UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
MARINA ALVES FONTOURA
Caracterização do papel de GSK-3β sobre o promotor gênico da
Miostatina e seus possíveis transreguladores
CAMPINAS
Caracterização do papel de GSK-3β sobre o promotor gênico da
Miostatina e seus possíveis transreguladores
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em BIOLOGIA CELULAR E ESTRUTURAL, na Área de BIOLOGIA TECIDUAL.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARINA ALVES FONTOURA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LÚCIA ELVIRA ALVARES.
Orientadora: PROFA. DRA. LÚCIA ELVIRA ALVARES Coorientador: DR. MURILO DE CARVALHO
CAMPINAS
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares (Orientadora) Prof. Dr. Murilo Vieira Geraldo
Dra. Angela Saito
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
Dedico aos meus pais, Harley e Cláudia, por todo o carinho, por acreditar e investir em mim, permitindo que eu chegasse a esta etapa na minha vida.
mar seria menor se lhe faltasse uma gota”. (Madre Teresa de Calcutá)
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez”. (George Bernard Shaw)
Agradeço primeiramente às instituições que possibilitaram a realização do meu mestrado. À UNICAMP e ao programa de pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia, pela formação e capacitação profissional no ambiente acadêmico. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro concedido por meio da bolsa de Mestrado. Ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio/CNPEM), local onde foram realizados os experimentos, por todo o apoio técnico e estrutura disponibilizados.
À minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Elvira Alvares, por ter me aberto as portas do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, sua didática e carisma permitiram que eu me envolvesse e me apaixonasse por esta área. Agradeço por acreditar na minha capacidade e por todos os conhecimentos transmitidos, auxiliando no meu crescimento enquanto pesquisadora e, sobretudo, como pessoa.
Ao meu coorientador, Dr. Murilo de Carvalho, pela disponibilidade, atenção e orientação que possibilitaram a realização deste trabalho num ambiente novo. Obrigada pelas valiosas contribuições ao meu amadurecimento profissional.
Aos membros da banca de defesa do mestrado, Prof. Dr. Murilo Vieira Geraldo, Dra. Angela Saito, Prof. Dr. Rafael Elias Marques Pereira Silva e Dr. André Gustavo de Oliveira, por todo o tempo que disponibilizaram para leitura e avaliação desta dissertação.
Ao Prof. Dr. José Xavier-Neto por abrir as portas do Laboratório de Modificação do Genoma para realização das clonagens e todas as sugestões técnicas para os experimentos da dupla luciferase. Ao Prof. Dr. Márcio Chaim Bajgelman e à técnica Jéssica Toscaro pela produção dos lentivírus na facility do Laboratório de Vetores Virais. À Dra. Carolina Figueira por permitir o uso do luminômetro na facility do Laboratório de Espectrometria e Calorimetria. À Dra. Adriana Paes Leme pelo uso da facility de Espectrometria de Massas.
Ao Prof. Dr. Sílvio Roberto Consonni e Dra. Ana Helena Pereira por me cederem as células C2C12 e por todas as dicas de manuseio. Ao Dr. Tanes Lima pela paciência e auxílio com protocolos alternativos de transfecção. À Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes, pela doação do anticorpo anti-MSTN.
Ao pessoal do Laboratório Nacional de Biociências, funcionários e alunos que me treinaram e me acolheram no novo ambiente, contribuindo, de certa forma, para este trabalho:
Agradeço a todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, não só pelo uso das instalações para a realização do trabalho, mas pela convivência e ensinamentos.
Aos meus colegas e ex-colegas de departamento – Bruno, Carol, Cyro, Daniela, Denis, Diego, Érico, Leandro, Lucimara, Luís, Monique, Paula, Raquel, Ricardo(s), Thaísa e Valquíria –, por toda a companhia, respeito e afeto concedidos ao longo dos meus anos neste lugar. Às amizades que se iniciaram no departamento e que tornaram meus dias mais leves, doces e únicos: Aline, Angela, Bianca, Mika e Viviane. Às minhas amigas e companheiras de laboratório, Carol, Fernanda e Renata, muito obrigada por todas as conversas, desabafos, choros e sorrisos, sempre entremeados por um gole de café. Foi um prazer estar com todas vocês.
Agradeço ao meu namorado e melhor amigo, Tennessee Williams, não só por ter lido diversas vezes esta dissertação, mas por ser meu refúgio e me proporcionar todo apoio, compreensão e carinho que alguém poderia desejar.
Aos meus pais, Harley e Cláudia, por todo amor, dedicação e paciência despendidos ao longo dos anos. Obrigada por sempre incentivarem meus estudos, por apoiarem minhas escolhas e acreditarem em mim, oferecendo condições para que eu pudesse arriscar e me tornar quem sou. Vocês são meus maiores exemplos de amor, força e determinação. À toda minha família, em especial, à minha irmã Letícia, por todo carinho, alegria e pela lista infindável de histórias para contar. Ao Toby por sempre me receber em casa com uma acolhida calorosa, alegrando meus dias.
Finalmente, agradeço a Deus por me dar a oportunidade de trilhar este caminho e me dar forças para prosseguir fazendo o que amo.
A Miostatina (MSTN) é uma proteína reguladora da deposição da musculatura esquelética e de sua homeostase. Ela atua controlando o balanço entre a proliferação e a diferenciação dos mioblastos, regulando a atividade de genes e proteínas do ciclo celular e dos fatores miogênicos, fatores de transcrição essenciais à diferenciação dos precursores miogênicos e à formação das fibras musculares. Níveis elevados de MSTN são associados a doenças que causam degeneração dos músculos esqueléticos, tais como atrofias, distrofias musculares e caquexia. A proteína GSK-3β também é encontrada em níveis elevados em pacientes caquéticos e, recentemente, tem sido relacionada ao controle da homeostase e da regeneração muscular devido ao seu papel negativo sobre a via de síntese e degradação proteica Akt/mTOR. GSK-3β também pode participar da ativação do fator transcricional CREB1 e na regulação de MEIS1 durante a miogênese, mecanismos que a colocam como forte candidata na regulação da atividade do promotor gênico basal da Mstn, o qual possui sítios de ligação para estes fatores de transcrição, em adição ao sítio para NF-Y, importante regulador da miogênese e do ciclo celular. Considerando este cenário, o presente trabalho se propôs a verificar os efeitos da proteína GSK-3β sobre a transcrição da Mstn por meio da transfecção de células C2C12 com construções de expressão de GSK-3β. Ademais, nós tratamos mioblastos C2C12 com LiCl, um conhecido inibidor desta proteína. As análises de expressão gênica diferencial revelaram que a proteína GSK-3β é capaz de aumentar a expressão da Mstn e inibir a transcrição de Creb1, Meis1 e das variantes de Nf-ya, enquanto o comportamento oposto é observado nos tratamentos com LiCl. Foi detectado um leve aumento da quantidade de proteína MSTN em células tratadas com GSK-3β, enquanto LiCl reduziu os níveis de expressão da proteína. Ensaios da dupla luciferase mostraram que a modulação de GSK-3β não modifica a atividade do promotor basal da Mstn, mas análises de bioinformática indicam que a indução de expressão da Mstn pode ser consequência da inibição da via Wnt/β-catenina por 3β. Nossos dados apontam para GSK-3β como um alvo importante de pesquisas visando o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para modular da expressão da Mstn de modo a recuperar a massa e função de músculos comprometidos.
Myostatin (MSTN) is a regulatory protein of skeletal muscle deposition and its homeostasis. This protein controls the balance between the proliferation and differentiation of myoblasts, regulating the activity of cell cycle genes and the myogenic factors, which are essential transcription factors for the differentiation of myogenic precursor cells into functional muscle fibers. High levels of MSTN are correlated with diseases that cause skeletal muscle degeneration such as cachexia, muscular atrophies and dystrophy. Patients diagnosed with cachexia show high levels of GSK-3β, in accordance with the association of this protein with the control of muscle homeostasis and regeneration due to its negative role in Akt/mTOR pathway of protein synthesis and degradation. GSK-3β may also activate CREB1 transcriptional factor and control Meis1 transcription during myogenesis. CREB1 and MEIS1, together with NF-Y, an important regulator of myogenesis and cell cycle, are putative regulators of Mstn transcription through its basal promoter. That being considered, GSK-3β is, therefore, a promising candidate for the modulation of Mstn gene. Considering this scenario, the present work aimed to verify the effects of GSK-3β on Mstn transcription by the transfection of C2C12 cells with GSK-3β expression constructs. In addition, we treated C2C12 myoblasts with LiCl, a known inhibitor of this protein. Differential gene expression evaluation revealed that GSK-3β is capable of enhancing Mstn expression and inhibiting the transcription of Creb1, Meis1 and Nf-ya variants, whereas the opposite behavior is observed in LiCl treatments. A slight increase in the amount of MSTN protein was detected in myoblasts treated with GSK-3β, while LiCl reduced the protein expression levels. Dual-luciferase assays have shown that GSK-3β modulation does not modify the activity of Mstn basal promoter, but bioinformatics analysis indicate that the induction of Mstn expression may be a consequence of the inhibition of Wnt/β-catenin pathway by GSK-3β. Our data point to GSK-3β as an important research target for the development of therapeutic strategies in modulating Mstn expression in order to recover impaired muscle mass and function.
