni Escherichia hermaninii Escherichia vulneris B) Grupo Klebsiella
Klebsiella pneumoniae Bacilo de Friedlander
Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae indol (+)
Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumoniae subspécie ozaenae
Klebsiella rhinoscleromatis Klebsiella pneumoniae subspécie rhinoscleromatis Klebsiella ornithinolítica Klebsiella oxytoca ormitina +
C) Grupo Enterobacter Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Enterobacter agglomerans nova denominação Pantoea agglomerans
Enterobacter sakazakii Enterobacter cloacae com pigmentação amarela Enterobacter gergoviae D) Grupo Serratia Serratia marcescens Serratia rubidae Serratia liquefaciens Serratia ficaria Serratia fontícola Serratia odorífera Serratia plymtelhica
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão E) Grupo Citrobacter
Citrobacter freudii
Citrobacter diversus Nova denominação Citrobacter koseri
Citrobacter amalonaticus
F) Grupo Proteus
Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus pennerii
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Bastonetes Gram Negativos Não Fermentadores de Glicose
II.1: Família Pseudomonadaceae:
Existe mais de 130 espécies sendo classificadas como não fermentadora de glicose. Atualmente houve uma divisão do gênero subdividindo em:
1. Brurkholderia cepacia. 2. Shewanella putrefasciens. 3. Stenotrophomonas maltophilia. 4. Commamonas spp., 5. Acidorax spp., 6. Brevundimonas spp., 7. Moraxella catarrhalis spp.,
Obs.: a Pseudomonas aeruginosa e Stenotrophomonas maltophilia são responsáveis por aproximadamente 80% das infecções clínicas nosocomiais.
1. Pseudomonas stutzeri:
Pertencem a este grupo a cepa VB3 CDC e Pseudomonas mendocina. È a mais freqüentemente isolada em espécimes clínicos. Apresenta colônia seca; de tonalidade amarelo/marron e formação de depressão na superfície do Ágar MacConckey.
2. Pseudomonas putida e Pseudomonas fluorescens:
Não pertence à flora normal humana sendo transmitida através de material médico–hospitalar contaminado.
3. Brurkholderia cepacia :
É a nova denominação para Pseudomonas cepacia. É uma bactéria oportunista e freqüentemente isolada em pacientes com fibrose cística. Pertence a este grupo Brurkholderia pseudomallei e Brurkholderia mallei.
4. Stenotrophomonas maltophilia:
É a mais nova denominação para Pseudomonas maltophilia e Xantomonas maltophilia. São bastonetes gram negativos RNA-r. São encontrados normalmente em: septicemia, pneumonias, infecções em feridas operatórias, contaminação em cateteres, meningite e infecções no trato urinário.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Juntamente com a Stenotrophomonas maltophilia e Burkolderia cepacia são de baixa virulência intrínseca e tem emergido como causa de problemas em Unidades de Terapia Intensiva (UTI).
O Acinetobacter baumanii é o patógeno humano mais prevalente; anteriormente era denominado Acinetobacter calcoaceticus. São bastonetes gram negativos com bom crescimento em ágar MacConckey. É freqüentemente isolado em pacientes de UTI especialmente em queimados ou com Diabetes Mellitus; ou em pacientes em corticoideterapia; diálise peritonial, câncer; alcoolismo e longos episódios de internação.
6. Alcaligenes, spp.,:
São bastonetes gram negativos, oxidase positiva e catalase positiva, neste grupo destacam-se:
6.1: Alcaligenes faecalis: anteriormente denominado Alcaligenes odorans 6.2: Alcaligenes piechaudii: descrito a partir de 1986,
6.3:Alcaligenes xylosidnas (subespécie denitrificans/xylosidans): é um oportunista raro que pode ser isolado de muitos sítios anatômicos.
