CAMILA DA SILVA FERNANDES SOUZA
SEQUESTRO E TRANSFERÊNCIA DA PROTEÍNA CRY1F
DO MILHO EM SPODOPTERA FRUGIPERDA (J. E. SMITH,
1797) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) E IMPLICAÇÕES
PARA ORGANISMOS NÃO ALVO
LAVRAS-MG
2017
SEQUESTRO E TRANSFERÊNCIA DA PROTEÍNA CRY1F DO MILHO EM
SPODOPTERA FRUGIPERDA (J. E. SMITH, 1797) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
E IMPLICAÇÕES PARA ORGANISMOS NÃO ALVO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Entomologia, área de concentração em Controle Biológico, para a obtenção do título de Mestre.
Professor Doutor Luís Cláudio Paterno Silveira Orientador
Doutora Simone Martins Mendes Coorientadora
Lavras-MG 2017
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Souza, Camila da Silva Fernandes.
Sequestro e transferência da proteína Cry1F do milho em Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) e implicações para organismos não alvo / Camila da Silva
Fernandes Souza. - 2017. 87 p.
Orientador(a): Luís Cláudio Paterno Silveira. Coorientador(a): Simone Martins Mendes.
Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Federal de Lavras, 2017.
Bibliografia.
1. Manejo de resistência de insetos. 2. Controle Biológico. 3. Proteína Cry1F do milho. I. Silveira, Luís Cláudio Paterno. II. Mendes, Simone Martins. III. Título.
SEQUESTRO E TRANSFERÊNCIA DA PROTEÍNA CRY1F DO MILHO EM
SPODOPTERA FRUGIPERDA (J. E. SMITH, 1797) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
E IMPLICAÇÕES PARA ORGANISMOS NÃO ALVO
UPTAKE AND TRANSFER OF CORN PROTEIN CRY1F PROTEIN IN
SPODOPTERA FRUGIPERDA (J. E. SMITH, 1797) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
AND IMPLICATIONS TO NON-TARGET ORGANISMS
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Entomologia, área de concentração em Controle Biológico, para a obtenção do título de Mestre.
Aprovada em 17 de fevereiro de 2017.
Doutor Marcos Antônio Matiello Fadini (UFSJ) Doutora Rosângela Cristina Marucci (UFLA)
Prof. Dr. Luís Cláudio Paterno Silveira Orientador
Doutora Simone Martins Mendes Coorientadora
LAVRAS-MG 2017
A Deus e aos meus pais pelo apoio nos estudos, extrema dedicação e incondicional amor.
Primeiramente a Deus por nunca me abandonar.
A Universidade Federal de Lavras pela oportunidade de ingressar no programa de Pós Graduação em Entomologia.
A Embrapa Milho e Sorgo por ceder suas dependências para realização do trabalho. A Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pela bolsa de mestrado. A Doutora Simone Martins Mendes pela dedicada orientação, importantes oportunidades,
carinho, apoio, valiosos ensinamentos e ajuda de sempre.
Ao Professor Doutor Luís Cláudio Paterno Silveira pela orientação, apoio, confiança, oportunidade e disponibilidade.
Aos Professores Doutores Rosangela Cristina Marucci e Marcos Antônio Matiello Fadini pela presença na banca, contribuindo grandemente com o trabalho.
A Doutora Débora Pires Paula e ao Doutor David Alan Andow pela dedicada e importante ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Ecotoxicologia e Manejo de Insetos da Embrapa Milho e Sorgo, Lorena, Nathália, Michele, Clareana, Caio, Amanda, Camila, Eustáquio, pelas ajudas
experimentais e grandes alegrias no convívio no dia-a-dia de trabalho. Aos meus amados pais Ronaldo e Wania pelo grandioso apoio, e enorme amor. Aos meus irmãos Raphael, Daniel e Bruno pelo grande apoio, carinho e paciência.
Ao meu namorado Thiago pelo carinho, apoio, paciência, dedicação e amor.
A todos os meus amigos pelos momentos de descontração, apoio e carinho. Aos meus amigos do curso de Entomologia Letícia, Tiago, Flavinha, Morango, Fernanda, Kulian, Alexandra,
Dyrson, Diego e Julius pelo apoio, momentos de descontração, companhia e ajuda nos estudos.
Aos colegas, funcionários, professores e pesquisadores da Universidade Federal de Lavras e Embrapa Milho e Sorgo.
Um dos principais problemas da utilização da tecnologia Bt é a capacidade dos insetos alvo evoluírem resistência às proteínas tóxicas, além da possibilidade de risco para os organismos não alvo à tecnologia. Portanto, objetivo deste trabalho foi avaliar a passagem da proteína Cry1F presente no milho Bt para os descendentes de Spodoptera frugiperda, bem como a ação dessa proteína na capacidade e eficiência de predação de Orius insidiosus e Doru
luteipes, avaliando a compatibilidade do uso desses agentes entomófagos para S. frugiperda
resistente à proteína Cry1F. Lagartas neonatas resistentes e suscetíveis à proteína Cry1F foram alimentadas com milho não Bt por dez dias e depois com milho Bt TC1507, que expressa a proteína Cry1F até o final do desenvolvimento da fase larval. Foram analisados quatro tratamentos: 1) Lagartas resistentes à proteína Cry1F com ambos os sexos expostos à mesma proteína, 2) lagartas resistentes à Cry1F com apenas o macho exposto à Cry1F, 3) lagartas resistentes com apenas a fêmea exposta e 4) lagartas suscetíveis não expostos à proteína servindo como tratamento controle. A detecção e quantificação da proteína Cry1F foi realizada através do teste Elisa de acordo com o protocolo do Kit Agdia®. O tempo de busca e capacidade de predação de ovos de S. frugiperda resistentes à proteína Cry1F foram determinados para ninfas de 1º, 3º e 5º ínstar de O. insidiosus e 1º, 3º e 4º de D. luteipes. Para a avalição com lagartas neonatas foram determinados para ninfas de 3º e 5º ínstar de O.
insidiosus e 3º e 4º de D. luteipes. Como testemunha foram utilizados ovos e lagartas de S. frugiperda suscetível à esta proteína. Para determinar o tempo de busca foi utilizado um
cronômetro disparado até a captura da primeira presa e a capacidade de predação através da contagem das presas remanescentes após 24 horas. Para o experimento de avaliação de injúrias foram utilizados o milho TC1507 e o milho convencional isogênico TC1507 como controle, combinando-se o milho Bt ou convencional com cinco lagartas e um predador O.
insidiosus e/ou D. luteipes por planta. As injúrias foram avaliadas 7, 14 e 21 dias após a
infestação de lagartas com escala de injúrias com notas de um a cinco. Verificou-se que as lagartas sequestraram Cry1F expressa no milho Bt e os adultos transferiram para os ovos. Quando ambos os sexos foram expostos à proteína, maior foi a quantidade de proteína detectada nos ovos. A quantidade de Cry1F detectada nos ovos diminuiu quando apenas um dos pais foi exposto. Os predadores não foram capazes de distinguir entre presas resistentes ou suscetíveis nos dois estádios avaliados (ovos e lagartas) considerando o tempo de busca e o consumo. Quanto às injúrias, onde havia a presença dos predadores a nota foi significativamente menor do que na ausência. Assim, na presença dos predadores observaram-se menores injúrias da lagarta mesmo quando essa era resistente à proteína Cry1F, podendo ser, portanto ferramentas para o manejo da resistência desta praga.
