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DISSERTAÇÃO_Reação de híbridos de milho à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum

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Academic year: 2021

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(1)RENATO BARBOSA CAMARGOS. REAÇÃO DE HÍBRIDOS DE MILHO À MANCHA-BRANCA, CERCOSPORIOSE E FERRUGEM COMUM. LAVRAS - MG 2013.

(2) RENATO BARBOSA CAMARGOS. REAÇÃO DE HÍBRIDOS DE MILHO À MANCHA-BRANCA, CERCOSPORIOSE E FERRUGEM COMUM. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética e Melhoramento de Plantas, para a obtenção do título de Mestre.. Orientador Dr. João Cândido de Souza. Coorientador Dr. Eduardo Alves. LAVRAS - MG 2013.

(3) Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca da UFLA. Camargos, Renato Barbosa. Reação de híbridos de milho à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum / Renato Barbosa Camargos. – Lavras : UFLA, 2013. 70 p. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2013. Orientador: João Cândido de Souza. Bibliografia. 1. Zea mays L. 2. AACPD. 3. Mecanismos de defesa estrutural. 4. Épocas de avaliação. 5. Resistência genética. 6. Doenças fúngicas. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD – 631.523.

(4) RENATO BARBOSA CAMARGOS. REAÇÃO DE HÍBRIDOS DE MILHO À MANCHA-BRANCA, CERCOSPORIOSE E FERRUGEM COMUM. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética e Melhoramento de Plantas, para a obtenção do título de Mestre.. APROVADA em 18 de fevereiro de 2013 Dr. João Bosco dos Santos. UFLA. Dr. Edson Ampélio Pozza. UFLA Dr. João Cândido de Souza Orientador. Dr. Eduardo Alves Coorientador. LAVRAS - MG 2013.

(5) OFEREÇO. Aos meus pais, Nivaldo e Ivaneide; aos meus avós, Josias (in memoriam), Eva (in memoriam), Josafá (in memoriam) e Helena e a minha irmã Fernanda..

(6) “Jamais se poderá expressar em simples palavras o sonho de um filho em tentar recompensar os sacrifícios de seus pais.” (GONÇALVES).

(7) AGRADECIMENTOS. A Deus, por abençoar o meu caminho e pelas oportunidades que me tem sido concedidas. Aos meus pais, Nivaldo e Ivaneide, a minha irmã Fernanda, ao meu primo e grande amigo Thiago pela compreensão quanto a minha ausência, pelo apoio incondicional e incentivo para que eu sempre acreditasse ser possível alcançar os meus objetivos. A minha namorada Lívia, pelo amor e companheirismo sempre presentes ao longo desta caminhada. As minhas madrinhas Maria, Sueli e Lúcia, e a minha tia Vilma pelo carinho e atenção durante a minha vida estudantil. À Universidade Federal de Lavras e ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, pela oportunidade de poder realizar o curso de Mestrado. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos. Aos. professores. João. Cândido. e. Eduardo,. pela. orientação,. companheirismo, confiança e amizade construída. Aos membros da banca examinadora, professores João Bosco e Édson Pozza, por contribuírem de forma decisiva para a qualidade desta dissertação. Aos professores da área de Genética e Melhoramento de Plantas, em especial aos professores João Bosco, Flávia Avelar, José Airton, Magno, Elaine, César e Édila, pelos ensinamentos transmitidos e agradável convivência. A toda a turma de mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas 2011/1 pela união, alegria, momentos de estudo e pelas amizades construídas dentro e fora da sala de aula..

(8) Ao grupo do milho, Carlão, Paulo Edu, Camila, Rafael, Guedes, Josiel, Juninho, Vavá, Lucas, Grampola, Carlos Henrique, Pedro e Natália, por todo o apoio na realização deste trabalho, pela amizade e ótimo convívio. Aos amigos Paulo Edu e Rafael, pelo auxílio nas análises estatísticas e na redação desta Dissertação. A todos os colegas do Núcleo de Estudos em Genética (GEN), pela amizade e boa convivência. Aos funcionários do DBI, Heloísa, Lilian, Léo, Lindolfo, Zélia, Rafaela, Irondina, Dú, e Lamartine, por estarem sempre dispostos a ajudar. Aos proprietários rurais Dona Aparecida e Magno pela oportunidade de instalação de experimentos em suas fazendas, pela oferta de infraestrutura para a condução dos mesmos, pela atenção e prazerosa convivência. Aos companheiros da república ‘Cunhão de Touro’, Carlão, Guedes, Marcim e Michael pela amizade e apoio. À querida Dona Sandra, zeladora da república pela atenção e boa vontade em ajudar. Enfim, a todos aqueles que, direta ou indiretamente, estiveram comigo durante esta caminhada, o meu MUITO OBRIGADO!.

(9) RESUMO. A mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum são doenças de ampla ocorrência no Brasil e que têm causado expressiva redução da produtividade de grãos na cultura do milho no país. Os objetivos deste trabalho foram identificar híbridos de milho que apresentem alta produtividade de grãos e resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum; estimar a época de avaliação mais eficiente para mensurar a reação dos híbridos aos patógenos causadores dessas enfermidades; estimar o grau de associação entre o nível de resistência a essas doenças e as estruturas morfológicas espessura da epiderme, densidade estomática, densidade de tricomas e organização da camada de cera. Para isso, foram instalados em duas épocas de semeadura, dois experimentos no município de Lavras - MG, no ano agrícola de 2011/2012. O delineamento experimental utilizado foi o látice 6 x 5 com três repetições. Foram realizadas cinco avaliações da severidade das doenças, em intervalos de 10 dias, a partir de 60 dias da emergência das plantas. Posteriormente, estimou-se a área abaixo da curva de progresso das doenças (AACPD) e a correlação de Sperman entre as mesmas com as diversas épocas de avaliação de cada doença. Foi também obtida a produtividade de grãos, tomadas as medidas da espessura da epiderme, densidade estomática, densidade de tricomas para estimar a correlação dessas estruturas morfológicas com à AACPD de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum, bem como, avaliada a organização da camada de cera. Constatou-se que os híbridos GNZ9501 PRO e GNZ9626 PRO apresentam alta produtividade de grãos e satisfatório nível de resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum; para a avaliação do nível de resistência a essas enfermidades deve-se optar pela avaliação no período que compreende 80 a 100 dias após a emergência das plantas, o qual fornece resultados semelhantes à AACPD; nas condições estudadas não há associação entre o nível de resistência a essas doenças e as estruturas morfológicas espessura da epiderme, densidade estomática, densidade de tricomas e a camada de cera de híbridos de milho.. Palavras-chave: Zea mays L. AACPD. Épocas de Avaliação. Mecanismos de defesa estrutural..

(10) ABSTRACT The white spot, grey spot and common rust are diseases with widespread occurrence in Brazil and that have been causing a significant reduction in grain yield in maize crop in the country. The objectives of this study were identify hybrids of maize which have high grain yield and resistance to white spot, grey spot and common rust; estimate the most efficient season of assessment to measure the reaction of the hybrids to the pathogens; estimate the degree of association between the level of resistance to these diseases and the morphological structures thickness of the epidermal, stomata density, trichomes density and organization of the wax layer. Two experiments were set up in Lavras, MG, in two seasons of 2011/2012. The experimental design used was the lattice 6 x 5 with three replications. Five assessments of the diseases severity were performed at ten-day intervals from 60 days after maize emergence. After that, was estimated the area under the disease progress curve (AUDPC) and the Spearman correlations therebetween with the several seasons of assessment of each disease, obtained the grain yield, taken values of thickness of the epidermal, stomata density, trichomes density to estimate the correlation of these morphological structures with the AUDPC of white spot, grey spot and common rust, as well as, evaluated the organization of the wax layer. It was found that the hybrids GNZ9626 PRO e GNZ9501 PRO present high grain yield and satisfactory level of resistance to the white spot, grey spot and common rust; the assessment of the level of resistance to these diseases should be done in the period which comprises 80 and 100 days after plants emergence, which provides similar results to AUDPC; in the conditions studied there is no association between the level of resistance to these diseases and the morphological structures thickness of the epidermal, stomata density, trichomes density and organization of the wax layer of maize hybrids.. Keywords: Zea mays L. AUDPC. Season of Assessment. Structural Mechanisms of Defense..

