UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
HELON GUIMARÃES CORDEIRO
ANÁLISE DA RESPONSIVIDADE DE CÉLULAS DE CÂNCER
COLORRETAL AO VEMURAFENIBE E INFLUÊNCIA EM PROTEÍNAS
FOSFATASES E VIAS DE SINALIZAÇÃO DO TGF BETA E NOTCH1
CAMPINAS
2019
ANÁLISE DA RESPONSIVIDADE DE CÉLULAS DE CÂNCER
COLORRETAL AO VEMURAFENIBE E INFLUÊNCIA EM PROTEÍNAS
FOSFATASES E VIAS DE SINALIZAÇÃO DO TGF BETA E NOTCH1
Orientadora:
Prof
a. Dr
a. CARMEN VERÍSSIMA FERREIRA HALDER
CAMPINAS
2019
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular na área de Bioquímica.
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO HELON
GUIMARÃES CORDEIRO E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CARMEN VERÍSSIMA FERREIRA HALDER.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof
aDr
a. Carmen Veríssima Ferreira Halder
Prof. Dr. Rodrigo Augusto da Silva
Prof. Dr. Leandro Henrique de Paula Assis
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a
Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida
Dedico este trabalho aos meus queridos e amados familiares. Aos meus pais, Irene e Geraldo (in memoriam), às minhas irmãs Geórgia e Amanda, e ao meu irmão Dênio. O amor, o carinho e a compreensão de vocês foram muito importantes para a concretização deste trabalho.
Primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por sempre me conceder energia para a busca dos meus ideais.
À minha família, Irene, Geraldo (in memoriam), Geórgia, Amanda e Dênio, que mesmo a longas distâncias, sempre me concedeu carinho e apoio nos momentos mais dolorosos. Agradeço encarecidamente a compreensão de vocês pelas inúmeras vezes em que estive ausente das reuniões familiares.
À minha orientadora, Dra. Carmen Veríssima Ferreira, muito obrigado pelas críticas,
pela confiança, pela amizade e pela orientação no decorrer deste trabalho. As suas críticas e sugestões foram imprescindíveis para a minha formação e para aperfeiçoar este trabalho.
Aos técnicos, Luís Ribeiro e Claudia Soraggi, por todo o apoio técnico concedido para a execução deste trabalho, pelas conversas compartilhadas e pelo companheirismo durante estes dois anos.
Agradeço o doutorando Célio Fernandes e o seu orientador Prof. Dr. Willian da UNESP de Botucatu por terem colaborado com a metodologia da PCR Real Time.
Aos amigos do laboratório Oncobiomarkers, Inês, Patrícia, Érika, Alessandra, Stefano, Emanuela, Maruska, muito obrigado pelo companheirismo e pelas críticas com o trabalho, que foram muito úteis para o meu aperfeiçoamento.
Aos amigos da República, especialmente Robert e Daimer, muito obrigado pelas conversas compartilhadas, pelo companheirismo e por todos os conselhos dados durante a minha trajetória no mestrado. Vocês tornaram minha segunda família.
Aos amigos de Divinópolis, Frederico Bruzzi, João Maurício, Miguel Lopes, Célio, João Paulo Vasconcelos, Marco Túlio, Vinicius Pimenta, Miguel Vitor, Rita Fernandes, Robert Fernandes, muito obrigado pela amizade, pelo companheirismo e por todo apoio concedido nesta luta rumo ao mestrado.
Às amigas, Flávia Tonelli e Fernanda Tonelli, por todo o companheirismo, conversas compartilhadas e por todo o carinho em que sempre me recebera em minhas visitas a Divinópolis. Tudo isso tornou a caminhada do mestrado mais prazerosa.
uma grande inspiração para a minha vida.
Aos técnicos do laboratório multiusuário, Fabiana, Emerielle e Cláudio, muito obrigado por toda a assistência técnica oferecida no fotodocumentador, que foram essenciais para a realização do Western Blotting.
Aos amigos da pós-graduação, Victória Sodré, Nathália Vilela, Leandro Assis, Vinicius Londe, Cristiane Santos, Lucas Rosa, Gabriela Seabra, Caroline Dal Pozzo, Marriam Khalid, Sara Araújo, Diego Rocha, muito obrigado pelas conversas compartilhadas, por todo carinho e pela compreensão nos momentos mais necessitados.
Aos docentes, Cristina Pontes Vicente, Marcelo Bispo de Jesus e Helena Barbosa, por todas as críticas e sugestões oferecidas no exame de qualificação, que permitiram aperfeiçoar este trabalho e também por terem contribuído para a minha formação de mestre.
A todos os outros docentes do programa de pós-graduação em Biologia Funcional e Molecular, Hiroshi Ayoma, Claudio Werneck, André Damásio, Leonardo Silveira, Carlos Francisco Sampaio Bonafé e Eduardo Galembeck, que contribuíram imensuravelmente para minha formação com as suas aulas e também com todas as sugestões oferecidas.
Ao laboratório ONCOBIOMARKERS, pela infraestrutura e por todos os reagentes oferecidos para a execução dos experimentos.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Ao CNPq, agradeço imensamente pela bolsa oferecida durante estes dois anos, número do processo
131738/2017-8,
que foi muito importante para o meu amparo em Campinas.À UNICAMP, muito obrigado pela infraestrutura fornecida, por todas as assistências oferecidas e por todos os recursos oferecidos para minha formação. Sinto muito orgulho de ter realizado o meu mestrado neste lugar.
"Deus criou para cada um seu próprio dom. Junto com cada talento uma unção. Para uns a força, a astúcia, a fama e o poder. Para outros deu a inquietude do saber".
O Câncer Colorretal (CRC-do inglês, Colorectal Cancer) é frequentemente diagnosticado e apresenta altas taxas de mortalidade, tanto no Brasil quanto no mundo. Mesmo com os avanços nas últimas décadas, o tratamento do CRC ainda é desafiador: a) muitos pacientes são diagnosticados em fase avançada, o que compromete a eficácia do tratamento; b) muitos pacientes apresentam resistência aos quimioterápicos, que compromete o sucesso do tratamento; c) a maioria dos quimioterápicos empregado nos protocolos terapêuticos atuais causa efeitos colaterais, que compromete a qualidade de vida dos pacientes. Sendo assim, a identificaçao de fármacos que possam diminuir a proliferação e sobrevivência de células de CRC é altamente desejável. Portanto, a estratégia inicial desse estudo foi rastrear a resposta de duas linhagens de células de CRC (HT29 e HCT116) frente a biomoléculas (Erlotinibe, Ciclopamina, Imatinibe, Vemurafenibe e Calix[6]areno) que comprovadamente tem propriedade antitumoral. De forma interessante, o Vemurafenibe foi eficiente em diminuir a viabilidade de ambas linhagens (IC50 = 2,5µM para HT29 e 25µM para HCT116). Como esperado, a HT29 (mutada em BRAF) foi mais sensível a esse fármaco, cujo alvo principal é a BRAF. Em seguida, um elenco de mediadores importantes para a agressividade do CRC foi avaliado, após o tratamento das células com o Vemurafenibe. É digno de nota que, proteínas quinases downstreams à BRAF: MEK e ERK foram inibidas com o tratamento da HT29 a partir da concentração de 0,25µM e 1µM, respectivamente. No entanto, as células HCT116 tiveram ativação dessas quinases, apesar da diminuição da viabilidade. Diante disso, foram analisadas proteínas fosfatases e proteínas das vias do TGFbeta e Notch, as quais apresentam papel importante na agressividade do CRC e a influencia do Vemurafenibe nessas proteínas ainda não tinha sido relatado na literatura. As análises por Western Blotting demonstraram que o tratamento com o Vemurafenibe diminuiu a expressão da LMWPTP, CDC25A e inibiu a atividade das fosfatases PTP1B, SHP2 e PP2A. Ademais, foi observado inibição da via de sinalização disparada pelo TGFβ e diminuição da expressão da NOTCH1. Dessa forma, o presente estudo mostra que o Vemurafenibe também pode ter efeito em células de CRC não mutadas em BRAF e que em parte, a atividade antitumoral do Vemurafenibe também pode ser devido à inibição de proteínas fosfatases. Esses achados indicam o potencial da introdução do Vemurafenibe em protocolos terapêuticos do câncer de colorretal.
Palavras Chaves: Câncer Colorretal (CRC), Vemurafenibe, Fosfatases, Notch e TGFβ.