GENERAL ABSTRACT
One of the main problems with the use of Bt is the ability of target insects to evolve resistance to toxic proteins, in addition the potential risk to non-target organisms.Therefore the goal of this work was evaluate the transfer of the Cry1F protein present in Bt maize to Spodoptera
frugiperda descendants, as well as this protein action in predation capacity and eficienty of Orius insidiosus e Doru luteipes, assessing the compatibility of these entomophagous agents
use for S. frugiperda resistant to the protein Cry1F. Resistant and susceptible neonates larvae to the protein Cry1F, were fed with non-Bt maize for ten days, and after that with Bt TC1507 ® maize, which expresses the Cry1F protein until the end of the larval development phase. Four treatments were studied a) Resistant larvae to the Cry1F protein with both sex exposed to the same protein, b) Resistant larvae with only the male exposed to Cry1F, c) Resistant larvae with only the female exposed to Cry1F, and g) susceptible larvae non-exposed to the protein, acting as control treatment. Detection and quantification of the Cry1F protein was performed by the Elisa test according to the Agdia® Kit protocol. The search time and capacity of predation of S. frugiperda eggs resistant to Cry1F protein were determined for nymphs of first, third and fifth instars for O. insidiosus and first, third and fourth for D.
luteipes. For the evaluation of neonates were determined for nymphs of third and fifth instars
for O. insidiosus and third and fourth for D. luteipes. As control, eggs and larvae of the susceptible S. frugiperda were used. To determine the search time, a triggered timer was used until the capture of the first prey and the predation capacity by counting the remaining prey after 24 hours. For the injury evaluation experiment, the maize TC1507 and the isogenic conventional maize TC1507 were used as control, matching the Bt or conventional maize with five neonates larvae and one predator O. insidiosus and/or D. luteipes per plant. The injuries were assessed 7, 14 e 21 days after larvae infestation, with scale of injuries with notes from one to five. Larvae were found to uptake Cry1F expressed in Bt maize and transferred it into the eggs. When both parents were exposed to the protein, the amount of protein identified in the eggs was higher. The amount of Cry1F detected in the eggs was smaller when just one parent was exposed. The predators were not able to distinguish between resistant preys or susceptible preys on the two evaluated phases (eggs and larvae) considering search time and consume. As for the injuries, where there was predator presence, the grade was significantly smaller than in the absence. Therefore, the use of predators promoted a decrease of larvae injury even when it was resistant to the Cry1F protein, being, this way, an instrument for resistance pest management.
PRIMEIRA PARTE ... 10 1 INTRODUÇÃO GERAL... 10 2 REFERENCIAL TEÓRICO... 13 2.1 Lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) (J.E Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae)... 13 2.2 Milho Bt... 14 2.3 Resistência de Spodoptera frugiperda a proteína Cry1F... 16 2.4 Predador Orius insidiosus (Say, 1832) (Hemiptera: Anthocoridae).... 18 2.5 O Predador Doru luteipes (Scudder, 1876) (Dermaptera:
Forticulidae... 19 2.6 Transferência Transovariana... 20 2.7
3
Compatibilidade de culturas geneticamente modificadas (Bt) com o controle biológico... CONSIDERAÇÕES FINAIS... 22 26 REFERÊNCIAS... 27 SEGUNDA PARTE-ARTIGOS... 37 ARTIGO 1- SEQUESTRO E TRANSFERÊNCIA DA PROTEÍNA CRY1F ENTRE GERAÇÕES DE SPODOPTERA FRUGIPERDA (SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)... RESUMO... 37 38 ABSTRACT... 39 1 2 INTRODUÇÃO... MATERIAL E MÉTODOS... 40 42 2.1 2.2 2.3 3
Criação de Spodoptera frugiperda... Detecção e quantificação da proteína Cry1F nos ovos de S.
frugiperda... Análises Estatísticas... RESULTADOS... 42 43 44 45 4 DISCUSSÃO... 50 5 CONCLUSÕES... 55 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 56 ARTIGO 2- COMPORTAMENTO DE PREDAÇÃO DE ORIUS
INSIDIOSUS (SAY, 1832) (HEMIPTERA: ANTHOCORIDAE) E DORU LUTEIPES (SCUDDER, 1876) (DERMAPTERA:
FORTICULIDAE) SOBRE LAGARTA-DO-CARTUCHO
RESISTENTE À PROTEÍNA BT CRY1F... RESUMO... 59 60 ABSTRACT... 61 1 INTRODUÇÃO... 62 2 MATERIAL E MÉTODOS... 65 2.1 2.2 2.3 2.4 3
Criação dos insetos... Tempo de busca e capacidade de predação... Injúria causada por S. frugiperda resistentes em milho Bt com e sem predadores... Análises Estatística... RESULTADOS... 65 65 67 68 69 3.1 Tempo de busca e capacidade de predação... 69 3.2 Injúria causada por S. frugiperda resistentes em milho Bt com e sem
4 DISCUSSÃO... 73
5 CONCLUSÕES... 78
6 REFERÊNCIAS... 79
1 INTRODUÇÃO GERAL
Dentre os fatores que contribuem para redução da produção em lavouras de milho, o ataque de pragas é um dos mais importantes. Entre as pragas pertencentes à ordem Lepidoptera, encontra-se a lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), considerada a principal praga da cultura, com potencial de redução da produção em até 34% (CRUZ; MENDES; VIANA, 2012).
A sua alta incidência em várias regiões do país provocou a dependência de inseticidas organo-sintéticos, que foi a principal forma de controle, levando à seleção da resistência à maioria destes produtos químicos até a primeira década desse século (CARVALHO et al., 2013). No entanto, a partir da safra 2008/2009, uma nova estratégia para o manejo integrado de pragas (MIP) com a utilização do milho Bt que, pouco tempo após a liberação, se tornou a principal estratégia de controle no Brasil (STORER et al., 2010, 2012). A proteína tóxica presente no milho transgênico (Bt) é extraída da bactéria Bacillus thuringiensis, que na esporulação produz inclusões de cristais inseticidas que são formadas por proteínas inseticidas chamadas Cry ou Cyt (BRAVO et al., 2011). Estas proteínas tóxicas atuam no tecido epitelial do tubo digestivo dos insetos, causando o desequilíbrio osmótico das células do intestino, reduzindo a alimentação desses insetos e os levando a morte (ALI et al., 2010). No entanto, desde 2014 tem sido registrado um dos principais problemas da utilização da tecnologia Bt que é a capacidade dos insetos alvo evoluírem resistência às proteínas tóxicas, além da possibilidade de atingir organismos não alvo à tecnologia.
No Brasil cultivam-se lavouras Bt durante todo o ano, concomitantemente, ou em áreas adjacentes e com muitas sucessões por ano. Com isto, a expressão contínua de genes cry em plantas transgênicas e com a baixa adesão da área de refúgio, exerce forte pressão de seleção para resistência em populações de pragas alvo (HORIKOSHI et al., 2016a).
Nesse sentido foram relatados casos de resistência de S. frugiperda à proteína Cry1F expressa em milho por Farias et al. (2014) no Brasil, por Storer et al. (2010) em Porto Rico e Huang et al. (2014) nos EUA. É crescente a demanda por estudos com insetos resistentes às proteínas presentes em plantas Bt, para aumentar o nível de compreensão da complexidade da interação com o ambiente, e para subsidiar novas estratégias de manejo de resistência de insetos (MRI) e MIP.
A cultura do milho abriga não somente os insetos-praga, mas também, vários outros insetos benéficos que desempenham importantes funções como inimigos naturais de pragas. A interação entre esses insetos resistentes e o controle biológico pode ser chave para o manejo
de pragas em campo. Portanto, se faz necessário realizar estudos com proteínas presentes no milho Bt em pragas e seus inimigos naturais, para garantir segurança no manejo integrado de pragas.
Predadores e parasitoides podem estar expostos às proteínas Bt expressas em plantas quando se alimentam de herbívoros que podem conter a proteína, ou pelo consumo de pólen ou exsudatos de plantas (LI et al., 2015). Apesar dos diferentes hábitos alimentares e funções ecológicas das espécies que vivem na lavoura do milho e são expostos a proteína, um dos papéis mais importantes é o controle de insetos-praga feito pelos inimigos naturais, sendo a predação uma das interações ecológicas mais importantes na estabilidade do agroecossistema (SCHRIJVER et al., 2016). Os predadores Orius insidiosus (Say, 1832) (Hemiptera: Anthocoridae) e Doru luteipes (Scudder, 1876) (Dermaptera: Forticulidae) ocorrem com frequência na cultura do milho no Brasil, contribuindo para o controle da lagarta-do-cartucho (PICANÇO et al., 2003; SILVEIRA et al., 2003; FIGUEIREDO; DIAS; CRUZ, 2006; MENDES et al., 2012b).
No Brasil, a espécie do gênero Orius mais abundante e de maior potencial para utilização em programas de controle biológico é O. insidiosus. Esta espécie é um voraz predador generalista em todas as suas fases de desenvolvimento. Outro fator que o faz um potencial agente em programas de controle biológico é a facilidade de criação em massa (MENDES et al., 2012a; SILVEIRA; BUENO; VAN LENTEREN, 2004). Na cultura do milho, este predador é atraído por voláteis emitidos pela planta e assim são conduzidos a possíveis locais que tenham ovos dos principais lepidópteros pragas do milho como S.
frugiperda, Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera: Noctuidae) e Diatraea saccharalis
(Fabr, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) o que ajuda no forrageamento e consequentemente na eficiência do controle (ALDRICH et al., 2007).
