UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Química
JULIANA PRESTES LORENSI
MICROALGA COMO SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO
CAMPINAS 2016
JULIANA PRESTES LORENSI
MICROALGA COMO SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Engenharia Química.
Supervisor/Orientador: Telma Teixeira Franco
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JULIANA PRESTES LORENSI, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. TELMA TEIXEIRA FRANCO
CAMPINAS 2016
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura Elizangela Aparecida dos Santos Souza – CRB 8/8090
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Microalgae as substrate to lactic acid Palavras-chave em inglês: Microalgae Carbohydrates Enzimatic hydrolysis Lactic acid Acid hydrolysis
Área de concentração: Engenharia de Processos Titulação: Mestra em Engenharia Química
Banca examinadora:
Telma Teixeira Franco [Orientador] Otávio Cavalett
Gustavo Mockaitis
Data de defesa: 19-02-2016
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Química
Lorensi, Juliana Prestes, 1990-
L886m Microalga como substrato na produção de ácido lático / Juliana Prestes Lorensi. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
Orientador: Telma Teixeira Franco.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas , Faculdade de Engenharia Química.
1. Microalga. 2. Carboidratos. 3. Hidrólise enzimática. 4. Ácido lático. 5. Hidrólise ácida. I. Franco, Telma Teixeira, 1957-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
Agência (s): CNPq
Dissertação de Mestrado defendida por Juliana Prestes Lorensi e aprovada em 19 de fevereiro de 2016 pela banca examinadora constituída pelos doutores:
________________________________________________ Profª. Drª. Telma Teixeira Franco - Orientador
________________________________________________ Prof. Dr. Gustavo Mockaitis
________________________________________________ Prof. Dr. Otávio Cavalett
A Ata da Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico a Deus, "que amou o mundo de tal maneira
que deu seu Filho Unigênito, para que todo o que Nele crer não pereça mas tenha a vida eterna" (Jo 3,16)
AGRADECIMENTOS
"Graças sejam dadas a Deus que nos da a vitória por meio de nosso senhor Jesus Cristo". Gostaria de agradecer primeiramente a Deus por ser um Pai tão amoroso que tem me capacitado, me dado sabedoria em todos os momentos desse meu estudo e de toda minha vida e me predestinou como sua filha antes da fundação do mundo. Que toda glória e toda honra sejam dadas a Ti, eternamente. Muito obrigada, Pai.
Agradeço toda minha família, principalmente meu pai e mãe Jairo Lorensi e Ana Oni Lorensi, minha irmã, meu cunhado e meu sobrinho Jana Lorensi Ardanaz, Ricardo Ardanaz e Bernardo Ardanaz, que em todos os momentos me deram suporte e apoio, desde o início com as dificuldades com a distância até agora para finalizar esse trabalho. Vocês mais do que ninguém acreditaram nesse trabalho e me deram base em Cristo para todas as etapas, me mostrando que as dificuldades são para o crescimento e que temos que aprender a viver contentes em Cristo Jesus, que é o meu maior tesouro na vida. Além disso meus familiares paternos, avós Wilson e Lourdes Lorensi, meus tios e primo Edemilson, Josiane e Lucas Lorensi, meus tios Flávio Lorensi e Greicieli Queiroz. Também aos familiares maternos, in memorian meus avós Eva Prestes e Laires Ferreira, aos meus tios Paulo Prestes e Magda Altafini, meu tio Alex Ferreira, tia Magda Naveira, primas Ana Prestes, Letícia Naveira.
Gostaria de agradecer aos profetas enviados por Deus para pregar ao evangelho, Antonio e Marines Perotti e aos irmãos em Cristo Jesus.
Agradeço a Profª Telma Teixeira Franco pela paciência para me ensinar, pela excelente infra-estrutura a mim disponibilizada e pela confiança no decorrer desses anos de trabalho juntas.
Agradeço aos amigos do LEBBPOR, a iniciar por um grande amigo que fiz durante esse período, Renato Sano Coelho, pela parceria nos momentos de risada, que agüentou muito as minhas reclamações, minhas bobeiras, meus choros, que foi um irmão e além de tudo foi praticamente meu co-orientador sempre me sugerindo idéias, me ajudando a dar direção ao meu trabalho, me
ensinando tudo sobre fermentação e improvisação e ter tido muita paciência comigo durante todo esse período juntos.
Agradeço aos amigos de coração que fiz no laboratório, Michelle Abreu também por toda paciência pra me ensinar desde a minha primeira fermentação, e ser essa pessoa tão doce e querida, uma amiga de verdade e ao seu noivo Sérgio Andres pela parceria de sempre. Agradeço também ao Vinicius Borges Maciel que eu considero como um irmão, que me ajudou e esteve sempre comigo quando tive que superar as inúmeras dificuldades que me surgiram pelo caminho, sempre com seu bom humor, suas risadas espalhafatosas e nossos inúmeros almoços que me trouxeram muito conforto e alegrias.
Por fim, agradeço a Jeniffer Andrea Peña, pela paciência em todas as dificuldades que passamos por iniciar esse período praticamente juntas e agora já estarmos conseguindo finalizar. Agradeço a Julia Bratifsch que me ajudou enormemente quando eu tinha milhões de coisas para serem feitas e por ter paciência durante tantos momentos de estresse e cansaço. Agradeço também aos amigos Bianca Ayres, Giovanna Padilha, Andréia Anschau, Érika Marques e Annamaria Vidotti.
Agradeço a uma grande amiga, um anjo que Deus colocou na minha vida em tempos muito difíceis, Suellen Zatti. Quando eu mais precisei ela foi a maior companheira, passamos por mil e uma dificuldades juntas, mas também por muitos momentos de felicidade extrema e companheirismo.
Agradeço ao João Sobreira Oliveira por ter sido um grande amigo, companheiro e ter me dado muito suporte em grande parte desse trabalho. Agradeço a Paula Palsikowski pela amizade e pelos bons momentos vividos em Campinas.
Agradeço as minhas amigas mais distantes de Cascavel, que apesar de estarem longe tenho certeza que estavam sempre torcendo por mim, Ellen Chrun, Jéssica Worm, Fabiana Roncaglio, Juliana Linzmeier, Daniela Teixeira, Jessica Bernart, Graycielle Ramon, Elis Marina, Mayara Scalon.
Agradeço ao grupo Cambada da Dança, principalmente a Iani Santos, Julia Marquesine, Adrielle Cristina, Samuel Daga, Bruno Lopes, Eduardo Pardin, Fabio Augustto. Vocês foram parte essencial da minha vida em
momentos de grande turbulência me trazendo muita alegria e diversão quando eu precisei muito.
Agradeço a grandes amizades que eu fiz na Rhodia, onde dentro de tão pouco tempo conheci pessoas excepcionais que se tornaram extremamente essenciais na minha vida e que tem me dado muito suporte e alegria em dias bons e ruins, Mariana Salvin, Maísa Heluany, Beatriz Uieda, Thuanny Borges e Amanda Costa. Além delas, pessoas que tem se tornado muito especiais pra mim, Guilherme Campos, Thiago Carvalho e Rogério Ramos. Gostaria de agradecer também Paula Delgado e Marie Chauve por toda compreensão e suporte nesse momento difícil que foi o término do mestrado e o início de uma carreira em uma empresa.
Nesse momento, relembrar todas as pessoas que passaram em minha vida em um curto intervalo de tempo é bastante difícil. Gostaria de agradecer muito as pessoas que foram importantes, mas que por um descuido acabei não citando. Sempre, o meu sincero muito obrigada!
RESUMO
Preocupações em relação às mudanças climáticas têm incentivado pesquisas para o uso de diversas biomassas. A biomassa de microalga pode ser fracionada em lipídios, carboidratos e proteínas, e seus carboidratos podem ser utilizados como fonte de carbono para produção de ácido lático. Este trabalho foi dividido em três processos: o primeiro na otimização da produção de biomassa e carboidratos da microalga, o segundo na hidrólise ácida e enzimática dos carboidratos e o terceiro na produção de ácido lático, utilizando o hidrolisado como fonte de carbono. Logo, no primeiro processo foi verificado que o NaNO3 foi o composto que mais influenciou o acúmulo de biomassa e de carboidratos, com 19,3g L-1 e 9,4g L-1, respectivamente, quando cultivada em tubos de ensaio. Quando o cultivo foi em fotobiorreator, a concentração de biomassa foi de 6,0g L-1 com 48,3% de carboidratos totais. No segundo processo foi feita hidrólise enzimática e química da microalga. O melhor rendimento de glicose (25% da biomassa inicial) foi obtido rompendo a célula com sonicador e utilizando duas enzimas associadas, α-amilase e AMG. Na última etapa, o hidrolisado enzimático de microalga foi utilizado como meio de cultivo para B. coagulans162 na produção de ácido lático. Foi possível verificar um elevado crescimento de biomassa e um rápido consumo da glicose, apesar de não haver produção de ácido lático. Portanto, o hidrolisado foi satisfatório para ser substrato na produção de ácido lático, porém verificou-se que o B. coagulans162 encontrava-se muito tempo inativo precisando de outras etapas para melhorar seu desempenho.