Figura 1. Representação esquemática da somitogênese. ... 23
Figura 2. Resumo das principais vias de regulação de hipertrofia e reparo muscular, bem como possíveis interações entre elas.. ... 28
Figura 3. Esquema da estrutura do promotor basal de 260pb do gene da Mstn indicando localização dos sítios dos possíveis fatores reguladores de sua transcrição. ... 29
Figura 4. Representação da estrutura básica da proteína GSK-3β. ... 32
Figura 5. Estratégias de clonagem utilizadas para a produção dos vetores lentivirais.. ... 47
Figura 6. Vetor lentiviral FUGW, arcabouço de destino das clonagens. ... 48
Figura 7. Delineamento das transduções virais em HEK293T para titulação.. ... 54
Figura 8. Rede de genes e proteínas relacionados à quinase GSK-3β e à transcrição do gene Mstn gerada pelo programa MetaCore.. ... 59
Figura 9. Análise de expressão das proteínas GSK-3β e MSTN por Western Blotting em células C2C12. ... 61
Figura 10. Imunolocalização da proteína MSTN em mioblastos C2C12. ... 63
Figura 11. Análise da expressão gênica relativa de cada tratamento com as variantes de GSK-3β e seu inibidor farmacológico LiCl. ... 65
Figura 12. Resumo dos experimentos de co-transfecção em mioblastos C2C12. ... 67
Figura 13. A transfecção das células HEK293T com as construções virais das variantes de GSK-3β não apresenta indução significativa do promotor com os tratamentos. ... 68
Figura 14. Testes de MOI para lentivírus MLuc-FUGW em células da linhagem C2C12. .... 70
Figura 15. Efeitos da transdução das diferentes variantes de GSK-3β na atividade do promotor gênico da Mstn em mioblastos C2C12. ... 71
Figura 16. Dados de citometria indicando a eficiência de transdução do vírus FUGW em células C2C12 ... 72
Figura 17. Alinhamento da sequência de 2,5kb do promotor gênico da Mstn murina e matrizes de ligação para fatores de transcrição encontrados. ... 75
Figura 18. Mapas dos plasmídeos utilizados para transfecção ... 91
Figura 21. Dados de citometria para titulação de vírus FUGW em células HEK293T... 96 Figura 22. Eficiência de transfecção de mioblastos C2C12 ... 96
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados para sequenciamento. ... 37 Tabela 2. Mixes de transfecção para extração de RNA e/ou proteínas ... 38 Tabela 3. Delineamento das transfecções para ensaio de imunofluorescência para MSTN em mioblastos C2C12 (quantidade por poço). ... 41 Tabela 4. Sequências de primers utilizados para RT-qPCR. ... 43 Tabela 5. Mixes de transfecção para leitura da luciferase em mioblastos (quantidade por poço).. ... 45 Tabela 6. Sequência e temperatura de anelamento dos primers utilizados para as clonagens em vetor viral. ... 49 Tabela 7. Composição de DNA dos mixes de transfecção para leitura da luciferase em HEK293T (quantidade por poço). ... 52 Tabela 8. Grupos de transdução utilizados para quantificar a atividade do promotor gênico da Mstn. ... 56 Tabela 9. Títulos virais estimados por citometria e qPCR. ... 69 Tabela 10. Lista de genes selecionados para análise de interação proteica no MetaCore após revisão de literatura.. ... 93 Tabela 11. Valores representativos dos experimentos de transfecção das construções lentivirais utilizando o sistema da dupla luciferase em linhagem HEK293T... 95
AR Receptor de andrógeno, do inglês, Androgen receptor BLAST do inglês, Basic Local Alignment Search Tool
BLAT do inglês, BLAST-Like Alignment Tool C/EBP do inglês, CCAAT/Enhancer-Binding Protein
cDNA DNA complementar, do inglês, complementary Deoxyribonucleic acid CDS do inglês, Coding sequence
CMV do inglês, Cytomegalovirus
CNPEM Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais CREB do inglês, cAMP response element-binding protein Ct do inglês, Cycle threshold
DAPI do inglês, 4',6-diamidino-2-phenylindole
DEPC dietilpirocarbonato, do inglês, Diethyl pyrocarbonate DMEM do inglês, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO dimetilsulfóxido, do inglês, Dimethyl sulfoxide
DNA ácido deoxirribonucléico, do inglês, Deoxyribonucleic acid
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético, do inglês, Ethylenediamine tetraacetic acid eGFP proteína fluorescente verde, do inglês, enhanced Green fluorescent protein FBS soro fetal bovino, do inglês, Fetal Bovine Serum
FOXO do inglês, Forkhead Box O
FSC do inglês, Forward-Scattered light FXR do inglês, Farnesoid X receptor
GDF-8 do inglês, Growth and differentiation factor 8 GSK-3β do inglês, Glycogen synthase kinase-3 beta HA do inglês, Human influenza hemagglutinin HRP do inglês, Horseradish peroxidase
IGF-1 do inglês, Insulin-like growth factor 1
kb kilobases
kDa kiloDaltons
LAP do inglês, Latency Associated peptide Lef do inglês, Lymphoid enhancer factor LiCl cloreto de lítio
mM milimolar
MOI multiplicidade de infecção, do inglês, Multiplicity of infection MRF4 do inglês, Myogenic regulatory factor 4
MRFs do inglês, Myogenic Regulatory Factors mRNA RNA mensageiro, do inglês, messenger RNA MSTN do inglês, MYOSTATIN (proteína)
Mstn do inglês, Myostatin (gene) Myf5 do inglês, Myogenic factor 5 MyHC do inglês, Myosin heavy chain
MyoD do inglês, Myogenic differentiation factor MyoG do inglês, Myogenin
NCBI do inglês, National Center for Biotechnology Information NF-Y do inglês, Nuclear transcription factor Y
pb pares de bases
PBS salina tamponada com fosfato, do inglês, Phosphate buffered saline PCR reação em cadeia da polimerase, do inglês, Polymerase chain reaction PFA paraformaldeído, do inglês, paraformaldehyde
pH potencial hidrogeniônico
qPCR PCR quantitativo, do inglês, quantitative PCR RT-qPCR do inglês, Reverse transcribed quantitative PCR Rb do inglês, Retinoblastoma
RL do inglês, Renilla luciferase
RNA ácido ribonucleico, do inglês, Ribonucleic acid Rplp0 do inglês, Acidic ribosomal phosphoprotein P0 Smad do inglês, SMA/MAD Related
SSC do inglês, Side-Scattered light
SV40 do inglês, Simian vacuolating virus 40 TALE do inglês, Three aminoacid loop extension TBP do inglês, TATA-Binding Protein
TBST Salina tamponada com tris, do inglês, Tris buffered saline with Tween20 Tcf do inglês, T-cell factor
TGF-β do inglês, Transforming growth factor beta
Formatação adotada para diferenciar as proteínas de seus genes
VSV-G do inglês, Vesicular stomatitis virus glycoprotein Wnt do inglês, Wingless-Type MMTV Integration Site
WPRE do inglês, Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element
wt tipo selvagem, do inglês, wild-type
μg micrograma
μL microlitro
1 INTRODUÇÃO ... 19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23
2.1 A Miogênese Esquelética ... 23
2.2 A Miostatina ... 24
2.3 Ação da Miostatina ... 25
2.4 O promotor gênico da Miostatina ... 28
2.5 A proteína GSK-3β ... 31
2.6 Desregulação da expressão da MSTN: atrofia muscular ... 33
3 OBJETIVOS ... 34
3.1 Objetivo Geral ... 34
3.2 Objetivos Específicos ... 34
4 METODOLOGIA ... 35
4.1 Avaliação da Expressão da Mstn e seus possíveis transreguladores ... 35
4.1.1 Desenvolvimento da hipótese de trabalho: software MetaCore ... 35
4.1.2 Cultura e expansão da linhagem celular C2C12 ... 35
4.1.3 Preparação de DNA plasmidial ... 36
4.1.4 Transfecção de mioblastos C2C12 para análises de expressão gênica e proteica 37 4.1.5 Citometria de Fluxo ... 38
4.1.6 Análise do conteúdo proteico ... 39
4.1.6.1 Extração de proteína total e dosagem ... 39
4.1.6.2 Análise da expressão de proteínas por Western Blotting ... 39
4.1.7 Imunofluorescência ... 40
4.1.7.1 Transfecção de mioblastos C2C12 para ensaio de imunofluorescência 40 4.1.7.2 Imunofluorescência para a proteína MSTN em mioblastos C2C12 ... 41
4.1.8 Análises de expressão gênica ... 42
4.1.8.1 Extração de RNA total das células C2C12 ... 42
4.1.8.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) ... 42