A tesourinha D. luteipes tem se mostrado um eficiente predador da lagarta-do-cartucho do milho (REIS et al., 1988; CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995; PICANÇO et al., 2003; GUERREIRO et al., 2005; CRUZ, 2007; PASSINI et al., 2010; ARAÚJO et al., 2011). Por ser uma espécie de clima tropical e possuir maior importância no Brasil, é importante que se tenha maiores informações da sua função como inimigo natural da lagarta-do-cartucho em milho Bt.
Mesmo que seja amplamente aceito que as proteínas Cry podem ser transferidas a cadeia trófica (ANDOW; LOVEI; ARPAIA, 2006; ROMEIS; MEISSLE; BIGLER, 2006; PAULA et al., 2016; SCHRIJVER et al., 2016; SHELTON et al., 2016), continua a haver uma grande incerteza sobre como ocorre a transferência. Uma maneira possível que uma presa
pode transferir proteína Cry, é ter esta proteína em seus tecidos corporais (FERRY et al., 2007). Vários insetos da ordem Lepidoptera são capazes de absorverem metabólitos secundários de plantas e transferirem para os ovos como forma de defesa dos inimigos naturais (NAHRSTEDT; DAVIS, 1985; RAUBENHEIMER, 1989). Apesar do maior peso molecular das proteínas Cry em relação a estes metabólitos esta absorção foi provada por Paula et al. (2104) através da passagem transovariana da proteína Bt, para a espécie Chlosyne
lacinia (Geyer, 1837) (Lepidoptera: Nymphalidae), contudo não existem estudos nesse
sentido para S. frugiperda e compreender essa questão pode auxiliar a entender os mecanismos envolvidos na seleção da resistência por essa espécie, além das implicações das interações tróficas que esta passagem pode resultar.
Agentes de controle biológico interagem funcionalmente com culturas GM, mas isso muitas vezes não é facilmente medido, mas são potencialmente importantes para as interações destas tecnologias nos sistemas de manejo integrado de pragas (LUNDGREN et al., 2009). O conhecimento das várias vias através das quais os inimigos naturais estão expostos a estas proteínas podem informar mais seguramente quais os possíveis efeitos deletérios de culturas GM em organismos não alvo. Contudo, estudos dos impactos da proteína para as espécies O.
insidiosus e D. luteipes ainda são incipientes e não retratam a dimensão das interações tróficas
das espécies e as possibilidades da utilização dos predadores como agente de controle biológico no milho, sobretudo diante da possibilidade da proteína passar entre os níveis tróficos.
Agentes de controle biológico podem atrasar o aparecimento da resistência à tecnologia Bt em insetos alvo e prolongar a vida da mesma (LEITE et al., 2014). Identificar e compreender as interações predador-praga e como o milho Bt interage com organismos não alvo através de suas presas é fundamental para avaliar a compatibilidade de controle biológico em culturas GM, oferecendo oportunidades para a integração destas duas estratégias eficazes e sustentáveis no MIP (LUNDGREN et al., 2009).
Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a transferência da proteína Cry1F presente no milho Bt para os descendentes de S. frugiperda, bem como a ação dessa proteína na capacidade e eficiência de predação de O. insidiosus e D. luteipes, avaliando a compatibilidade do uso desses agentes entomófagos com espécimes de S. frugiperda resistentes à proteína Cry1F expressa em milho Bt.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)
Entre as pragas pertencentes á ordem Lepidoptera, a lagarta do cartucho, Spodoptera
frugiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae), é considerada uma praga-chave na cultura do
milho, possui distribuição geográfica generalizada, causando danos durante praticamente todas as fases do seu desenvolvimento (DEQUECH et al., 2013). A lagarta-do-cartucho é um inseto que possui metamorfose completa (holometabolia), passando pelas fases de ovo, larva (lagarta), pupa (crisálida) e adulta. Essa espécie foi identificada como praga do milho em 1797, na Geórgia, Estados Unidos, incialmente nomeada Phalaema frugiperda. Desde então, mudou de nome várias vezes, até a denominação atual (CRUZ, 1995).
O inseto adulto é uma mariposa com aproximadamente de 3,5 cm de comprimento, coloração pardo-escura nas asas anteriores e branco-acinzentada nas posteriores com longevidade de aproximadamente 15 dias (SANTOS et al., 2004). As posturas são feitas em massa, com média de 150 ovos. O período para eclosão das larvas é de aproximadamente três dias.
As larvas recém-eclodidas alimentam-se da própria casca do ovo e, posteriormente das folhas da planta, provocando o sintoma conhecido como “folhas raspadas”, o que é um sintoma da presença da lagarta na cultura. As lagartas passam por cinco ou seis estádios larvais, atingindo 40 a 50 mm de comprimento e 2,7 a 2,78 mm de largura da cápsula cefálica. À medida que as lagartas crescem, começam a fazer orifícios nas folhas, podendo causar severas injúrias às plantas. É comum também o ataque na base da espiga ou nos grãos leitosos (CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995). A duração da fase larval é de 12 a 30 dias. Após este período as lagartas se direcionam para o solo onde passarão à fase de pupa, que dura entre de 10 a 12 dias. O ciclo biológico desse inseto em plantas de milho completa-se em 25 dias à temperatura de 25ºC, aumentando o número de dias quando as temperaturas estão mais baixas (BUSATO; GRUTZMACHER; GARCIA, 2005a; BUSATO; GRUTZMACHER; GARCIA, 2005b).
As perdas no milho podem variar de acordo com a fase de desenvolvimento da planta, onde a infestação ocorre, práticas de cultivo, presença da praga em áreas adjacentes, entre outros (CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995). Condições tropicais de cultivo aliadas a carecterística de grande polifagia da espécie, alta capacidade de reprodução e alta dispersão
do adulto (NAGOSHI; MEAGHER, 2008), favorecem a ocorrência de gerações sobrepostas ao longo do ano, levando a graves infestações em safra agrícola (BERNARDI et al., 2015). Para o manejo da lagarta do cartucho, a presença de inimigos naturais é de extrema relevância para seu controle (FIGUEIREDO; DIAS; CRUZ., 2006). No entanto diversos inseticidas são registrados para o controle da lagarta-do-cartucho, só em milho em 2017, 185 produtos estão registrados (Agrofit, 2017). Com isto para o manejo, devem ser priorizados aqueles seletivos, que não afetem os organismos não alvo (CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995). Para que seja possível a utilização de inimigos naturais para auxiliar no controle, e também o uso de híbridos Bt, para adequar uma estratégia de manejo integrado de pragas, que visa a integração de diferentes métodos de controle com base nos parâmetros econômicos, ecológicos e sociais.
A principal tática de controle de S. frugiperda envolve o uso de híbridos de milho transgênicos que expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt), mas por ter oferta do hospedeiro continuamente faz com que acelere a seleção de populações resistentes aos genótipos Bt (STORER et al., 2010, 2012), um aspecto que está comprometendo a gestão das espécies de pragas e custos de produção. Portanto a correta utilização desta tecnologia, assim como estratégias sustentáveis não poluentes são desejáveis, o manejo só é possível pelo uso conjunto de várias estratégias de controle. Neste contexto, a busca por utilização de métodos de controle combinados tornou-se uma necessidade iminente para manejo integrado de pragas (ANSANTE et al., 2015).
2.2 Milho Bt
A introdução da tecnologia dos transgênicos tem contribuído para uma mudança na redistribuição da importância econômica das espécies-pragas no milho. O alvo das cultivares de milho Bt no Brasil são as lagartas, principalmente a lagarta-do-cartucho (CRUZ; MENDES; VIANA, 2012).
O milho Bt expressa uma ou mais proteínas da bactéria Bacillus thuringiensis. Essas proteínas possuem atividade inseticida contra os insetos alvo e são sintetizadas através dos genes cry, vip e cyt. Atualmente já foram liberados comercialmente no Brasil 37 eventos de milho Bt com tolerância a herbicida e/ou resistência à insetos (Tabela 1 em anexo).