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Produtividade média de grãos de milho e tipos de híbridos norteamericanos, 1865 a 2004 .................................................................. 19. Figura 2. Eletromicrografias de varredura mostrando a camada de cera da superfície abaxial de folhas de híbridos de milho representantes dos níveis de resistência à mancha-branca ....................................... 52. Figura 3. Eletromicrografia de varredura mostrando a camada de cera da superfície abaxial de folhas de híbridos de milho representantes dos níveis de resistência à cercosporiose.......................................... 53. Figura 4. Eletromicrografia de varredura mostrando a camada de cera da superfície abaxial de folhas de híbridos de milho representantes dos níveis de resistência à ferrugem comum.................................... 54.

(12) LISTA DE TABELAS. Tabela 1 Estimativa do progresso genético com a cultura do milho no Brasil .. 20  Tabela 2  Descrição dos híbridos de milho utilizados, quanto à base genética e nível de resistência à mancha-branca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC) ................................... 28  Tabela 3  Resumo de análise de variância conjunta da produtividade de grãos (t ha-1) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) obtida a partir de avaliações da severidade de manchabranca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC), em 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras-MG .................................................................................. 39  Tabela 4  Valores da produtividade de grãos (kg ha-1) e da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) obtida a partir de avaliações da severidade de mancha-branca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC) de 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras-MG.............................. 42  Tabela 5  Resumo da análise de variância conjunta para severidade de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum em 30 híbridos de milho avaliados aos 60, 70, 80, 90 e 100 dias após a emergência (DAE), em dois ambientes no município de LavrasMG ................................................................................................... 45 .

(13) Tabela 6  Coeficientes de correlação de Sperman entre as notas provenientes da análise de variância conjunta da severidade de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum aos 60, 70, 80, 90 e 100 dias após a emergência das plantas com a respectiva área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), em 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras-MG ....................................................................................... 46  Tabela 7  Resumo da análise de variância da avaliação da espessura da epiderme, densidade estomática e densidade de tricomas da face abaxial de folhas de híbridos de milho representantes de cinco níveis de resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum.............................................................................................. 47  Tabela 8  Valores da espessura da epiderme (EE), densidade estomática (DE) e densidade de tricomas (DT) obtidos a partir da avaliação da face abaxial de folhas de híbridos de milho representantes de cinco níveis de resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum .............................................................................. 49  Tabela 9  Coeficiente de correlação de Sperman da área abaixo da curva de progresso das doenças mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum com a espessura da epiderme, densidade estomática e densidade de tricomas ...................................................................... 50 .

(14) SUMÁRIO. 1 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3 3.1 3.2 3.3 3.4. INTRODUÇÃO .................................................................................... REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................... Cultura do milho no Brasil .................................................................. Considerações sobre o melhoramento genético do milho ................. Mancha-branca do milho..................................................................... Cercosporiose do milho ........................................................................ Ferrugem comum do milho ................................................................. Resistência genética de plantas a patógenos....................................... MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. Ambientes.............................................................................................. Híbridos utilizados................................................................................ Condução e avaliação dos experimentos ............................................ Preparo das amostras para a microscopia eletrônica de varredura............................................................................................... 3.5 Análises estatísticas .............................................................................. 3.5.1 Análise dos dados da produtividade de grãos e da reação às doenças .................................................................................................. 3.5.2 Análise dos dados das épocas de avaliação das doenças ................... 3.5.3 Análise dos dados dos caracteres ultraestruturais ............................ 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 4.1 Produtividade de grãos e reação às doenças ...................................... 4.2 Épocas de avaliação das doenças......................................................... 4.3 Caracteres ultraestruturais ................................................................. 5 CONCLUSÕES..................................................................................... REFERÊNCIAS ................................................................................... ANEXOS ................................................................................................ 14 16 16 17 20 22 24 25 28 28 28 30 31 33 33 35 36 38 38 43 46 55 56 67.

(15) 14. 1 INTRODUÇÃO. A. incidência. e. a. severidade. das. doenças. têm. aumentado. significativamente ao longo dos últimos anos na cultura de milho no Brasil (GALVÃO; MIRANDA, 2008). Sendo o impacto causado por fitopatógenos na cultura, um dos principais entraves para se continuar obtendo ganhos em produtividade nos programas de melhoramento genético (PINHO et al., 2001) e também em escala comercial (ANUÁRIO DA AGRICULTURA BRASILEIRA - AGRIANUAL, 2011). O milho está sujeito à ocorrência de aproximadamente 30 doenças (PEREIRA; CARVALHO; CAMARGO, 2005), no entanto, pela frequência e intensidade com que ocorrem em áreas agrícolas brasileiras, somente algumas apresentam importância econômica. Dentre as quais à mancha-branca, a cercosporiose e a ferrugem comum são consideradas entre as principais doenças desse cereal (CASELA; FERREIRA; PINTO, 2006). Essas doenças têm causado grandes perdas econômicas por assumir proporções epidêmicas em várias regiões brasileiras e levado genótipos suscetíveis à seca prematura, com consequente redução de 30 a 60 % na produtividade de grãos (BRANDÃO, 2002; FERNANDES; OLIVEIRA, 2000; ROLIM et al., 2007). Com o intuito de evitar ou minimizar os danos causados por doenças na cultura do milho, a utilização de híbridos resistentes é o método mais eficiente, racional e econômico (CASELA; GUIMARÃES, 2005; REIS; CASA; BRESOLIN, 2004). Tendo isso em vista, é importante que os programas de melhoramento genético do milho, os quais são muito dinâmicos e produzem grande número de híbridos anualmente, avaliem concomitantemente a produtividade de grãos e a reação dos genótipos frente às principais doenças dessa espécie..  .

(16) 15. Além disso, é interessante que haja um melhor entendimento sobre a relação entre as estruturas morfológicas e o desempenho fitossanitário dos híbridos de milho, pois várias dessas estruturas potencialmente podem constituir-se em mecanismos de resistência estrutural, e a avaliação das mesmas pode contribuir para a elucidação da reação dos híbridos a patógenos. Do exposto, os objetivos deste trabalho foram identificar híbridos de milho que apresentem alta produtividade de grãos e resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum, estimar a época de avaliação mais eficiente para mensurar a reação dos híbridos aos patógenos Phaeospharia maydis, Cercospora zeae maydis e Puccinia sorghi, bem como, estimar o grau de associação entre o nível de resistência a essas doenças e a espessura da epiderme, densidade estomática, densidade de tricomas e organização da camada de cera presentes na face abaxial de folhas de híbridos de milho..  .

(17) 16. 2 REFERENCIAL TEÓRICO. 2.1 Cultura do milho no Brasil. O milho (Zea mays L.) é uma das espécies cultivadas de maior relevância na agricultura brasileira, sendo uma cultura estratégica do ponto de vista de segurança alimentar e de desenvolvimento regional. O Brasil é o terceiro maior produtor mundial desse cereal, superado apenas pelos Estados Unidos e China (UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE - USDA, 2012). Na safra de 2012, foram produzidas 72,7 milhões de toneladas, o que representa mais de um terço da produção de grãos do país, em uma área de cultivo de 15,1 milhões de hectares, com produtividade média de grãos de 4,8 t ha-1 (USDA, 2012). Contudo, a produtividade média de grãos brasileira é considerada baixa se comparada ao potencial da cultura, visto que em condições experimentais e em cultivos comerciais nos quais se emprega alto nível tecnológico são comumente obtidas produtividades próximas a 10 t ha-1. A cultura do milho no Brasil tradicionalmente ocupa o segundo lugar em área plantada, volume produzido e valor da produção, sendo superado apenas pela soja (COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB, 2011). No entanto, em 2012 em virtude da queda ocorrida na produção de soja (11,9%) e pela safra recorde obtida de milho, essa espécie volta a ser responsável pela maior parte da produção de grãos do país (CONAB, 2012). O milho é cultivado em todo território nacional, sendo a produção concentrada, principalmente, nas regiões Centro-Oeste (36,81%), Sul (36,21%) e Sudeste (16,40%) (AGRIANUAL, 2013). Em Minas Gerais, o terceiro maior Estado produtor desse grão (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA - IBGE, 2011), esse é o principal cereal cultivado, com destaque  .

