Faculdade de Odontologia de Piracicaba
FABRÍCIO DE FAVERI FAVERO
Avaliação das atividades anticâncer,
antinociceptiva e anti-inflamatória de
produtos oriundos da Artemisia annua L.
Piracicaba
2015
Avaliação das atividades anticâncer,
antinociceptiva e anti-inflamatória de
produtos oriundos da Artemisia annua L.
Orientadora: Prof
a. Dr
a. Mary Ann Foglio
Co-orientador: Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE
DEFENDIDA PELO ALUNO FABRÍCIO DE FAVERI FAVERO, E
ORIENTADA PELA PROF. DR(A) MARY ANN FOGLIO.
Piracicaba
2015
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do titulo de Doutor em Odontologia na área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Favero, Fabrício de Faveri,
F278a FavAvaliação das atividades anticâncer, antinociceptiva e anti-inflamatória de
produtos oriundos das Artemisia annua L. / Fabrício de Faveri Favero. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2015.
FavOrientador: Mary Ann Foglio.
FavCoorientador: João Ernesto de Carvalho.
FavTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Odontologia de Piracicaba.
Fav1. Artemisia annua. 2. Anticâncer. 3. Atividade antinociceptiva. 4. Atividade
antiinflamatória. I. Foglio, Mary Ann,1960-. II. Carvalho, João Ernesto de. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of anticancer, anti-inflammatory and antinociceptive activity of products obtained from Artemisia annua L.
Palavras-chave em inglês:
Artemisia annua
Anticancer
Antinociceptive activity Anti-inflammatory activity
Área de concentração: Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica Titulação: Doutor em Odontologia
Banca examinadora:
Mary Ann Foglio [Orientador] Isis Martins Figueiredo Aparecida Érica Bighetti Jose Francisco Hofling Rodrigo Ramos Catharino Data de defesa: 21-09-2015
Programa de Pós-Graduação: Odontologia
Dedico este trabalho aos meus pais Edison Favero
“Há uma providência especial na queda de um pardal.
Se tiver de ser agora, não está para vir;
se estiver para vir, não será agora;
e se não for agora, mesmo assim virá. O estar pronto é tudo.”
Aos Meus pais Edison e Solange por terem permitido muitas possibilidades em minha vida, por amar, pelo apoio e por acreditar que eu pudesse conquistar um espaço na sociedade que fizesse diferença aos outros e também por acreditar em meus sonhos
A minha avó Glades por sempre elogiar, admirar e apoiar com o carinho que as avós sabem como fazer
Ao meu sobrinho Luiz Fernando que sempre sorri quando me vê e me abraça como quando era criança
A Minha orientadora Mary Ann Foglio que acreditou nesse trabalho sem me conhecer anteriormente, correndo riscos como uma grande pesquisadora deve fazer, me atendendo com carinho e atenção, e proporcionando possibilidades dentro da pesquisa e ensinamentos para a vida científica e pessoal que terei orgulho em dividir
Ao meu co-orientador João Ernesto de Carvalho que abriu as portas do seu laboratório e também pela liberdade de desenvolver e aprender com esse projeto na divisão de Farmacologia e com sua equipe
A pesquisadora Ana Lúcia TG Ruiz que acompanhou e participou desse trabalho em vários momentos e também contribuiu com seus conhecimentos A amiga Maricene Sabha que me ajudou a fazer a escolha desse grupo de pesquisa e de minha orientadora, além de ter aberto grandes possibilidades profissionais
A amiga Fabiana R Nonato que com muita doçura, competência e segurança entrou nesse grupo de pesquisa me mostrado diferentes caminhos para esse projeto, atuando como uma pesquisadora admirável e sempre disposta a me ensinar
Ao amigo Rafael Zafred que com muita disponibilidade, grande coração e carinho não mediu esforços para ajudar e participar, dividindo seu tempo com esse trabalho
As amigas Ilza OLiveira e Núbia Queiroz por quem tenho muito respeito, por terem participado e acompanhado todo esse projeto sempre me atendendo com carinho e profissionalismo
As técnicas Natalia Niizo e Karina, por terem atendido minhas necessidades em momentos críticos e decisivos , sempre com muita responsabilidade
Aos parceiros de pesquisa e de jornada nessa pós graduação Leila Servat Medina, Patrícia Zago e Inês Giardini por terem me acolhido no CPQBA e FOP
escrita
A parceira de pós-graduação Giovana B Longato que com muita competência, leveza e doçura me auxiliou nos ensaios anticâncer desde o início
A veterinária Karin Maia por ter me atendido atenciosamente e dividindo sua experiência profissional
As técnicas do Biotério Ana Possenti e Sirlene Tinti por me atenderem sempre dispostas e participaram dos experimentos
A Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA - UNICAMP A Divisão de Produtos Naturais do CPQBA - UNICAMP
Aos alunos de pós-graduação que estiveram nesse período dividindo experiências e contribuíram de alguma forma
Aos pesquisadores e funcionários do CPQBA
Ao programa de Pós-Graduação em Odontologia da FOP - UNICAMP
A CAPES, CNPq FAPESP pelos recursos para o desenvolvimento desse projeto
A artemisinina, uma lactona sesquiterpênica que possui um grupamento endoperóxido, isolada da Artemisia annua L., é responsável pela ação esquizonticida no controle da malária. As lactonas sesquiterpênicas têm demonstrado atividade biológica para o controle do câncer e inflamação. Os objetivos desse trabalho consistiram nas avaliações das atividades antiproliferativa in vitro, anti-câncer in vivo, antinociceptiva e anti-inflamatória em diferentes modelos, além da avaliação da atividade de mieloperoxidase após edema de orelha com tratamento tópico das amostras. Foi produzido o extrato bruto seco a partir da Artemisia annua L., em 5,5% de rendimento sobre peso seco da planta contendo 0,075% de artemisinina. Esse extrato gerou a fração Lac-FR contendo lactonas sesquiterpênicas em 9,3% de rendimento contendo 1,72% artemisinina e 0,31% de deoxiartemisinina. A avaliação da atividade antiproliferativa em células tumorais humanas das quatro amostras demonstrou efeito antiproliferativo concentração-dependente em todas as linhagens testadas. O extrato bruto, a fração Lac-FR e a artemisinina promoveram uma inibição concentração-dependente com seletividade para a linhagem NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos) e U251 (glioma). Enquanto a deoxiartemisinina apresentou efeito concentração-dependente com seletividade apenas para a linhagem NCI-ADR/RES. Nos experimentos in vivo em modelos de tumor de Ehrlich ascítico e tumor sólido as amostras avaliadas foram capazes de inibir o crescimento tumoral, com exceção do extrato bruto. O composto deoxiartemisinina (100mg/kg), sem o grupamento endoperóxido foi capaz de inibir a proliferação do tumor sugerindo que seu mecanismo de ação independe desse grupo funcional. A fração de lactonas sesquiterpênicas (200mg/kg) via oral mostrou ser uma alternativa eficaz para controle do Tumor ascítico de Ehrlich tanto com tratamento diário como em dias alternados. Os resultados nos modelos de nocicepção e inflamação demonstraram que a Lac-FR apresentou efeito antinociceptivo por mecanismo de ação central e periférico demonstrando seu efeito antinociceptivo pela via opióide. O efeito anti-inflamatório foi evidenciado nos testes de edema de pata e de orelha, com importante correlação na
neurogênica e dor inflamatória como evidenciado no teste da formalina. Também evidenciaram envolvimento de atividade no sistema nervoso central, porém independente da via opióide. A atividade anti-inflamatória de ambas foi demostrada no teste de edema de orelha (i.p.) oferecendo subsídios para futuros estudos de identificação dos mediadores inflamatórios envolvidos em sua ação. Sugere-se que a inibição do tumor de Ehrlich possa ter ocorrido através de mecanismo anti-inflamatório das amostras testadas.