A inserção da toxina se dá de forma rápida e irreversível, levando à formação de poros líticos nas microvilosidades da membrana apical (ARONSON; SHAI, 2001; BRAVO et al., 2007). Posteriormente ocorre a lise celular e, muito provavelmente, resulta na permeabilidade
seletiva de cátions. Ocorre então a ruptura do epitélio do intestino médio, liberando o conteúdo da célula, fornecendo um meio com esporos germinando e como consequência uma septicemia grave (DE MAAGD; BRAVO; CRICKMORE, 2001; BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007) e/ou levando a paralisia do intestino, cessando a alimentação e como consequência a morte por inanição, o que ocorre geralmente após 1-3 dias (ALI et al., 2010).
Como os efeitos potenciais das culturas GM no ambiente e, particularmente, sobre organismos não alvo, são um assunto de grande preocupação, a avaliação de segurança tornou-se obrigatória na maioria dos países onde culturas GM estão registradas para o cultivo (ROMEIS et al., 2011). É necessário monitoramentos e estudos sobre a presença destes organismos como os inimigos naturais em milho Bt (COSTA, 2011).
O primeiro evento de milho transgênico foi liberado para uso comercial no Brasil em 2008 (CTNBio, 2016). Atualmente, culturas de milho Bt são plantadas em aproximadamente 12 milhões de hectares por ano, o que representa mais de 80% da área total do cultivo de milho no Brasil (CÉLERES, 2016). As principais vantagens de sua utilização são redução das perdas causadas por pragas e da aplicação de inseticidas, favorecendo a manutenção de inimigos naturais. Estes auxiliam no controle de pragas e contribuem para retardar a evolução da resistência, além de melhorar a rentabilidade do sistema produtivo, utilizando plantas resistentes a insetos com o máximo de eficiência (LOURENÇÃO; FERNANDES, 2013). Além da facilidade na logística dos tratos culturais, sobretudo em grandes áreas de cultivo. Por outro lado, problemas como a seleção de populações resistentes á tecnologia tem se mostrado como um dos principais problemas ligados ao milho Bt (HORIKOSHI et al., 2016b).No Brasil, cultivares transgênicas de algodão, milho e soja resistentes a pragas e/ou tolerantes a herbicidas são disponibilizadas após longos estudos e testes. A aprovação das culturas GM é feita pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), que é responsável por prestar apoio técnico consultivo ao governo federal na formulação, atualização e implementação da Política Nacional de Biossegurança relativa a organismos geneticamente modificados (OGM) bem como estabelecer normas técnicas de segurança e pareceres técnicos referentes à proteção da saúde humana, dos organismos vivos e do meio ambiente, para atividades que envolvam a construção, experimentação, cultivo, manipulação, transporte, comercialização, consumo, armazenamento, liberação e descarte de OGM e derivados (CNTBio, 2016). As aprovações fazem avaliações caso a caso, isso é importante porque para cada organismo o efeito pode ser diferente, além disso, o mesmo organismo em outro ambiente com grandes variações, o risco pode não ser o mesmo (PIRES; SUJII; FONTES, 2003).
2.3 Resistência de Spodoptera frugiperda a proteína Cry1F
Com a alta adoção de culturas GM, a exposição prolongada a proteínas Bt no campo sem gestão adequada e a falta de adoção da área de refúgio pode levar à resistência em populações de pragas. O risco potencial para a evolução da resistência é alta para S frugiperda porque o sistema de produção no Brasil tem sobreposição temporal e espacial do milho Bt. No campo estas culturas expostas à população de S. frugiperda, a pressão de seleção é intensa em cada geração da praga, aumentando o risco de seleção de indivíduos resistentes (BERNARDI et al., 2014). A resistência é um processo natural na evolução, isto ocorre por características genéticas onde o organismo seleciona a resistência e são capazes de sobreviverem á proteína tóxica expressa na planta e esta característica é transferida para os seus descendentes (BERNARDI et al., 2016). O gene que confere resistência pode estar presente em uma população de insetos, com isto é natural que alguns indivíduos apresentem diferentes reações as proteínas conferindo suscetiblidade ou resistência à determinda proteína devido a forte pressão de seleção imposta no campo, o que aumenta a frequência de indivíduos resistentes ao longo de gerações (TABASHNIK, 2008).
A resistência da S. frugiperda à proteína Cry1F foi verificada no Brasil por Farias et al. (2014), esta proteína está presente no milho TC1507 utilizado no Estados Unidos desde 2003 e no Brasil foi liberado em 2008 e utilizado no campo a partir da safra 2009/2010 pela empresa Dow AgroSciences Industrial Ltda (STORER et al., 2012). A resistência da lagarta-do-cartucho à proteína Cry1F foi verificada também por Storer et al., (2010) em Porto Rico e na região litorânea dos EUA por Huang et al., (2014) onde os autores sugerem que pode ter sido pela migração de populações resistentes de Porto Rico através de outras ilhas do Caribe para a Flórida.
A lagarta-do-cartucho possui grande risco de seleção de resistência devido ao sistema de cultivo no Brasil, a chamada ponte verde, onde são disponíveis diferentes hospedeiros durante a maior parte do ano. Como S. frugiperda além de ser polífaga, tem grande capacidade reprodutiva, e as proteínas presentes nas diferentes culturas muitas vezes são as mesmas, e a baixa adoção da área de refúgio facilita a seleção da resistência no campo (BERNARDI, et al., 2016).
Esta praga não é a única que selecionou a resistência à proteínas Cry. Outros casos já foram registrados como, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte, 1868) (Coleoptera: Chrysomelidae) à proteína Cry3Bb1 no milho, nos EUA (GASSMANN et al., 2011),
algodão, na Índia (DHURUA; GUJAR, 2011), Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera: Noctuidae) à proteína Cry1Ac no algodão nos EUA (ALI; LUTTRELL; YOUNG, 2006), também à mesma proteína na China, a Helicoverpa armigera (Hübner, 1805) (Lepidoptera: Noctuidae), (LIU et al., 2010) e Busseola fusca (Fuller, 1901) (Lepidoptera: Noctuidae) à proteína Cry1Ab no milho, na África do Sul,(VAN RENSBURG, 2007).
Para prolongar a eficácia de culturas Bt como o milho, é essencial desenvolver uma gestão estratégica para atrasar a evolução da resistência de pragas a proteínas Bt. Uma das principais estratégias é a chamada alta dose juntamente com a área de refúgio atrasando a evolução da resistência. Mas para isso, é necessário que a resistência seja recessiva, para que os indivíduos suscetíveis presentes na área de refúgio ao acasalarem com os possíveis raros resistentes na área de plantio de milho Bt, gerem indivíduos suscetíveis, diminuindo a pressão de resistência (CARROLL; HEAD; CAPRIO, 2012; TABASHNIK; BRÉVAULT; CARRIÈRE, 2013).
Outra maneira de manejo de resistência é com a introdução de eventos piramidados que é a combinação de diferentes genes em um só híbrido. As proteínas VIP3A, por exemplo, possuem características importantes como ser resistentes a insetos em que a proteína Cry não faz efeito (ESTRUCH, et al., 1996; HERNÁNDEZ-MARTÍNEZ et al., 2013). Além disso, segundo estudos realizados, possuem sítios de ação diferentes da proteína Cry (LEE et al, 2006; GOUFFON et al, 2011; CHAKROUN; FERRÉ, 2014). Portanto, são interessantes para complementar as proteínas Cry em culturas Bt, ampliar o espectro inseticida e para fins de manejo da resistência.
A evolução da resistência em populações de pragas de insetos alvo pode prejudicar muito os benefícios econômicos e ambientais dos transgênicos Bt (FARIAS et al., 2014). Segundo Lourenção e Fernandes (2013), mesmo mostrando resistência da lagarta-do-cartucho às proteínas Cry1Ab e Cry1F, híbridos expressando essas tecnologias efetuaram controle desta praga, a produtividade foi maior em relação as suas isolinhas e os custos de produção foram semelhantes aos observados em híbridos convencionais sob o manejo com inseticida químico. Como é conhecido, essa espécie possui o que chamamos de haplótipos ou raças (SOUZA et al., 2015). Assim efeito diferenciado dos eventos pode ser esperado em diferentes regiões do país.
A caracterização da resistência de S. frugiperda em Porto Rico mostrou ser autossômica e incompletamente resistente. Os autores sugerem que a resistência foi devido a alterações no sítio de ligação no intestino médio (STORER et al., 2010). A resistência relatada por Farias et al. (2014) no Brasil também mostrou ser autossômica e com resistência
completamente recessiva. Esta diferença pode ser explicada pelos diferentes procedimentos na realização dos bioensaios.