(18) 17. para o Sul (256 mil hectares), Alto Paranaíba (208 mil hectares) e Triângulo Mineiro (192 mil hectares) (ASSESSORIA DE COMUNICAÇÃO DA EMATER/MG - ASCOM / SECRETARIA DE ESTADO DE AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO DE MINAS GERAIS - SEAPA, 2008). O cultivo do milho no Brasil tem se caracterizado pela produção em duas épocas de semeadura (GURGEL, 2012), sendo a primeira realizada na época tradicional, durante o período chuvoso que contempla o final do mês de agosto na região Sul até novembro no Sudeste e Centro-Oeste do país. Já a segunda época, refere-se à chamada safrinha, semeada em fevereiro ou março, geralmente em sucessão com a cultura da soja na região Centro-Oeste e nos Estados do Paraná e São Paulo. Nesse cenário, destaca-se o deslocamento temporal da produção para a segunda safra (safrinha) na região Centro-Sul do país no ano de 2012, com incremento de 23% em relação à área plantada no ano anterior (CONAB, 2012). Desse modo, do total de grãos produzidos, 47 e 53% foram provenientes da primeira e segunda safra, respectivamente (CONAB, 2012). A área cultivada, a produtividade e a produção de grãos de milho brasileira vêm aumentando ao longo das últimas décadas (MONTEZANO; CORAZZA; MURAOKA, 2008), sendo isso atribuído à expansão da área agrícola para a região Centro-Oeste (GALVÃO; MIRANDA, 2008), adoção de modernas práticas culturais e, sobretudo aos progressos da genética e suas aplicações no melhoramento genético dessa espécie (RAMALHO et al., 2012).. 2.2 Considerações sobre o melhoramento genético do milho. A contribuição da genética para o aumento da produtividade do milho tem sido objeto de alguns estudos em diversos países (PIXLEY, 2006) e estima-.  .

(19) 18. se que o ganho genético seja responsável por 50 a 60% dos avanços observados no desempenho dessa cultura (DUVICK, 2005). A utilização de milho híbrido representa um dos mais significativos exemplos de sucesso da aplicação da teoria genética à produção de alimentos (DUVICK, 2001) e a heterose, definida há mais de um século por Shull (1909), constitui uma das maiores contribuições práticas da genética para a agricultura mundial. A heterose tem permitido expressivos aumentos na produtividade dessa cultura e com repercussão no melhoramento de diversas espécies cultivadas (HALLAUER, 1990). No intuito de quantificar o progresso genético proporcionado pela utilização de milho híbrido na agricultura norte-americana, vários foram os trabalhos conduzidos (DUVICK, 1994; TROYER, 2006). Segundo Troyer (2006), a produtividade média de grãos passou de 1,5 t ha-1, nos anos de 1930, quando o milho híbrido tornou-se disponível comercialmente para 10,0 t ha-1 em 2005, com 22% a menos de área plantada. No decorrer desse tempo, o aumento na produtividade de grãos foi de 63,1 kg ha-1 ano-1, no período de 1930 a 1960, associada aos híbridos duplos; de 110,4 kg ha-1 ano-1, no período de 1960 a 1999, associada aos híbridos simples e de 207,2 kg ha-1 ano-1, no período de 1995 a 2004, associada aos híbridos transgênicos (Figura 1)..  .

(20) 19. Figura 1. Produtividade média de grãos de milho e tipos de híbridos norteamericanos, 1865 a 2004. Fonte: Troyer (2006). Os incrementos em produtividade de grãos obtidos por programas de melhoramento do milho no Brasil também têm sido relevantes, tal como apresentados na tabela 1. As contribuições do melhoramento genético e o aperfeiçoamento do manejo fitotécnico dessa cultura permitiram que a produtividade média de grãos nacional passasse de 2.194 kg ha-1 para 4.818 kg ha-1, nos últimos 20 anos (CONAB, 2012). Nesse contexto, ao longo de muitas décadas, a seleção de híbridos superiores em programas de melhoramento do milho no Brasil foi conduzida concentrando esforços principalmente na obtenção de ganhos em produtividade, com poucas iniciativas na avaliação simultânea da reação desses híbridos à população de patógenos, o que favoreceu a perda de alelos de resistência nessa espécie (MESQUITA NETO, 2000). Concomitantemente a isso, algumas áreas de cultivo têm favorecido a multiplicação e preservação de inóculos de patógenos, devido à utilização de irrigação, sucessão de culturas com o plantio de milho em safrinha, adoção do sistema de plantio direto, ausência de rotação  .

(21) 20. de culturas e expansão da área agrícola para a região Centro-Oeste (GALVÃO; MIRANDA, 2008).. Tabela 1 Estimativa do progresso genético com a cultura do milho no Brasil. 1964-1983. Aumento na produtividade (kg ha-1 ano-1)* 72-109 (PE). (VENCOVSKY et al., 1986). 1970-1990. 31-51 (PG). (ARAÚJO, 1995). 1964-1993. 123 (PE). (FERNANDES; FRANZON, 1997). 1998-2002. 175 (PG). (STORCK; BISOGNIN; CARGNELUTTI FILHO, 2005). Período. *. Autores. PE – peso de espigas; PG – peso de grãos.. Dessa forma, o milho antes considerado uma planta rústica do ponto de vista fitossanitário, tornou-se vulnerável a partir do início da década de 90, quando as doenças tornaram-se mais frequentes e severas nesse cereal, passando a limitar o desempenho produtivo de vários híbridos nacionais (AGRIANUAL, 2011; DUARTE; JULIATTI; FREITAS, 2009). Com destaque para a manchabranca, cercosporiose e ferrugem comum do milho (CASELA; FERREIRA; PINTO, 2006).. 2.3 Mancha-branca do milho. A mancha-branca foi inicialmente relatada na cultura do milho em 1965 por Rane, na Índia, tendo como agente etiológico o fungo Phaeospharia maydis (RANE; PAYAK; RENFRO, 1965). No Brasil, a partir do início da década de 1980, essa doença passou a ser observada em campos de produção de milho e.  .

(22) 21. em estudo realizado por Fantin, Sawazaki e Barros (1991), o fungo Phaeospharia maydis foi descrito como o causador dessa enfermidade, tal como citado anteriormente por Rane, Payak e Renfro (1965). No entanto, após análises citológicas de lesões em estádio inicial Paccola Meirelles et al. (2001), isolaram com frequência elevada (63%), uma bactéria gram-negativa de coloração amarelo-brilhante, identificada como Pantoea ananatis, sugerindo que o fungo Phaeospharia maydis não é o patógeno primário dessa doença e que o mesmo se estabelece após a infecção bacteriana. Já Amaral et al. (2002), relatam os fungos Phyllosticta sp, Phoma sorghina e Sporormiella sp., como estando conjuntamente associados à etiologia dessa enfermidade e que cada um deles tem sua frequência variável nas lesões devido às condições ambientais presentes durante o cultivo desse cereal. Assim, o agente causal da mancha-branca do milho está em discussão pela comunidade científica e a etiologia da mesma ainda é controversa (COSTA; CASELA; COTA, 2009). Os sintomas apresentam-se na forma de lesões foliares em número variável, circulares e elípticas que sob condições favoráveis podem levar a senescência precoce das folhas, reduzindo o ciclo e a produtividade do milho, sendo que a quantidade e o tamanho das lesões variam bastante entre os diferentes genótipos (PACCOLA MEIRELLES et al., 2001). A doença não ocorre nos primeiros estádios de desenvolvimento do milho, em condições favoráveis os sintomas tornam-se visíveis à medida que as plantas aproximam-se do florescimento (MANERBA, 2010). As lesões iniciamse com o aparecimento nas folhas baixeiras de manchas cloróticas de aspecto aquoso do tipo anasarca, as quais tornam-se necróticas de coloração palha e com bordas bem definidas de cor marrom-escuras (PEREIRA; CARVALHO; CAMARGO, 2005). Porém, progridem rapidamente para o ápice da planta,.  .