ABSTRACT
Concerns related to climate change have developed researches for biomass utilization as feedstock for biofuels and biorefinery. Therefore, microalgae contain different fractions as lipids, carbohydrates and proteins it’s feasible to create a wide range of byproducts and apply the concept of biorefinery. This work was subdivided in three sections: first one to improve microalgae biomass and carbohydrate production, second refers to microalgae biomass hydrolysis and third for lactic acid production by Bacillus coagulans 162. Media culture optimization was proposed as first step in this work to maximize microalgae biomass and carbohydrate production. It has been seen that the main compound that changed this parameters was NaNO3, with 19,39 g L-1 of biomass and 9,40 g L-1 of carbohydrates, when cultivated in test tubes. When the cultivation was done in fotobioreactor, the maximum biomass concentration was 6,0 g L-1 and 48,30% of carbohydrate was accumulated. In a second stage, the microalgae biomass hydrolysis by chemical and enzymatic means was studied. High glucose yield (25,3% from initial biomass) was obtained when enzymatic treatment with α-amilase and amiloglucosidase was used with sonicator pre-treatment. The third stage was B. coagulans cultivation for lactic acid production with microalgae biomass hydrolysate as carbon source. It could be seen a high biomass growth (2,83 g L-1) and fast glucose consumption, despite small amounts of lactic acid was produced.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Oferta interna de energia no Brasil e percentual com base do ano de 2013. 60,6 % Recursos não renováveis (petróleo, gás natural, carvão mineral, urânio); 39,4 % Recursos renováveis (hidráulica, lenha e carvão vegetal, derivados da cana-de-açúcar, entre outros). Fonte: EPE (2014a). ... 18 Figura 2. Vista superior de um raceway de microalgas. A: área superficial; V:
volume do tanque; h: profundidade do raceway; XA: concentração de biomassa na entrada do tanque; XB: concentração de biomassa da saída do tanque. ... 22 Figura 3. Estrutura L(+) e D(-) dos isômeros de ácido lático. Fonte: Martinez, Balciunas et al. (2013). ... 32 Figura 4. Rotas fermentativas da produção de ácido lático.
(A)Heterofermentativa; (B)Homofermentativa. Fonte: MARTINEZ et al. (2013) ... 35 Figura 5. Foto da microalga em microscópio ótico com aumento de 100x. ... 37 Figura 6. Fluxograma da otimização do meio de cultivo subdividido em três
etapas. Primeira etapa com modificação do meio BBM, segunda etapa com modificação na concentração de NaNO3 e terceira etapa com otimização final. ... 39 Figura 7. Cultivo autotrófico da microalga em tubos de ensaio. ... 46 Figura 8. Foto e diagrama do fotobiorreator. 1. Câmara de fotoperíodo; 3. Ponto de amostragem; 4. Sensor de temperatura; 5. Fotobiorreator. Todas as dimensões em mm. ... 47 Figura 9. Enzimas e condições usadas para hidrólise da microalga. ... 53 Figura 10. Fluxograma do processo de produção de ácido lático a partir do
hidrolisado de microalga. ... 58 Figura 11. Fases de crescimento do cultivo de microalga em autotrofia.
Retirado de RICHMOND (2008). ... 60 Figura 12. Curvas de crescimento de biomassa para cultivos da microalga em tubos de ensaio com meio BBM completo. Inóculo transferido para cultivo após 24h (●) e após 48h (●) de crescimento. ... 61
Figura 13. Curva de crescimento de biomassa para cada aumento ou diminuição dos compostos do meio BBM e concentração de carboidratos totais durante a fermentação da microalga em tubos de ensaio. ... 63 Figura 14. Valores máximos de concentração e produtividade de biomassa
obtidos durante a fermentação em tubos de ensaio para a microalga para cada modificação nos compostos do meio BBM estudados. ... 65 Figura 15. Concentração máxima de carboidratos totais obtida durante a
fermentação para BBM original (controle), compostos com a concentração aumentada, compostos com a concentração diminuída. ... 68 Figura 16. Curva de crescimento de biomassa por densidade ótica (●) e gravimetria (●), concentração de carboidratos totais (▲) e concentração de nitrato residual (♦) para microalga em autotrofia cultivada em tubos de ensaio para as concentrações de 0,25 (BBM controle), 2, 4 e 6 g L-1 de NaNO3... 70 Figura 17. Foto do cultivo de microalga em tubos de ensaio após 108 horas de fermentação. ... 72 Figura 18. Fotos do cultivo da microalga em tubos de ensaio com 2 g L-1 e 4 g L-1 de NaNO3 após 144 horas. ... 73 Figura 19. Concentração de biomassa por gravimetria (●) e concentração de carboidratos totais (▲) para o cultivo da microalga em tubos de ensaio com 2 g L-1 NaNO3 + CaCl2, MgSO4, K2HPO4 + KH2PO4, FeSO4. ... 75 Figura 20. Curva de crescimento de biomassa por gravimetria e concentração
de carboidratos totais da microalga para a condição de 2 g L-1 NaNO3 e 0,15 + 0,35 g L-1 K2HPO4 + KH2PO4 e demais componentes na concentração do BBM original. ... 76 Figura 21. Curva de crescimento de biomassa para dois experimentos
(Experimento 1 e Experimento 2) por gravimetria para microalga em fotobiorreator com a melhor condição com 2 g L-1 NaNO3. ... 77 Figura 22. Foto das células de microalga antes e após o rompimento celular com sonicador 100% amplitude durante 15 minutos; (A) biomassa antes de ser levada ao sonicador; (B) vestígios celulares após biomassa sonicada. ... 82
Figura 23. Curva de crescimento de biomassa (●), concentração de glicose (■) e percentual de acidez titulável (▲) para a fermentação do B. coagulans 162 em glicose e no hidrolisado da microalga. ... 85 Figura 24. Comparação entre as curvas de crescimento do B. coagulans 162 cultivado em glicose (●) e no hidrolisado de microalga (●), e os seus respectivos percentuais de acidez titulável: fermentação glicose (♦); fermentação hidrolisado (♦). ... 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Produtividade de biomassa por área para diferentes espécies de microalgas encontradas na literatura para cultivo em raceway. ... 23 Tabela 2. Rendimento de óleo de diversas fontes de biomassa e produtividade de biocombustíveis. ... 24 Tabela 3. Principais resultados obtidos com hidrolisado de microalga na
literatura, condição de hidrólise e produto final obtido com o hidrolisado como meio de cultivo. ... 29 Tabela 4. Composição do meio sintético BBM (pH 6,8) para microalga X. ... 38 Tabela 5. Modificações propostas na concentração do meio BBM na Etapa 1.