4.1.8.3 Quantificação da expressão gênica por RT-qPCR ... 43
4.2 Avaliação da atividade do promotor gênico da Mstn ... 44
4.2.1 Transfecção de mioblastos C2C12 para os ensaios de leitura do repórter luciferase ... 44
4.2.2 Leitura da atividade do promotor gênico da Mstn através do repórter luciferase 46 4.2.3 Clonagem das construções de expressão de GSK-3β e repórter luciferase dirigido pelo promotor gênico da Mstn em vetor lentiviral ... 46
4.2.3.1 Desenho de primers para clonagem em vetor viral ... 47
4.2.3.6 Transformação de bactérias termocompetentes ... 51
4.2.3.7 Screening dos clones por PCR ... 51
4.2.3.8 Validação das construções de expressão em cultura de células ... 52
4.2.4 Produção das partículas virais ... 53
4.2.4.1 Titulação das partículas virais ... 53
4.2.5 Transdução de Mioblastos C2C12 ... 55
4.3 Busca por sítios de ligação para fatores de transcrição no promotor de 2,5kb da Mstn 56 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57
5.1 Análises de banco de dados revelam que a proteína GSK-3β interage com diversas proteínas que influenciam a transcrição da Mstn... 57
5.2 Validação da hipótese em cultura de mioblastos C2C12 ... 59
5.2.1 Análise da expressão de proteínas em células transfectadas com as variantes de GSK-3β e tratamento com LiCl ... 60
5.2.2 Quantificação da expressão gênica por RT-qPCR ... 63
5.3 Avaliação da atividade do promotor gênico da Mstn frente à modulação de GSK-3β . 66 5.3.1 Ensaios de co-transfecção de mioblastos C2C12 para análise do promotor da Mstn 66 5.4 Produção de lentivírus expressando diferentes GSK-3β e repórter luciferase dirigido pelo promotor gênico da Mstn ... 67
5.4.1.1 Teste das construções lentivirais na linhagem celular HEK293T ... 68
5.4.1.2 Titulação das partículas virais pós transdução em linhagem HEK293T 68 5.4.1.3 Testes de MOI para padronização da transdução viral em mioblastos C2C12 69 5.4.1.4 Os tratamentos com as variantes de GSK-3β e LiCl não alteraram a atividade do promotor gênico da Mstn ... 70
5.4.1.5 Citometria de fluxo revelou baixa eficiência de transdução viral ... 71
5.5 O aumento de expressão da Mstn induzido pela modulação de GSK-3β pode ser efeito direto da via Wnt ... 72
6 CONCLUSÕES ... 76
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 77
8 APÊNDICES ... 91
9 ANEXOS ... 97
9.1 Aprovação da Comissão de Biossegurança – CIBio/CNPEM ... 97
1
INTRODUÇÃO
A musculatura esquelética permite que o ser humano e demais vertebrados executem tarefas essenciais à vida, tais como respiração, deglutição e locomoção. O tecido muscular estriado esquelético compõe cerca de 40% da massa corporal (Marieb and Hoehn, 2010), representando o tecido mais abundante do corpo de indivíduos não obesos. A massa muscular esquelética é determinada pelo balanço entre os mecanismos de síntese e degradação proteica, uma vez que este tecido acumula a maior quantidade de proteínas de todo o corpo, sendo altamente sensível à desregulação deste balanço. A perda de massa muscular leva à intolerância ao exercício e prejudica o desempenho de atividades diárias, o que a torna um forte determinante da qualidade de vida e até da longevidade (Zhou et al., 2010; Dodson et al., 2011).
Durante o desenvolvimento embrionário, fetal e perinatal ocorre o aumento do número e tamanho das fibras musculares esqueléticas, definindo a forma e a força dos músculos do organismo (Chal and Pourquié, 2017). Porém, este tecido pode sofrer perdas de massa severas em condições de desuso, doença e naturalmente, ao longo do envelhecimento. Em situações de atrofia muscular por desuso é possível reestabelecer a massa muscular ao longo do tempo com a ajuda de exercícios físicos, uma vez que nestes indivíduos o tamanho da fibra muscular é reduzido, mas seu número é mantido (Narici and Maffulli, 2010). Contudo, em casos de caquexia (síndrome de perda de massa associada a doença) e sarcopenia (perda de massa muscular que acompanha o envelhecimento), a recuperação da força e tamanho dos músculos se torna mais complicada. Estes processos se diferem pois no primeiro ocorre a perda de músculos acompanhada da perda de tecido adiposo (Daas, Rizeq and Nasrallah, 2018), enquanto no segundo há perda de tamanho e quantidade de fibras musculares (Lexell, 1993). Contudo, em ambos os casos sucede uma progressão da fragilidade muscular, o que tende a um agravamento da perda de músculos e maior dependência dos pacientes crônicos com caquexia e dos idosos com sarcopenia. O entendimento e identificação dos mecanismos e vias de sinalização envolvidos na perda muscular são essenciais para o desenvolvimento de meios para impedir a progressão ou até reverter quadros de pacientes afetados com atrofia muscular.
O tecido muscular estriado esquelético é um tecido pós-mitótico, ou seja, este tecido alcança seu número final de células ainda no início da vida. Desta forma, o número de fibras musculares de um indivíduo adulto se mantém constante e inicia seu declínio a partir dos 30 anos de idade (Lexell, 1993), se intensificando ao longo da senescência (Short and Nair, 2000).
Apesar de não poder aumentar em número, ou seja, por hiperplasia, as fibras musculares podem aumentar em comprimento e circunferência (hipertrofia) durante o desenvolvimento e vida adulta pela incorporação das células satélites às fibras musculares (Mauro, 1961). Ao fim do desenvolvimento da musculatura fetal, a população de células progenitoras dá origem às células satélites, que vão se organizar no em torno das fibras musculares (Gros et al., 2005; Schienda et al., 2006), o que no adulto será entre a membrana basal e o sarcolema das fibras; neste nicho elas se mantêm mitoticamente quiescentes. Após um estímulo, como uma lesão muscular, estas células são ativadas (Chargé and Rudnicki, 2004) e migram para fora da membrana basal, realizando múltiplas divisões mitóticas. Uma fração destas células se mantém como células satélites, enquanto a outra iniciará o processo de diferenciação em mioblastos e se fundir em miofibras multinucleadas (Olguin and Olwin, 2004; Zammit et al., 2004). As células satélites são responsáveis pela “miogênese adulta”, permitindo a hipertrofia e, sobretudo, o reparo muscular (Zammit et al., 2004; Collins et al., 2005).
A proteína Miostatina (MSTN) é uma molécula sinalizadora da família dos fatores de crescimento e diferenciação TGF-β (McPherron, Lawler and Lee, 1997). Esta proteína atua como reguladora negativa da deposição da musculatura esquelética, exercendo efeito inibitório sobre a proliferação dos mioblastos e indução de fatores do programa miogênico no embrião (Manceau et al., 2008). Em miotubos diferenciados, a MSTN atua bloqueando a atividade de genes e proteínas relacionados à homeostase muscular (Durieux et al., 2007), além de impedir a síntese de proteínas ao inibir a via de sinalização Akt/mTOR (Trendelenburg et al., 2009), permitindo a expressão e ativação de proteínas de perfil “pró-atrofia”, como MURF1, ATROGIN e GSK-3β (Stitt et al., 2004; Palma et al., 2008; Litwiniuk et al., 2016). Este programa “pró-atrofia” é ativado pela MSTN sob condições de estresse, enquanto no plasma sanguíneo do indivíduo adulto, ela é encontrada em baixos níveis (Breitbart et al., 2011). Assim, não é de se espantar que a concentração desta proteína se encontre aumentada no músculo e no plasma de indivíduos com comprometimento da musculatura esquelética, como atrofia e caquexia (Gonzalez-Cadavid et al., 1998a). A presença da MSTN nestes pacientes reforça a dificuldade de se recuperar a massa muscular perdida, visto que ela inibe a ativação e auto-renovação das células satélites, responsáveis pela regeneração do músculo adulto (McCroskery et al., 2003).