Estudos dos mecanismos de resistência têm sido realizados com diferentes fatores, como diferença no modo de ação de proteínas Cry e ligação das proteínas Cry aos receptores (JURAT-FUENTES et al. 2004; FERRÉ; VAN RIE, 2002). Mutações nos genes receptores das proteínas Cry é a principal forma de resistência em Lepidoptera: Noctuidae (TABASHNIK et al., 2003). No entanto, como existem vários fatores para a evolução da resistência, os estudos sobre os mecanismos de resistência devem ser feitos caso a caso e as estratégias de MRI devem ser adaptadas, uma vez que os efeitos podem variar com a cultura, o ambiente, a proteína presente e a fauna associados a esta cultura (FONTES; PIRES; SUJII, 2003; PETERSON; BEZUIDENHOUT; VAN DEN BERG, 2017).
2.4 Predador Orius insidiosus (Say, 1832) (Hemiptera: Anthocoridae)
A família Anthocoridae (Hemiptera: Heteroptera) possui cerca de 500 espécies. Entre os vários gêneros que compõem esta família, o Orius contém aproximadamente 70 espécies distribuídas mundialmente em diversas culturas. Este gênero é constituído de predadores de pequenos artrópodes como tripes, ácaros, mosca-branca, pulgões e ovos de lepidópteros (BUENO, 2000).
Predadores generalistas são mundialmente conhecidos por sua capacidade de controlar insetos fitófagos e ácaros em muitas culturas cultivadas (SYMONDSON; SUNDERLAND; GREENSTONE, 2002; BIONDI et al., 2012). O predador Orius insidiosus possui alta eficiência de busca, habilidade para aumentar a população e se agregar rapidamente quando a oferta de presas é alta, mas também consegue sobreviver em baixa densidade populacional de pragas porque pode se alimentar também de pólen, e presas alternativas. E mesmo com a presença de flores com pólen, a predação não é diminuída (MOSCARDINI et al., 2013). Este fato se faz importante para sua utilização, pois é capaz de sobreviver e se reproduzir mesmo quando a população de pragas não for alta, e quando for, aumentará sua população controlando a praga (WONG; FRANK, 2013). Portanto estas características os tornam promissores agentes de controle biológico.
No Brasil, a espécie do gênero Orius mais abundante e de maior potencial para utilização em programas de controle biológico é Orius insidiosus (Say, 1832) (Hemiptera: Anthocoridae). Esta espécie é um voraz predador generalista em todas as suas fases de desenvolvimento. Outro fator que faz O. insidiosus um agente utilizável em programas de
controle biológico, é a facilidade de criação em massa (MENDES et al., 2012a; SILVEIRA; BUENO; VAN LENTEREN, 2004). Na cultura do milho, este predador é atraído por voláteis emitidos pela planta e assim são conduzidos a possíveis locais que tenham ovos dos principais lepidópteros pragas do milho S. frugiperda, H. zea e Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera:Crambidae, o que ajuda no forrageamento e consequentemente na eficiência do controle (ALDRICH et al., 2007).
O gênero Orius spp. representa mais de 40% do total de espécies predadoras presente no milho (ALBAJES; LÓPEZ; PONS, 2003). Em um levantamento da incidência de organismos não alvo em milho Bt, Mendes et al. (2009), encontraram o O. insidiosus como um dos predadores mais abundantes. A densidade de Orius spp. foi mais elevada em parcelas de milho Bt, em comparação com suas isolinhas, tal como observado por Pons et al. (2005); Jasinski et al. (2003); Musser; Shelton, (2003); De La Poza et al. (2005). Estes estudos comprovam a alta incidência deste predador na cultura do milho Bt, mostrando ser um importante agente no controle biológico de pragas no cultivo de milho Bt.
As interações ecológicas, incluindo as relações toxicológicas, entre agentes de controle biológico como O. insidiosus e culturas GM como o milho Bt, tornam-se então importantes para as discussões relativas à compatibilidade dessas culturas com as estratégias de MIP. Embora os impactos de campo das culturas GM no controle biológico são difíceis de prever, eles são uma consideração fundamental ao incorporar as culturas GM em sistemas de manejo de pragas juntamente com o controle biológico (LUNDGREN et al., 2009).
2.5 O predador Doru luteipes (Scudder, 1876) (Dermaptera: Forticulidae)
Estudos com o predador Doru luteipes (Scudder, 1876) (Dermaptera: Forticulidae) tem demonstrado que este é um eficiente inimigo natural da lagarta-do-cartucho e outras pragas do milho se alimentando de seus ovos e lagartas pequenas, chegando a comer uma média de 8276 ovos de H. zea ao longo do seu ciclo de vida, aproximadamente 39 ovos por dia, e 3.832 pulgões Schizaphis graminum nos dois primeiros meses de vida (CRUZ, 2007). Uma fêmea de D. luteipes coloca em média 25 ovos, este inseto possui o ciclo de vida longo e a longevidade do adulto pode chegar a até quase um ano (CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995).
O milho possui condições ideais para permanência do predador em campo durante todo o ano em cultivos Bt e não Bt, e sua presença pode deixar o milho fora do nível de dano econômico. Suas posturas são feitas no cartucho e nas espigas, locais onde se encontram os
lepidópteros-praga mais importantes do milho, lagarta-do-cartucho e lagarta-da-espiga, além de proporcionar alimento alternativo como o pólen (FIGUEIREDO; DIAS; CRUZ 2006; PASSINI; PARRA; LOPES, 2007; ARAÚJO, et al., 2011).
Estudos sobre sua biologia foram realizados nas décadas de 80 e 90 (REIS, et al., 1988; CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995). Este tipo de estudo bem como as condições ótimas de criação de um inimigo natural são procedimentos necessários para a utilização em um programa de controle biológico. Entre as temperaturas testadas para criação de D. luteipes a de 25ºc foi a ideal (HONÉK, 1996; PASINI et al., 2010).
Atualmente o milho Bt é o mais utilizado, mas pela seleção de resistência pelos insetos praga, a integralização de diferentes métodos de controle é almejado. O inseticida Triflumurom (24 g i.a. ha-1) foi o mais seletivo para D. luteipes entre os testados por REDOAN et al., (2013), e os inseticidas cholorantraniliprole e etofenprox foram os mais promissores devido a baixa toxicidade para D. luteipes (CAMPOS et al., 2011). Além disso, a ação conjunta de produtos biológicos como bioinseticidas à base de entomopatógenos deve ser fomentada ou o controle biológico através de entomófagos juntamente com cultivos Bt, seriam mais compatíveis com o ambiente e os organismos não alvo. A resistência induzida da planta através da aplicação de silício no milho favoreceu a ocorrência de D. luteipes (ANTUNES et al., 2010). O Baculovírus spodoptera utilizado na cultura do milho juntamente com o predador D. luteipes proporcionaram um bom controle de S. frugiperda, reduzindo o dano foliar (CRUZ et al., 2009).
No entanto, são necessários mais estudos das diferentes formas de interação entre inimigo natural e o milho Bt. A maioria dos trabalhos realizados com milho Bt e o predador
D. luteipes são avaliações da abundância destes predadores em milho Bt comparados com não
Bt (CRUZ; ALVARENGA; FIGUEIREDO, 1995; PICANÇO et al., 2003; FIGUEIREDO; DIAS; CRUZ, 2006; ARAÚJO et al., 2011; FRIZZAS et al., 2014; RESENDE et al., 2016). Assim trabalhos sobre a interação planta-presa-predador, assim como estudos comportamentais deste predador da lagarta-do-cartucho em milho Bt, sobretudo lagartas resistentes para avaliar possíveis impactos são necessários, uma vez que um dos maiores problemas do milho Bt é a seleção da resistência.
2.6 Transferência Transovariana
Os insetos podem sequestrar metabólitos de plantas que se deposita em tecidos ou glândulas do organismo que absorveu este produto. Estes compostos são absorvidos através
da membrana peritrófica do mesêntero, transportados através da hemolinfa e depositados no corpo gorduroso onde formam corpos multivesiculares dentro dos trofócitos. O corpo gorduroso tem a função de sintetizar, armazenar e mobilizar glicogênio, lipídeos e proteínas. (LOCKE; COLLINS, 1968; DUFFEY, 1980; TELFER; KUNKEL, 1991; HEGEDUS et al., 2009). Por exemplo, Utetheisa ornatrix (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Erebidae) sequestra alcaloides de plantas na fase larval e ambos os sexos na fase adulta transferem para os ovos como forma de proteção contra predadores (DUSSOURD, et al., 1988).