Palavras-chaves: Artemisia annua, Anticâncer, Atividade Antinociceptiva, Atividade Anti-inflamatória
Artemisinin an endoperoxide sesquiterpene lactone, isolated from Artemisia
annua L., is attributed with antimalarial activity. Sesquiterpene lactones have
shown biological activity for the control of cancer and inflammation. Herein the evaluation of in vitro antiproliferative activity, in vivo anti-cancer, anti-nociceptive and anti-inflammatory activity in different experimental models are reported, as well as evaluation of myeloperoxidase activity on ear edema model with topical samples treatment. The crude extract in 5.5% yield was obtained from dried leaves of Artemisia annua L., containing 0.075% artemisinin yield. From the crude extract phenolic compounds precipitation led to Lac-FR in 9.3% yield containing sesquiterpene lactones with 1.72% artemisinin and 0.31% deoxiartemisinin. Evaluation of four samples on antiproliferative activity in human tumor cells showed concentration-dependent effect on all strains tested. The crude extract fraction, Lac FR, and artemisinin promoted a concentration-dependent inhibition with selectivity for NCI-ADR / RES (ovary with the multidrug resistance phenotype) and U251 (glioma) cell lines. Whereas,
deoxiartemisinin demonstrated concentration-dependent inhibition with
selectivity only for NCI-ADR / RES cell line. The in vivo Ehrlich ascites tumor and solid tumor experimental model of the four samples evaluated demonstrated tumor growth inhibition, except for the crude extract. Deoxiartemisinin (100mg / kg) without the endoperoxide group also was able to significantly inhibit tumor proliferation suggesting that the mechanism of action was independent of this functional group. The sesquiterpene lactones fraction (200mg / kg) orally administrated showed to be an effective alternative to
control Ehrlich ascitic tumor with both daily and on alternate day’s treatment.
Fraction Lac-FR when tested in nociception and inflammation experimental models demonstrated analgesic effect through both central and peripheral mechanism of action with analgesic effect via opioid system. The anti-inflammatory effect was evaluated in the ear and paw edema tests, with an important correlation with myeloperoxidase activity decrease. Artemisinin and deoxiartemisinin demonstrated to be involved with control of neurogenic pain and inflammatory pain mechanism as evidenced in the formalin test. The involvement with central nervous system independent of the opioid pathway
mediators involved in this activity. The data presented herein also suggest that the samples tested might have inhibited Ehrlich through anti-inflammatory mechanism. Further studies will be undertaken for better understanding.
5-FU: 5-fluoruracil;
5-HT: 5-hidroxitriptamina ou serotonina; 5-LOX: 5-lipo-oxigenase;
786-0: linhagem celular de adenocarcinoma de rim;
13
C: carbono treze;
Aα: fibras mielinizadas de largo calibre e de condução rápida;
AlfaD (αD): rotação óptica;
AINEs: anti-inflamatórios não-esteroidais;
Aβ: fibras mielinizadas de largo calibre e de condução rápida; Aδ: fibras mielinizadas finas;
ANOVA: teste estatístico de análise de variância; ARE: arteeter;
ARM: artemeter; ARS: artemisinina; ART: artesunato;
ARTEMIS: artemisiteno;
ARTEST 1 / 2 esteroisômeros de di-idroartemisinina 1 e 2 ATP: trifosfato de adenosina;
C: controle de células;
CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior; CCD: cromatografia de camada delgada;
CDKs: quinases dependentes de ciclina; CDK4: quinases dependentes de ciclina - 4;
CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório;
CFA: Complete Freund Adjuvant;
CHCl3: clorofórmio
CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-IR: cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de índice de refração
Cmax: concentração máxima que a substância atinge o plasma;
COX-2: enzima ciclo-oxigenase do tipo 2;
CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas; CYPB6: enzima do citocromo P-450 (complexo enzimático);
CYP3A4: isoforma de enzima do complexo de enzimas do citocromo P-450; DI: densidade de inoculação;
DMSO: dimetilsulfóxido;
DNA: ácido desoxirribonucléico;
DU145: metástase de carcinoma de próstata; EB: extrato bruto;
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético;
Fe2+: ferro no estado ferroso
HaCaT: linhagem celular de queratinócito humano; HETE: ácido hidroxieicosatetraenóico;
HT-29: linhagem celular de adenocarcinoma colorretal; IASP: Associação Internacional para Estudos da dor; IC50: concentração inibitória para 50% das células; IFN - ɤ: interferon-gama;
IL: interleucina (exemplos: IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8); INCA: Instituto Nacional do Câncer;
IP3: trifosfato de inositol;
i.p.: administração de substâncias pela via intraperitoneal; J: constante de acoplamento;
LNCaP: nódulo linfático de paciente portador de tumor prostático; LOX: lipo-oxigenase;
LPS: lipopolissacarídeos;
LTB4: leucotrieno B4;
MCF-7: linhagem celular de adenocarcinoma de mama;
MEP: máximo efeito possível como uma resposta antinociceptiva; MPO: mieloperoxidase;
NCI: National Cancer Institute;
NCI-H460: linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão; NF-κB: fator de transcrição nuclear kappa-B;
NO: óxido nítrico;
NOS: óxido nítrico sintase
OECD: Organization for Economic Cooperation and Development; OMS: Organização Mundial da Saúde;
OVCAR-3: linhagem celular de adenocarcinoma de ovário;
P450: complexo enzimático (CYP17, CYPA1, CYPA2, CYPA4, CYPB6, CYPC9);
p53: proteína relacionada ao bloqueio do ciclo celular; PBMC: célula mononuclear do sangue periférico; PBS: solução salina tamponada;
PC-3: linhagem celular de adenocarcinoma de próstata; PG: prostaglandina;
PGE2: prostaglandina E2;
PGI2: prostaglandina I2
PLA2: fosfolipase A2;
plg3: polegadas cúbicas;
pós-trat: tratamento posterior a inoculação; ppm: partes por milhão;
pré-trat: tratamento prévio a inoculação; Ras: oncogene;
Rf: índice de retenção de um composto; RMN: ressonância magnética nuclear; RNA: ácido ribonucléico;
RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640); s.c.: subcutânea;
Scr: oncogene;
SFB: soro fetal bovino;
SNC: sistema nervoso central; Sp1: fator de transcrição; SRB: Sulforrodamina B;
TAE: tumor ascítico de Ehrlich; TCA: ácido tricloroacético;
TGI: Total Growth Inhibition (µg/mL) - inibição total de crescimento; TGF-β: fator de crescimento transformador beta;
Tmax: tempo máximo para determinada concentração ser atingida; TMS: tetrametilsilano;
TNF-α: Fator de necrose tumoral-α;
TPA: 12-O-tetracanoilforbol-13-acetato, presente no óleo de cróton; U251: linhagem celular de glioblastoma;
UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas; UV: ultravioleta;
VEGF: fator de crescimento endotelial vascular; v/v: volume/volume;
v.o.: administração pela via oral; μg/mL: microgramas por mililitro.