(23) 22. podendo infectar o colmo, folhas, pecíolo das folhas e brácteas das espigas (SIBIYA et al., 2011). A condição ambiental favorável para a mancha-branca consiste em temperaturas variando entre 25 e 300 C, associado a longos períodos de alta umidade relativa do ar (SILVA; SCHIPANSKI, 2007). O fungo Phaeospharia maydis é necrotrófico, podendo permanecer em restos de cultura, incrementando o potencial de inóculo para anos posteriores em áreas de plantio direto (REIS; CASA; BRESOLIN, 2004). Os danos causados por essa enfermidade podem ser significativos ocasionando perdas na produção que variam de 11 a 60%, de acordo com estudos realizados nos EUA e Brasil (CARSON, 2005; PACCOLA MEIRELLES et al., 2001). A resistência genética à mancha-branca apresenta predominantemente ação gênica aditiva, sendo essa resistência do tipo horizontal (LOPES et al., 2007).. 2.4 Cercosporiose do milho. A Cercosporiose foi inicialmente descrita na cultura do milho (Zeae mays L.), em Illinois, EUA, em 1925 (TEHON; DANIELS, 1925). No Brasil, foi relatada pela primeira vez em 1934 por Viégas e Krug em Campinas, no Estado de São Paulo (VIÉGAS, 1945). Durante um longo período foi considerada doença secundária, pela sua ocorrência esporádica e com baixa severidade (FANTIN et al., 2001). Contudo, isso mudou no início do ano 2000, quando foram relatadas epidemias severas dessa enfermidade em campos de produção no Sudoeste de Goiás e em safras seguintes, foram alastradas para toda a região Centro-Sul do país (JULIATTI; BRANDÃO, 2000)..  .

(24) 23. Os primeiros sintomas da doença são observados geralmente na fase de florescimento, principalmente nas folhas baixeiras (WARD et al., 1999), onde o patógeno inicia a colonização do limbo foliar, podendo provocar extensas áreas necróticas. Essa enfermidade caracteriza-se pelo aspecto linear-retangular das lesões que são geralmente delimitadas pelas nervuras. As manchas possuem coloração palha e sob condições de alta umidade relativa, tornam-se cobertas por esporos, conferindo-as uma coloração acinzentada (PEREIRA; CARVALHO; CAMARGO, 2005). A etiologia da doença é associada a duas espécies fúngicas, a Cercospora zeae maydis e a Cercospora sorghi (CHUPP, 1953). A ocorrência de ambas as espécies é relatada em várias áreas produtoras de milho no Brasil (FANTIN et al., 2001). No entanto, a C. sorghi é um patógeno pouco eficiente na colonização dos tecidos foliares, proporcionando sintomas mais brandos, circundado por halos cloróticos e com pequena produção de esporos (CHUPP, 1953; WARD et al., 1999). Já a espécie C. zea maydis, coloniza de forma mais eficiente o hospedeiro, geralmente sem halo clorótico e produz grande quantidade de esporos (LATTERELL; ROSSI, 1983). Com isso, as recentes epidemias da doença foram atribuídas à espécie C. zeae maydis (JULIATTI; BRANDÃO, 2000). A condição ambiental favorável para a cercosporiose consiste em temperaturas que oscilam entre 25 e 30° C, associado com longos períodos de umidade relativa do ar e com ausência de água livre sobre a folha (WARD et al., 1999). O fungo C. zeae maydis infecta apenas o milho não havendo relatos de que seja transmitido por semente (RICHARDSON, 1990). Trata-se de um fungo necrotrófico, sendo assim capaz de sobreviver em restos de cultura presentes na superfície do solo, o que favorece o potencial de inóculo para os próximos anos em áreas de plantio direto (NAZARENO; LIPPS; MADDEN, 1992)..  .

(25) 24. Os danos causados pela cercosporiose do milho podem ser significativos ocasionando perdas na produção que variam de 25 a 65%, de acordo com observações realizadas nos EUA e Brasil (BRITO et al., 2007; WARD et al., 1999). Estudos relacionados à determinação do tipo de ação gênica envolvida na resistência à cercosporiose têm concluído que a ação gênica aditiva é predominante (DERERA. et al., 2008) e que vários locos controladores de. caracteres quantitativos (QTLs) estão associados à resistência, demonstrando tratar-se de resistência do tipo horizontal (BUBECK et al., 1993).. 2.5 Ferrugem comum do milho. Dentre as ferrugens que infectam a cultura do milho no Brasil, a ferrugem comum foi a primeira a ser relatada e devido a sua maior relevância econômica ela é a mais estudada (BRANDÃO et al., 2003). Essa doença é causada pelo fungo Puccinia sorghi, o qual encontra-se disseminado por todas as regiões brasileiras nas quais o milho é cultivado (FERNANDES; OLIVEIRA, 2000). No Brasil, essa doença ocorre com maior severidade na região Sul devido à ocorrência de clima mais ameno, sendo a esporulação do fungo estimulada por temperaturas entre 17 e 250 C, acompanhada de elevada umidade relativa. do. ar. (MESQUITA. NETO,. 2000).. Porém,. dependendo. da. suscetibilidade da cultivar adotada, essa enfermidade pode também causar perdas significativas em áreas cujas temperaturas são mais elevadas, tais como a região Centro-Oeste (PEREIRA, 1995). Essa doença rompe a epiderme e os sintomas são caracterizados por pústulas em forma de fendas, predominantemente alongadas, de aspecto.  .

(26) 25. pulverulento, presentes em ambas as faces da folha, de coloração marrom-clara a marrom-escura (PEREIRA; CARVALHO; CAMARGO, 2005). O fungo Puccinia sorghi é um patógeno biotrófico, apresenta ciclo completo, tendo como hospedeiro alternativo no Brasil o trevo (Oxalis sp.), onde sobrevive na ausência do milho no campo. Apesar dessa doença ser geralmente iniciada em um período mais tardio, quando as plantas se aproximam do florescimento é considerada de maior relevância em cultivares de milho doce e milho pipoca, são relatadas perdas superiores a 30% em cultivares suscetíveis de milho duro e de milho dentado (BRANDÃO et al., 2003). A resistência do milho ao fungo Puccinia sorghi geralmente é caracterizada por uma reação de hipersensibilidade que resulta em manchas cloróticas com pouca ou nenhuma esporulação do patógeno (PATAKY; CAMPANA, 2007). A resistência a essa enfermidade é descrita com sendo do tipo horizontal ou vertical, com predominância de efeitos aditivos ou de dominância, respectivamente (WISSER; BALINT; NELSON, 2006).. 2.6 Resistência genética de plantas a patógenos. A resistência genética de plantas a patógenos é considerada como a habilidade do hospedeiro em prevenir ou retardar a entrada e a subsequente atividade destes microrganismos em seus tecidos, em um processo dinâmico, coordenado e dependente da existência de mecanismos de proteção estruturais e/ou bioquímicos (PASCHOLATI; LEITE, 1995). Os mecanismos de proteção bioquímicos são caracterizados por reações químicas que produzem substâncias tóxicas aos patógenos ou criam condições adversas ao crescimento desses no interior do hospedeiro. Ao passo que, os mecanismos de proteção estruturais atuam como barreiras físicas, impedindo a  .