Pratissoli, et al. (2004), verificaram que fêmeas de S. frugiperda na fase adulta ao se alimentar de solução contendo o inseticida químico Lufenuron, teve ação transovariana. Afetou consideravelmente a viabilidade de ovos em relação a testemunha. O mesmo foi verificado para Diabrotica speciosa (Germar, 1824) (Coleoptera: Chrysomelidae), quando os casais se alimentaram de folhas de feijão tratadas com Lufenuron apresentaram considerável redução da fecundidade consideravelmente em relação aos casais que não ingeriram o regulador de crescimento. Os autores sugerem que o produto ingerido pela fêmea, foi através da passagem transovariana para o embrião, afetando o seu desenvolvimento e impedindo a eclosão das larvas (ÁVILA; NAKANO, 1999).
Quando a proteína ou o composto ingerido vai da hemolinfa para o corpo gorduroso nos trofócitos, então se dá a passagem para os ovos, uma vez que os trofócitos são células que desempenham função na vitelogenia, neste processo a proteína pode ser depositada nos ovos (CRUZ-LANDIM, 1983; RAIKHEL; LEA, 1986; RAIKHEL; DHADIALLA, 1992).
Apesar das proteínas Cry possuírem maior peso molecular do que normalmente alguns metabólitos de plantas sequestrados por Lepidópteros possuem, esta absorção foi observada por Paula et al. (2014) pela passagem transovariana da proteína Cry1Ac para a espécie
Chlosyne lacinia (Geyer, 1837) (Lepidoptera: Nymphalidae), que é um inseto-praga na
cultura do girassol e não alvo em algodão. Este sequestro foi demonstrado também no predador Harmonia axyridis (Pallas, 1773) (Coleoptera: Coccinellidae) ao se alimentar do pulgão Myzus persicae (Sulzer, 1776) (Hemiptera: Aphididae) que ingeriu a proteína Cry1Ac e Cry1F (PAULA; ANDOW, 2016). Em um trabalho semelhante, foi possível detectar as proteínas Cry1Ac e Cry1Ab em Propylaea japonica (Thunberg) (Coleoptera: Coccinellidae) que se alimentaram de Aphis gossypii (Glover, 1877) (Hemiptera: Aphididae) alimentados com estas proteínas, e a quantidade aumentou à medida que o período de predação foi maior (ZHANG, et al., 2006). Compreender essa questão pode auxiliar a entender os mecanismos envolvidos na seleção da resistência por espécies alvo, além das implicações das interações tróficas que esta passagem pode resultar.
2.7 Compatibilidade de culturas geneticamente modificadas (Bt) com o controle biológico
O interesse mundial em produção agrícola sustentável reforçou a importância da conservação da biodiversidade e do agroecossistema, através da utilização de organismos benéficos para a proteção fitossanitária. (TALEBI; KAVOUSI; SABAHI, 2008; TAVARES; WANG; HOOKS, 2015).
A agricultura causa impacto ambiental pela remoção da vegetação nativa e implementação de outra, simplificando o ambiente. Com isto um dos impactos causados é o surgimento de pragas. Dentre estas, se destacam os insetos, que possuem sucesso habitacional, vivem praticamente em todos os locais e se adaptam facilmente às diversidades ambientais. Portanto, há necessidade de controle de populações de insetos praga de forma eficiente e sustentável (MACHADO, 2009).
Inimigos naturais como predadores e parasitoides fornecem um serviço essencial na conservação do controle biológico de pragas que mantém a estabilidade e resistência dos ecossistemas agrícolas, proporcionando benefícios ambientais, de saúde e econômicos diretos e indiretos para os agricultores e para a sociedade (ZHANG et al, 2007; BIANCHI; BOOIJ; TSCHARNTKE, 2006; ÖSTMAN; EKBOM; BENGTSSON, 2003; STALLMAN; JAMES JR, 2015).
Em um experimento realizado para avaliar os danos causados por S. frugiperda protegida da ação dos inimigos naturais e em situação de livre acesso dos inimigos naturais, FIGUEIREDO; DIAS; CRUZ (2006) verificaram que com a ausência destes organismos o dano foi muito maior, chegando á mais de 50% de perda no rendimento de grãos e 48% de perda de matéria seca, A demanda pública e preferência de consumidores para encontrar soluções com base em controle biológico é um dos principais motivos para o crescimento da utilização de inimigos naturais no controle de pragas (ROMEIS et al., 2008). Contudo, o controle biológico deve ser considerado como um dos pilares de sustentação do MIP. Diante disso, além do controle biológico, outras formas de controle devem ser implementadas. Atualmente a principal forma de controle da lagarta-do-cartucho e outros lepidópteros-praga do milho é através do milho Bt. Diante disto, os efeitos potenciais das culturas GM no ambiente e, particularmente, sobre organismos não alvo, ainda são um assunto de grande preocupação e que deve ser considerada caso a caso. A avaliação de segurança tornou-se obrigatória na maioria dos países onde culturas GM estão registradas para o cultivo (ROMEIS; MEISSLE, 2011). Um organismo não alvo é qualquer indivíduo que possa estar
presente no ambiente da cultura, mas que não tenha a intenção de controlar. Pode ser um inimigo natural, um detritívoro, polinizadores, bem como uma praga secundária da cultura. Isto faz parte da biodiversidade que é de fundamental importância em todas as interações ecológicas, para que o agroecossistema tenha um equilíbrio (FONTES; PIRES; SUJII, 2003).
No entanto, estudar o impacto de culturas GM em organismo não alvo como os inimigos naturais possui uma importância ecológica e econômica pela função que desempenham nas interações tróficas. Portanto, os estudos sobre os potenciais efeitos negativos de plantas Bt em inimigos naturais, foram realizados para avaliar os riscos envolvidos no seu acompanhamento de liberação comercial e pós-mercado (NARANJO, 2009; LOVEI; ANDOW; ARPAIA, 2009). É necessário monitoramentos e estudos sobre a presença destes organismos como os inimigos naturais em plantas Bt (COSTA, 2011). Estes organismos podem ser afetados por culturas GM quando a quantidade, a qualidade ou a adequação nutricional é reduzida. Muitos inimigos naturais necessitam de partes da planta pra suprir suas necessidades nutricionais além das presas, esta é uma forma de exposição direta do organismo não alvo à proteína tóxica expressa na planta, como por exemplo, pólen e néctar. Se o perigo de uma toxina transgênica ou herbicida para um inimigo natural é detectado, então o conhecimento das várias vias através das quais os inimigos naturais estão expostos a estas toxinas podem informar uma avaliação mais precisa dos potenciais efeitos deletérios de culturas GM (HILBECK; SCHMIDT, 2006; ANDOW; LÖVEI; ARPAIA, 2006; SCHRIJVER, et al., 2016).
A avaliação de risco é feita por etapas, primeiramente é realizada em laboratório onde se avalia os efeitos adversos sobre o organismo não alvo. Isto então é estendido para semi-campo para aumentar as condições reais com uma maior complexidade ecológica e reduzindo a generalização, e por fim, em campo para avaliação das consequências dos efeitos adversos (ROMEIS; MEISSLE, 2011). Esse fluxo de estudos preconiza que em testes de laboratório podem ser suficientes desde que não sejam detectados efeitos sobre organismos não alvo em alta dose. (LUNDGREN et al., 2009). Contudo efeitos em campo são possíveis, uma vez que não se estudou o comportamento dos insetos e não se estudou os efeitos sobre a cadeia trófica (Mendes et al., 2012b). Mesmo que a avaliação dos efeitos das proteínas Bt sobre as variáveis biológicas em laboratório e a densidade populacional em campo seja importante, talvez o mais crítico seja os impactos sobre a função do controle biológico como as taxas de predação e parasitismo e efeitos sobre a dinâmica das pragas (TIAN et al., 2015).
Na escolha do inimigo natural a ser estudado neste contexto de risco de culturas GM sobre o organismo, deve-se levar em consideração a importância da espécie na região de
estudo, conhecer bem a espécie alvo para a realização de amostragens e bioensaios corretos, certificar-se de que a proteína realmente está sendo expressa durante o experimento, avaliar variáveis biológicas e comportamentais e comparar com outros métodos de controle como, por exemplo, o químico (PIRES; SUJII; FONTES, 2003).