Lista de Ilustrações
Figura 1 - Estrutura das lactonas sesquiterpênicas: artemisinina (1),
deoxiar-temisinina (2) e di-idroepideoxiartenuína-b...41
Figura 2 – Artemisia annua L. Exemplar do CPQBA – UNICAMP (desde 1988)...48
Figura 3 – Representação esquemática do processo de obtenção do extrato seco etanólico a partir de folhas secas de Artemisia annua L...49
Figura 4 – Representação esquemática do processo de obtenção da fração clorofórmica (Lac-FR) contendo as lactonas sesquiterpênicas...50
Figura 5 - Representação gráfica da distribuição das amostras e suas concentrações na placa de 96 compartimentos utilizada no teste de atividade antiproliferativa in vitro ...54
Figura 6 – Representação esquemática da preparação da suspensão contendo as células de Ehrlich...59
Figura 7 – Medidas do Tumor sólido de Erhlich na pata direita com uso de Pletismômetro...59
Figura 8 – Procedimento de Medidas (plg3 ) das patas traseiras direitas com uso de paquímetro (A: paquímetro, B: medida do comprimento, C: medida da largura, D: medida da altura) e imagem da pata direita com tumor no último dia de experimento (E)...60
Figura 9 – Extração das Patas direita (A) e esquerda (B) dos camundongos Balb-c fêmeas no último dia de experimento...60
Figura 10: Citômetro de fluxo Guava EasyCyte Mini Flow Cytometry System, Millipore, Billerica, MA, EUA ...63
Figura 11 – Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético...65
Figura 12 – Avaliação de atividade locomotora - Teste de Campo Aberto ...66
Figura 13 – Avaliação de coordenação motora pelo teste de Rota-Rod...67
Figura 14 – Teste da Formalina para avaliação de atividade antinociceptiva por dor neurogênica (Fase 1) e dor inflamatória (Fase 2) ...68
Figura 15 – Avaliação do índice de alodínia em ratos Wistar machos ...70
Figura 17 – Avaliação de atividade antinociceptiva pelo teste de retirada da cauda...72 Figura 18 - Edema de orelha e extração padronizada...74
Figura 19 – Representação esquemática da avaliação da atividade de
mieloperoxidase com tratamento tópico das amostras de Lac-FR, artemisinina e deoxiartemisinina...75
Figura 20 – Representação do perfil observado por cromatografia de camada
delgada (CCD) com fase estacionária de sílica gel das amostras: A) extrato bruto de Artemisia annua L., B) Fração clorofórmica (Lac-FR), C) Fração acetato de etila, D) ponto misto com padrões de artemisinina, deoxiartemisinina e di-hidro-epideoxiarteanuína-b, E) deoxiartemisinina...76 Figura 21 – Perfil de atividade antiproliferativa da doxorrubicina em cultura de células tumorais e não tumorais...78
Figura 22 – Perfil de atividade antiproliferativa do Extrato bruto de Artemisia
annua L. em cultura de células tumorais e não tumorais ...78
Figura 23 – Perfil de atividade antiproliferativa da fração Lac-FR obtida da
Artemisia annua L. em cultura de células tumorais e não tumorais
...79
Figura 24 – Perfil de atividade antiproliferativa da artemisinina em cultura de
células tumorais e não tumorais...79 Figura 25 – Perfil de atividade antiproliferativa da deoxiartemisinina em cultura de células tumorais e não tumorais ...80 Figura 26 – Ensaio 1 – Avaliação do extrato bruto e Lac-FR - Tumor Sólido de Ehrlich ...82 Figura 27 – Ensaio 2 - Avaliação do extrato bruto e Lac-FR- Tumor Sólido de Ehrlich...83
Figura 28 – Ensaio 3 - Avaliação da Lac-FR - Tumor Sólido de
Ehrlich...84
Figura 29 – Ensaio 4 - Avaliação da artemisinina - Tumor Sólido de
Ehrlich...85
Figura 30 – Ensaio 5 - Avaliação de deoxiartemisinina - Tumor Sólido de
Ehrlich ...86
Figura 31 – Ensaio 6 - Avaliação da Lac-FR v.o. - Tumor Ascítico de
Figura 32 – Ensaio 7 - Avaliação do extrato bruto e Lac-FR pré e pós tratamentos - Tumor Sólido de Ehrlich ...88 Figura 33 – Ensaio 7 - Avaliação da Lac-FR pré e pós tratamento Tumor Sólido de Ehrlich...89 Figura 34 - Atividade Antinociceptiva da Lac-FR pelo teste de contorção abdominal...90 Figura 35 - Avaliação da atividade locomotora (teste de campo aberto) da Lac-FR...91 Figura 36 - Avaliação da coordenação motora com uso do Rota Rod nos tempos de 30, 60 e 90 minutos com uso da Lac-FR...92 Figura 37 - Atividade antinociceptiva da Lac-FR após estímulo químico para dor neurogênica no teste da formalina (Fase 1)...93 Figura 38 - Atividade antinociceptiva da Lac-FR após estímulo químico para dor inflamatória no teste da formalina (Fase 2)...94 Figura 39 - Determinação do índice de alodínia da Lac-FR em modelo de dor persistente por CFA (Complete Freund Adjuvant)...95 Figura 40 - Avaliação do efeito anti-inflamatório da Lac-FR em modelo de edema de pata induzido por carragenina...96 Figura 41 - Efeitos antinociceptivos da Lac-FR frente ao estímulo térmico pelo teste de retirada de cauda...97 Figura 42 - Evidências de envolvimento do sistema opióide na antinocicepção promovida pela Lac-FR associada com naloxona pelo teste de retirada de cauda por estímulo térmico...98 Figura 43 - Avaliação da atividade locomotora (teste de campo aberto) da deoxiartemisinina...99 Figura 44 - Avaliação da coordenação motora com uso do Rota Rod nos tempos de 30, 60 e 90 minutos da deoxiartemisinina...100 Figura 45 - Atividade antinociceptiva da deoxiartemisinina após estímulo químico para dor neurogênica no teste da formalina (Fase 1)...101 Figura 46 - Atividade antinociceptiva da deoxiartemisinina após estímulo químico para dor inflamatória no teste da formalina (Fase 2)...102 Figura 47 - Efeitos antinociceptivos da deoxiartemisinina frente ao estímulo térmico pelo teste de retirada de cauda...103
Figura 48 - Evidências de envolvimento do sistema opióide na antinocicepção promovida pela deoxiartemisinina associada com naloxona pelo teste de retirada de cauda por estímulo térmico...104 Figura 49 - Avaliação da atividade locomotora (teste de campo aberto) da artemisinina...105 Figura 50 - Avaliação da coordenação motora com uso do Rota Rod nos tempos de 30, 60 e 90 minutos com artemisinina...106 Figura 51 - Atividade antinociceptiva da artemisinina após estímulo químico para dor neurogênica no teste da formalina (Fase 1)...107 Figura 52 - Atividade antinociceptiva da artemisinina após estímulo químico para dor inflamatória no teste da formalina (Fase 2)...108 Figura 53 - Os efeitos antinociceptivos da artemisinina frente ao estímulo térmico...109 Figura 54 - Evidências de envolvimento do sistema opióide na antinocicepção promovida pela artemisinina associado com naloxona...110 Figura 55 – Controle da inflamação das amostras Lac-FR, deoxiartemisinina e artemisinina por via tópica pela redução do edema de orelha induzido por óleo de cróton tópico...111
Figura 56 – Quantificação da mieloperoxidase após do edema de orelha
induzido por óleo de cróton tópico após tratamento com Lac-FR, deoxiartemisinina e artemisinina...112 Figura 57- Controle da inflamação das amostras Lac-FR, deoxiartemisinina e artemisinina pela via intra-peritoneal pela redução do edema de orelha induzido por óleo de cróton tópico...113 Figura 58 - Proliferação de células de câncer prostático LNCaP, PC3, DU145 através da indução de um ciclo celular G1, após tratamento com artemisinina. Fonte: Willoughby et al (2009)...118
Figura 59 – Gráficos comparativos demonstrando a biotransformação da
artemisinina em deoxiartemisinina em camundongos saudáveis. Fonte: Weathers et al, 2014……….126
Lista de tabelas
Tabela 1 - Linhagens celulares tumorais e não tumorais utilizadas nos testes deatividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI)...52 Tabela 2 – TGI (µg/mL) - Resultados da atividade antiproliferativa das amostras testadas - Doxorrubicina (controle positivo), Extrato bruto de Artemisia annua
Lista de quadros
Quadro 1 – Principais sinais em teste de toxicidade aguda (n=3/grupo) após
1 INTRODUÇÃO 26
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 28
2.1 Câncer e Inflamação 28
2.2 Dor, Nocicepção e Inflamação 34
2.3 Produtos naturais oriundos de espécies vegetais 38
2.3.1 Artemisia annua L., artemisinina e deoxiartemisinina 40