Em destaque, o valor das concentrações modificadas e os demais valores de concentração original do meio BBM. ... 41
Tabela 6. Aumento na concentração de NaNO3, aumentando os demais
componentes do meio BBM original proporcionalmente e concentração original do meio BBM. ... 43 Tabela 7. Melhor concentração de NaNO3 mais MgSO4, CaCl2, K2HPO4 + KH2PO4, FeSO4 proporcionais e concentração original do meio BBM. .... 44 Tabela 8. Melhor concentração de NaNO3 mais K2HPO4 + KH2PO4
proporcional, mais demais componentes na concentração original do BBM e concentração original do meio BBM. ... 44 Tabela 9. Condições de temperatura e concentração de H2SO4 utilizadas na
hidrólise ácida da microalga... 51 Tabela 10. Concentração de glicose para as fermentações controle (glicose) e hidrolisado de microalga. ... 54 Tabela 11. Cálculo dos parâmetros cinéticos. ... 56 Tabela 12. Velocidade máxima de crescimento da microalga para cultivo com
meio BBM em tubos de ensaio após transferência de inóculo em 24 h e 48 h. ... 61 Tabela 13. Concentração de biomassa por densidade ótica e gravimetria e
concentração máxima de carboidratos totais para a microalga cultivada em tubos de ensaio com concentrações de 2, 4 e 6 g L-1 NaNO3 e controle (0,25 g L-1). ... 72
Tabela 14. Concentração de biomassa inicial (X0), concentração máxima de
biomassa (Xmax), velocidade máxima de crescimento (µmax) e
produtividade máxima de biomassa (PX,max) para microalga com cultivo em fotobiorreator... 78 Tabela 15. Caracterização de composição da célula da microalga após cultivo em fotobiorreator. ... 78 Tabela 16. Concentração de glicose, percentual de glicose com relação a
biomassa inicial, concentração de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) obtida com adição de 10% H2SO4, modificando a temperatura de hidrólise ácida. ... 80 Tabela 17. Concentração de glicose, percentual de glicose em relação a
biomassa, concentração de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) obtida com modificação na concentração de H2SO4 mantendo a temperatura a 120 °C. ... 81 Tabela 18. Concentração de glicose, percentual de glicose com relação a
biomassa inicial e rendimentos obtidos a partir da hidrólise enzimática com celulase (50°C), α-amilase (80°C) e α-amilase (80°C) mais amiloglucosidase (55°C) (AMG)... 83 Tabela 19. Teor de glicose obtido a partir das hidrólises ácidas e enzimática . 84
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 15 2. OBJETIVOS ... 17 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 18 Microalgas ... 20 Ácido lático ... 30
Bactérias láticas e o Bacillus coagulans ... 33
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 37
4.1. Microrganismo e condições de cultivo ... 37
4.1.1. Mudança na concentração dos compostos do meio BBM ... 38
4.2. Preparo do inóculo para cultivo em tubos de ensaio e em fotobiorreator ... 45
4.3. Cultivo em tubos de ensaio ... 45
4.4. Fotobiorreator ... 46
4.5. Métodos analíticos microalga ... 48
4.5.1. Concentração da biomassa da microalga: ... 48
4.5.2. Determinação da concentração de nitrato residual durante o cultivo da microalga: ... 48
4.5.3. Extração e determinação de lipídios da microalga ... 49
4.5.4. Determinação da concentração de carboidratos totais na biomassa de microalga: ... 49
4.5.5. Determinação de nitrogênio total e proteínas na biomassa da microalga 50 4.6. Hidrólise da microalga ... 50
4.6.1. Hidrólise ácida ... 50
4.6.2. Hidrólise enzimática ... 52
4.7. Cultivo do Bacillus coagulans 162 a partir de hidrolisado de microalga para produção de ácido lático ... 53
4.7.1. Preparo do inóculo ... 53
4.7.2. Fermentação do B. coagulans 162 em shaker ... 54
4.7.3. Métodos analíticos Bacillus coagulans 162 ... 55
4.8. Cálculo dos parâmetros cinéticos ... 56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57
5.1. Microalga: ... 57
5.1.1. Estudo do inóculo ... 59
5.1.2. Modificação do meio de cultivo em tubos de ensaio ... 62
5.1.4. Hidrólise da biomassa da microalga ... 79
5.2. Cultivo B. coagulans 162 para produção de ácido lático ... 84
6. CONCLUSÃO ... 88
15
1. INTRODUÇÃO
As mudanças climáticas e a escassez de energia intensificam as pesquisas para utilização de resíduos para produção de biocombustíveis e biomoléculas de valor agregado. A biomassa de microalga tem sido indicada como uma alternativa de potencial por possuir algumas vantagens como elevada velocidade de crescimento, alta produtividade, alta eficiência fotossintética, diversidade de subprodutos e tolerância a diversas concentrações de CO2, menor requerimento por áreas produtivas, ausência de lignina e muito baixo conteúdo de hemicelulose, capacidade de usar e recuperar nutrientes, usar água salina ou salobra e utilizar CO2 gerado por outras plantas industriais.
Os principais componentes da microalga são os lipídios, os carboidratos e as proteínas. A maior parte das pesquisas com microalgas são relacionadas à produção de ácidos graxos para combustíveis de terceira geração. Porém, as tecnologias atuais não são suficientes para permitir uma produção de grande escala, energética e economicamente favorável, com o combustível líquido como único produto. Uma das soluções para melhorar a sustentabilidade do processo é através do conceito de biorrefinaria que consiste em uma instalação integrada, combinando diversos processos e equipamentos, como em uma refinaria de petróleo.
Algumas microalgas podem conter uma grande quantidade de carboidratos na parede da célula (principalmente na forma de celulose e polissacarídeos solúveis) e também acumulados nos plastídios como material de reserva (principalmente na forma de amido). Esses carboidratos podem ser utilizados como fonte de carbono no cultivo de outros microrganismos, como por exemplo na produção de ácido lático.
Ácido lático, ou ácido 2-hidroxicarboxílico, é um ácido que ocorre naturalmente, não volátil e sem odores. Tem atraído grande atenção devido sua demanda mundial ter aumentado consideravelmente devido seu uso na síntese de polímeros plásticos, como o polilactato (PLA). O PLA pode ser usado em uma grande variedade de aplicações, desde pacotes a fibras e espumas, além de ter aplicações na medicina, como fios para sutura cirúrgica e aplicações cardiovasculares (enxertos), entre outros. Além disso, o ácido lático pode ser aplicado também nas indústrias de alimentos, químicas, cosméticos, têxteis e
16 farmacêuticas e foi considerado um dos 30 potenciais blocos construtores químicos produzidos por biomassa.
A produção de ácido lático pode ser feita por duas rotas, a rota química e a fermentativa. Pela rota química, o método mais comum é baseado na hidrólise da lactonitrila. Porém, uma mistura racêmica de DL-ácido lático é produzida. Já a rota fermentativa oferece vantagens pela utilização de substratos renováveis, baixo consumo de energia, e a produção de ácido lático opticamente puro, quando o microrganismo correto é selecionado. Atualmente, quase todo (90%) ácido lático produzido no mundo vem da rota fermentativa de produção. A fermentação é relativamente rápida, tem alto rendimento e pode levar a um dos dois estereoisômeros de ácido lático, ou a uma mistura racêmica.
O descobrimento de novas cepas que contêm elevadas quantidades de carboidratos é bastante promissor pelo fato de esses carboidratos poderem ser utilizados como fonte de carbono no cultivo de outros microrganismos na produção de ácido lático, por exemplo, aumentando a competitividade e sustentabilidade do processo de cultivo da microalga ao integrar o conceito de biorrefinaria e no cultivo para produção de ácido lático, agregando valor ao que antes seria considerado um resíduo.
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2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo principal otimizar a produção de carboidratos da microalga e utilizar esses carboidratos para produção de ácido lático. Dessa forma, esses objetivos puderam ser subdivididos em:
• Otimização do acúmulo de carboidratos e biomassa durante o cultivo da microalga em autotrofia através da modificação no meio de cultivo;
• Hidrólise da biomassa da microalga utilizando ácido ou enzimas para despolimerização dos polissacarídeos e liberação de monômeros de açúcares; • Utilização do hidrolisado de microalga como fonte de carbono no meio de cultivo
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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A escassez de energia e as mudanças climáticas estão desviando o foco para o desenvolvimento da produção de energia renovável e sustentável (ZHU et al., 2014). Projeções do EIA (2013) apontam que o consumo de energia mundial crescerá 56 % entre 2010 e 2040. Grande parte desse aumento no consumo de energia ocorrerá em países como China, Índia e Brasil.
Da energia utilizada no Brasil em 2013, 59 % provem de recursos não renováveis, como petróleo, carvão mineral e gás natural, indica o EPE (2014a) (Figura 1). O setor de transportes brasileiro é o segundo maior consumidor de energia (31 %). Historicamente a demanda de energia nesse setor cresce acima de 5 % ao ano e em termos ambientais, tem sido responsável por 49% das emissões de dióxido de carbono, correspondente a 209 MtCO2 (EPE, 2014b).
Figura 1. Oferta interna de energia no Brasil e percentual com base do ano de 2013. 60,6 % Recursos não renováveis (petróleo, gás natural, carvão mineral, urânio); 39,4 % Recursos renováveis (hidráulica, lenha e carvão vegetal, derivados da cana-de-açúcar, entre outros). Fonte: EPE (2014a).
Um dos problemas com os combustíveis de petróleo é a sua distribuição desigual no mundo. Esse recurso energético acaba por não ser sustentável, devido aos impactos ambientais, econômicos, de igualdade social e geopolíticos causados
19 pela sua utilização (DEMIRBAS e DEMIRBAS, 2011). Em 2040, segundo o EIA (2013), os combustíveis fósseis continuarão a suprir 80% da energia utilizada. Dentre eles, destaca-se uso o gás natural, que terá aumento do consumo pra cerca de 1,7 % ao ano. Fontes de energias como renovável e nuclear estarão em ascensão, cada uma aumentando 2,5 % por ano. No Brasil, conforme dados do EPE (2014b) estima-se que até 2050 a demanda brasileira total de energia aumente duas vezes. O consumo de recursos não renováveis, como petróleo, carvão mineral e gás natural será de 54,7 %.