Colorectal cancer (CRC) is often diagnosed and presents high mortality rates, both in Brazil and worldwide. Even with advances in the last decades, CRC treatment still face many challenges: a) many patients are diagnosed at an advanced stage, which compromises treatment efficacy; b) many patients present resistance to chemotherapy, which compromises the success of the treatment; c) many chemotherapeutics used in current therapeutic protocols cause many side effects, which compromise patients' quality of life. Thus, the identification of drugs that may decrease the proliferation and survival of CRC cells is highly desirable. Therefore, the initial strategy of this study was to track the response of two CRC cell lines (HT29 and HCT116) to biomolecules (Erlotinib, Cyclopamine, Imatinib, Vemurafenib and Calix[6]arene) that have been shown to display antitumor properties. Interestingly, Vemurafenib was effective in decreasing the viability of both cell lines (IC50 = 2.5 μM for HT29 and 25 μM for HCT116). As expected, HT29 (mutated in BRAF) was more sensitive to this drug, whose main target is Braf. Next, a set of important mediators for CRC aggressiveness were evaluated after treatment of the cells with Vemurafenib. It is noteworthy that, protein kinases downstreams to BRAF: MEK and ERK were inhibited with the treatment of HT29 at the concentration of 0.25 μM and 1 μM, respectively, however, HCT116 cells had activation of these kinases, despite the diminishion of viability. Next, protein phosphatases and TGFbeta and Notch proteins which play an important role in the aggressiveness of CRC, were investigated. The influence of vemurafenib in these proteins has not yet been reported. Western Blotting analyzes demonstrated that treatment with Vemurafenib decreased the expression of LMWPTP, CDC25A and inhibited the activity of PTP1B, SHP2 and PP2A phosphatases. In addition, inhibition of the signaling pathway triggered by TGFβ and decreased expression of NOTCH1 was observed. Thus, the present study shows that Vemurafenib can also have an effect on CRC cells not mutated in Braf and the antitumor activity of Vemurafenib, in part, may also be due to the inhibition of protein phosphatases. These findings indicate the potential of the introduction of Vemurafenib in therapeutic protocols of colorectal cancer.
Figura 1: Estrutura molecular do Vemurafenibe...23
Figura 2: Esquema da transdução de sinal envolvendo a proteína BRAF...24
Figura 3: Representação esquemática da via do TGFβ...34
Figura 4: Esquema representativo da via Notch...37
Figura 5: Esquema das sequencias metodológicas empregadas neste trabalho...42
Figura 6:Estruturas moleculares dos fármacos/compostos...52
Figura 7: Análise da viabilidade das células HT29 por redução do MTT...53
Figura 8: Efeito do Vemurafenibe em células HT29...54
Figura 9: Efeito do Vemurafenibe em células HCT116...55
Figura 10: Análise das proteínas quinases da via BRAF em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...57
Figura 11: Análise das proteínas quinases da via BRAF em células HCT116 tratadas com o Vemurafenibe...58
Figura 12: Análise das PTPs em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...59
Figura 13: Análise das PTPs em células HCT116...60
Figura 14: Análise da expressão gênica das PTPs (LMWPTP e PTP1B) em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...62
Figura 15: Análise de fosfatases em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe....64
Figura 16: Análise da expressão gênica do TGFβ em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...66
Figura 17: Análise da via do TGFβ em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...66
Figura 18: Análise da expressão gênica das NOTCHs em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...68
Tabela 1: Características das células utilizadas neste trabalho...38 Tabela 2: Concentrações dos compostos e fármacos nos tratamentos das células HT29 e HCT116...42 Tabela 3: Concentrações do Vemurafenibe nos tratamentos das células HT29 e HCT116...43 Tabela 4: Concentrações do Vemurafenibe nos tratamentos das células HT29 e HCT116...44 Tabela 5: Anticorpos utilizados...46 Tabela 6: Primers utilizados neste trabalho...49 Tabela 7: IC-50 dos fármacos/compostos pelo teste de MTT em células HT29...51
ADAM do inglês, A Disintegrin and Metalloprotease
AJCC do inglês, American Joint Committee on Cancer
APC do inglês, Adenomatous Polyposis Coli
BRAF do inglês, v-raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1
CDC25A do ingês, Cell Division Cycle 25A
CRC do inglês Colorectal Cancer (Câncer Colorretal)
EGFR do inglês, Epidermal Growth Factor Receptor
EMT do inglês, Epithelial-Mesenchymal Transition (Transição Epitélio-Mesênquima)
ERK do inglês, Extracellular Signal–Regulated Kinases
FDA do inglês, Food Drug Administration
FGFR do inglês, Fibroblast Growth Factor Receptor
GAPDH do inglês, Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
INCA Instituto Nacional de Câncer.
KRAS do inglês, Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog
LMWPTP do inglês, Low Molecular Weight Protein Tyrosine Phosphatase (Proteína Tirosina Fosfatase de baixo Peso Molecular)
MEK do inglês, Mitogen-Activated Protein kinase kinase
PBS do inglês, Phosphate Buffered Saline.
PDGFR do inglês, Platelet-Derived Growth Factor Receptor
p-ERKThr 202/Tyr 204 do inglês, Phospho- Extracellular Signal–Regulated
Kinases (Thr 202/Tyr 204)
p-MEKSer 217/221 do inglês, phospho- Mitogen-Activated Protein Kinase
Kinase (Ser 217/221)
PP2Aαβ do inglês, Serin/Threonine Protein Phosphatase 2A Isoforms α and β.
p-PP2ATyr 307 do inglês, Phospho-Protein Phosphatase 2A Isoform α
(Tyr 307)
p-PTEN Ser 380 do inglês, Phospho-Phosphatase and Tensin
p-PTP1BSer50 do inglês, Phospho-Protein Tyrosine Phosphatase 1B
(Ser 50)
p-SHP2 Tyr 542 do inglês, Phospho-Scr Homology Region 2 Domain
Containing Phosphatase 2 (Tyr 542)
PTEN do inglês, Phosphatase and Tensin Homologue
PTP1B do inglês, Protein Tyrosine Phosphatase 1B
SHP2 do inglês, Src Homology region 2 domain-containing phosphatase 2
TBS-T Tris-HCl contendo Tween 20 a 0,05%
TGFβ do inglês, Transforming Growth Factor β
VEGF do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor
1.Introdução...17
1.1. Câncer Colorretal (CRC)...17
1.2. Tratamentos do CRC e os seus desafios...20
1.3. Vemurafenibe...22 1.4. Proteínas Fosfatases...24 1.4.1. LMWPTP...25 1.4.2. PTP1B...27 1.4.3. PTEN...28 1.4.4. SHP2...29 1.4.5. CDC25A...30 1.4.6. PP1A...30 1.4.7. PP2A...31
1.5. Vias de transdução de sinal envolvidas com o CRC avaliadas nesse estudo...32
1.5.1. Via do TGFβ...32
1.5.2. Via da Notch...35
1.6. Linhagens celulares como modelos de estudo...37
2. Justificativa do estudo...39 3. Objetivos...40 3.1. Objetivo geral...40 3.2. Objetivos específicos...40 4. Materiais e Métodos...41 4.1. Materiais...41 4.1.1. Reagentes...41 4.1.2. Cultura de Células...41 4.2. Métodos...42
4.2.1. Avaliação da viabilidade celular por redução do MTT...42
4.2.2. Avaliação da viabilidade celular por contagem de exclusão por Tripan...43
4.2.3. Análise da expressão e/ou fosforilação de proteínas por Western Blotting...44
5.1. Influência do Vemurafenibe na viabilidade das células HT29 e
HCT116...50
5.2. Avaliação de proteínas quinases da via BRAF em células HT29 e HCT116 tratadas com o Vemurafenibe por 48 horas...56
5.3. Análise do nível proteico das PTPs (LMWPTP e PTP1B) em células HT29 e HCT116 tratadas com o Vemurafenibe em 48 horas...59
5.4. Análise do nível dos mRNA que codificam as PTPs (LMWPTP e PTP1B) em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe por 24 e 48 horas...61
5.5. Avaliação das fosfatases (SHP2, CDC25A, PTEN, PP2A, PP1A) em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe por 48 horas...63
5.6. Avaliação da via do TGFβ em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...65
5.7. Avaliação da proteína Notch em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe...67
6. Discussão...70
6.1. Células de câncer colorretal com mutação em BRAF e KRAS respondem ao tratamento com o Vemurafenibe...70
6.2. O tratamento das células HT29 e HCT116 com o Vemurafenibe modulou as PTPs e PPs...72
6.3. A via do TGFβ e a proteína Notch em células HT29 são afetadas pelo tratamento com o Vemurafenibe...77
7. Conclusão...80
8. Referências Bibliográficas...81
9. Anexos...99
9.1 Declaração de Bioética e Biossegurança...99
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer Colorretal (CRC)
O CRC é uma neoplasia que acomete o intestino grosso, compreendido pelo cólon ascendente, cólon transverso, cólon descendente, sigmoide e o reto. Embora haja uma proximidade anatômica entre o intestino grosso e o ânus, os cânceres que se desenvolvem no ânus não são classificados como câncer colorretal (SOCIETY, 2017).