3 PROPOSIÇÃO 47
4 MATERIAL E MÉTODOS 48
4.1 Descrição Botânica e Obtenção do material vegetal 48
4.2 Obtenções do extrato seco de Artemisia annua L.,
fração clorofórmica (Lac-FR), artemisinina e deoxiartemisinina 49
4.2.1 Análise por cromatografia de camada delgada (CCD) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-IR) 51
4.3 Ensaio in vitro – Atividade Antiproliferativa 52
4.3.1 Avaliação da atividade antiproliferativa em cultura de células
tumorais humanas 52
4.3.1.1 Cultivo celular 52
4.3.1.2 Preparo das suspensões celulares 53
4.3.1.3 Análise dos resultados in vitro 55
4.4 Amostras testadas nos ensaios in vivo 55
4.5 Avaliação de toxicidade aguda 56
4.6 Ensaios in vivo 57
4.6.1 Animais 57
4.6.2 Avaliação de atividade anticâncer - Tumor Sólido de Ehrlich 57
4.6.2.1 Esquemas terapêuticos – avaliação in vivo –
Tumor Sólido Ehrlich 61
4.6.3 Avaliação de atividade anticâncer - Tumor Ascítico de Ehrlich 62
4.6.3.1 Esquemas terapêuticos – avaliação in vivo –
Tumor Ascítico de Ehrlich 63
4.6.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva e Anti-inflamatória 65
4.6.4.1 Avaliação de contorção abdominal induzida por ácido acético 65
4.6.4.2 Avaliação da atividade locomotora (campo aberto)
como teste preliminar 66
4.6.4.3 Avaliação de coordenação motora pelo teste de Rota Rod 67
4.6.4.4 Avaliação de dor neurogênica e dor inflamatória pelo
teste da formalina 68
4.6.4.5 Avaliação da atividade anti-alodínica induzida por CFA
(Complete Freund Adjuvant) 69
4.6.4.6 Avaliação de atividade anti-inflamatória pelo teste de edema
de pata induzido por carragenina 70
4.6.4.7 Avaliação da atividade antinociceptiva pelo teste de
retira de cauda 71
4.6.4.8 Avaliação de nocicepção e inflamação dos compostos
4.6.5 Avaliação de atividade da mieloperoxidase (MPO) 74
4.7 Análise Estatística 75
5 RESULTADOS 76
5.1 Fitoquímica 76
5.1.1 Cromatografia de camada delgada para identificação das lactonas sesquiterpênicas presentes nas amostras de extrato
bruto e Lac-FR 76
5.1.2 Rendimentos e Monitoramento do Extrato bruto e
Lac-FR por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-IR) 77
5.2 Ensaio in vitro – atividade antiproliferativa 77
5.3 Ensaios in vivo 80
5.3.1 Toxicidade aguda 80
5.3.2 Atividade anticâncer – Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich 82
5.3.2.1 Ensaio 1 - Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich
(extrato bruto e Lac-FR) 82
5.3.2.2 Ensaio 2 - Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich
(extrato bruto e Lac-FR) 83
5.3.2.3 Ensaio 3 - Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich (Lac-FR) 84
5.3.2.4 Ensaio 4 - Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich (artemisinina) 85
5.3.2.5 Ensaio 5 - Modelo de Tumor Sólido
de Ehrlich (deoxiartemisinina) 86
5.3.2.6 Ensaio 6 - Atividade anticâncer – Tumor Ascítico
de Erlich (Lac-FR) 87
5.3.2.7 Ensaio 7 - Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich
(extrato bruto, Lac-FR) 88
5.3.3 Avaliação das atividades antinociceptiva e anti-inflamatória
da Lac-FR 90
5.3.3.1 Teste de contorção abdominal induzido por
ácido acético – Lac-FR 90
5.3.3.2 Avaliação da atividade locomotora pelo teste de
Campo Aberto – Lac-FR 91
5.3.3.3 Avaliação da coordenação motora com uso do
Rota Rod em 3 tempos (30, 60 e 90 minutos) – Lac-FR 92
5.3.3.4 Teste da formalina – Lac-FR 93
5.3.3.5 Avaliação do índice de alodínia – Lac-FR 95
5.3.3.6 Edema de pata induzido por carragenina – Lac-FR 96
5.3.3.7 Teste de retirada da cauda - Lac-FR 97
5.3.3.8 Teste de retirada da cauda - Lac-FR associada com naloxona 98
5.3.4 Avaliação das atividades antinociceptiva e
anti-inflamatória – deoxiartemisinina 99
5.3.4.1 Avaliação da atividade locomotora pelo teste de
Campo Aberto – deoxiartemisinina 99
5.3.4.2 Avaliação da coordenação motora com uso do Rota Rod
em 3 tempos (30, 60 e 90 minutos) - deoxiartemisinina 100
5.3.4.3 Teste da Formalina – deoxiartemisinina 101
5.3.5 Avaliação das atividades antinociceptiva e
anti-inflamatória – artemisinina 105
5.3.5.1 Avaliação da atividade locomotora pelo teste de
Campo Aberto – artemisinina 105
5.3.5.2 Avaliação da coordenação motora com uso do Rota Rod
em 3 tempos (30, 60 e 90 minutos) – artemisinina 106
5.3.5.3 Teste da Formalina – artemisinina 107
5.3.5.4 Teste de retirada da cauda – artemisinina 109
5.3.5.5 Teste de retirada da cauda - artemisinina associada
com naloxona 110
5.3.6 Edema de orelha e avaliação de atividade da mieloperoxidase - tratamento tópico com Lac-FR,
deoxiartemisinina e artemisinina 111
5.3.7 Edema de orelha - tratamento intra-peritoneal
com Lac-FR, deoxiartemisinina e artemisinina 113
6 DISCUSSÃO 114
6.1 Abordagens iniciais no contexto da pesquisa com
Artemisia annua L. 114
6.2 Atividade anti-proliferativa – in vitro 116
6.3 Atividade anti-câncer – in vivo 120
6.4 Atividade Antinociceptiva e Anti-inflamatória – in vivo 131
7 CONCLUSÃO 144
REFERÊNCIAS 146
APÊNDICES 163
Apêndice 1 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-IR) –
Extrato seco de Artemisia annua L. 163
Apêndice 2 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-IR)
- Fração clorofórmica de Lactonas Sesquiterpênicas (Lac-FR) 164
Apêndice 3 – Artigo: Favero F de F, Grando R, Nonato FR, Sousa IM, Queiroz NC, Longato GB, Zafred RR, Carvalho JE, Spindola HM, Foglio MA. Artemisia annua L.: evidence of sesquiterpene lactones' fraction antinociceptive activity. BMC Complement Altern Med.
2014:28;14:266 165
ANEXOS 166
Anexo 1 - Aprovação do Comitê de Ética para
desenvolvimento de quimioterápicos 166
Anexo 2 - Aprovação do Comitê de Ética para avaliação de atividade Anti-câncer, anti-inflamatória e antinociceptiva de extratos brutos e frações da
1 INTRODUÇÃO
Por milhares de anos, a natureza tem sido uma grande fonte de agentes com propriedades terapêuticas e um grande número de substâncias têm sido isoladas a partir de fontes naturais, muitas delas baseadas em seu uso terapêutico tradicional (Cragg e Newman, 2005; Newman, 2008; Cragg et al, 2009).
A história da descoberta e desenvolvimento de medicamentos está bem atrelada à utilização de produtos naturais para o tratamento de diversas doenças no decorrer de vários séculos. Pesquisas com plantas medicinais e o aumento da compreensão do papel dos micronutrientes em alimentos abriram um leque de oportunidades para a utilização de compostos químicos isolados que possibilitaram desenvolver medicamentos com controle de qualidade bem definido (Rishton, 2008).
Historicamente, o desenvolvimento da química orgânica ocorreu paralelamente ao estudo das propriedades das plantas, principalmente a partir do século XIX, quando foram registrados os primeiros estudos com embasamento científico. Isso resultou no isolamento de muitos compostos presentes nas plantas, em que já se conhecia algumas propriedades terapêuticas. Desses estudos foram obtidas substâncias que se consagraram como princípios ativos eficazes, e que até hoje, ainda são empregadas no tratamento de determinadas doenças (Montanari e Bolzani, 2001).
No caso de medicamentos fitoterápicos, são conhecidos os mecanismos de ação da mistura, porém os princípios ativos nem sempre são definidos. Acredita-se que as vantagens encontradas por medicamentos fitoterápicos sejam decorrentes de interações sinérgicas que enaltecem os seus efeitos farmacológicos com baixos efeitos colaterais (Heinrich et al, 2007).
Segundo Schmidt et al (2008), essa potencialização de efeito pode resultar da adição de efeitos de componentes individuais (aditivo) ou pela
combinação de substâncias bioativas que exerçam efeitos maiores que a soma dos mesmos individualmente (sinergismo). Assim a potencialização do efeito terapêutico pode ser resultante de dois componentes de um mesmo extrato, dois componentes da mistura de dois extratos distintos ou ainda a mistura de um extrato com um composto puro. Para validar este fenômeno inicialmente os compostos bioativos da mistura deverão ser isolados e identificados.