Numa análise global, a intensificação das mudanças climáticas (devido ao aumento de concentração dos gases de efeito estufa na atmosfera) provocada por atividades antrópicas decorre principalmente do desmatamento e da queima de combustíveis fósseis como carvão mineral, derivados do petróleo e gás natural (IAB, 2012). Dessa forma, as mudanças climáticas afetam diferentes aspectos da vida humana e do meio-ambiente, requerendo uma gama de soluções para resolvê-las (MATA et al., 2010).
As mudanças climáticas podem causar aumento na frequência e intensidade de catástrofes naturais e perigos criados pelo clima, tais como aumento do nível do mar, ondas de calor, intensas e freqüentes chuvas e intensificação das secas (ZHU et al., 2014). Devido ao gradual esgotamento de recursos fósseis e os problemas citados com relação às mudanças no clima, faz-se necessário explorar fontes alternativas de energia, como a biomassa (GOO et al., 2013).
Uma das definições de biomassa é qualquer material orgânico capaz de armazenar energia solar na forma de energia química (ZHU et al., 2014). Há inúmeros tipos de biomassa para matéria-prima, incluindo plantas terrestres e microalgas aquáticas, que têm sido estudadas para produzir produtos renováveis e substituir os recursos fósseis. (BAHADAR e KHAN, 2013).
A biomassa de microalga tem sido indicada como uma alternativa de potencial robusto aos tradicionais recursos combustíveis devido à sua versatilidade como matéria-prima para uma variedade de biocombustíveis e outros produtos químicos de valor agregado (SOH et al., 2014). Uma forma de agregar valor a biomassa é aplicar na produção bioplásticos. Os plásticos podem ser usados em eletrônicos, produtos para saúde, têxteis, brinquedos, embalagem para alimentos, entre outros (HOTTLE et al., 2013). Aproximadamente 7 % da produção mundial de petróleo é
20 destinada à produção de plásticos (STORZ e VORLOP, 2013). A produção de bioplásticos ainda é pouco significativa, representando apenas 1 % dos 181 milhões de toneladas produzidas de plástico anualmente no mundo, mas há projeções de crescer 20 - 30 % nos próximos anos (MADHAVAN NAMPOOTHIRI et al., 2010).
Microalgas
Alga é um termo que se refere a uma coleção de diversos organismos que realizam fotossíntese e/ou que possuem plastídios (POSTEN e WALTER, 2012). Microalgas são organismos fotossintéticos que podem ser encontrados em ambientes marinhos ou de água doce (DEMIRBAS e DEMIRBAS, 2010). Existem divergências entre os autores com relação à classificação das microalgas. BECKER (1994) considera que os organismos fotossintéticos são agrupados em três categorias distintas: bactérias fotossintéticas, algas e plantas superiores. Bactéria fotossintética realiza fotossíntese sem produção de oxigênio e sua bactério-clorofila é quimicamente distinta da clorofila a, presente nos outros organismos fotossintéticos. Além disso, entre as algas eucarióticas e as bactérias fotossintéticas encontram-se as algas procarióticas azul-esverdeadas, ou cianobactérias, que não possuem clorofila b e, diferentemente das bactérias, realizam fotossíntese com produção de oxigênio. Segundo o autor, esses organismos possuem mais características em comum com as bactérias e, por isso, não utiliza o termo "algas" quando se refere a cianobactérias. Já RICHMOND (2008) utiliza o termo "microalgas" para algas eucarióticas microscópicas assim como para bactérias fotossintéticas oxigênicas, isso é, cianobactérias.
As vantagens que tornam as espécies de microalga potenciais matérias-primas para a produção de biocombustíveis e produtos químicos de alto valor agregado são sua alta velocidade de crescimento, alta produtividade, alta eficiência fotossintética, diversidade de subprodutos e tolerância a diversas concentrações de CO2 (MATA et al., 2010; MARKOU e NERANTZIS, 2013; TORRES et al., 2013; HARISKOS e POSTEN, 2014; SOH et al., 2014). Além disso, devido à sua maior velocidade de crescimento e produtividade de biomassa e/ou óleo quando comparadas com culturas agrícolas convencionais, o requerimento por áreas produtivas é menor em comparação à cultivos como da soja, por exemplo (Tabela 2)
21 (MATA et al., 2010; QUINN et al., 2014). Em comparação aos cultivos de segunda geração as microalgas tem ausência de lignina e muito baixo conteúdo de hemicelulose, portanto pré-tratamentos mais brandos podem ser utilizados (CHEN et al., 2013). As microalgas podem usar e recuperar nutrientes, crescer em condições de mixotrofia, usar água salina ou salobra e utilizar CO2 gerado por outras plantas industriais, como por exemplo, na geração termelétrica de energia ou fontes similares (TORRES et al., 2013; HARISKOS e POSTEN, 2014; SOH et al., 2014).
Microalgas podem ser cultivadas em raceways ou fotobioreatores. Raceways consistem em tanques circulares com um agitador rotativo para misturar a cultura ou longos canais com múltiplas curvas agitados com pás (CARVALHO et al., 2006). São amplamente utilizados porém as maiores limitações são a baixa produtividade volumétrica comparada com fotobiorreatores e alguns fatores externos não podem ser controlados. Perdas por evaporação, mudanças na temperatura, fotoperíodo e variações sazonais estão fora do controle em cultivos abertos e afetam diretamente a produtividade. O maior contribuinte para baixa produtividade é a taxa de transferência de CO2 e a limitação de luz devido ao aumento da densidade do cultivo. Cultivos abertos tendem a contaminar com indesejáveis espécies rapidamente. Ainda assim é considerado como o método mais vantajoso em termos de custos, na produção de biomassa de microalga (RAWAT et al., 2013). Condições climáticas, custo de terra, disponibilidade de água e a seleção de espécie são determinantes nesse tipo de cultivo. Uso de terras não aráveis é a maior vantagem. A manutenção e limpeza são mais fáceis e exigem menos energia do que os fotobiorreatores.
Fotobiorreatores são geralmente usados para produtos com valores agregados, como farmacêuticos. As principais configurações do fotobiorreator são tubulares, verticais ou coluna, placa plana e reatores anulares (RAWAT et al., 2013). Oferecem maiores condições de controle de cultivo e de parâmetros de crescimento (pH, temperatura, agitação, CO2 e O2), evitam evaporação, reduzem perdas de CO2, permitem alcançar maiores densidades ou concentrações celulares, tem maiores produtividades volumétricas, previnem ou minimizam invasões por microrganismos competitivos. As maiores limitações são superaquecimento, incrustações, acúmulo de oxigênio, dificuldades de aumento de escala, elevados preços de construção,
22 operação e de cultivo de biomassa algal, ruptura da célula devido a tensão de cisalhamento e deterioração de material usado para fotoperíodo (MATA et al., 2010).
A avaliação entre qual tipo de sistema utilizar depende de muito fatores, dentre eles a espécie cultivada e o método para avaliar produtividade. Existem parâmetros para avaliar produtividade em unidades de produção de alga, dentre eles a produtividade volumétrica que é produtividade por unidade de volume de reator (g L-1 d-1) e a produtividade por área, que é a produtividade por área cultivada ocupada pelo reator (g m-² d-1) (MATA et al., 2010).
Logo, um parâmetro bastante interessante das microalgas, mais verificado em cultivos em raceways (Figura 2), é o de produtividade por área. Geralmente esse sistema apresenta operação contínua e a velocidade específica de crescimento da microalga é igual a sua taxa de diluição. Dessa forma, a produtividade de por área pode ser obtida pela Equação (01) (POSTEN e WALTER, 2012):
𝑃𝑃𝑋𝑋𝑋𝑋 = 𝜇𝜇𝑋𝑋𝐵𝐵ℎ (01) na qual PXA é a produtividade de biomassa por área (g m-² d-1), μ é a velocidade específica de crescimento (d-1), XB é a concentração de biomassa na saída do raceway (g m-3) e h é a altura do raceway (m).
Figura 2. Vista superior de um raceway de microalgas. A: área superficial; V: volume do tanque; h: profundidade do raceway; XA: concentração de biomassa na entrada do tanque; XB: concentração de biomassa da saída do tanque.