Duan et al. (2008) elaboraram um banco de dados de 25 estudos de laboratório sobre a abelha, Apis mellifera, e uma meta-análise desses estudos revelaram que Proteínas Bt encontradas em culturas resistentes a lepidópteros e coleópteros não teve nenhum efeito sobre a sobrevivência de larvas ou adultos. Alguns estudos têm afirmado que culturas Bt possuem efeitos negativos sobre importantes inimigos, principalmente os parasitoides, mas muito mais estudos demonstraram que as culturas Bt não prejudicam os inimigos naturais (TIAN et al., 2015). No entanto, os poucos trabalhos que mostram algum efeito negativo da proteína Bt em inimigos naturais, não é considerado impactante em comparação com os efeitos de inseticidas organo-sintéticos especialmente os de amplo espectro. Desta forma culturas GM podem ter um efeito positivo quanto a biodiversidade se integrada com outros métodos de controle alternativo ao controle químico (FONTES; PIRES; SUJII, 2003).
Os inimigos naturais são altamente sensíveis á aplicação de inseticidas organo-sintéticos, e influenciam na composição e abundância de espécies benéficas em agroecossistemas (ZHANG et al., 2007; LU et al., 2012; MARTINOU; SERAPHIDES; STAVRINIDES, 2014). Portanto, a manutenção de insetos benéficos pode ser desafiadora quando se utiliza inseticidas de amplo espectro, além de prejudicar o meio ambiente e os organismos não alvo, há uma dificuldade em atingir principalmente pragas que se encontram nas espigas, colmos e até mesmo dentro do cartucho do milho como a S. frugiperda através de pulverizações (CRUZ et al.,2009).
A maioria dos trabalhos que relatam risco de culturas GM para os inimigos naturais é a menor abundância no campo. Mas isto é em função do menor número de presas e hospedeiros uma vez que a maioria é controlada pela proteína tóxica expressa na planta (ROMEIS et al., 2006). Para avaliação de efeitos diretos é importante avaliar como o organismo vai ser exposto à proteína tóxica, saber os grupos intraguilda que ocorrem na cultura GM e quais são os mais vulneráveis e expostos às proteínas (ROMEIS et al., 2013). Esta abordagem pode ser válida também para plantas transgênicas baseadas em RNA de interferência (RNAi). Para as plantas RNAi, o conhecimento da sequência do genoma específico que seja alvo é uma informação importante para a seleção de espécies através da bioinformática, para estudos de expressões específicas que seja seguro para os organismos não alvo (DILLES et al., 2013; LI et al., 2013).
Diante da seleção de resistência dos insetos alvo à proteínas tóxicas, vários estudos foram feitos com diferentes proteínas em estudos tri-tróficos realizados com herbívoros resistentes e susceptíveis demonstrando não haver efeitos negativos para o inimigos naturais (TIAN et al., 2012; ROMEIS; MCLEAN; SHELTON, 2013; SHELTON et al., 2016). A presença de inimigos naturais pode retardar a resistência de insetos alvo à culturas Bt, uma vez que estes agentes se alimentam de presas resistentes, diminuindo os alelos de resistência da população (LIU et al., 2014).
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As lagartas de S. frugiperda foram capazes de sequestrar a proteína Cry1F e transferir para os ovos (geração F1). Ambos os sexos viabilizaram o sequestro e transferência da proteína para os ovos, mas quando ambos os pais foram expostos à proteína, maior foi a quantidade identificada nos ovos. A quantidade de Cry1F detectada nos ovos não reduziu para os cinco primeiros dias de postura quando ambos os pais foram expostos à toxina, mas reduziu quando apenas um dos pais foi exposto. A quantidade de Cry1F detectada nos ovos foi menor do que na folha. A quantidade de ovos produzida foi maior no tratamento em que ambos os sexos e somente a fêmea foram expostos à Cry1F, comparado a quando somente o macho foi exposto e ao grupo controle, onde as lagartas suscetíveis não foram expostas à proteína Cry1F.
O fato de a lagarta ser resistente não alterou o comportamento de busca e predação de
O. insidiosus e D. luteipes. A capacidade de predação aumentou com o desenvolvimento do
predador. A integração de milho Bt TC1507 com os predadores O. insidiosus e D. luteipes reduz significativamente as injúrias causadas por S. frugiperda, mesmo quando as lagartas são resistentes ao evento. O fato de que quando ambos os sexos quando resistentes transferem maior concentração da proteína para os ovos, mostra que a utilização da área de refúgio e controle biológico pode ser eficiente no manejo da resistência desta lagarta, uma vez que diminuirá a pressão de seleção no embrião quando apenas um dos sexos for resistente. Como ambos os predadores não foram capazes de identificar a proteína nas presas e a nota de injúria foi reduzida na presença deles, estes podem ser utilizados como agentes de manejo de controle e resistência de S. frugiperda.
REFERÊNCIAS
AGROFIT- Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários. Brasília, 2016. Disponível em: <http://extranet.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons> Acesso em 20 de março de 2017.
ALBAJES, R.; LÓPEZ, C.; PONS, X. Predatory fauna in corn fields and response to imidacloprid seed treatment. Journal of Economic Entomology, Lanham, v. 96, n. 6, p. 1805–1813, Dec. 2003.
ALDRICH, J. R. et al. Semiochemical Investigations of the Insidious Flower Bug, Orius
insidiosus (Say). Journal of Chemical Ecology, New York, v. 33, n. 8, p. 1477- 1493, Jun.
2007.
ALI, S. et al. Bacillus thuringiensis and its application in agriculture African. Journal of
Biotechnology, Amsterdam, v. 9, n. 14, Apr. 2010.
ALI, M. I.; LUTTRELL, R. G.; YOUNG, S.Y. Susceptibilities of Helicoverpa zea and
Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) populations to Cry1Ac insecticidal protein.
Journal of Economic Entomology, Lanham, v. 99, n. 1, p. 164- 175, Feb. 2006.
ANDOW, D. A.; LÖVEI, G.L.; ARPAIA, S. Ecological risk assessment for Bt crops. Nature
Biotechnology, New York, v. 24, n. 7 p. 749–751, jul. 2006.
ANSANTE, T. F. et al. Secondary metabolites from Neotropical Annonaceae: Screening, bioguided fractionation, and toxicity to Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Industrial Crops and Products, Amsterdam, v. 74, p. 969–976, Nov. 2015. ANTUNES, C. S. et al. Influência da aplicação de silício na ocorrência de lagartas (Lepidoptera) e de seus inimigos naturais chaves em milho (Zea Mays L.) e em girassol (Helianthus annuus L.). Bioscience Journal, Uberlândia, v. 26, n. 4, p. 619-625, July-Aug. 2010.
ARAÚJO, L. F. de. et al. Flutuação populacional de Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH),
Diatraea saccharalis (Fabricius) e Doru luteipes (Scdder) em milho convencional e
transgênico Bt. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 10, n. 3, p. 205-214, 2011.
ARONSON, A. I.; SHAI, Y.; Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiology Letters, Amsterdam, v. 195, n. 1, p. 1-8, Feb. 2001.
ÁVILA, C. J.; NAKANO, O. Efeito do Regulador de Crescimento Lufenuron na Reprodução de Diabrotica speciosa (Germar) (Coleoptera: Chrysomelidae). Anais da Sociedade
Entomológica do Brasil, Jaboticabal, v. 28, n. 2, p. 293- 299, jun. 1999.
BERNARDI, O. et al. Frequency of resistance to Vip3Aa20 toxin from Bacillus thuringiensis in Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) populations in Brazil. Crop Protection, Guildford, v. 76, p. 7-14, Oct. 2015.
BERNARDI, O. et al. Low susceptibility of Spodoptera cosmioides, Spodoptera eridania and
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) to genetically-modified soybean expressing
Cry1Ac protein. Crop Protection, Guildford, v. 58, p. 33-40, Apr. 2014.
BERNARDI, O. et al. Manejo da resistência de insetos a plantas Bt. In: BERNARDI, O.; BERNARDI, D.; HORIKOSHI, R. J.; OMOTO, C. (Eds.). 1º Ed., 2016, 45 p.