A Artemisia annua L. (Asteraceae) é uma espécie nativa da China e foi introduzida no Brasil em 1987 e obtém-se dela a artemisinina e alguns de seus derivados semi-sintéticos. Essa espécie produz uma variedade de compostos conhecidos como lactonas sesquiterpênicas, que apresentam diferentes atividades biológicas, algumas das quais são de grande interesse terapêutico como a anticâncer e anti-inflamatória (Klayman, 1985; Tornhamre, 2001; Inayat-Hussain e Tomas, 2004; Merfort, 2011; Chadwick et al, 2013; Ivanescu e Corciova, 2014; Martínez et al, 2014; Chaturverdi, 2011; Favero et al, 2014).
Esse trabalho buscou investigar produtos obtidos da A. annua em modelos experimentais in vitro e in vivo no controle do câncer, nocicepção e inflamação, e encontrar uma correlação das atividades anticâncer e anti-inflamatória.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Câncer e Inflamação
O câncer, também denominando de tumor maligno, é um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado, ou seja, células malignas que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do organismo. Um tumor benigno se caracteriza por uma massa localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido original saudável, raramente constituindo um risco para a saúde (INCA, 2014; INCA, 2015).
De acordo com os dados do INCA (2014), cerca de 80% a 90% dos cânceres estão correlacionados com fatores ambientais, com o consumo do tabaco e o aumento do risco de desenvolvimento de câncer de pulmão, a exposição excessiva ao sol e os riscos de câncer de pele, infecções virais e sua relação com a leucemia, além do que o envelhecimento natural das células que propicia o seu desenvolvimento.
Estimativas realizados por Siegel et al (2013) indicaram que a expectativa
para aumento dos casos de cânceres mais comuns em homens para o ano de 2013, foram o de próstata (1º lugar), seguido dos cânceres de pulmão e brônquios (2º lugar), e o câncer colorretal (3º lugar), esse último representando cerca de 50% de todos os canceres diagnosticados. O câncer de próstata é
responsável por 28% (238.590 mil) de casos incidentes nos homens. Foi
estimado para o Brasil que no ano de 2014, surgiriam 68.800 casos novos. Esses valores correspondem a um risco de 70,42 casos novos para cada 100 mil homens (INCA, 2015).
Os três tipos de tumores malignos mais comumente diagnosticados entre mulheres são o de mama (1º lugar), pulmão e brônquios (2º lugar), e colorretal (3º lugar); este último respondendo por 51% dos casos registrados. O câncer de mama estava estimado em 29% (232.340 mil) de todos os novos casos de
câncer entre as mulheres (Siegel et al, 2013). Para o Brasil, em 2014, foram esperados 57.120 casos novos de câncer de mama, com um risco estimado de 56,09 casos para cada 100 mil mulheres. Além disso, 15.070 mil casos novos de câncer de cólon e reto em homens e 17.530 mil em mulheres. Esses valores correspondem a um risco estimado de 15,44 casos novos a cada 100 mil para homens e 17,24 a cada 100 mil mulheres (INCA, 2015).
O câncer de próstata e o câncer de mama são os de maior incidência, no entanto os cânceres de brônquios e pulmão são os que mais geram índices de óbitos (Siegel et al, 2013). Os usuários de tabaco têm cerca de 20 a 30 vezes mais risco de desenvolver câncer de pulmão quando comparados aos não fumantes. Com relação ao sexo, os homens apresentam maiores taxas de incidência comparado as mulheres (INCA, 2015)
As taxas de incidência de câncer e mortalidade variam consideravelmente entre grupos raciais e étnicos. Para todos os tipos de cânceres, os homens afro-americanos possuem uma incidência 14% maior e uma taxa de mortalidade 33% maior do que os homens caucasianos, ao passo que as mulheres afro-americanas têm uma taxa de incidência de 6% menor, no entanto uma taxa de mortalidade 16% maior do que as mulheres caucasianas (Siegel et al, 2013; INCA, 2015).
Em 2030, a carga global será de 21,4 milhões de novos casos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população (INCA, 2015). Para o ano de 2015, estimativas de 576 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não-melanoma, reforçando a magnitude do problema dessa doença no país. O câncer de pele do tipo não melanoma (182 mil casos novos) será o mais incidente na população brasileira.
Há descrições na literatura clínica que o câncer é uma doença genética e que o acúmulo de alterações genéticas promove o surgimento e evolução de tumores (Weinberg, 2008; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012). Dessa forma, além dos fatores já citados anteriormente (ambientais, tabagismo, exposição
prolongada ao sol e envelhecimento natural), tem sido apontado como agentes causadores de câncer, mal-hábitos alimentares, alcoolismo, hábitos sexuais, medicamentos e fatores ocupacionais (INCA, 2015).
Os tumores são compostos por múltiplos tipos celulares e componentes, assim como as células saudáveis, e competem com o microambiente normal dessas células para superar as condições e se desenvolver. Uma vez que homeostasia do microambiente normal é alterada, essa condição pode favorecer o desenvolvimento tumoral; a iniciação dos tumores é inevitável, mas a sua progressão para malignidade pode e deve ser controlada (Bissell e Hines, 2011; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012).
A comunicação entre as células e o seu microambiente ocorre por meio de uma rede complexa de sinais gerados pela matriz extracelular e da adesão célula-célula e moléculas de junção, assim como pela colaboração entre o epitélio, estroma (fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e células da matriz extracelular) e outros tipos de células específicas dos órgãos. Estas moléculas da matriz extracelular em conjunto com as enzimas, remodelam, organizam e constroem tecidos, mas também emitem sinais para as células (Bissel e Hines, 2011; Wu e Chen, 2013).
A Inflamação crônica e infecções são as maiores causas de câncer (Schetter et al, 2010). Isso leva à uma excessiva remodelagem dos tecidos, perda da arquitetura tecidual e modificações no DNA e proteínas como consequência do estresse oxidativo, e todos estes fatores propiciam o desenvolvimento do câncer (Visser et al, 2006; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012).
A investigação sobre a relação entre câncer e a inflamação têm crescido significativamente (Mantovani et al, 2008; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012). As células inflamatórias e citocinas presentes nos tumores contribuem mais para o crescimento, progressão e imunossupressão, do que para induzir uma resposta antitumoral (Wu e Chen, 2013).
Geralmente, o início tumoral se dá através de alterações genéticas com mutações somáticas (Alberts, 2008). A carcinogênese pode ser dividida em três fases, dentre elas, a de iniciação (1ª), a promoção tumoral (2ª) e progressão tumoral (3ª). A iniciação do tumor envolve alterações irreversíveis do DNA, por carcinógenos químicos (radicais de oxigênio e nitrogênio) ou físicos, levando à ativação de oncogenes e/ou supressão de genes que inativam o tumor. No estágio de promoção tumoral, por estimulação de certos agentes conhecidos como promotores, esses levam as células mutantes a se expandirem por um aumento da proliferação celular e/ou redução dos processos de morte celular (apoptose). A fase de progressão inclui a angiogênese, aumento em tamanho, invasão dos tecidos adjacentes e também a metástase (Hanahan e Weinberg, 2011; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012). Além disso, a instabilidade do genoma, promove uma diversidade genética que acelera sua expressão e mutações, e a inflamação local proporciona a manutenção do tumor (Hanahan e Weinberg, 2011).
A inflamação é uma resposta adaptativa fundamental para os animais, e o seu mecanismo mostra uma complexa interação com mediadores moleculares, até mesmo as células imulológicas no microambiente tecidual através de uma resposta que ocorre em todos os níveis de organização biológica (Wu e Chen, 2013). A inflamação crônica está envolvida em diversos tipos de doença, como as cardiovasculares, diabetes, artrite reumatóide, a doença de Alzheimer, doença pulmonar, a doença auto-imune e também o câncer (Aggarwal, 2006).
Quanto ao desenvolvimento do câncer, as citocinas pró-inflamatórias, incluindo as interleucinas (IL)-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, quimiocinas, metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9) e do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) são principalmente reguladas pela transcrição do NF-κB (factor nuclear kappa B), que são ativos na maioria dos tumores e induzidos por agentes cancerígenos (Bremner e Heinrich, 2002; Vendramini-Costa e Carvalho, 2012; Wu e Chen, 2013), além de atuação de micro-RNAs e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Schetter et al, 2010). Assim, o ambiente tumoral permite múltiplos alvos para a terapia anticâncer, dentre eles a inflamação associada ao tumor (Li et al, 2007).