(27) 26. entrada do patógeno e a subsequente colonização dos tecidos (SCHWANESTRADA; STANGARLIN; PASCHOLATI, 2008). Esses mecanismos de proteção são bastante complexos e foram desenvolvidos em plantas superiores ao longo da evolução das mesmas, principalmente por meio da ocorrência de mutações e da ação da seleção natural (RESENDE et al., 2008). Eles são subdivididos, considerando-se um particular mecanismo é operativo antes da infecção (mecanismo pré-formado) ou depois da instalação do processo infeccioso (mecanismo pós-formado) (STANGARLIN et al., 2011). Os mecanismos de defesa bioquímicos pós-formados correspondem a compostos antimicrobianos produzidos ou ativados em resposta à presença dos patógenos ou a moléculas eliciadoras desses derivados, recebem a denominação geral de fitoalexinas, as quais são metabólitos secundários de baixo peso molecular, de natureza não proteica e com ampla atividade antimicrobiana (FERREIRA et al., 2007). Já os mecanismos de resistência bioquímicos préformados correspondem a substâncias prejudiciais aos patógenos previamente existentes no hospedeiro, tais como fenóis, alcaloides, lactonas insaturadas e glicosídeos (RESENDE et al., 2008). Os. mecanismos. de. resistência. estruturais. pós-formados. são. desencadeados após o estabelecimento da interação patógeno-hospedeiro, momento em que se podem observar novas barreiras, como as reações citoplasmáticas, papilas e tiloses (ALVES, 2007). Em contrapartida, os mecanismos de defesa estruturais pré-formados estão presentes na planta antes mesmo do contato desses organismos com os patógenos e determinarão o avanço ou não dos fitopatógenos na superfície do hospedeiro. São exemplos dessas estruturas de defesa a espessura e organização da camada de cera, espessura da epiderme, densidade de estômatos e tricomas, bem como, a presença de camadas lignificadas nos tecidos vegetais (DIANESE, 1990)..  .

(28) 27. Nesse contexto, percebe-se que algumas estruturas morfológicas potencialmente podem constituir-se em importantes mecanismos de proteção estrutural e o entendimento do grau de associação dessas estruturas com o nível de resistência a doenças pode contribuir para a elucidação da reação das plantas aos patógenos. Contudo, para a cultura do milho são escassos os trabalhos disponíveis na literatura que tratam deste assunto. Tendo em vista que, para este tipo de abordagem é necessário o emprego de equipamentos que permitam o aumento dessas estruturas morfológicas, as quais são microscópicas. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma técnica que tem sido estimulada, devido aos grandes avanços proporcionados no entendimento da resistência, como atuam e quais são os mecanismos estruturais de defesa (ALVES, 2007)..  .

(29) 28. 3 MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Ambientes. Os experimentos foram instalados em dois locais no município de Lavras - MG, na safra agrícola 2011/2012. O primeiro no dia 17 de novembro na área experimental do Departamento de Biologia da UFLA (DBI/UFLA), situado a 915 metros de altitude, 21°13’32’’ de latitude Sul e 44°58’55’’ de longitude Oeste. O segundo foi semeado após 30 dias, na propriedade particular Xavier, localizada a 865 m de altitude, nas coordenadas 21º13’48’’ latitude Sul e 45º04’54’’longitude Oeste.. 3.2 Híbridos utilizados. Foram avaliados 30 híbridos de milho, sendo 15 comerciais e 15 em fase final de avaliação do programa de melhoramento genético do DBI/UFLA (Tabela 2).. Tabela 2 Descrição dos híbridos de milho utilizados, quanto à base genética e nível de resistência à mancha-branca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC).  .  . Híbridos. Base Genética(1). MB(2). CE(2). FC(2). Empresa. Maximus Viptera. HS. MR. MR. MR. Syngenta. GNZ9501 PRO. HS. R. R. R. Geneze. GNZ9506 PRO. HS. R. MR. MR. Geneze. GNZ9505 PRO. HS. MS. MS. MR. Geneze.

(30) 29. “Tabela 2, continuação”.    .  . Híbridos. Base Genética(1). MB(2). CE(2). FC(2). Empresa. GNZ9626 PRO. HS. R. MR. R. Geneze. GNZ9688 PRO. HS. R. R. R. Geneze. DKB 390. HS. R. MS. MS. Dekalb. AG4051. HT. R. R. S. Agroceres. P30F90. HS. MS. S. MR. Pioneer. P30F80 H. HS. MS. S. MR. Pioneer. P30F87. HT. MR. MR. MR. Pioneer. P32R22 H. HS. S. S. MS. Pioneer. 30P70 H. HS. S. MR. S. Pioneer. BM3061. HT. MS. MR. MR. Biomatrix. BM207. HD. MR. MR. MS. Biomatrix. BIO 001. HD. SI. SI. SI. UFLA. BIO 002. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 003. HD. SI. SI. SI. UFLA. BIO 004. HD. SI. SI. SI. UFLA. BIO 005. HI. SI. SI. SI. UFLA. BIO 006. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 007. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 008. HS. SI. SI. SI. UFLA. BIO 009. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 010. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 011. HT. SI. SI. SI. UFLA. BIO 012. HD. SI. SI. SI. UFLA. BIO 013. HT. SI. SI. SI. UFLA.

(31) 30. “Tabela 2, conclusão” Híbridos. Base Genética(1). MB(2). CE(2). FC(2). Empresa. BIO 014. HD. SI. SI. SI. UFLA. BIO 015. HT. SI. SI. SI. UFLA. Nota: De acordo com informações das empresas/instituições produtoras de sementes. (1) HS= híbrido simples; HD= híbrido duplo; HT= híbrido triplo; HI= híbrido intervarietal. (2) Reação às doenças, sendo: S = suscetível, MS = moderadamente suscetível, MR = moderadamente resistente, R= resistente e SI= sem informação.. 3.3 Condução e avaliação dos experimentos. Os experimentos foram conduzidos no sistema de plantio direto, em áreas nas quais se tem plantado milho após milho durante várias safras. O delineamento experimental utilizado foi o látice triplo 6 x 5, sendo as parcelas constituídas por quatro linhas de três metros, espaçadas 0,6 m entre linhas e 0,25 m entre plantas, com estande de aproximadamente 66.666 plantas ha-1. Contudo, para a coleta dos dados foram consideradas somente as duas fileiras centrais como úteis. Na semeadura de ambos os experimentos foram utilizados 350 kg ha-1 do formulado 08-28-16 (N, P2O5, K2O). Em cobertura, aplicou-se 200 kg ha-1 de sulfato de amônio no estádio fenológico V3 e 200 kg ha-1 de ureia no estádio V6. Os demais tratos culturais foram realizados de acordo com as recomendações técnicas para a cultura do milho na região Sul de Minas Gerais (GROSS; PINHO; BRITO, 2006). Os experimentos foram conduzidos sob condições de incidência natural dos patógenos, porém com o intuito de aumentar o potencial de inóculo nas áreas experimentais, foi semeado o híbrido P30F53 (moderadamente suscetível.  .

(32) 31. às três doenças avaliadas) em bordadura e em faixas de um metro de comprimento nas extremidades de cada bloco. Na avaliação do nível de resistência dos híbridos de milho, foram utilizados os dados de severidade (notas) das doenças considerando-se toda a área de parcela útil, obtidos com o auxílio da escala diagramática proposta pela Agroceres (1996). As notas dessa escala variam de 1 a 9, sendo que 1 = 0% de doença, 2 = 0,5%, 3 = 10%, 4 = 30%, 5 = 50%, 6 = 70%, 7 = 80%, 8 = 90% e 9 = 100% de área da folha lesionada (Anexo 1A). Foram realizadas cinco avaliações, em intervalos de dez dias, a partir de sessenta dias após a emergência das plantas. Em ambos os experimentos foram avaliados a produtividade de grãos, obtida em kg parcela-1 e posteriormente, convertida para kg ha-1, utilizando a área útil da parcela, 3m x 1,2m, que corresponde a 3,6 m2. Sendo os dados referentes a esse caráter corrigidos para a umidade padrão de 13% (Brasil, 2009).. 3.4 Preparo das amostras para a microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo ultraestrutural, foi utilizado o microscópio eletrônico de varredura LEO Evo 40 do Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultraestrutural da UFLA. Para tanto, aos 60 dias após a emergência das plantas de milho, no segundo ambiente, foi coletado um fragmento na região mediana da primeira folha acima da espiga em uma das plantas presente na área central da porção considerada útil de cada parcela. Com base nos resultados dos experimentos conduzidos em campo, os híbridos foram discriminados em cinco níveis de resistência à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum. Sendo considerado a= altamente resistente.  .