A proteína GSK-3β, uma serina treonina quinase com múltiplos papéis celulares, tem sido associada à atividade de várias vias de sinalização e a uma ampla gama de doenças humanas (Jope and Johnson, 2004), atuando, inclusive, no perfil “pró-atrofia”. Esta proteína
tem um grande espectro de alvos (Doble and Woodgett, 2003), se opondo à hipertrofia muscular (Vyas et al., 2002). Além disto, GSK-3β tem papel de destaque na inibição da via canônica Wnt/β-catenina através da formação do complexo de degradação da β-catenina e fosforilação da mesma (Doble and Woodgett, 2003). Dentro do contexto do desenvolvimento da musculatura esquelética, esta via de sinalização é essencial para o comprometimento das células precursoras do embrião com o destino miogênico (Otto, Schmidt and Patel, 2006). Além disso, o reparo do músculo adulto pelas células satélites também é mediado pelas proteínas WNT (Michael A. Rudnicki and Williams, 2015). De forma oposta, GSK-3β suprime a diferenciação miogênica (Van Der Velden et al., 2008) e dificulta a regeneração do músculo esquelético (Pansters, Schols, Verhees, de Theije, Frank J. Snepvangers, et al., 2015). Assim como a MSTN, altos níveis desta quinase são detectados em músculos com atrofia (Merli et al., 2013) e caquexia (Aversa et al., 2012). Os papéis de GSK-3β e MSTN como inibidores do crescimento muscular são tão plausíveis que inibidores e antagonistas destas proteínas estão sendo utilizados em testes clínicos por seu potencial terapêutico em pacientes com miosite de corpos de inclusão, uma das miopatias mais comuns a indivíduos acima de 50 anos (Machado, Brady and Hanna, 2013).
No contexto desta dissertação, a MSTN e GSK-3β foram o alvo das análises realizadas dada sua importância para a formação e homeostase do músculo esquelético. Além do papel conhecido de GSK-3β na progressão de programas “pró-atrofia”, existem indícios de que esta proteína pode interferir na expressão da Mstn, uma vez que a ativação da via Wnt canônica resulta na redução da expressão deste gene (Bernardi et al., 2011). Além disso, o promotor basal do gene da Mstn apresenta sítios para fatores de transcrição como CREB e MEIS1 (Grade et al., 2009), que podem ser regulados por GSK-3β (Grimes and Jope, 2001; Wang et al., 2010). Desta forma, o objetivo desta dissertação foi avaliar se GSK-3β afeta de fato a transcrição do gene da Mstn através da transfecção de diferentes variantes desta proteína em cultura de mioblastos da linhagem C2C12. Para inibir a GSK-3β endógena foi utilizado cloreto de lítio (LiCl), uma vez que sais de lítio são empregados em pesquisas científicas como um inibidor seletivo desta quinase, além de serem empregados de forma terapêutica como estabilizadores de humor pelo bloqueio de GSK-3β (Freland and Beaulieu, 2012; Geng et al., 2015). Com o intuito de verificar se esta modulação do gene da Mstn se dá via promotor basal, foram realizados ensaios in vitro utilizando uma construção repórter contendo a sequência do promotor dirigindo a transcrição da luciferase. Em conjunto, os resultados demonstram que a modulação de GSK-3β repercute de forma ampla na biologia dos mioblastos C2C12
proliferativos, repercutindo nos níveis de expressão da Mstn e de seus possíveis transreguladores.
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
A Miogênese Esquelética
Em vertebrados, a musculatura esquelética é formada no embrião a partir dos somitos, estruturas derivadas do mesoderma paraxial e que flanqueam ambos os lados do tubo neural e notocorda (Christ and Ordahl, 1995). É nos somitos onde as células progenitoras têm seu programa miogênico ativado, uma vez que recebem sinais indutivos do tubo neural e ectoderma, como a liberação de glicoproteínas da família Wnt1 que, em conjunto com sinais provenientes da notocorda, levam os progenitores iniciais à sua conversão em mioblastos (Münsterberg et al., 1995; Tajbakhsh et al., 1998; Tajbakhsh and Buckingham, 2000; Otto, Schmidt and Patel, 2006).
Os somitos maduros apresentam três grandes compartimentos: o esclerótomo, que auxiliará na formação de cartilagem e ossos da coluna vertebral e quadril; o miótomo, onde se encontram células precursoras da musculatura esquelética; e o dermomiótomo, que formará derme e a musculatura esquelética de membros (Buckingham, 2006). É no dermomiótomo que os mioblastos passam por sucessivos ciclos de divisão celular, gerando um conjunto de células
1 do inglês, Wingless-Type MMTV Integration Site
Figura 1. Representação esquemática da somitogênese.
progenitoras miogênicas (Gros, Scaal and Marcelle, 2004). Após interromperem as mitoses, estas células convertem-se em miócitos mononucleados e se deslocam para o miótomo. Neste compartimento, os miócitos se alinham e se fundem entre si para formar miotubos multinucleados. A transição de miotubos para fibras musculares maduras ocorre com a ativação de genes estruturais e metabólicos do músculo esquelético, como a cadeia pesada de miosina (MyHC2) e a creatina quinase muscular (CK3) (Buckingham and Vincent, 2009). Com a progressão da miogênese, as sucessivas ondas de geração de miócitos no dermomiótomo levam à formação do miótomo primário, estrutura onde é formado o primeiro conjunto de fibras musculares diferenciadas do embrião (Buckingham and Vincent, 2009).
Uma segunda onda de miogênese, denominada miogênese fetal, ocorre ao redor dos dois terços finais do desenvolvimento, quando começam a serem estabelecidas as junções neuromusculares, também sob influência da sinalização Wnt (Buckingham et al., 2003; Cisternas et al., 2014). Os novos mioblastos gerados alinham-se e conectam-se à rede de fibras musculares do miótomo primário, diferenciando-se em fibras musculares secundárias ou fetais (Chanoine and Hardy, 2003). Ao término da miogênese fetal é estabelecida uma população finita de fibras musculares característica de cada indivíduo, a qual é responsável por determinar o potencial de crescimento da musculatura de tal indivíduo.
A sinalização Wnt no tecido muscular é novamente ativada quando é necessário o reparo tecidual através das células-satélite quiescentes, promovendo assim, a miogênese esquelética adulta (Cisternas et al., 2014; Michael A Rudnicki and Williams, 2015). Fatores como exercícios físicos, perfil hormonal, nutrição, doenças e envelhecimento também contribuem na modulação da massa muscular de cada indivíduo ao longo da vida, mas dentro dos limites previamente estabelecidos pelo desenvolvimento fetal (Almada and Wagers, 2016).
2.2
A Miostatina
A Miostatina (MSTN), também conhecida como GDF-84, é um fator parácrino, membro da superfamília de fatores de crescimento e transformação beta (TGF-β5). Esta proteína
desempenha um papel fundamental no controle da deposição dos músculos esqueléticos durante o desenvolvimento embrionário dos vertebrados, inibindo a diferenciação precoce dos
2 do inglês, Myosin heavy chain 3 do inglês, Creatine kinase
4 do inglês, Growth and differentiation factor 8 5 do inglês, Transforming growth fator beta
mioblastos, que são as células precursoras das fibras musculares. Em concordância com sua função, a MSTN é primeiramente expressa no miótomo, compartimento dos somitos responsável pela miogênese, atuando como regulador negativo da deposição de músculo estriado esquelético (McPherron, Lawler and Lee, 1997). O nocaute desta proteína resulta em fenótipos com hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares de camundongo (McPherron and Lee, 1997), sendo que características similares foram encontradas em cães (Mosher et al., 2007), bovinos (Kambadur et al., 1997), ovelhas (Clop et al., 2006) e humanos (Schuelke et al., 2004; Tobin and Celeste, 2005) apresentando mutações no gene da Mstn.