BIANCHI, F.; BOOIJ, C. J. H.; TSCHARNTKE, T. Sustainable pest regulation in agricultural landscapes: a review on landscape composition, biodiversity and natural pest control.
Proceedings of the Royal Society Bioogical Sciences, Washington, v. 273, n. 1595, p. 1595-
1715, Jul. 2006.
BIONDI, A. et al. Using organic certified rather than synthetic pesticides may not be safer for biological control agents: Selectivity and side effects of 14 pesticides on the predator Orius
laevigatus. Chemosphere, Oxford, v. 87, n. 7, p. 803–812, May. 2012.
BRAVO, A. et al. Bacillus thuringiensis: A story of a successful bioinsecticide. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, Oxford, v. 41, n. 7, p. 423-431, Feb. 2011.
BRAVO, A.; GILL, S. S.; SOBERÓN, M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon, Elmsford, v. 49, n. 4, p. 423-435, Mar. 2007.
BUENO, V.H.P. 2000. Desenvolvimento e multiplicação de percevejos predadores do
gênero Orius Wolff, p. 69-90. In: V.H.P. Bueno (ed.), Controle biológico de pragas:
Produção massal e controle de qualidade. Lavras, Editora UFLA, 207p.
BUSATO, G. R.; GRUTZMACHER, A. D.; GARCIA, M. S. Biologia comparada de populações de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) em folhas de milho e arroz. Neotropical Entomology, Londrina, v.34, n.5, Sept-Oct. 2005a.
BUSATO, G. R.; GRUTZMACHER, A. D.; GARCIA, M. S. Exigências térmicas e estimativa do número de gerações dos bióticas ‘milho’ e ‘arroz’ de Spodoptera frigiperda.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.40, n.4, Apr. 2005b.
CAMPOS, M.R. et al. Insecticide selectivity and behavioral response of the earwig Doru
luteipes. Crop Protection, Guildford, v. 30, p. 1535-1540, Aug. 2011.
CARROLL, M. W.; HEAD, G.; CAPRIO, M. When and where a seed mix refuge makes sense for managing insect resistance to Bt plants. Crop Protection, Guildford v. 38, p. 74-79, Aug. 2012.
CARVALHO, R. A. et al. Investigating the molecular mechanisms of organophosphate and pyrethroid resistance in the fall armyworm Spodoptera frugiperda. Plos One, San Francisco, v. 8, n. 4, e62268, Apr. 2013.
CÉLERES, 2016. Segundo Acompanhamento da adoção da biotecnologia agrícola para a
safra 2016/17. Disponível em < http://www.celeres.com.br/>. Acesso em 20 de outubro de
COSTA, M. L. M. Caracterização molecular de genes cyt de cepas de Bacillus
thuringiensis e avaliação da toxicidade de proteínas inseticidas contra Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). 2011. 71 p. Dissertação (mestrado em
Biotecnologia Vegetal)-Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2011.
CRUZ, I. et al. Monitoramento de Parasitoides de Lagartas de Spodoptera frugiperda (J.
E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) em Municípios de Minas Gerais, Brasil. Sete Lagoas:
EMBRAPA/CNPMS, dez. 2009. 33 p. Documentos 92, Embrapa Milho e Sorgo.
CRUZ, I. A lagarta-do-cartucho na cultura do milho. Sete Lagoas: EMBRAPA/CNPMS, nov. 1995. 45 p. Circular Técnica 21, Embrapa Milho e Sorgo.
CRUZ, I. Controle Biológico de pragas na cultura de milho na produção de conservas
(mini-milho), por meio de parasitoides e predadores. Ago. 2007. 16 p. Circular Técnica 91,
Embrapa Milho e Sorgo.
CRUZ, I; ALVARENGA, C. D; FIGUEIREDO, P. E. F. Biologia de Doru luteipes (Scudder) e sua capacidade predatória de ovos de Helicoverpa zea (Boddie). Anais da sociedade
entomológica do Brasil, Jaboticabal, v. 24, n. 2, p. 273-278, May. 1995.
CRUZ, I.; MENDES, S. M.; VIANA, P. A. Importância econômica e manejo de insetos
sugadores associados à parte aérea de plantas de milho Bt. Circular técnica 175. Sete
Lagoas, MG, Dezembro, 2012. ISSN 1679-1150.
CRUZ-LANDIM, C. O corpo gorduroso da larva de Melipona quadrifasciata anthidioides LEP (Apida, Meliponinae). Naturalia, São Paulo, v.8, [S.I.], p.7-23, 1983.
CTNBio - Conselho Técnico Nacional de Biossegurança. Disponível em < http://www.ctnbio.gov.br/>. Acesso em 20 de março de 2017.
DE LA POZA, M. et al. Impact of farm-scale Bt maize on abundance of predatory arthropods in Spain. Crop Protection, Guildford, v. 24, n. 7, p. 677–684, Jul. 2005.
DE MAAGD, R. A.; BRAVO, A.; CRICKMORE, N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends in Genetics, Amsterdam, v. 17, n. 4, p. 193-199, Apr. 2001.
DEQUECH, S. T. B. et al. Population fluctuation of Spodoptera frugiperda eggs and natural parasitism by Trichogramma in maize. Acta Scientiarum Agronomy, Maringá, v. 35, n. 3, p. 295–300, July-Sept. 2013.
DHURUA, S.; GUJAR, G. T. Field-evolved resistance to Bt toxin Cry1Ac in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella (Saunders) (Lepidoptera: Gelechiidae), from India. Pest
Management Science, Sussex, v. 67, n. 8, p. 898-903, Mar. 2011.
DILLIES, M. A. et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Briefings in bioinformatics, London, v. 14, n. 6, p. 671- 683, Nov. 2013.
DUAN, J.J. et al. A meta-analysis of effects of Bt crops on honey bees (Hymenoptera: Apidae). PLoS One, San Francisco, v. 3, n. 1, e1415, Jan. 2008.
DUFFEY, S. S. Sequestration of plant natural products by insects. Annual Review of
Entomology, Stanford, v. 25, p. 447-477, 1980.
DUSSOURD, D. E. et al. Biparental defensive endowment of eggs with acquired plant alkaloid in the moth Utetheisa ornatrix. PNAS, Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA, Washington, v. 85, n. 16, p. 5992-5996, Aug. 1988.
ESTRUCH J. J. et al. Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proceeding of the National
Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 93, n. 11, p. 5389–
5394, May. 1996.
FARIAS, J. R. et al. Field-evolved resistance to Cry1F maize by Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Crop Protection, Guildford, v. 64, n. 0261-2194, p.150-158, June 2014.
FERRÉ, J.; VAN RIE, J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus
thuringiensis. Annual Review of Entomology, Stanford, v. 47, p. 501-533, Jan. 2002.
FERRY, N. et al. Bitrophic and tritrophic effects of Bt Cry3A transgenic potato on beneficial, non-target, beetles. Transgenic Research, London, v. 16, n. 6, p. 795–812, Dec. 2007.
FIGUEIREDO, M.L.C.; DIAS, A.M.P.M.; CRUZ, I. Associação entre inimigos naturais e
Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) na cultura do milho.
Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 5, n. 3, p. 340-350, dez. 2006.
FONTES, E. M. G.; PIRES, C. S. S.; SUJI, E. R.; O impacto de plantas geneticamente
modificadas resistentes a insetos sobre a biodiversidade. In: PIRES, C. S. S.; FONTES, E.
M. G.; SUJI, E. R. (Eds.). Impacto ecológico de plantas geneticamente modificadas- O algodão resistente a insetos como estudo de caso. 1º Ed., 2003. P. 65-83.
FRIZZAS, M. R. et al. Milho geneticamente modificado e sua ação sobre a lagarta-do-cartucho e tesourinha em condições de campo. Ciência Rural, Santa Maria, v. 44, n. 2, p. 203-209, fev. 2014.
GASSMANN, A. J. et al. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.
Plos One, San Francisco, v. 6, n. 7, e22629, Jul. 2011.
GUERREIRO, J. C. et al. Distribuição espacial do predador Doru luteipes (Scudder, 1876) (Dermaptera: Forficulidae) na cultura do milho. Revista científica eletrônica de agronomia, Garça, v. 4, n. 7, p. 1-11, jun. 2005.
GOUFFON, C. et al. Binding sites for Bacillus thuringiensis Cry2Ae toxin on heliothine brush border membrane vesicles are not shared with Cry1A, Cry1F, or Vip3A toxin. Applied