(33) 32. (AR); b= resistente (R); c= moderadamente resistente (MR); d= moderadamente suscetível (MS); e= suscetível (S), tal como proposto por Juliatti e Souza (2005). Posteriormente, foi selecionado um híbrido simples referente a cada um desses níveis de resistência para que os fragmentos vegetais provenientes dos mesmos viessem a ser preparados de acordo com o procedimento empregado por Alves (2004). Tal procedimento consistiu em colocar os tecidos vegetais em fixador primário Karnovsky modificado (Glutaraldeído 2,5%, Formaldeído 2,5%, em tampão cacodilato de sódio 0,05M ph 7,2 e CaCl2 0,001 M), onde foram mantidos por cinco meses. Após isso, os fragmentos de cada híbrido foram subdivididos utilizando um bisturi e metade dos mesmos conduzidos à série de três lavagens em tampão cacodilato de sódio 0,05M e transferidos para glicerol 30%, onde ficaram por 30 minutos. Subsequentemente foram imersos em nitrogênio líquido e submetidos à fratura sobre uma superfície metálica resfriada com nitrogênio líquido. Os fragmentos foliares provenientes de cada um dos híbridos, nos quais empregou-se o método de corte transversal em nitrogênio líquido e aqueles que ainda se encontravam imersos em fixador primário, foram submetidos à fixação secundária em tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato 0,05M pH 7,2, por uma hora. Posteriormente, esses fragmentos foram lavados em água destilada por três vezes para serem submetidos à desidratação em série de acetona. O tempo de exposição dos híbridos às soluções foi de 10 minutos para cada concentração de acetona, em ordem crescente de concentração, sendo que a primeira exposição foi na solução a 25%, posteriormente 50%, 75%, 90% e por último, mais três exposições de 10 minutos cada, em solução acetona a 100%. Uma vez desidratado, os híbridos foram submetidos à etapa de secagem ao ponto crítico e posterior banho de ouro. Com isso, as amostras foram conduzidas para o microscópio eletrônico de varredura para a geração das imagens..  .

(34) 33. Neste momento, na face abaxial das folhas de milho foram tomadas medidas da espessura da epiderme, densidade estomática, densidade de tricomas e avaliada a organização da camada de cera. Sendo avaliadas três repetições por híbrido e utilizado um aumento de 400 vezes para avaliar a densidade estomática e a densidade de tricomas, 800 vezes para mensurar a espessura da epiderme e 3.000 vezes para avaliar a organização da camada de cera.. 3.5 Análises estatísticas. 3.5.1 Análise dos dados da produtividade de grãos e da reação às doenças As notas de severidade das doenças obtidas nas cinco avaliações foram utilizadas para estimar o progresso da mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum na cultura do milho. Para isso, foi calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), tal como proposto por Campbell e Madden (1990). Os dados da AACPD e da produtividade de grãos foram submetidos à análise de variância individual, considerando todos os efeitos fixos, exceto o erro experimental, a partir do modelo estatístico, equação (1).. Yijk = m + ti + rk +bj(k) + e(ijk). Em que: Yijk: valor do híbrido i no bloco j dentro da repetição k; m: média geral do experimento; ti: efeito do híbrido i ( i =1...30); rk: efeito da repetição k ( k =1, 2, 3);.  . (1).

(35) 34. bj(k): efeito do bloco j dentro da repetição k (j =1...6); e(ijk): erro experimental associado à observação Yijk. As variâncias do erro dos dados de AACPD e da produtividade de grãos foram submetidas ao teste de Hartley (NETER; WASSERMAN, 1974). Mediante homogeneidade das mesmas, foi realizada a análise de variância conjunta envolvendo os dois ambientes, considerando todos os efeitos fixos, exceto o erro experimental, a partir do modelo estatístico, equação (2),. Yijkp = m + ti + ap + rk(p) +bj(kp) + taip + e(ijkp). (2). Em que: Yijkp: valor do híbrido i no bloco j dentro da repetição k e ambiente p; m: média geral do experimento; ti: efeito do híbrido i ( i =1...30); ap: efeito do ambiente p ( a =1 e 2); rk(p): efeito da repetição k dentro do ambiente p ( k =1, 2, 3); bj(kp): efeito do bloco j dentro da repetição k e no ambiente p (j =1...6); ta(ip): efeito da interação híbridos x ambientes; e(ijkp): erro experimental associado à observação Yijkp. As análises de variância foram efetuadas utilizando o software SAS (SAS INSTITUTE INC, 2000). As médias dos híbridos foram agrupadas pelo teste de Scott e Knott (1974), a 5% de probabilidade, com o uso do software GENES (CRUZ, 2001)..  .

(36) 35. 3.5.2 Análise dos dados das épocas de avaliação das doenças Nesse caso foi adotada a metodologia proposta por Lopes et al. (2011), em que os dados da severidade de cada uma das doenças em cada época de avaliação foram submetidos à análise de variância individual, considerando todos os efeitos fixos, exceto o erro experimental, a partir do modelo estatístico, equação (3).. Yijk = m + ti + rk + bj(k) + e(ijk). (3). Em que: Yijk: valor do híbrido i no bloco j dentro da repetição k; m: média geral do experimento; ti: efeito do híbrido i ( i =1...30); rk: efeito da repetição k ( k =1, 2, 3); bj(k): efeito do bloco j dentro da repetição k (j=1...6); e(ijk): erro experimental associado à observação Yijk. Posteriormente, as variâncias do erro das épocas de avaliação foram submetidas ao teste de Hartley (NETER; WASSERMAN, 1974) e, mediante homogeneidade das mesmas, foi realizada a análise de variância conjunta referente a cada época de avaliação envolvendo os dois ambientes, considerando todos os efeitos fixos, exceto o erro experimental, a partir do modelo estatístico, equação (4).. Yijkp = m + ti + ap + rk(p) +bj(kp) + ta(ip) + e(ijkp) Em que:.  . (4).

(37) 36. Yijkp: valor do híbrido i, no ambiente p, bloco j dentro da repetição k; m: média geral do experimento; ti: efeito do híbrido i (i =1...30); ap: efeito do ambiente p (p=1 e 2); rk(p): efeito da repetição k dentro do ambiente p (k =1, 2, 3); bj(kp): efeito do bloco j dentro da repetição k e do ambiente p (j =1, 2, 3...6); ta(ip): efeito da interação híbridos x ambientes; e(ijkp): erro experimental associado à observação Yijkp. Foram obtidas as estimativas da correlação classificatória de Sperman (STELL, TORRIE, 1980) entre cada época de avaliação da severidade de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum com a respectiva AACPD, utilizando o software SAS (SAS INSTITUTE INC, 2000).. 3.5.3 Análise dos dados dos caracteres ultraestruturais Os dados da mensuração da espessura da epiderme, densidade estomática e densidade de tricomas obtidos a partir da avaliação dos híbridos de milho altamente resistente (AR), resistente (R), moderadamente resistente (MR), moderadamente suscetível (MS) e suscetível (S) à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum foram submetidos à análise de variância, na qual foram considerados todos os efeitos fixos, exceto o erro experimental, de acordo com o seguinte modelo estatístico, equação (5).. Yij = m + ti + e(ij) Em que:.  . (5).

(38) 37. Yij: valor do híbrido i na repetição j; m: média geral do experimento; ti: efeito do híbrido i ( i =1,2...5); e(ij): erro experimental associado à observação Yij. Posteriormente, as médias dos híbridos foram agrupadas pelo teste de Scott e Knott (1974), a 5% de probabilidade, com o uso do software GENES (CRUZ, 2001), também foram obtidas às estimativas da correlação classificatória de Sperman (STELL, TORRIE, 1980) entre os dados da AACPD de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum com a espessura da epiderme, número de estômatos e número de tricomas. Para tanto, foi utilizado o software SAS (SAS INSTITUTE INC, 2000)..  .

(39) 38. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO. 4.1 Produtividade de grãos e reação às doenças. Na análise de variância conjunta para os dados de produtividade de grãos, envolvendo dois ambientes no município de Lavras - MG, observou-se significância da fonte da variação - híbridos (Tabela 3). Isso evidencia que pelo menos um dos híbridos apresentou desempenho diferente dos demais quanto à produtividade de grãos, fato esse esperado, visto que, os híbridos apresentam diferentes constituições genéticas. A fonte de variação - ambientes - também foi significativa (Tabela 3), o que é justificado pelas diferenças nas condições edafoclimáticas presentes entre os dois ambientes de condução dos experimentos. A interação - híbridos x ambientes - foi não significativa (Tabela 3), mostrando que o comportamento dos híbridos foi consistente em ambos os ambientes, o que facilita a indicação dos melhores híbridos para o cultivo na região..  .