A MSTN humana é composta por uma sequência de 375 aminoácidos e sua estrutura proteica possui as características típicas dos membros da superfamília TGF-β: uma sequência sinal para secreção de 23 aminoácidos hidrofóbicos N-terminais, um domínio para o pro-peptídeo de 27,7kDa, um sítio proteolítico para processamento e uma região C-terminal contendo um padrão de nove resíduos de cisteína, onde se encontra o domínio da proteína madura (Gonzalez-Cadavid et al., 1998b). Para a ativação da MSTN é necessário seu processamento proteolítico, iniciando-se pela remoção do peptídeo-sinal, seguido pelo processamento da região C-terminal realizado por uma serina protease dependente de cálcio denominada Furina, pertencente à família de proproteína convertases (PCs) (Lee and McPherron, 2001). Tal processamento resulta em dois peptídeos: o pro-peptídeo N-terminal, também chamado LAP6 e o peptídeo maduro proveniente da região C-terminal, dimerizados através de uma ponte dissulfito (Thomas et al., 2000). A MSTN madura é mantida inativa pela sua associação com o LAP, sendo esta MSTN latente a forma predominante do peptídeo circulante (Hill et al., 2002). Em murinos, a MSTN madura é liberada do complexo latente no tecido-alvo através da clivagem do pro-peptídeo por membros da família BMP-1/tolloide de metaloproteases (Wolfman et al., 2003; Lee, 2008). Enquanto o peptídeo maduro é responsável pela função biológica da MSTN se ligando a seu receptor, o LAP aparenta ser necessário para a correta produção e secreção da proteína (Munger et al., 1997).
2.3
Ação da Miostatina
Quando a MSTN ativa se liga ao seu receptor de superfície serina/treonina quinase do tipo II (ActRIIB7), este se complexa a receptores do tipo I (ALK4/58) (Bogdanovich et al., 2002;
6 do inglês, Latency Associated peptide 7 do inglês, Activin Receptor type IIB 8 do inglês, Activin receptor like-kinase
Langley, 2002; Joulia-Ekaza and Cabello, 2007). Assim, ActRIIB fosforila ALK4/5, ativando-os. A partir de então a sinalização intracelular pode seguir uma via canônica dependente de proteínas SMADs9, ou vias não canônicas, independentes de SMAD (Zhang, 2009; Elkina, Haehling and Anker, 2011). Na via dependente de SMADs, estes receptores fosforilam as proteínas SMADs 2 e 3 (Bogdanovich et al., 2002; Langley, 2002) que, quando ativas, formam um complexo tetramérico com duas SMAD4. Esse complexo de SMADs propaga o sinal e é direcionado ao núcleo, onde poderá recrutar co-ativadores ou co-repressores da transcrição dos genes-alvo (Massagué, 2000). Também é possível que a sinalização da MSTN siga vias de sinalização não-canônicas da família TGF-β, que parecem ainda ser dependentes do receptor ActRIIB, mas não necessariamente de ActRIB (Zhang, 2009). ActRIIB ativa a sinalização p38 MAPK através da cascata TAK1-MMK6 (Philip, Lu and Gao, 2005) e Erk1/2 por Ras (Yang et al., 2006) em células C2C12 proliferativas e em diferenciação, levando ao bloqueio dos genes responsáveis pela miogênese (Figura 2). Outra via que exerce papel fundamental no efeito inibitório da MSTN sobre proliferação e diferenciação celular é JNK, que uma vez ativada pela cascata TAK1-MKK4, é capaz de fosforilar diversos fatores de transcrição importantes para miogênese e ciclo celular (Huang et al., 2007).
Esses processos resultam na ação negativa da MSTN sobre a proliferação e diferenciação de mioblastos por meio do aumento dos níveis de p21, redução da atividade de Cdk2 e fosforilação da proteína RB10 e da inativação dos fatores miogênicos Myf511, MyoD12 e MyoG13 (Thomas et al., 2000; Rios et al., 2001; Lee, 2004). A MSTN ainda pode atuar no programa “pró-atrofia” inibindo a atividade de genes necessários para a homeostase muscular, tais como MyHC, Troponin e Desmin (Durieux et al., 2007). Assim, a MSTN pode bloquear a diferenciação de mioblastos em miotubos, inibindo o programa de diferenciação celular mesmo em células musculares já diferenciadas (Langley, 2002; Mcfarlane et al., 2006; W Yang et al., 2007).
Outra frente de atuação da MSTN se dá pela inibição da ativação da proteína Akt (Figura 2) em mioblastos e miotubos (Trendelenburg et al., 2009). De maneira oposta ao papel da MSTN, a via de sinalização Akt/mTOR induz a hipertrofia muscular pelo aumento de síntese proteica (Musaro et al., 2001; Rommel et al., 2001; Lai et al., 2004). A proteína efetora da via é a p70S6K, uma quinase responsável pela regulação das fosforilações múltiplas da proteína
9 do inglês, SMA/MAD Related 10 do inglês, Retinoblastoma 11 do inglês, Myogenic fator 5
12 do inglês, Myogenic differentiation factor 13 do inglês, Myogenin
S6, componente da subunidade ribossomal 40S, que tem papel crítico na regulação de uma classe de mRNAs que codificam grande parte dos componentes da maquinaria de tradução necessária para a progressão do ciclo celular (Ballou, Luther and Thomas, 1991; Pullen and Thomas, 1997; Meyuhas, 2000). Enquanto ativa, Akt mantém inibida a família de fatores de transcrição FoxO14, necessários para a ativação de proteínas E3 ligases como MuRF1 e Atrogin,
que apresentam-se superexpressas em atrofias musculares pois levam à degradação proteica pelo sistema ubiquitina-proteossomo (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004; Palma et al., 2008; Salanova et al., 2008). Ao bloquear Akt, a MSTN não só possibilita a expressão de MuRF1 e Atrogin, como também permite a ativação da proteína GSK-3β15 (Elkina, Haehling and Anker, 2011; Litwiniuk et al., 2016), outro fator que atua na inibição da síntese proteica, da regeneração muscular e no arresto do ciclo celular (Diehl et al., 1998; Alt et al., 2000; Sears et al., 2000; Vyas et al., 2002; Verhees et al., 2011; Pansters, Schols, Verhees, de Theije, Frank J Snepvangers, et al., 2015).
Desta forma, ao inibir Akt, a MSTN não só impede a síntese proteica, como também permite a expressão de genes do programa “pró-atrofia” (Figura 2). Contudo, tal inibição pode ser revertida pela indução da via Akt por IGF-116, retornando a função hipertrófica da via (Musaro et al., 2001; Rommel et al., 2001; Latres et al., 2005).
14 do inglês, Forkhead Box O
15 do inglês, Glycogen synthase kinase-3 beta 16 do inglês, Insulin-like growth fator 1
2.4
O promotor gênico da Miostatina
A expressão de genes em eucariotos depende do seu promotor, um segmento de DNA17 localizado próximo ao início do gene. Em geral, os promotores gênicos apresentam um TATA box ao qual a proteína TBP18 se liga para recrutar fatores de transcrição basais formando o
complexo de iniciação da transcrição. Uma vez formado, este complexo liga-se à RNA19
polimerase II para promover a síntese de mRNAs20 específicos (Koch et al., 2011; Jeronimo,
Bataille and Robert, 2013). Fatores de transcrição adicionais são requeridos para garantir um refinamento da atividade do promotor gênico, conferindo especificidade espacial e temporal à
17 do inglês, Deoxyribonucleic acid 18 do inglês, Tata binding protein 19 do inglês, Ribonucleic acid 20 do inglês, messenger RNA
Figura 2. Resumo das principais vias de regulação de hipertrofia e reparo muscular, bem como
possíveis interações entre elas. A via de sinalização IGF1/Akt é uma das principais vias de síntese de proteínas, responsável pela hipertrofia muscular. Por outro lado, a MSTN é uma proteína sinalizadora da família TGF-β que leva à inibição dos fatores reguladores miogênicos (MRFs) e contribui para a degradação de proteínas pela inibição da AKT, permitindo a expressão dos genes do programa “pró atrofia”. Quando ativa, a sinalização Wnt canônica promove a proliferação celular e inibe a quinase GSK-3β. É possível que esta quinase seja capaz de modular a expressão gênica da
expressão de um dado gene, bem como ajustando os níveis de sua transcrição às necessidades perante situações específicas (Koch et al., 2011; Gingold et al., 2014).