Segundo POSTEN e WALTER (2012) sob condições ótimas, a velocidade específica de crescimento e a concentração de biomassa da microalga em raceway
Xa
Xb
A,V,h
23 geralmente não excedem 0,167 d-1 e 0,5 kg m-3 (0,5 g L-1), respectivamente, com um tempo de duplicação de biomassa de 4 dias. Em locais de clima tropical com temperatura média de 25 °C, a produtividade de biomassa alcança 25 g m-2 d-1. A altura (h) do tanque não deve ser maior que 0,30 m para não haver inibição pela diminuição ou ausência de luz. Cada microalga apresenta um valor de velocidade de crescimento distinto, para cada condição estudada. O crescimento será mais rápido em cultivos mais diluídos devido aos efeitos de penetração da luz no meio. Em cultivos não limitados pela luz e nutrientes, essa velocidade pode vir a ser maior, dependendo da espécie. Uma produtividade de biomassa da microalga Scenedesmus obliquus de 48 g m-² d-¹ após 3 meses foi observada em um cultivo de raceway com área de 20m² (GROBBELAAR, 2000). Para plantas como trigo, centeio, aveia e arroz, a máxima produtividade de biomassa seria de, aproximadamente, 34- 39 g m² d-¹ se o crescimento pudesse ser mantido durante o ano inteiro, porém estes cultivos dependem de condições sazonais, produzindo somente durante um período limitado do ano. As microalgas, por outro lado, podem ser cultivadas por até 90% do ano, em condições ambientais adequadas (POSTEN e WALTER, 2012).
A literatura apresenta valores de produtividade por área de biomassa para microalgas encontrados por diversos autores (Tabela 1).
Tabela 1. Produtividade de biomassa por área para diferentes espécies de microalgas encontradas na literatura para cultivo em raceway.
Espécie de microalga Produtividade por área de
biomassa (g m-2 d-1) Referência
Arthrospira platensis 15 RICHMOND (2008)
Chlorella sp. 20,8 WEISSMAN et al. (1988)
Nannochloropsis sp. 12,5 RICHMOND (2008)
Pleurochrysis carterae 33,7 MOHEIMANI e
BOROWITZKA (2006)
Porphyridium cruentum 20 - 25 RICHMOND (2008)
Scenedesmus obliquus 48 GROBBELAAR (2000)
24 Além disso, também estão presentes na literatura valores de comparação entre rendimento de óleo, e o uso de terra para plantas e microalgas (Tabela 3), ressaltando as vantagens das microalgas.
Tabela 2. Rendimento de óleo de diversas fontes de biomassa e produtividade de biocombustíveis. Cultivo Rendimento óleo (g m-2 d-1) Uso de terra (m² ano-1 kg-1 biodiesel) Milho 0,04 66 Soja 0,11 18 Girassol 0,24 11 Pinhão-manso (Jatropha) 0,47 15 Óleo palma 1,45 2 Microalga (30% óleo, massa) 14,31 0,2 Microalga (70% óleo, massa) 33,38 0,1
Fonte: modificado de ZIOLKOWSKA e SIMON (2014).
Os principais componentes da microalga são os lipídios, os carboidratos e as proteínas. Os lipídios são interessantes por conterem ácidos graxos essenciais que servem como matéria-prima do biodiesel, além de conterem outros ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (PUFAs), que possuem alto valor agregado como omega-3, ácido γ-linoleico, ácido docosahexaenóico (DHA), ácido pentaenóico (EPA), etc. Suas principais aplicações são na indústria alimentícia e farmacêutica (BOROWITZKA, 2013; MARKOU e NERANTZIS, 2013).
Os carboidratos são fontes de energia e de carbono. Em geral, os carboidratos da microalga são amido, glicose, celulose, e diversos tipos de polissacarídeos. Os polissacarídeos extracelulares são especialmente atrativos, do ponto de vista da engenharia de processos, porque a sua recuperação é possível sem necessitar de ruptura celular (HARISKOS e POSTEN, 2014). Eles são principalmente utilizados em indústrias alimentícias, de cosméticos, têxteis e farmacêuticas, como estabilizadores, emulsificantes, lubrificantes, biofloculantes,
25 antioxidante, anticoagulante, anti-inflamatório, antiviral e antitumor (MARKOU e NERANTZIS, 2013; YEN et al., 2013).
Além disso, as microalgas são importantes fontes de vitaminas e pigmentos. Os pigmentos são compostos de alto valor agregado que podem ser usados como aditivos e suplementos alimentares. Podem ser clorofila (como clorofila a, b, c), carotenóides (como β-caroteno, luteína, xantina) ou ficobiliproteínas. Diversas microalgas produzem vitaminas (como E e C) e podem ser aplicadas no setor alimentício e farmacêutico. (MARKOU e NERANTZIS, 2013; BUSI et al., 2014; HARISKOS e POSTEN, 2014).
A maior parte das pesquisas com microalgas são relacionadas à produção de ácidos graxos para combustíveis de terceira geração, por seu conteúdo de óleo superior ao de sementes e frutas terrestres (HARISKOS e POSTEN, 2014). Porém, ainda que o biocombustível de algas pareça promissor, as tecnologias atuais não são suficientes para permitir uma produção de grande escala, energética e economicamente favorável, tendo o combustível líquido como o único produto (MARKOU e NERANTZIS, 2013; SOH et al., 2014). Além disso, algumas recentes avaliações de ciclo de vida (ACV) referentes aos combustíveis de microalga tem provado que grandes entradas de energia são necessárias para produzir os biocombustíveis (biodiesel), especialmente durante o estágio de cultivo e separação da biomassa de microalga. Alguns estudos têm indicado um balanço de energia negativo, indicando que a sustentabilidade dos biocombustíveis de microalga como combustível do futuro ainda é questionável (LAM e LEE, 2012; LAM et al., 2014).
Uma das soluções plausíveis para melhorar a sustentabilidade do processo de produção do biocombustível de microalga, é através do conceito de biorrefinaria integrada, pela produção de diferentes produtos a partir da biomassa de microalga, recuperação da energia e dos nutrientes, e aproveitamento das frações não lipídicas da biomassa (LAM et al., 2014; SOH et al., 2014).
Biorrefinaria consiste em uma instalação integrada, combinando diversos processos e equipamentos, que pode converter biomassa em vários produtos como biocombustíveis, energia e produtos químicos de alto valor agregado, e implica na valorização dos resíduos remanescentes, maximizando o seu valor (JUNG et al., 2013; MARKOU e NERANTZIS, 2013; NURRA et al., 2014).
26 Embora os lipídios sejam considerados os componentes mais valiosos da biomassa de microalga no contexto de processo de biocombustíveis, outros componentes como proteínas e carboidratos também compõem uma grande fração da biomassa (TEMPLETON et al., 2012). Com exceção de alguns compostos que já são produzidos a nível comercial, a maioria dos compostos de alto valor agregado da microalga ainda não estão estabelecidos no mercado ou ainda não são comercializados (MARKOU e NERANTZIS, 2013).
Microalgas como fonte de carboidrato
Carboidratos são os maiores produtos derivados da fotossíntese e do metabolismo de fixação de carbono (ciclo de Calvin) (CHEN et al., 2013). O termo carboidrato refere-se a, ambos, monômeros e polímeros de açúcares e derivativos de açúcares, como ácidos urônicos e amino açúcares (TEMPLETON et al., 2012).
Algumas microalgas podem conter uma grande quantidade de carboidratos na parede da célula (principalmente na forma de celulose e polissacarídeos solúveis) e também acumulados nos plastídios como material de reserva (principalmente na forma de amido) (CHEN et al., 2013; HO, HUANG, et al., 2013a; HO, LI, et al., 2013). Porém a composição e o metabolismo dos carboidratos na microalga são significativamente diferentes de espécie para espécie (CHEN et al., 2013)
As paredes celulares da microalga consistem de uma camada interna e outra externa. A composição das paredes celulares exteriores, varia de espécie para espécie, mas usualmente contém polissacarídeos específicos como pectina, agar e algina (CHEN et al., 2013). Esses polissacarídeos produzidos ao redor das células, em um aspecto fisiológico, podem existir para proteger a célula, reduzindo a penetração de íons desnecessários através da superfície celular (GOO et al., 2013). A camada interior da parece celular da microalga é composta principalmente por celulose e outros materiais, como hemicelulose e glicoproteínas. Para algumas microalgas, os polímeros de glicose produzidos via celulose/amido são o componente predominante na parede celular e de armazenamento (CHEN et al., 2013).
Alguns estudos apresentados na literatura (Tabela 3) retratam o uso das microalgas como fonte de carbono para diversificados meios de cultivo.