(40) 39. Tabela 3. Resumo de análise de variância conjunta da produtividade de grãos (t ha-1) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) obtida a partir de avaliações da severidade de mancha-branca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC), em 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras - MG. Quadrados Médios CE FC Produtividade (AACPD x 10-3) (kg ha-1 x 10-6) Híbridos 29 12.66** 9,05** 8,51** 12,15** Ambientes 1 28,37** 17,90** 36,69** 25,20* Híbridos x Ambientes 29 0,53NS 0,42NS 1,25NS 2,23NS Resíduo 86 0,36 0,40 0,84 2,36 Média Geral 144,00 121,14 135,11 9.562 CV (%) 13,31 16,54 21,53 16,07 NS , *, ** = não significativo, significativo a 5% e 1%, respectivamente, pelo teste F. Fonte de variação. GL. MB. A precisão experimental, avaliada pelo coeficiente de variação experimental, foi de 16,07% (Tabela 3), o que é considerado por Pimentel Gomes (2000) como de média magnitude. Considerando os dois ambientes, a produtividade média foi de 9.562 kg -1. ha (Tabela 3), a qual reflete o grande potencial genético dos híbridos utilizados e o alto nível tecnológico adotado no manejo das áreas experimentais. A análise de variância conjunta para os dados de AACPD de manchabranca, cercosporiose e ferrugem comum, mostra que houve diferenças significativas para a fonte de variação - híbridos - nas três doenças avaliadas (Tabela 3). Isso demonstra que há diferença entre os 30 híbridos avaliados quanto à reação à Phaeospharia maydis, Cercospora zeae maydis e Puccinia sorghi. A fonte de variação - ambientes - foi significativa para as três doenças avaliadas (Tabela 3). Considerando que as condições climáticas influenciam o progresso dessas doenças, o intervalo de 30 dias entre a instalação dos dois experimentos pode ter contribuído para intensificar as diferenças entre os.  .

(41) 40. ambientes (Tabela 4A). O plantio de experimentos em épocas diferentes é comum na experimentação agrícola quando avalia-se doenças em condição de incidência natural dos patógenos (BRITO et al., 2007; JULLIATI; SOUZA, 2005; LOPES et al., 2011). Isso aumenta a probabilidade dos ambientes apresentarem condições favoráveis para que a severidade das doenças ocorra em níveis suficientes para a discriminação dos genótipos quanto ao nível de resistência. A interação - híbridos x ambientes - considerando as três doenças avaliadas foi não significativa (Tabela 3), ou seja, o comportamento dos híbridos foi consistente nos ambientes avaliados. Esses resultados corroboram com o fato da resistência à mancha-branca e à cercosporiose ser do tipo horizontal (BUBECK et al., 1993; LOPES et al., 2007), na qual a interação patógenohospedeiro é menos específica. Além disso, provavelmente ocorreram populações dos patógenos geneticamente semelhantes entre si nos ambientes avaliados. No caso da resistência à ferrugem comum do milho, a mesma pode ser do tipo horizontal ou vertical (WISSER et al., 2006). Assim, é esperado que a expressão de resistência tenha sido do tipo horizontal, justificada pelas mesmas razões apresentadas para a mancha-branca e para a cercosporiose ou pode ter ocorrido o chamado efeito Parlevliet, em que se tem uma falsa aparência de resistência do tipo horizontal, observada quando a população do hospedeiro e do patógeno são heterogêneas (SIDHU, 1984). A resistência horizontal apresenta maior estabilidade por supostamente atuar uniformemente contra várias populações dos fitopatógenos, sendo também considerada mais durável por estar menos sujeita a flutuações na população desses microrganismos (PINHO et al., 2001). Com isso, a resistência horizontal é considerada mais eficiente no controle de várias doenças foliares do milho (BRITO et al., 2011) e a mesma tem sido buscada por programas de melhoramento, os quais concentram esforços no desenvolvimento de híbridos.  .

(42) 41. para as regiões onde à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum são prevalentes. Na avaliação dos dois ambientes, foi constatada alta severidade das doenças avaliadas, tal como indicado pelos valores médios de AACPD de mancha-branca (144,00), cercosporiose (121,14) e ferrugem comum (135,11) (Tabela 3). Os coeficientes de variação experimental obtidos na avaliação da mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum foram de 13,31%, 16,54% e 21,53%, respectivamente (Tabela 3). No contexto de avaliação fitossanitária geralmente a ocorrência dos patógenos causadores de doenças foliares no milho não é uniforme nas áreas experimentais e isso reduz a precisão experimental (SANTOS et al., 2002), tal como pode ser verificado em diversos trabalhos conduzidos com esse propósito (FANTIN; SAWAZAKI; BARROS, 1991; VIEIRA et al., 2009). Os menores valores de coeficiente de variação experimental observados neste trabalho podem ser decorrentes da utilização de bordadura e semeadura da fonte de inóculo na extremidade de cada bloco, cuidados os quais contribuíram para que as doenças ocorressem com maior severidade e os inóculos dos patógenos mais uniformemente distribuídos nos experimentos. De modo concordante com a análise de variância conjunta (Tabela 3), o teste de agrupamento para AACPD de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum evidenciaram grupos distintos (Tabela 4). Foi verificado que dentre os híbridos avaliados há uma grande variabilidade quanto à reação dos mesmos à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum (Tabela 4), o que indica que existe fonte de resistência genética para o controle dessas enfermidades do milho e essa informação é de grande relevância para orientar futuros trabalhos de melhoramento..  .

(43) 42. Os híbridos GNZ9626 PRO e GNZ9501 PRO destacaram-se dentre os demais, por apresentarem alta produtividade de grãos e satisfatório nível de resistência as três doenças avaliadas (Tabela 4). Sendo indicados para o cultivo em regiões e épocas de plantio nas quais há maior pressão dessas doenças. Dentre os híbridos provenientes do programa de melhoramento genético do DBI/UFLA o BIO 006, BIO 007 e BIO 009 apresentaram desempenho produtivo semelhante a alguns híbridos comerciais de alto nível tecnológico, mas foi verificado nos mesmos, baixos níveis de resistência as três doenças avaliadas (Tabela 4). Isso mostra que o cultivo desses híbridos deve ser recomendado para regiões e épocas de plantio nas quais essas doenças foliares são observadas com menor severidade. Além disso, tais resultados reforçam a necessidade da avaliação simultânea da produtividade de grãos e do nível de resistência a doenças para a escolha e recomendação de híbridos para o cultivo nas diferentes regiões do país.. Tabela 4 Valores da produtividade de grãos (kg ha-1) e da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) obtida a partir de avaliações da severidade de mancha-branca (MB), cercosporiose (CE) e ferrugem comum (FC) de 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras - MG Híbridos GNZ9626 PRO GNZ9501 PRO BM207 Maximus Viptera BIO 006 BIO 007 P30F87 GNZ9688 PRO 30P70 H BM3061 BIO 009 GNZ9506 PRO.  . MB(1). CE(1). 77,92 a 65,82 a 123,43 b 140,16 c 139,79 c 180,96 d 146,24 c 68,77 a 240,22 e 169,50 d 156,47 c 110,38 b. (AACPD) 62,14 a 52,19 a 102,10 b 111,69 b 150,66 d 151,01 d 88,24 b 47,89 a 150,28 d 133,43 c 157,44 d 117,65 c. FC(1). Produtividade(2). 125,15 c 61,74 a 144,71 d 111,98 c 168,39 d 214,66 e 127,23 c 46,35 a 188,43 e 148,53 d 132,77 c 123,87 c. (kg ha-1) 13.388 A 13.003 A 11.451 B 11.313 B 10.890 B 10.875 B 10.759 B 10.628 B 10.404 B 10.130 B 10.061 B 9.883 B.