7. Moraxella, spp.,:
São microrganismos normalmente encontrados parasitando membranas mucosas humanas, dentre eles os mais encontrados são:
7.1: Moraxella catarrhalis: apresentam estrutura diplococoides semelhantes às Neissérias a qual grupo anteriormente pertencia.
Características dos Principais Bacilos Gram Negativos Não Fermentadores
Gênero Oxi Hemólise em
Ág Sg
Motil Lis Orni Arg Mal Cit Ind
Pseudomonas aeruginosa + Beta hemólise + - - + + + - Burkholderia cepacia + Ausência de
beta hemólise + + V - + + - Stenotrophomonas maltophilia - Ausência de beta hemólise + + - - - - -
Acinetobacter baumanii - Ausência de beta hemólise
- - - - V V -
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão Mecanismo de Resistência dos Bacilos Gram Negativo Não Fermentadores.
Gênero Mecanismo Características
Pseudomonas aeruginosa Diminuição da permeabilidade da membrana externa “S” a PENICILINAS anti-pseudomonas (Ticarcilina, Piperacilina) “S” a AMINOGLICOSÍDEOS e CIPRO “S” CEFALOSPORINAS de 3ºG (cefoperazona, ceftazidima) “S” ao IMIPENEM e MEROPENEM “R” intrínseca à AMPICILINA, AMOXACILINA + ÁC CLAVULÂNICO, TETRACICLINA, MACROLÍDEOS; CLORANFENICOL e SULFA (Penicilina sintética lábil)
Burkolderia cepacia Diminuição da permeabilidade das porinas “S” a PIPERACILINA, AZILOCILINA, CEFOPERAZONA, CEFTAZIDIMA, CLORNAFENICOL e SULFA “R” variável ao IMIPENEM e MEROPENEM
Stenotrophomonas maltophilia Mutação nas porinas da membrana externa
Droga de escolha “S”:
SULFAMETOXAZOL + TRIMETROPIM “R” aos AMINOGLICOSÍDEOS e QUINOLONAS
“R” aos beta-lactâmicos: produz 2 beta lactamases denominadas L1 e L2 (*)
Acinetobacter baumanii Diminuição da permeabilidade da camada de porina
Geralmente “S” à SULFAMETOXAZOL + TRIMETROPIM, IMIPENEM, AMPIICLINA + SULBACTAM, AMOXACILINA + ÁC CLAVULÂNICO, PIPERACILINA + TAZOBACTAM e CIPROFLOXACINA INTRINSICAMENTE “R” às Cefalosporinas de primeira geração.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão
Técnicas de Preparo e Leitura de Galerias Api 20E BioMerrieux.
II: Técnicas de Preparo e Leitura da Galeria Api 20E
1. Ao identificar que uma bactéria é Gram negativa, ou seja, com crescimento em Ágar MacConckey prepare a confecção da Galeria Api 20E.
2. Se a colônia bacteriana em questão for Lactose positiva (coloração rosa), não desenvolver a reação da oxidase bacteriana; porém se a mesma for Lactose negativa (marrom) desenvolva a reação da oxidase bacteriana
3. Os reagentes e as Galerias Api 20E encontram-se na geladeira (8ºC), e a Suspensão Medium (utilizada para realização da suspensão bacteriana) encontra-se à temperatura ambiente;
4. 1 º Passo: Preparação da Câmara Úmida:
4.1. Na caixa do kit, pegar o Fundo (parte escavada semelhante à caixa de ovo) e a Tampa de Plástico (conjunto de câmara úmida) localizados dentro da caixa do kit Api 20E e preencher os pocinhos do fundo do conjunto com água destilada.
Atenção! Cuidado para NÃO EXTRAVASAR OS POCINHOS (a finalidade desta câmara úmida é não desidratar a reação durante o período de incubação);
5. 2º Passo: Preparação da Suspensão para Inoculação na Galeria Api 20E 5.1. Abrir uma ampola de Meio Api Suspension Medium localizada em
temperatura ambiente conforme instruções do fabricante.