27 HO, HUANG, et al. (2013a) realizaram um estudo sobre o aumento da concentração de carboidratos na microalga Chlorella vulgaris FSP-E, para produção de etanol, e encontraram que a espécie pode acumular, sob limitação de nitrogênio, 50,39 % (em massa seca) de carboidratos, e quando hidrolisados, 93,10 % eram convertidos em glicose. A produtividade máxima de biomassa foi de 1,36 g L-1 d-1 e de carboidratos foi de 0,687 g L-1 d-1. Uma concentração de 11,66 g L-1 de etanol foi produzida após 12 horas, com um rendimento teórico de 87,59 %.
TALUKDER et al. (2012) estudou o hidrolisado desengordurado da microalga Nannochloropsis salina para produção de ácido lático e lipídios. O rendimento máximo de açúcares (xilose e glicose) após a hidrólise na biomassa seca foi de 64,3 %, com as condições otimizadas de 5 % (m/v) de ácido sulfúrico à 120 °C por 1 hora. A concentração máxima de ácido lático foi de 10,1 g L-1, com rendimento de 90 %, muito próximo ao encontrado com o meio MRS (96,1 %).
HO, LI, et al. (2013) realizaram o cultivo com Scenedesmus obliquus CNW-N para produção de bioetanol e utilizou duas abordagens para o acúmulo de carboidratos na célula. Quando utilizou-se um meio de cultivo deficiente em nutrientes, o acúmulo de carboidratos foi de 52 % (em massa seca), onde 80,3% desses carboidratos eram glicose. Já quando se utilizou de um cultivo deficiente em nitrogênio, o acúmulo de carboidratos foi de 40,3 %. A produtividade ótima de biomassa da S. obliquus CNW-N foi de 0,681 g L-1 d-1, a produtividade de carboidratos foi de 0,352 g L-1 d-1 e a concentração final de etanol foi de 8,55 g L-1, representando um rendimento teórico de 99,8 %.
Para a produção de maltodextrina, LAM et al. (2014) estudaram o hidrolisado da microalga Chorella vulgaris, após a extração de lipídios. A melhor condição estudada para a hidrólise foi ácido sulfúrico 3 % (v/v) a temperatura de 90 °C por 1 hora. Extraiu-se 18,1 % de lipídios e o hidrolisado restante continha 40,2 % de carboidratos. Um rendimento de 90% de maltodextrina foi obtido.
GAO et al. (2012) estudaram o hidrolisado de microalga na produção de ácido lático e etanol. O hidrolisado da microalga Pseudochoricystis ellipsoidea continha 22 % de carboidratos e 32 % de proteínas. Com a intenção de substituir o extrato de levedura, o hidrolisado foi usado como fonte de nutrientes. Os resultados mostraram que pouco ácido lático foi produzido (10 g L-1) quando apenas o hidrolisado era utilizado e com a suplementação de 3 g L-1 de extrato de levedura, a concentração
28 de ácido lático aumentou para 55 g L-1, muito próximo ao encontrado quando apenas extrato de levedura é utilizado (60 g L-1). Na fermentação de etanol com a levedura Saccharomyces cerevisiae, obteve-se um melhor desempenho. Quando cultivada apenas no hidrolisado, produziu cerca de 40 g L-1, porém nem toda glicose foi consumida. O consumo foi maximizado quando o hidrolisado foi suplementado com 3 g L-1 de extrato de levedura.
29 Tabela 3. Principais resultados obtidos com hidrolisado de microalga na literatura, condição de hidrólise e produto final obtido com o hidrolisado como meio de cultivo.
Microalga
Concentração biomassa
(g L-1)
Limitação Tipo de hidrólise
Conteúdo carboidrato/ proteína (%) Produto final Concentração Rendimento (g L-1 / %) Referência Chlorella vulgaris FSP-E (fonte de carbono) 5,51 Nitrogênio Ácida (H2SO4 1%; autoclave 121°C, 20min) Enzimática (Celulase; β-glucosidase; amilase) 51,3 / 19,63 Bioetanol 11,66 / 87,59 (HO, HUANG, et al., 2013a; b) Nannochloropsis salina (fonte de carbono) - - Ácida (H2SO4 5%; autoclave 120°C; 60min) 64 / - Ácido lático 10,1 / 90,0 (TALUKDER et al., 2012) Scenedesmus obliquus CNW-N (fonte de carbono) 2,58 Nitrogênio Nutrientes Ácida (H2SO4 2%;
autoclave 121°C, 20min) 51,8 / - Bioetanol 8,55 / 99,80
(HO et al., 2010; HO, LI, et al., 2013) Chlorella vulgaris (fonte de carbono) 0,55 - Ácida (H2SO4 3%; 90°C, 60min) 40,2 / - Malto- dextrina - / 90,0 (LAM et al., 2014) Pseudochoricystis ellipsoidea (fonte de nitrogênio) - - Ácida (H2SO4 3M; autoclave 121°C, 20min) 21,77 / 32,96 Ácido lático e Bioetanol 55 / - 40 / - (GAO et al., 2012)
30 Ácido lático
Ácido lático, ou ácido 2-hidroxicarboxílico é um ácido que ocorre naturalmente, e foi descoberto como um xarope marrom impuro no leite azedo pelo químico sueco Carl Wilhelm Scheele em 1780 (WANG et al., 2015). Após nove anos, em meados de 1789, Antoine Lavoisier nomeou esse composto como "acide lactique", iniciando a terminologia pelo nome ácido lático. Até muitos anos mais tarde, cerca de 1857, ainda era considerado como um composto do leite, até que Louis Pasteur postulou o ácido lático como um metabólito de fermentação gerado devido ao envolvimento de microrganismos. Com essa descoberta de Pasteur, um cientista francês chamado Edmond Frémy produziu ácido lático por fermentação e deu início à primeira produção industrial de ácido lático nos Estados Unidos por processo fermentativo, em 1881 (GHAFFAR et al., 2014).
O ácido lático é um ácido orgânico, não volátil e sem odores (REDDY et al., 2008) que tem atraído grande atenção devido ao seu diferente número de propriedades, sendo um produto industrial importante que é usado como precursor de compostos de pequena (propileno glicol) ou grande (polímeros de acrílico) massa molecular. Pode ser aplicado em diversos produtos, mas principalmente nas indústrias de alimentos, químicas, cosméticos, têxteis e farmacêuticas e foi considerado um dos 30 potenciais blocos construtores químicos produzidos por biomassa (NGUYEN et al., 2012; ABDEL-RAHMAN et al., 2013; MARTINEZ et al., 2013; ZHOU et al., 2014).
Além do seu uso tradicional como conservante e agente flavorizante na indústria alimentícia, o ácido lático tem sido usado como agente emulsificante e hidratante pela indústria cosmética. Também é usado na síntese de produtos e processos farmacêuticos e pela indústria de curtumes. Outra aplicação é na síntese de lactato de etila, que é usado como solvente biodegradável. Recentemente, a demanda mundial por ácido lático tem aumentado consideravelmente por causa do seu uso como bloco construtor na síntese de polímeros plásticos, como o polilactato (PLA). O PLA pode ser usado em uma grande variedade de aplicações, desde pacotes a fibras e espumas, além de ter
31 aplicações na medicina, como fios para sutura cirúrgica e aplicações cardiovasculares (enxertos), entre outros (MAZZOLI et al.; ABDEL-RAHMAN et al., 2013; MARTINEZ et al., 2013; WANG et al., 2015).
A produção de ácido lático pode ser feita por duas rotas, a rota química e a fermentativa. Pela rota química, o método mais comum é baseado na hidrólise da lactonitrila. Porém, uma mistura racêmica de DL-ácido lático é produzida (WANG et al., 2015). Por essa rota, o acetaldeído é deixado para reagir em fase líquida sobre altas pressões com cianeto de hidrogênio na presença de uma base, para formar a lactonitrila. Após a recuperação e a purificação por destilação, ácido hidroclórico ou ácido sulfúrico é adicionado para hidrolisar a lactonitrila em ácido lático, o qual é esterificado com metanol para produzir lactato de metila, e este também é recuperado e purificado por destilação. O lactato de metila purificado é finalmente hidrolisado em uma solução aquosa ácida de ácido lático e metanol, e o último é reciclado para o mesmo processo. Outras rotas químicas para a síntese do ácido lático incluem degradação de açúcares por catalisador básico, oxidação do propileno glicol, monóxido de carbono e água a altas temperaturas e pressões, hidrólise do ácido cloropropiônico e oxidação do propileno por ácido nítrico, entre outros (MARTINEZ et al., 2013).