(44) 43. “Tabela 4, conclusão” Híbridos. MB(1). CE(1). FC(1). Produtividade(2). (AACPD) (kg ha-1) DKB 390 66,03 a 161,35 d 172,44 d 9.872 B BIO 004 166,69 d 110,90 b 140,73 d 9.512 C BIO 011 113,77 b 80,11 b 119,31 c 9.498 C P32R22 H 250,46 e 189,85 e 175,25 d 9.334 C GNZ9505 PRO 192,57 d 129,65 c 87,79 b 9.274 C P30F90 150,22 c 185,19 e 146,28 d 9.186 C BIO 005 176,43 d 144,63 d 154,54 d 9.124 C BIO 008 122,14 b 65,42 a 150,96 d 9.096 C BIO 013 144,38 c 134,42 c 109,88 c 8.974 C AG4051 77,01 a 95,12 b 193,46 e 8.683 C BIO 010 166,13 d 135,53 c 111,10 c 8.609 C P30F80 H 181,64 d 188,63 e 115,51 c 8.586 C BIO 002 187,20 d 151,03 d 83,84 b 8.132 C BIO 001 202,08 d 163,06 d 92,76 b 8.083 C BIO 012 136,54 c 100,19 b 148,86 d 7.959 C BIO 003 172,31 d 137,81 c 98,33 c 7.907 C BIO 014 135,29 c 97,19 b 141,49 d 7.004 D BIO 015 59,42 a 39,37 a 217,00 e 5.245 D Média 144,00 121,14 135,11 9.562 (1) Médias seguidas de mesmas letras minúsculas na coluna pertencem ao mesmo agrupamento, pelo teste Scott-Knott, a 5% de significância. Sendo: a= altamente resistente (AR); b= resistente (R); c= moderadamente resistente (MR); d= moderadamente suscetível (MS); e= suscetível (S). (2) Médias seguidas de mesmas letras maiúscula na coluna pertencem ao mesmo agrupamento, pelo teste Scott-Knott, a 5% de significância.. 4.2 Épocas de avaliação das doenças. A AACPD é utilizada para discriminar os genótipos quanto ao nível de resistência a doenças, pois essa metodologia permite quantificar a ação dos patógenos por estimar o progresso da doença ao longo do ciclo da cultura (CAMPBELL; MADDEN, 1990). Esse método de avaliação é considerado mais estável, sendo menos afetado pela época de avaliação e flutuações ambientais quando comparada com.  .

(45) 44. a avaliação em uma única época (SOUZA; DUARTE, 2002). Contudo, nem sempre é viável em um programa de melhoramento genético avaliar os mesmos híbridos em diversas épocas ao longo de seu ciclo. Isso porque geralmente são conduzidos experimentos com centenas ou até milhares de genótipos em cada safra, o que leva o melhorista a tomar a decisão de avaliar os híbridos em uma única época, visando poupar tempo e recurso financeiro. Por meio da análise de variância conjunta para os dados de severidade, envolvendo dois ambientes, três doenças e cinco épocas de avaliação, observouse que a fonte de variação - híbridos - foi significativa em todas as épocas (Tabela 5). Isso mostra que em cada época pelo menos um híbrido diferiu dos demais quanto à reação a Phaeospharia maydis, Cercospora zeae maydis e Puccinia sorghi. Na tabela 6, estão representados os coeficientes de correlação de Sperman entre as notas de severidade de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum em cada época de avaliação com a respectiva AACPD, na qual percebe-se que todas as correlações estimadas foram positivas e significativas. No entanto, aos 60 e 70 dias após a emergência das plantas foram estimadas correlações de Sperman com valores de menor magnitude (Tabela 6). Sendo isso, atribuído ao fato dessas épocas de avaliação apresentarem menores valores médios para a severidade dessas enfermidades (Tabela 5), o que demonstra que as mesmas não são as épocas mais indicadas para a discriminação fenotípica do nível de resistência a essas doenças na cultura do milho. Nos resultados das avaliações realizadas aos 80, 90 e 100 dias após a emergência das plantas foram observadas maiores valores médios para a severidade dessas doenças (Tabela 5), acompanhados também, por elevados valores de correlação de Sperman (Tabela 6). Esses resultados mostram que as informações obtidas quanto ao nível de resistência dos híbridos às doenças avaliadas com o emprego da AACPD são semelhantes às observadas ao se optar.  .

(46) 45. por uma única avaliação entre 80 e 100 dias após a emergência das plantas, o que pode proporcionar maior eficiência no processo seletivo. Resultados semelhantes foram obtidos no trabalho conduzido por Souza e Duarte (2002), no qual ao avaliar à mancha-branca do milho foram verificadas correlações positivas e de alta magnitude entre a AACPD e as épocas de avaliação 85, 95 e 105 dias após a semeadura. Corroborando com isso, Lopes et al. (2011), avaliando essa mesma enfermidade do milho, verificaram que estimativas aos 15 e 30 dias após o florescimento, fornecem correlações positivas e de alta magnitude com a AACPD.. Tabela 5 Resumo da análise de variância conjunta para severidade de manchabranca, cercosporiose e ferrugem comum em 30 híbridos de milho avaliados aos 60, 70, 80, 90 e 100 dias após a emergência (DAE), em dois ambientes no município de Lavras - MG.  . Fonte de Variação. GL. 60. Híbridos Ambientes Híbridos x Ambientes Resíduo Média CV (%). 29 1 29 86. 1,32** 32,08** 0,25NS 0,17 1,74 23,85. Híbridos Ambientes Híbridos x Ambientes Resíduo Média CV (%). 29 1 29 86. 0,09* 0,00NS 0,04NS 0,05 1,06 22,16. Quadrados Médios 80 90 Mancha-branca 4,59** 10,41** 13,34** 105,80** 39,20** 1,08NS NS 0,64* 1,22 1,14** 0,34 1,11 0,47 2,44 3,67 4,65 23,98 28,75 14,77. 19,36** 51,20** 1,95** 0,48 5,55 12,53. Cercosporiose 7,53** 12,89** 17,42** 4,67* 0,83NS 0,67NS 1,24 0,90 3,02 4,09 36,85 23,17. 23,82** 78,67** 1,21NS 0,84 5,80 15,87. 70. 1,11** 6,80** 0,37NS 0,25 1,56 32,31. 100.

(47) 46. “Tabela 5, conclusão” Quadrados Médios 80 90 100 Ferrugem comum Híbridos 29 0,45** 3,25** 8,42** 10,30** 13,76** Ambientes 1 42,05** 61,25** 10,27* 11,75* 8,45* Híbridos x Ambientes 29 0,30** 0,55NS 2,50NS 1,82NS 2,11NS Resíduo 86 0,13 0,42 1,62 1,85 1,59 Média 1,58 1,96 3,66 4,54 5,10 CV (%) 23,43 33,37 34,84 29,94 24,70 NS , *, ** = não significativo, significativo a 5% e 1%, respectivamente, pelo teste F. Fonte de Variação. GL. 60. 70. Tabela 6 Coeficientes de correlação de Sperman entre as notas provenientes da análise de variância conjunta da severidade de mancha-branca, cercosporiose e ferrugem comum aos 60, 70, 80, 90 e 100 dias após a emergência das plantas com a respectiva área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), em 30 híbridos de milho avaliados em dois ambientes no município de Lavras - MG 60 DAE (1) 70 DAE 80 DAE 90 DAE 100 DAE. AACPD mancha-branca 0,72 (<0,001) 0,79 (<0,001) 0,97 (<0,001) 0,96 (<0,001) 0,93 (<0,001). AACPD cercosporiose 0,44 (0,014) 0,83 (<0,001) 0,97 (<0,001) 0,97 (<0,001) 0,94 (<0,001). AACPD ferrugem comum 0,57 (0,001) 0,56 (0,001) 0,94 (<0,001) 0,96 (<0,001) 0,95 (<0,001). (1). DAE – dias após a emergência; ( ) Entre parêntesis a probabilidade de significância pelo teste t.. 4.3 Caracteres ultraestruturais. A análise de variância para os dados da espessura da epiderme, densidade estomática e densidade de tricomas dos híbridos de milho altamente resistente (AR), resistente (R), moderadamente resistente (MR), moderadamente suscetível (MS) e suscetível (S), à mancha-branca, cercosporiose e ferrugem.  .

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