Embora os genes alvo para NF-kB tenham sido mais intensamente estudados por seu envolvimento na imunidade e inflamação, este fator de transcrição também regula a proliferação das células, a apoptose e a migração celular. Portanto, não é surpreendente que o NF-kB seja constitutivamente ativado em vários tipos de células tumorais (Karin et al, 2002).
O arsenal terapêutico quimioterápico para o câncer possui um grande número de fármacos antineoplásicos disponíveis com capacidade de atuar na divisão celular. Desse modo, outros grupos celulares saudáveis também são afetados por esses agentes promovendo mielossupressão (toxicidade da medula óssea), cicatrização deficiente de feridas, queda de cabelos, lesão epitelial gastrintestinal, esterilidade e teratogenia (Rang et al, 2003). Desse modo, faz-se necessário a procura por agentes mais seletivos para as células tumorais, assim como outros recursos terapêuticos que possam promover o controle dos tumores.
Interferir no desenvolvimento do tumor pode ser uma alternativa, não obrigatoriamente atingindo diretamente o tecido tumoral com tratamentos quimioterápicos, mas afetando o seu microambiente. Exemplos de terapias
anticâncer podem ser representadas pelo bevacizumabe (Avastin®) que reduz
a vascularização, suprimindo os nutrientes que nutrem o tecido tumoral; o
celecoxibe (Celebra®), um anti-inflamatório não-esteroidal (inibidor de COX-2),
indicado para o tratamento dos sinais e sintomas da osteoartrite e artrite reumatoide, pode ser utilizado em estudos clínicos de fase II como adjuvante no tratamento de câncer de próstata e pâncreas, por suprimir o crescimento de vasos (Bissel e Hines, 2011).
Desta forma, a inflamação mostra ser um componente crítico na progressão tumoral, visto que os canceres surgem de regiões inflamadas. Em diversas formas de inflamação, o microambiente do tumor contém células imunitárias inatas, incluindo neutrófilos, macrófagos, mastócitos, células dendríticas, células natural killers e células imunológicas adaptativas (linfócitos T e B), além de células cancerosas e seu estroma circundante (Wu e Chen, 2013).
O metabolismo do ácido araquidônico (ácido graxo essencial) pela ação da ciclo-oxigenase, lipo-oxigenase e sistema enzimático P450 geram eicosanóides, incluindo prostanóides e leucotrienos. Os eicosanóides, como as prostaglandinas e leucotrienos, são lipídios biologicamente ativos e têm sido relacionados com várias doenças inflamatórias e o câncer (Wang D, Dubois, 2010). Diferentes estudos tem demonstrado que a atividade de mediadores inflamatórios, pela ação de ciclo-oxigenase 2 (COX-2), cria uma ambiente promotor de tumores no qual transforma as células epiteliais e a COX-2 são induzidas por oncogenes Ras e Scr, Interleucina-1 (IL-1), hipóxia, luz ultravioleta, fator de crescimento epidérmicos, fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Wu e Chen, 2013).
Evidências sugerem que a via LOX (lipo-oxigenase) também está envolvida na carcinogênese. A enzima 5-LOX, responsável pela liberação de diferentes leucotrienos, tem mostrado um papel importante na carcinogênese, compreendendo a contribuição de cada prostanóide derivado da COX e da 5-LOX no câncer. Desse modo, o entendimento cada vez mais aprofundando dessas rotas sinalizadoras, estimulam o estudo de novos agentes terapêuticos quimiopreventivos, com mais benefícios e menores efeitos colaterais (Wang D, Dubois, 2010).
Entre os prostanóides, a prostaglandina PGE2 tem mostrado um
importante papel como promotora do crescimento tumoral, demonstrando ser a mais abundante prostaglandina encontrada em tumores de cólon, pulmão,
mama, cabeça e pescoço (Wang e Dubois, 2010). A PGE2 inibe a ativação dos
macrófagos, células T e células natural killers, consequentemente levando a imunossupressão e favorecendo o crescimento tumoral (Vendramini-Costa e Carvalho, 2012).
Os leucotrienos também desempenham um papel importante nas
respostas inflamatória e imunológica. O leucotrieno LTB4, age em receptores
específicos, aumentando os níveis intracelulares de trifosfato de inositol (IP3) e cálcio, e que é quimiotático para neutrófilos e macrófagos (Vendramini-Costa e
Carvalho, 2012). Os níveis de LTB4 estão aumentados no câncer de colon e
próstata, e um aumento na expressão de receptores desse leucotrieno no câncer de pâncreas (Wang e Dubois, 2010).
Baseados nesses dados, investigar a resposta de novos compostos com potencial terapêutico nas relações fisiopatológicas e moleculares, de acordo com os diferentes tipos de cânceres existentes e seus possíveis mecanismos, pode ser útil no entendimento da evolução da doença, mostrando rotas inibitórias pelo controle do processo inflamatório envolvido no processo de proliferação tumoral.
2.2 Dor, Nocicepção e Inflamação
Definida por Merskey (1979), a dor é “uma experiência sensorial e
emocional desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial, ou descrito em termos de tal dano”. Essa definição foi adotada pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (I.A.S.P.) e permanece até os dias atuais no contexto da prática clínica (Le Bars et al, 2001; Loeser e Treede, 2008; Porto e Porto, 2014).
A dor é uma experiência subjetiva difícil de definir de modo exato e inclui um forte componente emocional. Tipicamente se expressa como uma resposta direta de um evento desfavorável associado a um dano tecidual, como lesão, inflamação ou câncer (Rang et al, 2003; Porto e Porto, 2014). A manifestação dolorosa pode ser modulada por uma série de experiências comportamentais, pois não envolve somente a transmissão do estímulo nocivo, mas também fatores genéticos, sociais, culturais, ambientais e cognitivos (Julius e Basbaum, 2001; Porto e Porto, 2014) e nem sempre está associada com nocicepção (Rang et al, 2003). Além disso, envolve funções cerebrocorticais com ativação dos componentes discriminativo e locomotor (Riedel e Neek, 2001).
Nocicepção é um termo neurofisiológico que se refere somente à percepção sensorial do sistema nervoso central (SNC), evocada pela ativação de receptores sensoriais especializados, os nociceptores, existentes no local do estímulo (Furst, 1999). Experimentos com animais para avaliar amostras com possível potencial analgésico, chamado nesse contexto de substâncias como potencial antinociceptivas, medem a nocicepção e envolvem a avaliação da reação do animal a um estímulo doloroso (hipernocicepção), com frequência mecânica ou térmica (Verri et al, 2006; Rang et al, 2003).
A dor, enquanto modalidade de percepção, promove ao animal pela resposta nociceptiva, um controle da homeostasia. O sistema sensorial, que engloba visão, olfato, tato, audição e gustação, tem função de informar ao cérebro sobre os ambientes externo e interno do corpo. Assim a manifestação dolorosa funciona como um sistema de alarme que protege o animal contra uma lesão prejudicial (Le Bars et al, 2001; Quintão et al, 2011), através da ativação de mecanismos que envolvem vias reflexas medulares e supramedulares (Le Bars et al, 2001; Julius e Basbaum, 2001; Quintão et al, 2011).
Há mais de um século, Sherrington (1906) sugeriu a existência de nociceptores, representados por neurônios sensoriais primários, ativados por estímulos periféricos capazes de gerar danos teciduais, transformando estímulos em impulsos nervosos. Desta forma, calor, frio, pressão, distensão, traumas, estímulos químicos, dentre outros, podem ativar os nociceptores direta ou indiretamente (Bessou e Perl, 1969; Quintão et al, 2011).
Os nociceptores são considerados como moléculas de sinalização bidirecional, sendo que os estímulos podem ser transmitidos tanto a partir de terminais nervosos centrais, quanto periféricos (Bessou e Perl, 1969; Quintão et al, 2011). São portanto, terminações nervosas sensíveis a estímulos
mecânicos e ou térmicos (relacionados às fibras Aδ) e estímulos químicos
(relacionados às fibras C não-mielinizadas) (Porto e Porto, 2014). Em condições normais, a dor está associada com a atividade elétrica em fibras aferentes primárias de pequeno diâmetro nos nervos periféricos. Estes nervos
possuem terminações sensoriais nos tecidos periféricos e são ativados por estímulos mecânicos, térmicos e químicos (Rang et al, 2003).