O CRC é caracterizado pelo crescimento descontrolado das células epiteliais do cólon e reto, associado com várias alterações genéticas e epigenéticas que conduzem essas células para um fenótipo maligno e invasivo. É importante ressaltar que essas alterações genéticas e epigenéticas que conduzem as células epiteliais para esse fenótipo maligno diferem consideravelmente de tumor para tumor, sendo assim, o CRC não é uma única doença, mas um complexo heterogêneo de doenças com diferentes conjuntos de alterações genéticas e epigenéticas (OGINO et al., 2011; BAHRAMI et al., 2018). Entre as mutações associadas com o CRC podemos destacar: as mutações que inativam supressores tumorais (APC e P53) e mutações que ativam oncogenes (RAS, BRAF e PI3K) (MARKOWITZ; BERTAGNOLLI, 2009).
A grande maioria dos tumores que acomete a região colorretal é classificado como adenocarcinoma, tipo de câncer que se inicia nas células glandulares produtoras de muco que revestem o cólon e o reto. Outros tipos de cânceres que acometem a região colorretal, entretanto numa proporção menor, são: a) os tumores no estroma, que se formam em células especializadas do cólon conhecidas como células intersticiais de Cajal; b) os tumores carcinoides, que iniciam-se em células intestinais produtoras de hormônios; c) os linfomas, cânceres do sistema imunológico que se formam no cólon ou reto; d) e os sarcomas, que normalmente iniciam-se nos vasos sanguíneos, mas ocasionalmente se formam nas paredes do cólon e/ou reto (MARLEY; NAN, 2016).
O CRC inicia-se a partir de pólipos, estruturas de crescimento benigno que podem ocorrer no intestino grosso. Se não forem detectados e removidos precocemente, os pólipos podem evoluir e culminar em CRC (SOCIETY, 2014).
Os casos de CRC, predominantemente, desenvolvem-se de forma lenta e gradual ao longo do tempo, a partir do acúmulo de mutações, sendo conhecido
como sequência adenoma-carcinoma (HILL; MORSON; BUSSEY, 1978). O início dessa sequência caracteriza-se por lesões aberrantes e displasias, podendo ocasionar a formação de pólipos. Esses pólipos constituem o início da formação do adenoma, caracterizado por displasia e alterações na diferenciação do epitélio. O acúmulo de mutações contribui para a transição desse adenoma em tumor maligno (SOUZA et al., 2014).
Fatores hereditários como a Síndrome de Lynch (também conhecida como câncer colorretal não-polipoide) e a FAP (Polipose Adenomatosa Familiar) contribuem para o desenvolvimento do CRC, entretanto, estima-se que a maioria dos casos de CRC identificados sejam esporádicos, isto é, não hereditários (DA SILVA et al., 2016; DA SIlVA; ERRANTE, 2016). Uns dos principais fatores de risco para o desencadeamento do câncer colorretal são: o consumo excessivo de bebidas alcoólicas, alta ingestão de gordura animal, tabagismo, obesidade, sedentarismo, alto consumo de carne vermelha e carne processada, entre outros (MARLEY; NAN, 2016; JOHNSON et al., 2013). Recentemente, pesquisas tem demonstrado a influência da microbiota intestinal no desenvolvimento do CRC (LIN et al., 2018).
Estudos têm mostrado que o uso regular da aspirina e de outras drogas anti-inflamatórias não-esteroidais reduzem o risco de CRC (CHAN et al., 2005). Ademais, recentes investigações reportaram que o uso da aspirina após o diagnóstico do CRC contribuiu para melhorar a sobrevivência geral dos pacientes (BAINS et al., 2016). Outros fármacos, como os bifosfonatos orais, que são empregados no tratamento e prevenção da osteoporose, podem reduzir o risco de CRC (THOSANI et al., 2013).
No estágio inicial, o CRC é praticamente assintomático, o que reforça a necessidade de métodos preventivos nessa fase. Entretanto, em estágios avançados, devido a evolução do tumor, pode haver inúmeros sintomas: sangramento nas fezes, mudança nos hábitos intestinas ou na forma das fezes, cólicas ou desconfortos no abdômen inferior, sensação de evacuação incompleta, diminuição do apetite, perda de peso de forma inexplicada, entre outros (SOCIETY, 2017).
Os métodos empregados para a prevenção e diagnóstico do CRC são os testes de sangue oculto nas fezes e a colonoscopia. O teste de sangue oculto nas fezes é um método simples, que busca identificar sangue nas fezes dos pacientes um dos sintomas mais comuns da doença. Entretanto apresenta algumas desvantagens:a) o teste pode apresentar falsos-positivos e falsos-negativos devido a
diversos fatores; b) pacientes em estágio inicial pode não apresentar sangramento nas fezes, o que dificulta a detecção do CRC em fase inicial por esse método. A colonoscopia é um método mais eficaz, permite a visualização de todo o lúmem da camada interna do cólon e reto, e os tecidos suspeitos de câncer são removidos e encaminhados para as biópsias histopatológica para serem confirmados. Além disso, a colonoscopia permite a remoção dos pólipos quando detectados, o que evita a evolução dos mesmos para o CRC. No entanto esse método apresenta altos custos e é invasivo. Com relação aos biomarcadores, ainda não há nenhum empregado para o diagnóstico do CRC, o biomarcador CEA (Antígeno Carcinoembrionário) é utilizado para o monitoramento da eficácia do tratamento (recidiva) em pacientes já diagnosticados com CRC, porém o mesmo não é utilizado para a detecção e diagnóstico inicial dessa doença (CENTER et al., 2009; DAS; KALITA; PAL, 2017; MARlEY; NAN, 2016; SOCIETY, 2017).
O estadiamento do CRC indica em que estágio a doença se encontra, sendo isso muito importante para as decisões terapêuticas e para avaliar o prognóstico dos pacientes. Um dos sistemas mais comuns que faz o estadiamento do CRC é o sistema TNM da AJCC (American Joint Committee on Cancer), que avalia a classificação histopatológica do CRC de acordo com o grau de invasão local do tumor (estágio T), o envolvimento de nódulos linfáticos (estágio N) e a presença de metástases distantes (estágio M). Embora essa avaliação seja importante para as decisões terapêuticas e preveem valores prognósticos, a responsividade e as consequências da terapia pelos pacientes não podem ser preditas por esse sistema (SOCIETY, 2017)
Sob o ponto de vista epidemiológico, o CRC possui relevância em nível mundial, pois é o terceiro câncer mais incidente e o segundo com a maior taxa de mortalidade. Na população masculina é o terceiro câncer mais frequente e o quarto com a maior taxa de mortalidade, já na população feminina é o segundo mais incidente e terceiro com a maior taxa de mortalidade (BRAY et al., 2018). No Brasil, excetuando o câncer de pele não-melanoma, o CRC é o terceiro mais frequente em homens e o segundo entre as mulheres, sendo que para cada ano do biênio 2018-2019 foi estimado um risco de 16,83 casos novos a cada 100 mil homens e 17,90 para cada 100 mil mulheres (INCA, 2018).
A incidência de CRC tende a aumentar levando em consideração o crescimento e o envelhecimento populacional (TEIXEIRA et al., 2015). A taxa de sobrevivência dos pacientes com CRC está intimamente relacionada com o estágio
da doença em que é diagnosticado, sendo que 85-90% dos pacientes em estágio I apresentam taxas de sobrevivência de cinco anos, entretanto pacientes em estágio IV essa taxa diminui para 5% (RIIHIMÄKI et al., 2016). Mesmo com o desenvolvimento de tratamentos mais efetivos nas últimas décadas, o CRC ainda permanece com várias situações críticas: muitos pacientes quando diagnosticados com o CRC, já apresentam metástases diminuindo consideravelmente a sobrevivência, em 5 anos, de 90% para 12% (SIEGEL; DESANTIS; JEMAL, 2014).