A estrutura e sequência do gene que codifica a proteína MSTN são bem conservadas entre diversas espécies de vertebrados. No caso da Mstn humana, o gene está localizado na região cromossomal 2q32.2, sendo composto por dois íntrons e três exons, e codificando um mRNA de 2,8kb (Cunningham et al., 2015). Com relação aos elementos reguladores da sua transcrição, foram identificadas sequências conservadas em um segmento de 1,6kb upstream ao gene da Mstn de humanos, bovinos, suínos e murinos, as quais possuem sítios de ligação para fatores de transcrição em comum, em particular e-boxes, que podem potencialmente ligar-se a proteínas (Spiller et al., 2002). E-boxes são sítios de interação entre fatores de transcrição hélice-volta-hélice que promovem a diferenciação das células precursoras musculares, mais conhecidos como fatores miogênicos ou MRFs21 (Murre et al., 1989; Davis et al., 1991), tais como Myf5, MyoD, MRF422 e MyoG (Sassoon, 1991; Rudnicki et al., 1993; Braun, Hinuma and Jaenisch, 2000).
Um estudo detalhado da região upstream ao gene da Mstn utilizando uma abordagem filogenética revelou a presença de um segmento de DNA de 260pb, que é conservado do homem ao peixe e atua como um promotor contexto-dependente (Grade et al., 2009). Neste promotor basal, há um TATA box e sítios de ligação para diferentes fatores de transcrição: CREB23 , NF-Y24, MEIS125 e FXR26 (Grade et al., 2009), conforme esquematizado na Figura 3.
O fator de transcrição NF-Y segue um padrão de expressão que se mostra essencial para a diferenciação miogênica (Gurtner et al., 2003). Ele é encontrado em níveis elevados em mioblastos C2C12 proliferativos, mas é reduzido a quantias quase que indetectáveis nos mioblastos terminalmente diferenciados (Farina et al., 1999). A proteína NF-Y apresenta
21 do inglês, Myogenic regulatory factors 22 do inglês, Myogenic regulatory factor 4
23 do inglês, cAMP response element-binding protein 24 do inglês, Nuclear transcription factor Y
25 do inglês, Meis homeobox 1 26 do inglês, Farnesoid X receptor
Figura 3. Esquema da estrutura do promotor basal de 260pb do gene da Mstn
indicando localização dos sítios dos possíveis fatores reguladores de sua transcrição.
grande poder regulador, uma vez que seu sítio de interação com DNA, o CCAAT box está presente em 30% das regiões promotoras de eucariotos superiores (Buchert, 1996). Trata-se de
um fator composto por três subunidades amplamente conservadas: NF-YA, NF-YB e NF-YC, no qual todas são necessárias para a interação específica do complexo com CCAAT boxes (Hooft van Huijsduijnen et al., 1990; Sinha et al., 1995; Bellorini et al., 1997). NF-Y é conhecido por ativar o promotor gênico de proteínas de ciclo celular, tais como Ciclina B1, Ciclina B2 e cdc2 (Liu et al., 1998; Bolognese et al., 1999; Farina et al., 1999; Manni et al., 2001). Este fator também promove a proliferação celular conduzindo modificações epigenéticas e alterações no acesso a regiões da cromatina (Gurtner et al., 2008; Oldfield et al., 2014). A interação de NF-Y com outros elementos regulatórios já é descrita na literatura (Zhang et al., 2005; Lin et al., 2014). Um exemplo foi reportado em 2014, quando Sasi e colaboradores mostraram diferentes funções para CREB e NF-Y no controle da atividade do promotor gênico de Hspa1a (Sasi et al., 2014). Esta dupla de fatores de transcrição também pode ser encontrada próxima ao sítio de iniciação da transcrição em outros genes, como MHC Classe II, onde junto com ATF1, este compõe um enhanceosome que modula a transcrição do gene em questão (Wong et al., 2014). É conhecido que elementos CRE frequentemente se co-segregam com sítios de outros fatores de transcrição, sendo NF-Y um destes fatores (Zhang et al., 2005). Além disso, a distância entre os sítios para CREB e NF-Y parece ser crucial para uma performance eficiente de CREB enquanto fator transcricional (Mantovani, 1999). Há uma diferença na atividade do promotor da Mstn frente a mutações nos sítios de ligação para NF-Y e CREB (Grade et al., 2017), portanto, a interação entre os fatores NF-Y e CREB pode exercer um importante papel na regulação da transcrição da Mstn.
CREB é um fator de transcrição envolvido em vários processos biológicos, inclusive na miogênese. Ele atua na ativação dos fatores miogênicos MyoD e Myf5, bem como na da proteína PAX3, em um processo dependente de cAMP (Chen, Ginty and Fan, 2005). CREB pode ser ativado por injúria muscular por promover a regeneração deste tecido (Stewart et al., 2011). A atividade de CREB pode ser promovida pela fosforilação por PKA27 nos resíduos
Serina 119 ou Serina 133, seguida da fosforilação pela proteína multifuncional GSK-3β no resíduo Serina 129 (Fiol et al., 1994; Chen, Ginty and Fan, 2005). Na ausência da fosforilação por PKA, a proteína CREB pode ter papel repressor, se ligando temporariamente ao elemento CRE e impedindo a transcrição de diversos genes (Lamph et al., 1990; Ofir et al., 1991; Giono, Varone and Canepa, 2001). Esta interação repressora também perturba a ligação de outros
importantes fatores de transcrição, resultando na inibição da atividade do gene-alvo (Vallejo et al., 1995). Os genes modulados por CREB apresentam perfis de ativação gênica tecido-específicos que não conseguem ser explicados apenas pela ativação de CREB ou pela sua ocupação sobre elementos CRE, mas que também refletem a sua interação com outros parceiros regulatórios para recrutamento seletivo de cofatores específicos para cada promotor, pois mesmo a interação de P-CREB28 com seus co-ativadores é muito fraca para ativar por si só a transcrição de genes (Zhang et al., 2005). Dados preliminares de nosso grupo indicam um envolvimento de CREB com outros fatores de transcrição para o controle da atividade do promotor gênico da Mstn.
A proteína MEIS1 pertence à família TALE29 de fatores de transcrição homeóticos e, assim como os outros membros desta família, apresenta um homeodomínio bem conservado (Coy and Borycki, 2010). Juntamente a outras proteínas HOX, a proteína MEIS1 exerce um papel importante no controle da proliferação e regeneração de cardiomiócitos (Mahmoud et al., 2013). Esta proteína interage com o cofator PBX1 para aumentar sua atividade na transcrição de genes em diferentes contextos. Na miogênese, o complexo MEIS1/PBX1 liga-se ao heterodímero MYOD/E12 no promotor gênico da Miogenina, permitindo a ligação de MYOD a um E-box não-canônico, crucial para a miogênese (Heidt et al., 2007). É possível que este complexo seja ativado pela sua interação com co-reguladores da expressão gênica num mecanismo dependente da sinalização mediada por cAMP via PKA (Saleh et al., 2000; Goh et al., 2009). Desta forma, é possível estabelecer um elo entre os fatores MEIS1 e CREB e, por sua vez, entre eles e a miogênese esquelética. Uma clara correlação foi estipulada entre 3β/CREB/MEIS1 na ativação transcricional de genes HOX em leucemias agudas, onde GSK-3β regula a transcrição de Meis1 e de seu co-ativador Pbx1 e promove a ativação de CREB e o recrutamento de seus co-ativadores, permitindo a transcrição de genes HOX envolvidos no desenvolvimento de leucemia (Wang et al., 2010).