As fibras C não-mielinizadas possuem baixa velocidade de condução (inferior a 1m/s) e são conhecidas como nociceptores polimodais C. (Rang et al, 2003) devido à sua habilidade de responder a estímulos nociceptivos mecânicos (pressão dolorosa, distensão, corte tecidual), térmicos (calor ou frio) ou químicos. No entanto, sua ativação por estímulos mecânicos depende das substâncias químicas liberadas como resultado da lesão tecidual (Davis et al, 1993; Kidd e Urban, 2001).
As fibras mielinizadas finas (Aδ), de condução mais rápida, mas que
respondem a estímulos periféricos semelhantes, são conhecidas como mecanotermo nociceptores, visto serem responsivas às estimulações nociceptivas mecânicas e térmicas (Julius e Basbaum, 2001; Rang et al, 2003). Finalmente, existem as fibras Aα e Aβ da terceira categoria, mielinizadas de largo calibre e de condução rápida (100m/s), responsáveis pela informação proprioceptiva (toque leve e pressão) (Davis et al, 1993; Rang et al, 2003). As fibras Aβ, numa proporção substancial nos aferentes sensoriais da pele, músculos, articulações e tendões, geralmente são unimodais e respondem a estímulos de baixa e alta intensidade (Julius e Basbaum, 2001; Rang et al, 2003).
Na maioria dos casos, o estímulo das terminações nociceptivas de regiões periféricas é de origem química (Rang et al, 2003). Os estímulos mecânicos e térmicos dolorosos, além de excitarem os nociceptores a eles sensíveis, promovem dano tecidual e vascular local, causando liberação ou formação de uma série substâncias tais como os íons hidrogênio e potássio, serotonina, histamina, cininas (exemplo, a bradicinina e calidina), leucotrienos, prostaglandinas e substância P (neuropeptídeo), que atuam nos nociceptores sensíveis a elas (fenômeno denominando transdução: detecção do estímulo). A liberação dessas substâncias ocorre por mecanismos de ação direta (potássio, hidrogênio, cininas, serotonina e histamina), por sensibilização (cininas,
prostaglandinas e substância P) e por extravasamento do plasma (substância P e cininas) (Rang et al, 2003; Porto e Porto, 2014).
Além da transdução citada anteriormente, o fenômeno chamado de transmissão, representa o conjunto de vias e mecanismos que permitem o impulso nervoso, originado nos nociceptores, sejam conduzidos para estrutura do sistema nervoso central comprometidos com o reconhecimento da dor. Outra fase desse processo, a modulação da dor, contempla centros e vias responsáveis por sua supressão, sendo essas vias modulatórias ativadas pelas próprias vias nociceptivas (Porto e Porto, 2014).
No contexto dos estudos da dor e nocicepção, sabe-se que a ausência de comunicação verbal em animais é, sem dúvida, um obstáculo para a avaliação da manifestação dolorosa em condições comuns. Há circunstâncias de clara percepção de que um animal manifesta um sinal doloroso. Por outro lado, torna-se difícil a certificação de que em um dado momento, um animal não sinta dor por não apresentar nenhum sinal físico típico ou comportamento ostensivo. A imobilidade e/ou prostração são por vezes, as únicas respostas que acompanham essa manifestação. Em animais faz-se a identificação e quantificação da manifestação dolorosa pelas reações avaliadas após um estímulo nociceptivo padronizado em ensaios experimentais (Le Bars et al, 2001).
Os estímulos excessivos, mecânicos ou térmicos, podem obviamente causar dor aguda, mas a persistência de tal dor após o estímulo ser removido, ou a dor que resulta das alterações inflamatórias ou isquêmicas nos tecidos, geralmente refletem um ambiente químico alterado dos aferentes da manifestação dolorosa (Rang et al, 2003).
As principais substâncias que estimulam as terminações nociceptivas são as cininas, tal como a bradicina. Esta é uma importante indutora de dor, agindo parcialmente pela liberação de prostaglandinas, que aumentam a ação da bradicinina nas terminações nervosas. As prostaglandinas (PGs) não causam dor, no entanto aumetam fortemente o efeito produtor da dor de outros
agentes como a 5-HT (5-hidroxitriptamina ou serotonina) ou a bradicinina. As PGs da série E e F são liberadas no processo inflamatório, derivadas da cascata do ácido araquidônico pela ação das ciclo-oxigenases. Outros
eicosanóides, incluindo a Prostaglandina I2 (PGI2), os leucotrienos (derivados
da ação da Lipo-oxigenase) e dervidados do HETE (ácido hidroxi-eicosatetracético) também acompanham esse quadro (Kidd e Urban, 2001; Rang et al, 2003).
Vários metabólitos e subtâncias são liberados de células lesadas ou isquêmicas, ou tecidos inflamados, incluindo a 5-HT, ácido lático, ATP
(trifosfato de adenosina) e K+, muitos dos quais afetam as terminações
nociceptivas (Rang et al, 2003).
2.3 Produtos naturais oriundos de espécies vegetais
Apesar da grande variedade vegetal existente e disponível para ser investigada, apenas aproximadamente 6% da biodiversidade do mundo tiveram a sua atividade biológica testada, enquanto 15% possuem estudos fitoquímicos. Um exemplo de sucesso de coleta randômica é a descoberta do taxol em 1970, um diterpeno com ação anticancerígena isolado da casca da árvore Taxus brevifolia, em pesquisa conduzida pelo NCI (Instituto Nacional do Câncer – EUA) (Nam et al, 2007; Rodrigues e Otsuka, 2011).
O meio ambiente tem sido uma fonte de produtos com propriedades medicinais há milênios e com o aperfeiçoamento dos métodos de isolamento, identificação e síntese de compostos, durante o último século, muitos deles foram desenvolvidos a partir de fontes naturais, particularmente de espécies vegetais (Cragg e Newman, 2009).
O território brasileiro possui a flora mais rica do mundo, com cerca de cinco a dez espécies de gimnospermas, 55.000 a 60.000 angiospermas, 3.100 briófitas, 1.200 a 1.300 pteridófitas e cerca de 525 algas marinhas. Até o século
XIX, as plantas eram, de longe, as principais fontes de recursos para o tratamento das doenças (Rodrigues e Otsuka, 2011).
O Brasil possui uma enorme biodiversidade e um vasto potencial florístico para a provisão de recursos naturais e de fármacos potentes para a indústria farmacêutica (Negri e Duarte-Almeida, 2011). Sabe-se que mais de 80% dos fármacos foram obtidos de produtos naturais ou inspirados em um composto natural (Harvey, 2008).
Os produtos do metabolismo primário (lipídeos, protídeos e glicídeos), através de rotas biossintéticas, originam o segundo grupo de substâncias, os metabólitos secundários, que geralmente apresentam estrutura complexa, atividades biológicas marcantes e são encontrados em concentrações relativamente baixas e em determinados grupos de espécies vegetais. Esses metabólitos são biossintetizados pelas plantas para sua defesa contra herbívoros e microorganismos, proteção contra os raios UV, atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes e em alelopatias, sendo esses compostos de grande interesse científico para identificação de novas propriedades farmacológicas, por exemplo. Quando isolados, possuem estruturas complexas, algumas das quais raramente poderiam ser obtidas por meio de síntese orgânica (Negri e Duarte-Almeida, 2011).
Várias recomendações tem sido apontadas como relevantes para o desenvolvimento de novos fitofármacos, dentre elas, a padronização dos extratos das plantas de acordo com um perfil de expressão, tendo em conta as concentrações relevantes e a biodisponibilidade dos compostos envolvidos. Faz-se necessário a determinação dos efeitos dos fitofármacos e componentes bioativos de espécies vegetais, identificando seus mecanismos de ação e comparando-os aos mecanismos já conhecidos de outros compostos. No futuro, o desenvolvimento de fármacos a partir de produtos naturais não necessariamente deverá contar apenas com a descoberta e análise das novas estruturas, mas também explorar sistematicamente regimes de drogas combinatórias (Ulrich-Merzenich et al, 2010; Brasil, 2015).