1.2. Tratamentos do CRC e os seus desafios
Entre as modalidades terapêuticas empregadas atualmente para o tratamento do CRC podemos destacar: Cirurgia, Quimioterapia padrão (5-Fluorouracil, Oxaliplatina, Irinotecan), Terapia seletiva (Anticorpos monoclonais, Inibidores de Quinases) e Radioterapia. A eficácia do tratamento do CRC é influenciada por vários fatores: estado de saúde geral do paciente, tamanho, extensão e localização do tumor (REDDY et al., 2015; DA SILVA; ERRANTE, 2016). Mesmo com introdução de terapias mais sofisticadas nos protocolos terapêuticos, os tratamentos do CRC ainda enfrentam inúmeros desafios, que serão discutidas adiante.
Nos estágios iniciais da doença a intervenção cirúrgica é um tratamento eficaz, entretanto muitos pacientes quando diagnosticados com CRC já se encontram em fase avançada, o que compromete a implementação eficaz dos procedimentos cirúrgicos, pois o câncer já encontra-se em fase metastática, fato que diminui consideravelmente as chances de sobrevivência (SIEGEL; DESANTIS; JEMAL, 2014; HOWLADER et al., 2013).
A quimioterapia padrão (5-Fluorouracil, Oxaliplatina, Irinotecan), modalidade comumente empregada, atua de forma não seletiva em células que apresentam altas taxas de proliferação. Sendo assim, acarreta em diversos efeitos colaterais, que compromete consideravelmente a qualidade de vida dos pacientes (GHARWAN; GRONINGER, 2016). Além disso, muitos pacientes submetidos à quimioterapia apresentam alta recidiva devido à resistência para esses fármacos (ZHANG et al.; 2015; CHEN et. al.; 2015; MAKONDI et al., 2017; HSU et al., 2018).
Entre os modelos de tratamentos seletivos para o CRC (terapia alvo) atualmente estão os inibidores de quinases e os anticorpos monoclonais (VAN CUTSEM et al., 2009; GROTHEY et al., 2013; LEE; TAN; OON, 2018).
Diferentemente da quimioterapia convencional que não é seletiva e atua em todas as células que apresentam alta taxa de proliferação, os inibidores de quinases e os anticorpos monoclonais são fármacos mais seletivos, que interferem nas vias de sinalização responsáveis pelo desenvolvimento do tumor e consequentemente, impedem a sua progressão (KRAUSE; VAN ETTEN, 2005; AMIR et al., 2011; LEE; TAN; OON, 2018).
Os anticorpos monoclonais aprovados para o tratamento dos pacientes com CRC são: Panitumumabe, Cetuximabe, Bevacizumabe e Ramucirumabe. O Panitumumabe e Cetuximabe atuam sobre o EGFR (do inglês, Epidermal Growth
Factor Receptor), proteína bem expressa na superfície das células, que contribuem
para o desenvolvimento tumoral, já o Bevacizumabe e Ramucirumabe, atuam sobre a proteína VEGF (do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor), proteína que contribui para a angiogênese (BAHRAMI et al., 2018). Os anticorpos monoclonais, Panitumumabe e Cetuximabe, prolongam a sobrevivência de pacientes com CRC que não apresentam a mutação KRAS (do inglês, Kirsten Rat Sarcoma Viral
Oncogene Homolog). No entanto, muitos pacientes não são beneficiados dessa
imunoterapia, uma vez que 40% dos pacientes diagnosticados com CRC apresentarem a mutação KRAS ou BRAF (do inglês, v-raf Murine Sarcoma Viral
Oncogene Homolog B1), que são downstream ao receptor EGFR (BAHRAMI et al.,
2018; LEE; TAN; OON, 2018). Além disso, os anticorpos monoclonais apresentam outros problemas: a) altos custos; b) alguns anticorpos monoclonais não são completamente humanizados, ou seja, contêm sequências não humanas em sua composição, que podem ser reconhecidas como estranhas, quando introduzidas nos pacientes, e consequentemente podem ocasionar reações alérgicas; c) alguns anticorpos apresentam toxicidade dermatológica, como é o caso do Panitumumabe, outros, como o Cetuximabe, podem causar problemas cardiorrespiratórios (GHARWAN; GRONINGER, 2016; CICENAS; CICENAS, 2016).
Outro tratamento seletivo empregado no CRC é o Regorafenibe. Este fármaco foi aprovado pelo FDA em 2012, sendo o primeiro inibidor de quinase aprovado para o tratamento de pacientes com CRC em estágio metastático, que se encontra não responsivo ao tratamento quimioterápico padrão. Este é um inibidor oral que atua em proteínas quinases (VEGFR-2 (do inglês, Vascular Endothelial
Growth Factor Receptor 2), PDGFR (do inglês, Platelet-Derived Growth Factor Receptor); FGFR (do inglês, Fibroblast Growth Factor Receptor) envolvidas em
FAN et al., 2016). Embora o Regorafenib contribuiu para melhorar as condições dos pacientes com CRC, este fármaco pode causar diversos efeitos colaterais: hiperbilirrubinemia (alta concentração de bilirrubina no soro), citopenia (diminuição do número de algum tipo de célula sanguínea), proteinúria (perda de proteína pela urina) e hepatotoxicidade (toxicidade no fígado). Além disso, pode contribuir para o desenvolvimento de efeitos mais graves como infarto do miocárdio, hemorragia e perfuração gastrointestinal (GHARWAN; GRONINGER, 2016).
A radioterapia consiste em empregar radiação de raios X de alta energia para induzir a morte de células neoplásicas. Tanto o tratamento radioterápico como quimioterápico podem ser implementados antes (terapia neoadjuvante) ou após (terapia adjuvante) à cirurgia. Quando implementado antes da cirurgia contribui para diminuir a massa tumoral e por conseguinte facilita a sua remoção, e quando empregado posterior a cirurgia contribui para destruir células cancerosas remanescentes na área tratada (MARTLING et al., 2016; DA SILVA; ERRANTE, 2016). Em se tratando de CRC, a radioterapia é utilizada principalmente nos tratamentos dos tumores que acometem o reto. Entre os inúmeros efeitos colaterais oriundos da radioterapia, podemos destacar: a) irritação da bexiga; b) irritação do reto; c) problemas sexuais; d) fadiga; e) aumento do risco de câncer secundário nas áreas expostas à radiação; f) em mulheres, a radiação próxima da pelve pode danificar os ovários e causar infertilidade (SOCIETY, 2017).
1.3. Vemurafenibe
Vemurafenibe (PLX4032) – (Figura 1) é um inibidor de quinase desenvolvido por ferramentas de modelagem molecular para atuar seletivamente e com maior eficácia, sobre a proteína quinase BRAF mutada (V600E, troca do aminoácido valina por ácido glutâmico) - (GARBE; EIGENTLER, 2018). Este fármaco se liga ao domínio de ligação do ATP dessa proteína, inibindo de forma competitiva a sua atividade catalítica (GARBE; EIGENTLER, 2018; TSAI et al., 2008; LUKE; HODI, 2012). O nome comercial desse fármaco é Zelboraf e o mesmo é fabricado pela Hoffmann-La Roche, e o seu custo é elevado, 240 mg (30 tablets) está por volta de $12,013.80 (GHARWAN; GRONINGER, 2016).
Figura 1: Estrutura molecular do Vemurafenib. Fonte: (GARBE; EIGENTLER, 2018).
A proteína BRAF faz parte da família das proteínas RAF serina-treonina quinases, constituídas pelas proteínas ARAF, BRAF e CRAF, as quais são mediadores upstreams na via de transdução de sinal da MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno) RAS/RAF/MEK/ERK (SCHRECK; RAPP; 2006) – (Figura 2). Essa via ativa a proliferação e a sobrevivência celular em resposta a hormônios e fatores de crescimento. Quando os fatores de crescimento e/ou hormônios ligam no receptor tirosina-quinase, o mesmo é ativado e ocorre o recrumento das proteínas Gbr2 e SOS, e a proteína Ras é ativada pela troca um GDP por um GTP. Em seguida, a proteína Ras interage com a quinase BRAF ativando-a e então esta quinase fosforila a MEK ativando-a. Por fim, a MEK fosforila a ERK, e a p-ERK é translocada para o núcleo, onde aturá na fosforilação de fatores de transcrição responsáveis pela proliferacão e sobrevivência celular. Sendo assim, mutações em BRAF que resultam em ativação constitutiva dessa proteína, desregula os efetores
downstream MEK e ERK, tornando-os sempres fosforilados, e isso culmina em
proliferação excessiva e sobrevivência celular, independentemente dos sinais extracelulares. Portanto, essa via de transdução possui papel crítico no desenvolvimento tumoral (MCCUBREY et al., 2008; MCCUBREY et al., 2007; SEBOLT-LEOPOLD; HERRERA, 2004; WAN et al., 2004).