2.5
A proteína GSK-3β
A proteína GSK-3β foi inicialmente identificada como uma quinase chave na regulação da glicogênese. Ela é capaz de inibir a atividade da enzima glicogênio sintase por fosforilar diversos sítios serina/treonina da sua região C-terminal (Embi, Rylatt and Cohen, 1980). A GSK-3β humana é codificada a partir de 12 exons, seu mRNA pode sofrer splicing alternativo
28 do inglês, Phospho-CREB
do exon 9 e produzir duas possíveis isoformas: GSK-3β1, de 47kDa, composta por 420 aminoácidos; e GSK-3β2, que apresenta mobilidade de 49kDa e uma sequência de 433 aminoácidos (Sutherland, 2011). A primeira isoforma apresenta expressão ubíqua, enquanto a segunda é predominante no cérebro (Woodgett, 1991; Mukai et al., 2002; Castaño, Gordon-Weeks and Kypta, 2010). Pouco é sabido sobre a estrutura da proteína GSK-3β, sendo esta descrita de maneira relativamente simples, como esquema da Figura 4: uma região amino-terminal, um domínio quinase bem conservado entre as isoformas de GSK-3 com um “loop” de ativação, uma porção C-terminal e uma sequência de identificação nuclear (Meares and Jope, 2007; Eom and Jope, 2009; Sutherland, 2011). A fosforilação do resíduo de serina na posição 9, próximo à porção N-terminal, resulta na inibição da atividade de GSK-3β (Cross et al., 1995). Enquanto isso, a fosforilação da tirosina 216, no “loop” de ativação, facilita a fosforilação dos substratos, apesar de não ser essencial para a função de quinase (Hughes et al., 1993; Dajani et al., 2001). Além disso, GSK-3β apresenta um resíduo de ancoragem de ATP na lisina 85, também chamado sítio ativo, a substituição desta lisina por uma alanina impede que esta quinase fosforile seus substratos (Nicot et al., 2014; Jin et al., 2016).
Desde sua descoberta, já foi registrado o envolvimento desta proteína na regulação de diversos outros processos biológicos, inclusive na miogênese esquelética. GSK-3β exerce papel-chave na via de sinalização canônica Wnt/β-catenina (Figura 2) (Doble and Woodgett, 2003; Mi et al., 2015), prejudica o reparo da musculatura esquelética bloqueando vias de síntese proteica e miogênese pós-natal (Pansters, Schols, Verhees, de Theije, Frank J Snepvangers, et al., 2015), estimula processos inflamatórios (Beurel, Michalek and Jope, 2010) e atua na regulação da sobrevivência celular (Pap and Cooper, 1998). Como mencionado anteriormente, ao bloquear a via Akt/PI3K, a MSTN possibilita que GSK-3β se mantenha ativo (Litwiniuk, Pijet and Pijet-kucicka, 2016), assim como a MSTN, essa proteína se opõe à hipertrofia muscular mediada por IGF-I, uma vez que é capaz de fosforilar o fator de transcrição NFAT, fazendo com que este não possa mais atuar na ativação da expressão de genes relacionados à síntese proteica (Vyas et al., 2002). Além disso, GSK-3β é expresso em níveis elevados em
Figura 4. Representação da estrutura básica da proteína GSK-3β. A variante 1 é composta por uma
sequência de 420 aminoácidos e 47kDa, enquanto a variante 2 é maior, apresentando 433 resíduos e peso molecular de 49kDa.
tecidos musculares atróficos (Merli et al., 2013)e na caquexia associada ao câncer (Garcea et al., 2007; Aversa et al., 2012), permitindo a expressão de moléculas associadas à atrofia muscular, como Atrogina e MuRF1, em células C2C12(Verhees et al., 2011).
2.6
Desregulação da expressão da MSTN: atrofia muscular
No indivíduo adulto, a MSTN é produzida e secretada por células do músculo esquelético, sendo encontrada em baixos níveis na sua forma circulante no plasma sanguíneo. Porém, a atividade da proteína e seu nível no plasma podem estar alterados sob condições de estresse (Breitbart et al., 2011).
A concentração da MSTN muscular e plasmática encontra-se aumentada em diversas situações onde há comprometimento da musculatura esquelética. Por exemplo, os níveis séricos desta proteína são elevados em adultos HIV-positivos com perda muscular associada (Gonzalez-Cadavid et al., 1998b). Tendo em vista os mecanismos de ação da MSTN, ela também exerce um papel-chave na manutenção e progressão da caquexia (Jespersen, Kjaer and Schjerling, 2006; Joulia-Ekaza and Cabello, 2007; Lokireddy et al., 2012; Schiaffino et al., 2013). A caquexia é uma síndrome metabólica multifatorial que frequentemente acomete pacientes com câncer, acarretando em grande perda de massa muscular, com ou sem perda de gordura (Rivadeneira et al., 1998; Mendes, Pimentel and Costa, 2009; Fabbro, Graffi and Cecchini, 2016). Esta síndrome não pode ser completamente revertida por suporte nutricional convencional e leva à debilidade funcional (Rivadeneira et al., 1998; Fearon et al., 2011). Os efeitos da caquexia estão relacionados ao crescente catabolismo de proteínas, resistência à insulina, inflamações recorrentes e perda de apetite (Homsi and Luong, 2007), reduzindo consideravelmente a sobrevivência dos pacientes (Utech et al., 2012).
Intervenções farmacológicas com inibidores e antagonistas da MSTN ou seu receptor demonstraram prevenir e até reverter a atrofia muscular em diversos modelos de doenças (Han et al., 2013) e miopatias como a distrofia muscular de Duchenne (Bogdanovich et al., 2002), inserindo a MSTN e moléculas de sua via de sinalização na lista de alvos terapêuticos para diversas patologias (Roth and Walsh, 2004; Carnac et al., 2006).
3
OBJETIVOS
3.1
Objetivo Geral
Avaliar o papel da quinase GSK-3β na regulação transcricional do gene que codifica a proteína MSTN em mioblastos C2C12 proliferativos.
3.2
Objetivos Específicos
I. Investigar os efeitos da superexpressão de variantes da proteína GSK-3β [wild-type, mutante S9A (proteína constitutivamente ativa) e mutante K85A (proteína sem atividade de quinase)] e do inibidor farmacológico cloreto de lítio (LiCl) sobre a quantidade e distribuição espacial da proteína MSTN em cultura de mioblastos C2C12 por Western Blotting e imunofluorescência;
II. Avaliar os efeitos da superexpressão de variantes da proteína GSK-3β e do LiCl sobre a transcrição do gene da Mstn endógeno e dos seus reguladores Meis1, Creb1 e Nf-y em cultura de mioblastos C2C12 por RT-PCR quantitativo;
III. Caracterizar efeitos da superexpressão de variantes da proteína GSK-3β e do LiCl sobre a atividade do promotor gênico da Mstn em cultura de mioblastos C2C12 por ensaios da dupla luciferase.
4
METODOLOGIA
4.1
Avaliação da Expressão da Mstn e seus possíveis transreguladores
4.1.1
Desenvolvimento da hipótese de trabalho: software MetaCore
Após a revisão bibliográfica foram selecionadas proteínas que poderiam participar de vias de regulação do promotor gênico da Mstn através de seus possíveis transreguladores ou que interagissem com GSK-3β. A lista de proteínas resultante foi relacionada com as suas respectivas Gene IDs, obtidas no GenBank (NCBI30), de modo a ser compatível com a plataforma do MetaCore versão 6.29 (Thomson Reuters). O MetaCore é um software de análise utilizado para decifrar informações funcionais de listas de genes regulados (Ekins et al., 2005). Também conhecido como GeneGO, o programa pode devolver vias relevantes, doenças e redes associadas aos seus genes de interesse.
O propósito desta etapa foi verificar relações já descritas na literatura que poderiam oferecer suporte à hipótese inicial de trabalho. Para tanto, as IDs foram enriquecidas com genes relacionados ao ambiente miogênico e importadas para o programa em formato “.txt”, construindo uma rede de interação a partir da ferramenta Auto-expand Network do MetaCore. Os dados foram organizados e utilizados para verificar modificações e cenários esperados ao manipular GSK-3β em cultura celular. Com o intuito de conhecer fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica da Mstn que poderiam ser diretamente influenciados por GSK-3β, foi realizada uma segunda análise combinando o algoritmo Dijkstra’s shortest paths (Dijkstra, 1959) à ferramenta Transcription regulation Network.