Já a rota fermentativa oferece vantagens pela utilização de substratos renováveis, baixo consumo de energia, e a produção de ácido lático opticamente puro, quando o microrganismo correto é selecionado (ABDEL-RAHMAN et al., 2013). Atualmente, quase todo (90%) ácido lático produzido no mundo vem da rota fermentativa de produção (ABDEL-RAHMAN et al., 2013; GAO e HO, 2013; ZHOU et al., 2014; WANG et al., 2015). A fermentação é relativamente rápida, tem alto rendimentos e pode levar a um dos dois estereoisômeros de ácido lático, ou a uma mistura racêmica. Após a suplementação de nutrientes, soluções de açúcares são inoculadas com o microrganismo produtor, sendo selecionadas também as melhores condições em termos de temperatura, pH, aeração, agitação, os quais variam conforme o microrganismo selecionado (MARTINEZ et al., 2013). A Figura 3 apresenta os dois isômeros ativos o L(+) e o D(-) do ácido lático. Quando os isômeros estão puros eles acabam por ser mais valiosos do que a
32 mistura racêmica DL, porque cada isômero tem sua aplicação industrial específica. L-ácido lático pode ser usado na síntese de poli L-ácido lático (PLLA), um polímero semi-cristalino biodegradável e termoestável que tem um grande mercado potencial em embalagens. PLLA tem grande resistência a tração e pouco alongamento, o que o torna adequado para os produtos médicos usados em fixação ortopédica (pinos, hastes, ligamentos, etc.), aplicações cardiovasculares (microtubos, enxertos, etc.), aplicações dentais, intestinais e suturas. O D-ácido lático é usado na produção de poli D-ácido lático (PDLA) e em elevados níveis é perigoso para saúde humana. A relação LD-ácido lático influência as propriedades e a degradabilidade do PLA (ABDEL-RAHMAN et al., 2011).
Figura 3. Estrutura L(+) e D(-) dos isômeros de ácido lático. Fonte: Martinez, Balciunas et al. (2013).
A demanda mundial de ácido lático em 2007 era estimada em 130 - 150mil toneladas por ano, com um preço comercial de $1,38 por quilograma (50% de pureza) e $1,54 por quilograma (88% de pureza) (ABDEL-RAHMAN et al., 2013; MARTINEZ et al., 2013). Atualmente, a produção mundial de ácido lático é de 300 - 400 mil toneladas por ano, com um preço de mercado de €1,00- 1,20 por quilograma, ou R$3,10 - 3,80 por quilograma (HARMSEN et al., 2014).
A produção de PLA (450 mil toneladas por ano) é ainda muito pequena quando comparada com à produção total de plásticos (181 milhões de toneladas por ano). A produção de PLA é restrita devido aos altos custos de produção, e tem
33 sido mostrado que o custo da matéria-prima no processo fermentativo do ácido lático representa mais de 34% do custo total de manufatura (WANG et al.).
Os custos primários associados com a produção de ácido lático incluem os substratos para fermentação (fontes de nitrogênio e açúcares requeridos para o crescimento da célula) e os processos de recuperação e purificação. Além disso, para produzir alta concentração de ácido lático, o processo de fermentação precisa ter o seu pH controlado entre 5,0 e 7,0, necessitando de grandes quantidades de agentes neutralizantes durante a fermentação, aumentando os custos durante a fermentação e na recuperação do ácido lático no processo de downstream (MADHAVAN NAMPOOTHIRI et al., 2010; ABDEL-RAHMAN et al., 2013; MAZZOLI et al., 2014).
A eficiência do processo de fermentação do ácido lático depende principalmente do microrganismo, do substrato de fermentação e do modo operacional. A maior preocupação na fermentação do ácido lático é reduzir o custo da matéria-prima e melhorar a eficácia da produção. O uso de várias matérias-primas de baixo custo tem sido estudadas para diminuir esses custos e tornar a produção mais viável (ABDEL-RAHMAN et al., 2011; TALUKDER et al., 2012; ABDEL-RAHMAN et al., 2013; IDREES et al., 2013; XU e XU, 2014; ZHANG et al., 2014)
Bactérias láticas e o Bacillus coagulans
As bactérias láticas incluem um grande grupo de bactérias gram-positivas fermentativas, que geralmente não esporulam e não são móveis (MAZZOLI et al.; ABDEL-RAHMAN et al., 2013). Elas existem em plantas, carnes e produtos lácteos, e podem produzir ácido lático como produto da glicólise, com alto rendimento e alta produtividade. Também se caracterizam por crescer em temperaturas tão baixas quanto 5°C ou tão altas quanto 45°C, pH de 3,2 - 9,6 e geralmente requerem nitrogênio, vitaminas e minerais para o seu crescimento e produção de ácido lático (WANG et al.; ABDEL-RAHMAN et al., 2013).
34 As espécies mais comuns são do gênero Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Wisella, Leuconostoc, Streptococcus e Enterococcus (WANG et al., 2015).
Bactérias produtoras de ácido lático fermentam açúcares como hexoses e pentoses, via diferentes caminhos metabólicos que conduzem a homo ou heterofermentações (WANG et al., 2015).
Na homofermentação, o processo ocorre em dois passos. No primeiro, chamado glicólise ou caminho Embden-Meyerhof-Parnas, glicose é transformada em ácido pirúvico. No segundo passo, é reduzido para ácido lático pela redução de energia previamente produzida na forma de NADH. O ácido lático é então obtido da glicose como único produto (Figura 4B).
O processo heterofermentativo é caracterizado pela formação de co-produtos como CO2, etanol e/ou ácido acético, além do ácido lático como produto final da fermentação (Figura 4A). O primeiro passo da degradação da glicose, que é chamado caminho pentose fosfato, leva a gliceraldeído 3-fosfato, acetil-fosfato e CO2. Gliceraldeído 3-fosfato entra na glicólise através do qual é transformado em ácido lático, enquanto o acetil-fosfato é convertido em ácido acético e/ou etanol.
35 Figura 4. Rotas fermentativas da produção de ácido lático. (A)Heterofermentativa; (B)Homofermentativa. Fonte: MARTINEZ et al. (2013)
A maioria dos probióticos estudados e vendidos no mercado são classificados como organismos produtores de ácido lático, incluindo muitas espécies de Lactobacillus (LEE e SALMINEN, 2009). O Bacillus coagulans apesar de sua capacidade de produzir ácido lático, não é considerada uma bactéria ácido-lática. Uma vez que ele exibe características típicas de ambos os gêneros, Lactobacillus e Bacillus, sua posição taxonômica foi exaustivamente discutida. Até 1974, o B. coagulans era classificado como Lactobacillus sporogenes, mas de acordo com a oitava edição do "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", esporos com hastes, produtores de ácido lático, facultativo ou aeróbico e catalase positivo são classificados no gênero Bacillus. Portanto, B. coagulans é uma bactéria Gram positiva, formadora de endoesporo, que possui hastes móveis,
36 podendo ser aeróbica ou microaerófila, Gram negativas quando entrando na fase estacionária de crescimento, ocorrendo isoladamente ou em pequenas cadeias de comprimentos variados (BUCHANAN e GIBBONS, 1974; DRAGO e DE VECCHI, 2009; ENDRES et al., 2009; DE ARRUDA RODRIGUES, 2012).
A literatura apresenta o ótimo desempenho do Bacillus coagulans 162 em fermentações utilizando como substrato hidrolisado de cana-de-açúcar.
DE ARRUDA RODRIGUES (2012) utilizou o Bacillus coagulans 162 na produção de ácido lático a partir do hidrolisado de cana-de-açúcar explodido a vapor. A hidrólise foi feita com ácido sulfúrico 72 % e autoclave por 30 minutos a 121°C. As concentrações de glicose, xilose e arabinose encontradas foram de 100, 19 e 6gL-1, respectivamente. As concentrações de inibidores encontradas, como hidroximetilfurfural e furfural foram maiores que 10 ppm. Um rendimento de produto de 90 % foi obtido, com uma produtividade volumétrica de 0,081 g L-1 h-1. A fermentação finalizou após 11 horas, produzindo predominantemente ácido lático.
XAVIER (2011) utilizou água residual utilizada na lavagem de bagaço de cana-de-açúcar como meio de cultivo para o Bacillus coagulans 162. A composição do meio de cultivo contendo a água de lavagem era 2,1 g L-1 de xilose, 0,08 g L-1 de glicose e 0,04 g L-1 de arabinose, totalizando 2,22 g L-1 de açúcares. A concentração final de ácido lático foi de 1,88 g L-1 com rendimento de 0,85 g g-1 e a máxima produtividade volumétrica de 0,35 g L-1 h-1 atingida após 2 horas de cultivo.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Microrganismo e condições de cultivo
A microalga foi obtida em uma estação de tratamento de efluentes na região de Cosmópolis - SP. É eucariótica, unicelular, circular, possivelmente pertencente ao grupo das Chlorophytas e está em processo de identificação no laboratório de pesquisa do Dr. Armando Augusto Vieira, na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Instituto de Biologia, Departamento de Botânica.