5.2. Após realizar a Prova da Oxidase Bacteriana, com auxílio de uma alça descartável estéril preparar uma suspensão semelhante 0,5 de Mac Farland utilizando colônias individualizadas provenientes de meio específico Ágar MacConckey
5.3. Aferir a turbidez conforme preconizado. 6. 3º Passo - Preparação da Galeria Api 20E
6.1. Pegar a Galeria Api 20E condicionada em embalagem de alumínio na geladeira dentro do kit e deixar atingir a temperatura ambiente dentro da Câmara Úmida anteriormente preparada.
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão 7. 4 º Passo - Inoculação da Galeria Api 20E:
7.1. Com auxílio de uma pipeta de 1000 uL ou 1,0 mL proceda a inoculação da Galeria Api 20E aspirando o volume da suspensão anteriormente preparada; cuidado para não aspirar e conseqüentemente não inocular pedaços da suspensão nas galerias.
7.2. Preencher os pocinhos até a curvatura superior tomando o devido cuidado para não deixar formar bolhas no momento da inoculação;
7.3. Nos pocinhos identificados como ADH, LDC, ODC, H2S, URE criar uma atmosfera de anaerobiose adicionando, após a inoculação da suspensão 03 gotas de óleo mineral nestes pocinhos;
7.4. Nos pocinhos CIT, VP e GEL que além de sublinhado encontram-se fechados nas laterais simulando um “casinha” ou “sapatinho” preencher TODO o pocinho com a suspensão preparada até a curvatura superior e NÃO ADICIONAR óleo mineral.
7.5. Fechar a Câmara Úmida;
7.6. Incubar o conjunto por 18 a 24h à 35ºC.
8. Adição de Reagentes e Leitura da Galeria Api 20E:
8.1. Adicionar na Prova VP 01 gota de VP1 e 01 gota de VP2 e aguardar 20 minutos;
8.2. Adicionar 03 gotas de IND (Reativo de Kovac’s) na Prova do IND (Prova do Indol), a cor se desenvolverá imediatamente;
8.3. Adicionar 01 gota de TDA (Cloreto Férrico a 10%) na Prova do TDA (Prova da Fenil Alanina), a cor se desenvolverá imediatamente;
Dr. Edlaine Rodrigues Montalvão 9. Tabela Para Leitura da Galeria Api 20E
TESTES LAUDOS NEGATIVOS LAUDOS POSITIVOS
ONPG INCOLOR AMARELO
ADH AMARELO ROXO, LARANJA OU VERMELHO
LDC AMARELO ROXO, LARANJA OU VERMELHO
ODC AMARELO ROXO, LARANJA OU VERMELHO
CIT VERDE PÁLIDO OU AMARELO AZUL OU AZUL ESVERDEADO
H2S INCOLOR OU CINZA DEPÓSITO NEGRO OU UNHA NEGRA
URE AMARELO ROXO, LARANJA OU VERMELHO
TDA AMARELO MARRON ESCURO
IND INCOLOR, AMARELO OU
VERDE PÁLIDO ROSA
VP INCOLOR ROSA OU ROXO
GEL NÃO HÁ DIFUSÃO DO
PIGMENTO
DIFUSÃO DO PIGMENTO NEGRO EM TODO O POCINHO
GLU AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO OU AMARELO CINZA
MAN AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
INO AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
SOR AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
RHA AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
SAC AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
MEL AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
AMY AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
ARA AZUL OU AZUL ESVERDEADO AMARELO
REALIZAR AS LEITURAS COMPARANDO OS RESULTADOS COM A COR DESENVOLVIDA NO TESTE APÓS A ADIÇÃO DOS REAGENTES E RESPEITADO O PERÍODO DE INCUBAÇÃO. COLOCAR NA FOLHA DE LEITURA OS TESTES POSITIVOS E PROCURAR A IDENTIFICAÇÃO