4.1.2
Cultura e expansão da linhagem celular C2C12
Os mioblastos da linhagem celular C2C12 obtidos a partir do músculo de camundongo C3H (ATCC31 - Rockville, Md) foram doação da Dra. Ana Helena Macedo Pereira e Prof. Dr. Sílvio Roberto Consonni. Estas células foram mantidas em cultura em meio DMEM32 (Sigma, USA), composto por 4mM de L-glutamina, 4500mg/L de glicose, 1500mg/L de bicarbonato de sódio e 110mg/L piruvato de sódio. No preparo do meio foram adicionados 1% penicilina/estreptomicina (50U/mL penicilina e 50µg/mL estreptomicina). Posteriormente, esse
30 do inglês, National Center for Biotechnology Information 31 do inglês, American Type Culture Collection
meio foi suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado (FBS33, Gibco), constituindo o que será aqui chamado meio DMEM completo. As células foram cultivadas em garrafas de cultura (Corning® 75 cm² Flask Cell Culture) em estufa 37°C e atmosfera de 5%CO2. As subculturas foram realizadas quando as culturas alcançavam 70% de confluência,
utilizando Tripsina 0,25%/EDTA34 em PBS35 0,1M pH7,4 para desaderir as células e meio
DMEM completo para inativação da tripsina, uma vez que o soro inibe sua ação. As células eram coletadas utilizando pipeta sorológica e transferidas para tubos cônicos de centrífuga, onde eram centrifugadas a 250rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Após sucção do meio contendo tripsina, estas células foram ressuspendidas em meio completo e uma alíquota era retirada para contagem das células em câmara de Neubauer para prosseguir com subculturas e plaqueamentos. Os congelamentos de passagens foram realizados com 1x106 células em meio DMEM completo suplementado com 5% de DMSO36.
4.1.3
Preparação de DNA plasmidial
Inicialmente foi feito um estoque de bactérias E.coli DH5α termocompetentes, segundo o método desenvolvido por Hanahan (Sambrook and Russell, 2001). Estas bactérias foram utilizadas nos procedimentos de preparo de DNA e clonagens.
Antes de preparar o DNA a ser utilizado em larga escala, foi realizada a extração e purificação de DNA plasmidial em baixa escala por lise alcalina (MiniPrep) (Sambrook and Russell, 2001). Estas MiniPreps foram levadas para sequenciamento de cada um dos vetores: MLuc-pGL3 (M S Salerno et al., 2004); HA GSK-3β(wt) pcDNA3; HA GSK-3β(S9A) pcDNA3; e HA GSK-3β(K85A) pcDNA3, os três últimos são variantes de GSK-3β1 obtidos por Jim Woodgett (plasmídeo Addgene #14753 #14754 e # 14755). Os mapas destes e de todos os plasmídeos utilizados neste trabalho podem ser encontrados no Apêndice A.
Em seguida foi realizado o sequenciamento dos insertos presentes nos plasmídeos preparados utilizando os primers listados na Tabela 1. Para o promotor basal da Mstn contido em MLuc-pGL3 foram utilizados os primers RVprimer3 e GLprimer2, enquanto que os vetores GSK-3β foram sequenciados com primers SP6 e T7. Após confirmação do conteúdo dos vetores, foi realizada a extração de DNA plasmidial em larga escala utilizando o kit QIAGEN Plasmid MaxiPrep, seguindo protocolo do fabricante.
33 do inglês, Fetal bovine serum
34 do inglês, Ethylenediamine tetraacetic acid 35 do inglês, Phosphate buffered saline 36 do inglês, Dimethyl sulfoxide
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados para sequenciamento.
RVprimer3 5’-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3’
GLprimer2 5’-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3’
T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’
SP6 5’-ATTTAGGTGACACTATAG-3’
4.1.4
Transfecção de mioblastos C2C12 para análises de expressão
gênica e proteica
Cerca de 1x105 células foram plaqueadas com 2mL de meio DMEM completo em cada poço de placas de 6 poços. Decorridas 18 horas, o meio de cultivo foi renovado para 1mL de meio DMEM puro, livre de soro. As células foram mantidas em estufa 37°C, em atmosfera 5% CO2 enquanto realizou-se o preparo dos mixes de transfecção, contendo até 4µg de cada
construção para GSK-3β, conforme indicado na Tabela 2. Para os experimentos contendo LiCl, o meio de cultura foi preparado de modo a conter 2,5mM deste composto. Após 16 horas o meio de transfecção foi suplementado com DMEM +2%P/S +20%FBS e, após 24 horas, este meio foi removido e renovado com DMEM completo. Para os experimentos contendo LiCl, o composto foi adicionado ao meio de cultura na concentração final de 2,5mM e renovado durante as trocas de meio de cultura. No dia seguinte, as células foram coletadas para extração de RNA e proteína total. A quantificação da eficiência de transfecção foi realizada por citometria, utilizando o plasmídeo pEGFP-N1-FLAG.
Tabela 2. Mixes de transfecção para extração de RNA e/ou proteínas.
4.1.5
Citometria de Fluxo
Para a submissão ao citômetro, as células transfectadas com plasmídeo eGFP foram coletadas e após nova centrifugação, o PBS 0,1M foi aspirado e substituído por fixador PFA37 4%, a 4°C, overnight. Na manhã seguinte, o fixador foi retirado, as células foram ressuspendidas em 200µL de PBS 0,1M e mantidas a 4°C. Posteriormente, estas células foram passadas no citômetro NovoCyte (Acea Biosciences) do Laboratório de Vetores Virais do LNBio38/CNPEM39 utilizando software NovoExpress versão 1.2.1. A população de células a
serem analisadas foi isolada através de um gate no dotplot (FSC40 x SSC41) de células controle
(não transfectadas) e a fluorescência do controle foi verificada ao transportar esse gate para o dotplot (FITC x SSC). Os mesmos parâmetros foram utilizados para as células transfectadas, determinando a porcentagem de células GFP42 positivas e eficiência da transfecção.
37 do inglês, Paraformaldehyde 38 Laboratório Nacional de Biociências
39 Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais 40 do inglês, Forward scatter
41 do inglês, Side scatter
42 do inglês, Green fluorescent protein
Mix A Mix B Opti-MEM Lipofectamine 2000 Opti-MEM DNAs
Controle 250µL 10µL 250µL H2O MilliQ
eGFP 250µL 10µL 250µL 4µg pEGFP-FLAG
WT 250µL 10µL 250µL 4µg GSK-3β(wt)
S9A 250µL 10µL 250µL 4µg GSK-3β(S9A)
K85A 250µL 10µL 250µL 4µg GSK-3β(K85A)
4.1.6
Análise do conteúdo proteico
4.1.6.1
Extração de proteína total e dosagem
Para realizar a extração do conteúdo proteico das células transfectadas, o meio de cultura foi sugado e as células foram lavadas duas vezes com tampão PBS 0,1M gelado. Após remoção do PBS, foram adicionados a cada poço 500µL de tampão de lise RIPA gelado (50mM Tris-HCl pH7,4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0,25% deoxicolato de sódio, 1% Nonidet P-40 (NP-40, Sigma) em água MilliQ, com adição de coquetel inibidor de protease cOmplete (Roche) em concentração final 1X). As células foram removidas dos poços e transferidas para tubos eppendorf de 1,5mL mantidos em gelo. Após vortexar por 10 segundos, os tubos foram incubados em gelo por 30 minutos e novamente vortexados. Em seguida, estes tubos foram centrifugados a 14000rpm a 4°C por 30 minutos. Os sobrenadantes desta centrifugação foram transferidos para novos tubos e submetidos a dosagem de proteína utilizando o Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific).
4.1.6.2
Análise da expressão de proteínas por Western Blotting
Após a dosagem, as amostras foram preparadas de forma a adicionar 100µg de proteína no gel desnaturante, adicionando tampão de amostra redutor Laemmli SDS Sample Buffer (ThermoFisher Scientific) a concentração final 1X e aquecendo a 95°C por 5 minutos. Para a eletroforese foi preparado gel SDS-poliacrilamida 10% seguindo protocolo estabelecido (Harlow and Lane, 1988). As amostras foram aplicadas ao gel para corrida em voltagem constante de 100V e o marcador do tamanho de proteínas utilizado foi PageRuler Prestained 10-180kDa (ThermoFisher Scientific). A transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose Amersham™ Protan™ Premium 0,45µm NC (GE Healthcare) foi realizada em sistema úmido, a 120V por 90 minutos, no gelo.
Após a transferência, o bloqueio das membranas foi realizado em 2% ou 5% de leite em pó (Itambé) em tampão TBST43 (20mM Tris-HCl; 160mM NaCl e 0,1% Tween 20, pH7,6) por 30 minutos, temperatura ambiente, sob agitação. Em seguida, as membranas foram incubadas overnight a 4°C sob agitação utilizando os anticorpos primários: anti-MSTN (AB3239-I, Millipore) diluído 1:1000 em TBST contendo 2,5%BSA e 0,01% de azida sódica; anti-HA44 (H6908, Sigma) diluído 1:5000 e anti-VINCULIN (AB18058, Abcam) diluído 1:1000, ambos
43 do inglês, Tris buffered saline with Tween20 44 do inglês, Human influenza hemagglutinin