Figura 5. Foto da microalga em microscópio ótico com aumento de 100x.
O cultivo e a manutenção da microalga foi feito em agar inclinado (slant) contendo o meio BBM (STEIN, 1979), descrito na Tabela 4 com 10 g L-1 de glicose e 1,21 g L-1 de NaNO3. Foi mantida a temperatura de 25 °C e pH 6,8.
38 Tabela 4. Composição do meio sintético BBM (pH 6,8) para microalga X.
Componente g L-1 Componente g L-1 Na2EDTA 0,050 Fe2SO4.7H2O 0,00498 KOH 0,003 H2SO4 (uL/L) 1 CaCl2.2H2O 0,025 H3BO3 0,01142 MgSO4.7H2O 0,075 ZnSO4.7H2O 0,00882 K2HPO4 0,075 MnCl2.4H2O 0,00144 KH2PO4 0,175 CuSO4.5H2O 0,00157 NaCl 0,025 Co(NO3)2.6H2O 0,00049 NaNO3 1,21 MoO3 0,00071
4.1.1. Mudança na concentração dos compostos do meio BBM
Para otimização do meio de cultivo da microalga foram realizadas diferentes modificações em três etapas (Figura 6) e a primeira etapa consistiu em modificar todo o meio de cultivo BBM, aumentando e diminuindo a concentração de cada composto (Tabela 5). A partir dessa etapa, verificou-se a necessidade de estudar o composto NaNO3 mais profundamente, devido apresentar grande vantagem em relação aos demais compostos. Logo, a segunda etapa consistiu no estudo da modificação da concentração do NaNO3 (Tabela 6). A partir dos melhores resultados, realizou-se a terceira etapa que foi dividida em duas partes: a primeira parte que consistiu em juntar as melhores concentrações obtidas na primeira (modificação concentração BBM) e na segunda etapa (modificação na concentração de NaNO3) (Tabela 7). A segunda parte consistiu em combinar a melhor concentração de NaNO3 com elevada concentração de KH2PO4 + K2HPO4 e o restante dos compostos na concentração original do BBM (Tabela 8). Cada modificação era definida após realização dos experimentos anteriores, de forma que o número de etapas eram definidos com a necessidade de experimentos mais aprofundados.
39 Figura 6. Fluxograma da otimização do meio de cultivo subdividido em três etapas. Primeira etapa com modificação do meio BBM, segunda etapa com modificação na concentração de NaNO3 e terceira etapa com otimização final.
4.1.1.1. Primeira etapa (Tabela 5): Modificação na concentração dos composto do BBM
Foram propostas modificações na concentração dos componentes do meio de cultivo BBM de forma a otimizar, principalmente, a produção de carboidratos da microalga, mas também a produção de biomassa e a velocidade de crescimento. Para tais testes, foi proposto aumento ou diminuição da concentração de apenas
Modificação BBM Redução concentração todos compostos BBM Aumento concentração todos compostos BBM Modificação NaNO3 2 g L-1NaNO 3 4 g L-1NaNO 3 6 g L-1NaNO 3 Otimização meio 2 g L-1NaNO 3+ KxHxPO4+ BBM concentração original 2 g L-1NaNO 3+ Compostos principais
(MgSO4, CaCl2, KxHxPO4e FeSO4)
1ª Etapa (Tabela 5) 2ª Etapa (Tabela 6) 3ª Etapa (Tabela 7 e 8)
40 um componente por vez do meio de cultivo enquanto os demais eram mantidos na concentração original do meio BBM, conforme Tabela 5.
41 Tabela 5. Modificações propostas na concentração do meio BBM na Etapa 1. Em destaque, o valor das concentrações modificadas e os demais valores de concentração original do meio BBM.
Ensaios Componente
modificado
Concentração dos componentes (g L-1)
NaNO3 K2HPO4 + KH2PO4 CaCl2 MgSO4 NaCl Na2EDTA FeSO4 Metais H3BO3
Ensaio 1 NaNO3 0,1 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 2 2 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 3 CaCl2 0,250 0,250 0,01 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 4 0,250 0,250 0,1 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 5 MgSO4 0,250 0,250 0,025 0,025 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 6 0,250 0,250 0,025 0,15 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 7 K2HPO4 + KH2PO4 0,250 0,025 + 0,075 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 8 0,250 0,25 + 0,75 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 9 NaCl 0,250 0,250 0,025 0,075 0 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 10 0,250 0,250 0,025 0,075 0,1 0,1 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 11 Na2EDTA / KOH 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 12 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,2 0,00498 0,0541 0,115 Ensaio 13 FeSO4 / H2SO4 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,001245 0,0541 0,115 Ensaio 14 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,0996 0,0541 0,115 Ensaio15 Metais 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0 0,115 Ensaio 16 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,1082 0,115 Ensaio 17 H3BO3 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0 Ensaio 18 0,250 0,250 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,23 BBM Original 0,250 0,075 + 0,175 0,025 0,075 0,025 0,1 0,00498 0,0541 0,115
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4.1.1.2. Segunda etapa (Tabela 6): Modificação na concentração
do NaNO3
A partir dos resultados dos testes acima, foram separados os compostos que obtiveram melhor crescimento de biomassa e concentração de açúcares na microalga para serem estudados mais aprofundadamente. Como os experimentos com o NaNO3 obtiveram grande destaque, optou-se por estudá-lo a parte dos demais compostos.
Portanto na segunda etapa, realizou-se o aumento na concentração de NaNO3, aumentando a concentração dos demais componentes do meio BBM original proporcionalmente. Por exemplo, para 2 g L-1 de NaNO3, os demais componentes terão sua concentração aumentadas em duas vezes e assim sucessivamente, conforme apresentado na Tabela 6.
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Tabela 6. Aumento na concentração de NaNO3, aumentando os demais componentes do meio BBM original
proporcionalmente e concentração original do meio BBM.
4.1.1.3. Terceira etapa (Tabela 7 e 8): Otimização final
Novamente, a partir dos melhores resultados obtidos com a modificação na concentração de nitrato, foram realizados mais dois testes. O primeiro com a melhor concentração de NaNO3 (2 g L-1) obtido da segunda etapa mais os componentes do meio BBM que foram escolhidos com os melhores resultados entre os principais parâmetros estudados (biomassa, carboidratos totais) que foram NaNO3, MgSO4, CaCl2, K2HPO4 + KH2PO4 e FeSO4 (Tabela 7). Já o segundo ensaio foi realizado com a melhor concentração de NaNO3 (2 g L-1) mais o K2HPO4 + KH2PO4 com concentração duplicada e os demais componentes na concentração original do meio BBM (Tabela 8).
Concentração dos componentes (g L-1)
NaNO3 K2HPO4 + KH2PO4 CaCl2 MgSO4 NaCl Na2EDTA FeSO4 Metais H3BO3
Modificações NaNO3 2,0 0,15 + 0,35 0,05 0,15 0,05 0,20 0,0099 0,108 0,23 4,0 0,25 + 0,75 0,10 0,30 0,10 0,40 0,0199 0,216 0,46 6,0 0,45 + 1,05 0,15 0,45 0,15 0,60 0,0298 0,324 0,69 BBM Original 0,25 0,075 + 0,175 0,025 0,075 0,025 0,1 0,0049 0,054 0,11
44 Tabela 7. Melhor concentração de NaNO3 mais MgSO4, CaCl2, K2HPO4 + KH2PO4, FeSO4 proporcionais e concentração original do meio BBM.
Concentração dos componentes (g L-1)
NaNO3 K2HPO4 + KH2PO4 CaCl2 MgSO4 NaCl Na2EDTA FeSO4 Metais H3BO3
Componente
modificado 2,0 0,15 + 0,35 0,05 0,15 0 0 0,0099 0 0
Concentração
original BBM 0,25 0,075 + 0,175 0,025 0,075 0,025 0,1 0,0049 0,0541 0,115
Tabela 8. Melhor concentração de NaNO3 mais K2HPO4 + KH2PO4 proporcional, mais demais componentes na concentração original do BBM e concentração original do meio BBM.
Concentração dos componentes (g L-1)
NaNO3 K2HPO4 + KH2PO4 CaCl2 MgSO4 NaCl Na2EDTA FeSO4 Metais H3BO3
Componente
modificado 2 0,15 + 0,35 0,025 0,075 0,025 0,1 0,0049 0,0541 0,115
Concentração