Figura 2: Esquema da transdução de sinal envolvendo a proteína BRAF. Fonte: (Adaptado de MONTAGUT; SETTLEMAN, 2009).
As mutações em BRAF foram encontradas em diversos tipos de cânceres: melanoma, tireoide, pulmão, ovário, colorretal (DAVIES et al. 2002; IKENOUE et al. 2003; KIMURA et al. 2003; BROSE et al. 2002; SINGER et al. 2003; XING, 2007). Devido à alta incidência da mutação BRAF em melanoma, e os resultados favoráveis em fase clínica com o Vemurafenibe (CHAPMAN et al., 2011; FLAHERTY
et al., 2010; RIBAS; FLAHERTY, 2011), esse fármaco foi aprovado em 2011 pelo
FDA (Food Drug Administration) para o tratamento de pacientes diagnosticados com melanoma que apresentam a mutação BRAF. No Brasil, o Vemurafenibe foi aprovado pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) em 2012 para o tratamento de melanoma (GARBE; EIGENTLER, 2018).
1.4. Proteínas Fosfatases
Vias de transdução de sinais são cruciais para que as células eucarióticas respondam a estímulos específicos. Para tal, é mandatória a ocorrência de modicações pós-tradução de proteínas ao longo de uma via de tansdução de sinal
(MILLER; TURK, 2018). Dentre as diferentes modificações pós-traducionais, a fosforilação de uma proteína pode criar um novo sítio de reconhecimento para interações proteína-proteína, controlar a estabilidade proteica e, mais importante, pode regular a atividade enzimática. Desta forma, a fosforilação de resíduos de tirosina, serina e treonina, mediada pelo balanço entre a ação de proteínas quinases (PKs) e proteínas fosfatases (PPs), é reconhecida como fator crucial na geração e regulação de sinais necessários para a sobrevivência, proliferação, diferenciação e morte celular (JAILKHANI; CHAUDHRI; RAO, 2011). Nesse contexto, mudanças anormais na atividade dessas enzimas podem acarretar em consequências graves que incluem diabetes, obesidade, inflamação, doenças imunológicas, neurodegenerativas e neoplasias (MUSTELIN et al.,2005; FERREIRA et al., 2006; SOUZA et al., 2009; JAILKHANI; CHAUDHRI; RAO, 2011; HE et al., 2014; LEE et
al., 2015; CASSELLI et al., 2016).
Com base na função, estrutura, sequência, especificidade, sensibilidade a ativadores e inibidores, as PPs podem ser divididas em duas grandes famílias: proteínas serina/treonina fosfatases e proteínas tirosina fosfatases (PTPs) (AOYAMA
et al., 2003; FERREIRA et al., 2006).
Em estudos de câncer, as proteínas quinases têm recebido muito mais atenção devido ao conceito consolidado que a desregulação nestas enzimas podem contribuir para o desenvolvimento de diversos tipos de câncer (GSCHWIND et al., 2004). Diferentemente, as proteínas fosfatases, por serem funcionalmente opostas às proteínas quinases, pensava-se que eram supressores tumorais. No entanto, evidências indicam que a contribuição das proteínas tirosina fosfatases (PTPs) para o controle da fosforilação na célula é tão importante quanto das proteínas tirosina quinases (ZHANG, 2001), e que os membros da família PTPs são decisivos no processo da tumorigênese, tendo efeitos oncogênicos (SOUZA et al., 2009). Em CRC, frequentemente, são observadas problemas no padrão de fosforilação de proteínas, demonstrando desbalanço nas atividades de proteínas quinases e fosfatases (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001). Além disso, muitas mutações somáticas em PTPs que afetam o CRC foram encontradas (WANG et al., 2004).
Neste trabalho foram alvos de investigação as fosfatases: LMWPTP, PTP1B, PTEN, SHP2, CDC25A, PP2A e PP1A.
Proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular (LMWPTPs) constituem um grupo de enzimas tirosina específicas de 18 kDa, também conhecidas como ACP1, amplamente expressas em diferentes tecidos. Em humanos, essas enzimas são codificadas por uma única cópia do gene ACP1, localizado no cromossomo 2, cuja transcrição origina quatro diferentes RNAs mensageiros através de um complexo sistema de splicing alternativo. Das quatro isoformas de LMWPTPs apenas duas, isoforma 1 (IF1) e isoforma 2 (IF2), demonstram ser cataliticamente ativas (MODESTI et al., 1998; SOUZA et al., 2009). Estas isoformas apresentam diferenças nas propriedades físico-químicas e fisiológicas (SOUZA et al., 2009; ALHO, et al., 2013), sendo a IF1 diretamente associada com agressividade e resistência de células tumorais (ALHO et al., 2013; FERREIRA et al., 2012; HOEKSTRA et al., 2015; RUELA-DE-SOUSA et al., 2016).
Dentre as PTPs, a LMWPTP vem se destacando como oncogênica. A LMWPTP está relacionada com vários processos celulares como modulação de resposta imune, crescimento celular e modulações no citoesqueleto. Apesar de já ter sido considerada supressor tumoral por contrabalancear as atividades das quinases (HOEKSTRA; PEPPELENBOSCH; FUHLER, 2012), a superexpressão de LMWPTP tem sido encontrada em tumores (MALENTACCHI et al., 2005) e está associada com prognóstico ruim e desenvolvimento de câncer mais agressivo (FERREIRA et
al., 2012). Mais especificamente, Ferreira e colaboradores (2012) demonstraram que
a expressão aumentada da LMWPTP em células tumorais leucêmicas não resistentes aos quimioterápicos conduz as mesmas para o fenótipo de resistência, e que o silenciamento dessa enzima, em células resistentes, tornam as mesmas mais sensíveis aos quimioterápicos. Em outros trabalhos, foi apresentado o envolvimento da LMWPTP para a manutenção do metabolismo glicolítico de células leucêmicas resistentes, Lucena-1, contribuindo assim para o efeito Warburg (FARIA et al., 2017). Isso demonstra que essa proteína está diretamente relacionada com o fenótipo maligno em células tumorais leucêmicas e é um possível alvo para novos tratamentos. Importante ressaltar que essa participação da LMWPTP na manutenção do metabolismo glicolítico também foi reportado em estudos de melanoma (LORI et al., 2018).
No estudo de Ruela-de-Sousa e colaboradores (2016) foi reportado alta expressão da LMWPTP em biópsias de pacientes com câncer de próstata. Além disso, foi apresentado alta detecção da LMWPTP na linhagem de câncer de próstata (PC3), e as investigações demonstraram a relação dessa proteína com a resistência
a anoikis, com o aumento da capacidade de migração e a resistência à apoptose, contribuindo para um fenótipo mais agressivo.
Nos estudos de CRC, Hoekstra e colaboradores (2015) reportaram aumento da expressão de LMWPTP em linhagens celulares (HCT116 e Caco-2), sendo que este aumento está diretamente relacionado com quimiorresistência e com a taxa de migração dessas células, possivelmente contribuindo para o processo de metástase. Além disso, neste trabalho, foi mostrado alta concentração da LMWPTP em tecidos de pacientes com CRC, e inclusive observou-se um aumento gradativo da LMWPTP quando foi comparado tecido saudável, adenoma (lesões pré-neoplásicas) e o carcinoma (lesões pré-neoplásicas).
1.4.2. PTP1B
A PTP1B tem 50 kDa e localiza-se no interior do retículo endoplasmático. O gene PTPN1 que codifica a PTP1B está localizado no cromossomo 20q13.1– q13.2. Esta proteína apresenta um domínio catalítico no N-Terminal, dois motivos ricos em prolina e apresenta um domínio hidrofóbico no C-Terminal (HE et al., 2014). Estudos genéticos e bioquímicos tem revelado o papel da PTP1B como regulador negativo da via de sinalização da insulina e leptina, que são importantes reguladores do peso corporal, homeostase glicêmica e gasto energético. Portanto, a PTP1B tem sido considerada um modelo alvo para o tratamento de diabetes e obesidade (ZHANG; LEE, 2003).