2.3.1 Artemisia annua L., artemisinina e deoxiartemisinina
Em 1967, a República Popular da China iniciou um programa sistemático em busca de novos fármacos, empregando plantas nativas usadas como remédios em sua medicina tradicional (Klayman, 1985). Uma dessas plantas, a
Artemisia annua L., já apresentava uma longa história de uso. Conhecida como
“qing hao” desde 167a.C. descrita no documento “Recipes for Fifty Two Prescripitons”, foi usada inicialmente no tratamento de hemorróidas (Dhingra, 1999).
No ano 340 d.C., a Artemisia foi descrita como propriedade antipirética no Manual de Prescrições para Emergências (Zhou Hou Bei fi Fang), escrito por Ge Heng (Meshnick, 2002). Em 1596, foi descrito no Compêndio de Matéria Médica (Ben Cao Gang Mu) que a febre poderia ser combatida com preparações de qing hao (Meshnick, 2002). Em 1798, a decocção de A. annua e Carapax trionycis foi sugerida como tratamento para a malária (Klayman, 1985).
Como resultado do programa iniciado em 1967, observou-se, em 1971, que o extrato etéreo de Artemisia annua, obtido a baixa temperatura, apresentava atividade antimalárica. Em 1972, foi isolado o princípio ativo, não relatado na literatura anteriormente. Esse composto foi denominado qinghaosu (QHS), que significa princípio ativo de qing hao. Como nenhum detalhe sobre os procedimentos de isolamento foi relatado pela literatura chinesa, pesquisadores do Walter Reed Army Research investigaram o processo de extração a partir de partes aéreas da planta com vários solventes (Klayman, 1985).
Foi observado que o éter de petróleo era o solvente mais eficiente para a extração do princípio ativo. O princípio ativo da Artemisia annua ficou conhecido no Ocidente como artemisinina, sendo citada pelo Chemical
Abstracts como “artemisinin”. Em 1979, o Qinghaosu Antimalaria Coordinating Research Group apontou que 2.099 mil casos de malária foram tratados com
foram causados por parasitas resistentes à cloroquina e 141 foram casos de malária cerebral, para os quais o tratamento promoveu resultados significativos (Klayman, 1985).
A estrutura da artemisinina (figura 1) foi determinada por difração de raios-X (Luo e Shen, 1997). A sua síntese total foi obtida no ano de 1983 (Shmid e Hofheinz, 1983). Da sua fonte natural, Artemisia annua, a artemisinina pode ser obtida por extração das folhas, em o conteúdo de artemisinina é o mais abundante (Gilbert et al, 2005).
A concentração média de artemisinina nas plantas de origem européia varia de 0,03% a 0,22% do peso seco das folhas. Por outro lado, um clone produzido na China pode conter 1,1% do composto. Há variações de concentrações obtidas na Alemanha (0,02%) e plantas cultivadas na Suíça (1,38%) (Gilbert et al, 2005).
A artemisinina é uma lactona sesquiterpênica que possui um grupamento endoperóxido (figura 1). Desde seu isolamento, vários derivados da artemisinina foram sintetizados, obtendo-se compostos mais e menos ativos (Luo e Shen 1987; Balint, 2001). Com uma alteração no carbono 10 da artemisinina é possível obter seu derivados semi-sintéticos como o artesunato, artemeter, arteeter, di-hidroartemisinina e o ácido artelínico, todos contendo o grupamento endoperóxido (Luo e Shen 1987; Balint, 2001; Woodrow et al, 2005).
Figura 1: Estrutura das lactonas sesquiterpênicas: artemisinina (1), deoxiartemisinina (2) e di-idroepideoxiartenuína-b
Esses compostos foram denominados de peróxidos de primeira geração e empregados na quimioterapia da malária na Tailândia, Vietnã, Brasil e China, onde a resistência ao parasita é comum (Meshnick et al, 1996). Derivados desprovidos de grupamento, embora com estrutura geral bastante similar à artemisinina, são considerados inativos (Klayman, 1985). No tratamento da
malária, o grupo endoperóxido da artemisinina têm-se mostrado
farmacologicamente importante e responsável pelo controle do parasita (Crespo-Ortiz e Wei, 2012; Naeem, 2014). Acredita-se que esse grupamento
possa ser ativado pela redução do heme ou do ferro no estado ferroso (Fe2+),
levando ao efeito citotóxico dos radicais livres de carbono que são altamente alquilantes. Os radicais podem atuar em alvos moleculares essenciais ao parasita, causando a sua morte (Crespo-Ortiz & Wei, 2012).
Mais de 600 compostos foram identificados na Artemisia annua L.. Muitos estudos focam em processos extrativos e na quantificação de artemisinina sem traçar completamente o perfil químico de formulações envolvendo essa espécie vegetal. Mais de 600 metabólitos secundários foram identificados, enquanto apenas 37 desses compostos foram detectados em infusões, como o ácido caféico, flavonóides, cumarinas e a lactona artemisinina. Além disso, há 25 compostos fenólicos reconhecidos nessas preparações (Kooy e Sullivan, 2013; Zhu et al., 2013).
Além das suas propriedades antimaláricas, muitos investigadores demonstraram que artemisinina e derivados semi-sintéticos apresentam efeitos farmacológicos significativos como antitumorais, antimicrobiano, na regulação da função imunológica, propriedades antialérgicas e no controle de desordens neurodegenerativas e de lesões neuronais induzidas por traumas (Crespo-Ortiz e Wei, 2012; Martínez et al, 2014). Um dos compostos promissores para essas atividades é a artemisinina no controle de diferentes tipos de linhagens tumorais (Crespo-Ortiz e Wei, 2012).
A atividade antitumoral significativa de artemisinina e seu derivados semi-sintéticos foi testada in vitro e em modelos animais. A capacidade da artemisinina para eliminar células cancerosas através de múltiplos e
heterogêneos eventos moleculares foi documentada. Entretanto, há dúvidas sobre a base molecular da morte celular induzida por artemisinina e necessita ser melhor investigada (Woerdenbag et al, 1993, Efferth e Oesch, 2004; Willoughby et al, 2009; Crespo-Ortiz e Wei, 2012; Tin et al, 2012; Zhu et al, 2013; Martínez et al, 2014).
Outra vantagem da artemisinina na terapia do câncer é a possibilidade de utilizá-la em combinações sinérgicas na quimioterapia tradicional, reduzindo assim a dose e as reações adversas dessas terapias (Crespo-Ortiz e Wei 2012; Lai et al. 2013; Ivanescu e Corciova, 2014).
Algumas pesquisas investigam o mecanismo de bioativação e eventos moleculares subjacentes aos efeitos da artemisinina no controle do câncer. No entanto, a atividade antitumoral exercida pela artemisinina ainda não é totalmente compreendida (Woerdenbag et al, 1993, Efferth e Oesch, 2004; Effert T, 2007; Willoughby et al, 2009; Crespo-Ortiz e Wei, 2012; Tin et al, 2012; Zhu et al, 2013; Martínez et al, 2014; Ivanescu e Corciova, 2014).
As lactonas sesquiterpênicas, como a artemisinina e deoxiartemisinina, são metabólitos secundários produzidos por várias espécies vegetais, pertencentes à várias famílias, incluindo a Asteraceae. Vários compostos desta classe apresentam diferentes atividades biológicas, alguns dos quais são de grande interesse terapêutico. Os efeitos das lactonas sesquiterpênicas são devidos principalmente à capacidade desses compostos inibirem a atividade de enzimas e outras proteínas funcionais em células vivas. Estes efeitos são mediados por um mecanismo comum, que envolve a formação de ligações covalentes com resíduos livres de cisteinil (metabólito do ácido araquidônico). Muitas das lactonas já estudadas reagem com grupos tióis de baixo peso molecular presentes nas células, tais como a cisteína e a glutationa. Para isto, ocorre uma adição de Michael, do enxofre pertencente ao grupamento tiol, aos elementos estruturais α,β insaturados das lactonas sesquiterpênicas (Tornhamre, 2001; Ivanescu e Corciova, 2014).