Inicialmente, a PTP1B foi considerada um supressor tumoral por inibir a atividade de proteínas tirosina quinases com propriedades oncogênicas, como BCR-ABL, β-catenina e EGFR (EDEN et al., 2010; BALSAMO et al., 1996; LAMONTAGNE; HANNON; TONKS, 1998). Entretanto, pesquisas demonstraram também os papéis oncogênicos dessa fosfatase por interagir com diversos substratos ligados ao câncer, como por exemplo HER2/Neu, ERK1/2, PITX1/p120RasGAP (TENG et al., 2016).
Em câncer de esôfago e linfoma foi demonstrado que a PTP1B possui um papel supressor tumoral (WARABI et al., 2000; DUBÉ et al., 2005). Por outro lado, em investigações de câncer de estômago, análises in vitro e in vivo demonstraram a PTP1B envolvida com o aumento da proliferação celular (WANG et al., 2010). Recentemente, foi observada alta quantidade dessa proteína em amostras de pacientes com câncer de estômago. Ademais, em linhagens celulares desse tipo de
tumor (MGC803 e MKN45) foi demonstrado a ligação dessa fosfatase com o aumento da proliferação, migração e resistência à apoptose (SUN et al., 2018). Em estudos de câncer de pulmão foi reportado alta detecção dessa proteína em amostras de pacientes e análises in vitro demonstraram que essa fosfatase potencializa proliferação e migração das células (LIU et al., 2015). Resultados similares foram encontrados em câncer de mama (LIAO et al., 2017).
Nos estudos de CRC foi detectada alta concentração dessa fosfatase em tecidos de pacientes diagnosticados com CRC quando comparado com o tecido saudável. Além disso, a alta expressão dessa proteína no tecido neoplásico foi correlacionada com os piores prognósticos clínico-patológico dos pacientes, o que evidencia um possível potencial biomarcador prognóstico da PTP1B em CRC (CHEN
et al., 2014). A PTP1B foi altamente expressa em linhagens CRC (HCT15, HCT116,
SW480, DLD1 e HT29) quando comparada com a linhagem normal de fibroblastos do cólon (CCD-18Co), e os estudos apresentaram o envolvimento dessa proteína com as propriedades tumorigênicas nessas células (TENG et al., 2016), e inclusive foi demonstrado o papel da PTP1B no desenvolvimento do CRC por ativar a proteína quinase Src (ZHU; BJORGE; FUJITA, 2007).
Recentemente, no trabalho de Hoekstra e colaboradores (2016), essa proteína também foi detectada em alta quantidade nas amostras de pacientes com CRC. Ademais, observou-se um aumento gradativo da PTP1B quando foi comparado tecido saudável, displasias (lesões pré-neoplásicas) e o carcinoma. De forma interessante, além de apresentar alta detecção dessa proteína nas amostras neoplásicas, esse estudo também reportou o aumento na atividade catalítica da PTP1B.
1.4.3. PTEN
A PTEN é uma PTP codificada pelo gene que está localizado no cromossomo 10q23.3. Essa enzima atua na desfosforilação de proteínas e lipídeos sendo que sua afinidade é maior por lipídeos. Por atuar em lipídeos, essa enzima regula negativamente a via PI3K/PKB/mTOR, pois desfosforila o fosfolipídeo de membrana Fosfatidilinositol (3,4,5-trifosfato-PIP3), que é importante para a ativação dessa via, transformando-o em (4,5-difosfato-PIP2). Sendo assim, a inativação de PTEN resulta em ativação constante da via PI3K/PKB, que pode culminar em aumento da proliferação, sobrevivência e migração das células, podendo contribuir
para o processo de tumorigênese. Mutações no gene da PTEN é a segunda alteração genética mais comum em cânceres humanos, atrás das mutações em p53 (HOEKSTRA; PEPPELENBOSCH; FUHLER, 2012).
A alta expressão dos microRNAs, miR-106b e miR-93, em amostras de pacientes com câncer de mama e na linhagem deste tipo de tumor (MDA-MB-231) potencializa a migração e proliferação dessas células por suprimir a expressão da PTEN e consequentemente ativar a via PI3K/AKT (LI et al., 2017).
Alterações em PTEN são encontradas em diversas neoplasias como o CRC. No trabalho de Langlois e colaboradores (2010) foi reportado redução da expressão dessa fosfatase em amostras de pacientes com CRC. Além disso, estes autores demonstraram que a redução da expressão de PTEN contribui para a agressividade tumoral por potencializar o crescimento tumoral e induzir o potencial metastático.
1.4.4. SHP2
A proteína SHP2, codificada pelo gene PTPN11, é uma PTP citoplasmática formada por 593 aminoácidos que contém dois domínios (SH2) localizados no N-terminal. A proteína SHP2 é um regulador positivo da via RAS-RAF-ERK. Além disso, tem sido reportada regular as vias oncogênicas PI3K-AKT e JAK/STAT, mutações no gene dessa fosfatase está relacionada com tumores hematopoiéticos e diversos tumores sólidos (HE et al., 2014).
Alta quantidade dessa proteína foi detectada em amostras de pacientes com câncer de pâncreas e isso foi correlacionado com pior prognostico. Ademais, análises moleculares em linhagem celular deste tipo de tumor (HPAF) apresentaram o envolvimento dessa fosfatase com a transição epitélio-mesênquima (ZHENG et al., 2016; GROSSKOPF et al., 2015).
No trabalho de Huang e colaboradores (2017), análises feitas em amostras de pacientes diagnosticados com CRC mostraram que altos níveis de SHP2 foram correlacionados com bom prognóstico, indicando que essa fosfatase seria um supressor tumoral em CRC. Entretanto, análises recentes demonstraram o envolvimento dessa fosfatase com o fenótipo maligno em CRC (ZHANG et al. 2018).
1.4.5. CDC25A
A CDC25A faz parte da família de fosfatases CDC25 que ativam quinases dependentes de ciclinas e é codificada pelo gene que localiza-se no cromossomo 3p21A. Essas fosfatases pertencem a classe das PTPs e as mesmas ativam as quinases dependentes de ciclina por remover o fosfato inibitório dos seus resíduos de serina/treonina. A CDC25A regula a transição do ciclo celular, da fase G1 para a fase S, onde ativa o complexo ciclina E/CDK2 (HOEKSTRA; PEPPELENBOSCH; FUHLER, 2012; HE et al., 2014; LYON et al., 2002). A elevada expressão dessa fosfatase contribui para a desregulação do ciclo celular, proliferação descontrolada e instabilidade genética e está envolvida na tumorigênese de diversos cânceres, como mama, pâncreas, próstata, linfoma não-Hodgkin’s (JIANG; ZHANG, 2008).
A redução da expressão da CDC25A pelo microRNA, miR-125b, contribuiu para a inibição do ciclo celular na fase G1 e consequentemente redução da proliferação de células tronco de glioma (U251) (SHI et al., 2010). Em estudos realizados nas linhagens de câncer de bexiga (T24 e 5637), foi demonstrado que o miR-449a inibe o ciclo celular na fase G1 dessas células por reduzir a expressão da CDC25A (CHEN et al., 2012).
Diversos estudos tem mostrado o papel oncogênico dessa fosfatase e inclusive em tecidos de pacientes diagnosticados com CRC foi detectada alta expressão dessa fosfatase (DIXON; MOYANA; KING, 1998). Recentemente, nos estudos de Liu e colaboradores (2018), a redução da expressão da CDC25A inibiu a proliferação das células tronco de câncer colorretal (SW480).
1.4.6. PP1A
A PP1 é uma proteína serina-treonina fosfatase, com peso molecular de 37kDa, que tem um importante papel em diversos eventos biológicos: mitose, meiose, metabolismo do glicogênio, entre outros. Quatro isoformas da PP1 têm sido caracterizadas: PP1α, PP1δ, PP1γ1 and PP1γ2 (LIN et al., 1999; AOYMA et al., 2003), sendo a isoforma PP1a uma proteína envolvida em progressão do ciclo celular e apoptose.
No trabalho de Ladha e colaboradores (2010) foi reportado alta detecção dessa proteína, como também alta expressão do gene que codifica a PP1A, em amostras de pacientes com gliobastomas, sugerindo que essa fosfatase estaria envolvida com a tumorigênese nesse tipo de tumor. Em estudos de câncer de ovário, análises in vitro mostraram que PP1A está envolvida com resistência à morte celular por desfosforilar fatores de transcrição envolvidos com apoptose (WANG et
al., 2011). Esta proteína também foi bem expressa em linhagens de câncer oral
(SCC131, SCC103 e SCC084) e as investigações demonstraram que PP1A pode está envolvida com o fenótipo maligno deste tipo de tumor (HSU et al., 2006).
Recentemente, análises em células HCT116 demonstraram que a PP1A pode estar envolvida com a transição epitélio-mesênquima, o que pode contribuir para um fenótipo mais agressivo em CRC (ISLAM et al., 2018).
1.4.7. PP2A
A proteína fosfatase 2A (PP2A) é uma proteína serina-treonina fosfatase heterotrimérica, composta por uma subunidade catalítica, uma subunidade
scaffold(âncora) e uma subunidade regulatória que está envolvida na especificidade
e localização da holoenzima. Importante salientar que existem múltiplas isoformas para cada subunidade da PP2A, especialmente no caso da subunidade regulatória, sendo assim, essa proteína pode formar diversos complexos heterotriméricos com diferentes especificidades de substrato e portanto exercer diferentes funções biológicas (ARINO et al., 1988; ZHOU et al., 2003; EICHHORN; CREYGHTON; BERNARDS, 2009). Essa fosfatase apresenta uma sequência homóloga com a PP1 e é importante na regulação de eventos biológicos: mitose, motilidade celular, diferenciação e citocinese. Além disso, essa proteína está envolvida com doenças virais, doenças neurodegenerativas e câncer (SONTAG, 2001; AOYAMA et al., 2003).
No trabalho de Hofstetter e colaboradores (2012) foi reportado pior prognostico em pacientes com Glioblastoma que apresentaram alta atividade da PP2A. Ademais, análises moleculares demonstraram que essa fosfatase contribui para a sobrevivência de células tronco derivados de Glioblastoma. De forma interessante, no trabalho de Lu e colaboradores (2009), foi demonstrado que a inibição da PP2A em Glioblastoma potencializa os efeitos da quimioterapia.
No trabalho de Cristóbal e colaboradores (2014) foi reportado que pacientes com CRC em estágio metastático e que apresentaram baixa atividade dessa proteína nas suas respectivas biópsias apresentaram os piores prognósticos clínicos. Em contrapartida, no trabalho de Dai e colaboradores (2017) foi demonstrado que a inibição dessa fosfatase reduz a proliferação das CRC (HT29 e HCT116).
1.5. Vias de transdução de sinal envolvidas com o CRC avaliadas
nesse estudo
Desregulações nas vias de transdução de sinal decorrentes de mutações em genes supressores ou promotores de tumores, estão relacionadas com o desenvolvimento tumoral. Estas alterações gênicas fazem com que os seus produtos, ganhem ou percam função e a consequência disso será a desregulação em muitos eventos biológicos. Essas alterações afetam o balanço entre proliferação, diferenciação e morte celular, além de contribuírem para processo metastático (HANAHAN; WEINBERG, 2011).
No contexto do CRC várias vias de sinalização estão alteradas e desreguladas. Neste estudo foi dada ênfase as vias do TGFβ e da Notch 1, reconhecidamente, importantes para a agressividade e o fenótipo maligno em CRC.
1.5.1. Via do TGFβ
O TGFβ (transforming growth factor β) faz parte de uma superfamília de TGFβs, composta pelas Ativinas, Inibinas, Hormônio Anti-Mulleriano, BMP (Bone morphogenetic proteins), os quais apresentam semelhanças nas estruturas, no processo de síntese e nos mecanismos de regulação e transdução de sinal (SCHMIERER; HILL, 2007). Em mamíferos, três isoformas homólogas do TGFβ (TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3) são conhecidas. O TGFβ é sintetizado como um precursor inativo, chamado de TGFβ latente, sendo que alterações no pH, interações com integrinas e clivagem proteolítica ativam o TGFβ tornando-o livre para ligar-se no seu receptor e exercer suas funções (SHI et al., 2011). O TGFβ tem várias funções biológicas: inibição da proliferação celular, indução da transição epitélio mesênquima (EMT), imunossupressão e inflamação. No câncer, o TGFβ tem
papel duplo: nos estágios iniciais exibe um papel supressor tumoral por induzir apoptose e inibição no ciclo celular, entretanto, com a progressão do tumor, as células tornam-se insensíveis a estes efeitos e o TGFβ secretado contribui para a imunossupressão, angiogênese, invasão e metástase (AKHURST; HATA, 2012).
O TGFβ sinaliza na célula através da interação com receptores diméricos tipo II na superfície da membrana, que são proteínas serina/treonina quinases. Este receptor tipo II quando interage com o TGFβ recruta e fosforila o receptor tipo I, que propagará o sinal através da fosforilação do efetor dowstream SMAD2/3. A SMAD2/3 quando fosforilada, forma um complexo heterodimérico com a SMAD4 que será translocado para o núcleo, onde atuará na regulação da expressão dos genes alvos. As proteínas nucleares SKI e SNOL (também conhecidas como SKIL) antagonizam a regulação transcricional das SMADs. O inibidor de SMAD (SMAD 7) inibe a via de transdução do TGFβ por múltiplos mecanismos: a) degradação do receptor tipo I; b) inibição da fosforilação pelo receptor tipo I, c) inibição da formação do complexo heterodimérico SMAD fosforilada/SMAD4. Além da sinalização dependente de SMAD, o TGFβ também pode ativar outras vias de sinalização: RHO/ROCK/MAPK/PI3K, conhecidas como vias do TGFβ não-canônicas ou vias não dependentes de SMADs (SHI; MASSAGUE, 2003; MOUSTAKAS; HELDIN, 2009; MASSAGUÉ, 2012; AKHURST; HATA, 2012; HATA; CHEN, 2016). A figura 3 a seguir esquematiza a via canônica do TGFβ.
Figura 3: Representação esquemática da via do TGFβ. Fonte: Adaptado de AKHURST; HATA, 2012).
A via TGFβ/SMAD é crucial para a regulação de vários processos celulares: proliferação, diferenciação, migração, apoptose. Em CRC, nos estágios iniciais, o TGFβ é correlacionado como supressor tumoral, já nos estágios mais avançados da doença contribui para um fenótipo mais agressivo (BELLAM; PASCHE, 2010).
No trabalho Tang e colaboradores (2018) foi demonstrado que o TGFβ2 secretado no microambiente tumoral está correlacionado com desdiferenciacão, e consequentemente, quimioresistência e sobrevivência celular. Num estudo feito em célula de câncer de mama (MDA-MB-231) foi reportado que o TGFβ2 potencializa a proliferação e migração dessas células (REITHMEIER et al., 2017).
No trabalho de Li e colaboradores (2017) foi reportada alta expressão tanto em nível de mRNA, quanto em nível proteico de TGFβ1 em amostras de pacientes com CRC, quando comparado com o tecido saudável. Além disso, estudos realizados nas linhagens celulares (HCT116 e SW480) demonstraram que o TGFβ1 contribui para o aumento da proliferação e invasão celular.
1.5.2. Via da Notch
A sinalização da Notch é composta pelo receptor Notch, o ligante de Notch e a sequência de ligação ao DNA, onde o fragmento da Notch clivada se liga. Em mamíferos tem sido identificadas quatro isoformas dos receptores Notch (Notch-1/ Notch-2/ Notch-3/ Notch-4), sendo a isoforma Notch-1 a mais conhecida, e cinco ligantes dos receptores da Notch (DLL1, DLL2, DLL3, Jagged-1 e Jagged-2) (MUMM; KOPAN, 2000; LAI, 2004).
A ativação inicial da via Notch ocorre quando o receptor Notch interage com o ligante da célula adjacente, portanto, o contato célula-célula através da interação receptor-ligante é importante para ativação inicial da via. Para a ativação clássica da Notch três passos de clivagem proteolítica são requeridos: a) o precursor da Notch formado é clivado no Complexo de Golgi pelas proteases Furin, para formar o receptor Notch maduro que será translocado para a membrana plasmática; b) quando ocorre a interação do receptor Notch maduro com o ligante da célula adjacente, esse receptor altera a sua conformação e é clivado na porção extracelular pelas proteínas TACE (Tumor necrosis factor α-converting enzyme) ou Kuz, que fazem parte da família das metaloproteinases ADAM (A Disintegrin and
Metalloprotease); c) o fragmento remanescente do receptor Notch, a porção transmembrana e intracelular, é clivado pelo complexo enzimático da γ-secretase liberando o NCID (domínio intracelular da Notch) no citoplasma que será posteriormente translocado para o núcleo. O NCDI liga-se ao fator de transcrição no núcleo, onde atuará na transcrição dos genes alvos, sendo que esses alvos podem variar em diferentes tecidos e células. Uns dos genes genes alvos dessa via são: HES, HEY, P21, MMP2/9, Ciclina D1, c-Myc, Her-2. Além disso, múltiplas vias como MAPK, AKT, NF-κB, mTOR tem sido reportadas interconectar com a via da Notch (WEINMASTER, 2000; LI et al., 2017). A figura 4 esquematiza a via da Notch para facilitar a compreensão.
Essa via é importante para a regulação de vários processos celulares: proliferação, diferenciação, desenvolvimento e apoptose (BORGGREFE; OSWALD, 2009; LEON; KARSAN, 2006). Portanto, desregulações nessa via podem contribuir para o desencadeamento de doenças como o câncer.
Em alguns tipos de câncer foi demonstrado o papel oncogênico da Notch: em câncer de pâncreas foi demonstrado contribuir para o crescimento do tumor (MA
et al., 2012), em câncer gástrico foi demonstrado envolver com o aumento da
quimioresistência (ZHOU et al., 2013). Entretanto em outros tipos de câncer, como próstata e fígado, a via da proteína Notch tem sido correlacionada como supressor tumoral (GUPTA et al., 2008; VIATOUR et al., 2011).
Nos estudos de CRC tem sido reportado desregulações nessa via e várias investigações demonstraram a contribuição dessa via para a agressividade e o fenótipo maligno. No trabalho de Zhang e colaboradores (2010), a proteína Notch1 foi altamente expressa em amostras de pacientes com CRC e também em linhagens de CRC (HT29 e SW480), e as análises demonstraram a contribuição dessa proteína para o aumento da proliferação celular. Inclusive no trabalho de Chu e colaboradores (2010) foi apresentado que altos níveis de Notch1 em amostras de pacientes foi correlacionado com pior prognóstico. Nos estudos de Rodriguez e colaboradores (2015), foi demonstrado que altos níveis de folato induz a tumorigênese em CRC através da ativação da Notch 1. Outras investigações demonstraram a contribuição da Notch para o aumento da invasão, metástase, quimioresistência e transição epitélio-mesênquima (SONOSHITA et al, 2015; ZHOU
et al., 2017; JIN et al., 2018). Recentemente, foi detectada alta expressão de Notch
4 em amostras de pacientes e isso foi correlacionado com pior prognóstico (WU et al., 2018).
Figura 4: Esquema representativo da via Notch. Fonte: (Adaptado de LI et al., 2017).
1.6- Linhagens celulares como modelos de estudos
Por décadas, linhagens celulares derivadas de tumores humanos têm sido o pilar da pesquisa sobre o câncer e contribuído para a compreensão das alterações genéticas e epigenéticas que impulsionam o processo de malignidade (GAZDAR et al., 2010; SHOEMAKER, 2006; ASHRAF et al., 2012; BARRETINA et
al., 2012; AHMED et al., 2013).
No campo da pesquisa, a cultura de células apresenta vantagens únicas como a ampla oferta de células vivas, a facilidade de controle dos fatores experimentais e serem modelos comuns de referência. No entanto, é questionada a relevância clínica dos resultados obtidos em linhagens de células tumorais, uma vez que problemas biológicos, tais como a natureza monoclonal e a ausência de estroma tumoral, limitam a comparação direta dos dados obtidos em linhagens com
tumores in vivo (GAZDAR et al., 2010). Porém, muitas linhagens apresentam aberrações genéticas e epigenéticas que também são encontradas em biópsias do tecido tumoral correspondente (SAAF et al., 2007; VAN STAVEREN et al., 2009; JONES et al., 2008; GAYET et al., 2001). No estudo realizado por Mouradov e colaboradores (2014) foram analisados mutações e número de cópias do DNA por sequenciamento do exoma total e análise por microarranjo de SNP (do inglês, Single
Nucleotide Polymorphism), respectivamente, em 70 linhagens de câncer de cólon
retal. Os dados obtidos foram comparados com os dados publicados pela The
Cancer Genome Atlas para tumores primários de câncer de cólon retal.
Notavelmente, verificou-se que o espectro de mutações presentes no exoma e o número de cópias do DNA, nas linhagens estudadas, foi semelhante aos observados nos tumores primários. Nesta dissertação, foram utilizadas duas linhagens de CRC com diferentes características genéticas (Tabela 1).
Tabela 1: Características das células utilizadas neste trabalho.
Células Características genéticas
HT29
(Adenocarcinoma)
BRAF (V600E); PI3K (P449T); p53 (R273H)
HCT116 (Adenocarcinoma)
TGFβ 1 e 2 positivo (H1047R); KRAS (G13D); PI3KCA (H1047R)
(LIU, BODMER, 2006; GRIFIN et al., 2011; MOURADOV et al., 2014; AHMED et al., 2013).
2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
As atividades de quinases e/ou fosfatases são frequentemente desbalanceadas em câncer de cólon retal (CRC) (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001). Em estudos de câncer, as proteínas quinases têm recebido muito mais atenção devido ao conceito consolidado que a desregulação nestas enzimas podem contribuir para o desenvolvimento de diversos tipos de câncer (GSCHWIND et al., 2004). As proteínas fosfatases por terem função oposta às quinases, pensava-se que eram supressores tumorais. No entanto, muitas pesquisas demonstraram o envolvimento das proteínas fosfatases com o desenvolvimento tumoral. Recentemente, foi reportado alta detecção das fosfatases (LMWPTP e PTP1B) em amostras de pacientes e linhagens celulares de CRC. Além disso, os estudos demonstraram que essas proteínas estão envolvidas com o aumento da proliferação, migração e quimioresistência (HOEKSTRA et al., 2015; HOEKSTRA et al., 2016). Além dessas PTPs, as fosfatases: PTEN, CDC25A, SHP2, PP1A, PP2A, também foram alvos de investigação pois em diversos trabalhos foram reportados que desregulações e/ou mutações nos genes dessas fosfatases estão correlacionadas com diversos tipos de cânceres, incluindo o CRC (HOEKSTRA; PEPPELENBOSCH; FUHLER, 2012; ZHANG et al., 2018; DIXON; MOYANA; KING, 1998; CRISTÓBAL et al., 2014; SAKKOF et al, 2004). Diante disso, nesse estudo foi formulada a hipótese se o tratamento das linhagens de CRC com Vemurafenibe afetaria a atividade e/ou expressão dessas fosfatases.
Além de avaliar essas proteínas fosfatases, este trabalho também propôs a investigar se este fármaco atuaria em vias de transdução de sinal como o TGFβ e a Notch, pois os estudos demonstraram desregulações dessas vias em CRC. Além disso, várias pesquisas apresentaram a relação dessas vias com um fenótipo mais agressivo em CRC por contribuírem com o aumento da migração, proliferação e quimioresistência das células (SONOSHITA et al, 2015; ZHOU et al., 2017; JIN et al., 2018).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a responsividade das células de Câncer Colorretal (HT29 e HCT116) frente ao Vemurafenibe e a influência nas PTPs (PTP1B, LMWPTP, CDC25A e PTEN), PPs (PP1A e PP2A) e vias de sinalização: TGFβ e Notch.
3.2. Objetivos específicos
1- Avaliar a viabilidade das células de CRC (HT29 e HCT116) frente ao tratamento com o Vemurafenibe;
2- Examinar a via de sinalização alvo do Vemurafenibe [via da MAPKKK(BRAF)] nas células de CRC após o tratamento com esse fármaco;
3- Avaliar o nível de expressão proteica das PTPs (LMWPTP e PTP1B) por Western Blotting em células de CRC após o tratamento com o Vemurafenibe;
4- Avaliar o nível de expressão gênica das PTPs (IF1/IF2-LMWPTP e PTP1B) por PCR Real Time em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe;
5- Avaliar o nível de expressão proteica (forma total e fosforilada) das PTPs (SHP2, CDC25A, PTEN) e PPs (PP1A e PP2A) por Western Blotting em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe;
6- Avaliar o nível de expressão gênica do TGFβ por PCR Real Time em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe;
7- Avaliar o nível de expressão proteica do TGFβ e do efetor downstream SMAD2/3 (forma total e fosforilada) por Western Blotting em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe;
8- Avaliar o nível de expressão gênica das isoformas Notchs por PCR Real Time em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe;
9- Avaliar o nível de expressão proteica da Notch1 por Western Blotting em células HT29 tratadas com o Vemurafenibe.
