Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
RAÍSA SALES DE SÁ
MICROAMBIENTE IMUNE NO CARCINOMA DE CÉLULAS
ESCAMOSAS DE LÍNGUA E SUA RELAÇÃO COM
VARIAVÉIS CLINICO-PATOLÓGICAS E SOBREVIDA
IMMUNO MICROENVIRONMENT AND PROGNOSIS OF
TONGUE SQUAMOUS CELL CARCINOMAS
Piracicaba
2019
RAÍSA SALES DE SÁ
MICROAMBIENTE IMUNE NO CARCINOMA DE CÉLULAS
ESCAMOSAS DE LÍNGUA E SUA RELAÇÃO COM VARIAVÉIS
CLINICO-PATOLÓGICAS E SOBREVIDA
IMMUNO MICROENVIRONMENT AND PROGNOSIS OF
TONGUE SQUAMOUS CELL CARCINOMAS
Piracicaba 2019 Orientador: Prof. Dr. Luiz Paulo Kowalski
Coorientador: Pablo Agustin Vargas
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA RAÍSA SALES DE SÁ, E ORIENTADA PELO PROF. DR. LUIZ PAULO KOWALSKI E COORIENTADA PELO PROF. DR. PABLO AGUSTIN VARGAS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Estomatopatologia, na Área de Estomatologia Dissertation presented to the Piracicaba Dental School of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Stomatopathology, in Stomatology area.
Sales-Sá, Raísa,
Sa32m SalMicroambiente imune no carcinoma de células escamosas de língua e sua relação com as variavéis clínico-patológicas e sobrevida / Raísa Sales de Sá. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2019.
SalOrientador: Luiz Paulo Kowalski. SalCoorientador: Pablo Agustin Vargas.
SalDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Sal1. Microambiente tumoral. 2. Linfócitos do interstício tumoral. 3. Antígeno CD3, cadeia zeta. 4. Antígenos CD8. 5. Carcinoma de células escamosas oral. I. Kowalski, Luiz Paulo. II. Vargas, Pablo Agustin, 1973-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Immune microenvironment and prognosis of tongue suqamous cell
carcinomas
Palavras-chave em inglês:
Tumor microenvironment Lymphocytes, tumor-infiltrating CD3 antigen, zeta chain CD8 antigens
Oral squamous cell carcinoma
Área de concentração: Estomatologia Titulação: Mestra em Estomatopatologia Banca examinadora:
Luiz Paulo Kowalski [Orientador] Márcio Ajudarte Lopes
Cláudia Malheiros Coutinho Camillo
Data de defesa: 26-07-2019
Programa de Pós-Graduação: Estomatopatologia
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0003-4563-6531 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/0431171461182621
DEDICATÓRIA
“Robusta, vivaz, Amada por certos Ímpia não serás. Sorrindo te oferto Augúrios de paz”
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Á Deus por me proporcionar à vida, guiado minhas decisões e mesmo em momentos difíceis nunca ter deixado perder a fé.
À minha mãe, Regina, por ser o maior exemplo de amor. Por toda dedicação que teve na minha educação e todos os momentos de maior demonstração de carinho. Sendo meu exemplo de humildade, de profissional, mãe e mulher. Por ser sem dúvidas a minha melhor amiga.
Ao meu pai, Marcelo, por me tranquilizar nos momentos de dificuldade. Nunca deixando render-me aos desafios da vida, é meu exemplo de amizade e lealdade. Obrigada por cada ensinamento, incentivo e amizade.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Francisco Haiter Neto;
À Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba na pessoa da Profa. Dra. Karina Gonzales Silveiro Ruiz e ao Programa de Pós-Graduação em Estomatopatologia em nome do coordenador Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Paulo Kowalski, por sua enorme contribuição na área da cirurgia de cabeça e pescoço, e me permitir ter a honra de ser sua aluna e receber todos seus ensinamentos. Por toda confiança depositada, e seu compromisso contínuo permitiram a execução e conclusão deste projeto.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Pablo Augustin Vargas, por toda a orientação, oportunidades e incentivos dados a mim durante ao longo desse período.
Ao Prof. Dr. Kenneth John Gollob, por toda sua contribuição durante a realização desse trabalho e todos ensinamentos compartilhados ao longo desse projeto.
Aos Profs. Drs. Alan Roger dos Santos Silva, Edgar Graner, Jacks Jorge Júnior, Márcio Ajudarte Lopes, Oslei Paes de Almeida, Pablo Augustin Vargas e Ricardo Della Coletta, professores das áreas de Patologia e Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba por todo suporte, dedicação e valiosos ensinamentos.
Ao AC Camargo Câncer Center na pessoa de seu Diretor Vice-presidente Dr. Ademar Lopes e o departamento de anatomia patológica, na pessoa de seu diretor Drª Maria Dirlei Ferreira de Souza Begnami, que disponibilizaram o pessoal, instalações, amostras, materiais e demais recursos para o andamento deste estudo.
Ao Dr. Clóvis Antônio Lopes Pinto, médico patologista titular do AC Camargo Câncer Center, pela considerada disposição, capacitação e ensinamentos transmitidos.
Aos técnicos do laboratório de Histologia-IHQ-TMA do hospital AC Camargo Câncer Center, em especial ao Lais, Rafaela e Severino, pelo auxilio na busca pelo material histopatológico para realizar a pesquisa.
Ao laboratório Instituto de Anatomia Patológica –IAP, no nome da Dra. Inês Schultz e Dra. Luciana Schultz, que abriram as portas gentilmente disponibilizaram o pessoal, instalações, amostras para o andamento desta pesquisa.
Ao estatístico Vinicius Calsavara, pela realização das análises estatísticas, sempre disposto ao esclarecimento de dúvidas e obtenção de confiáveis resultados.
À equipe do Orocentro Prof. Dr. Marcio Lopes, Rogério de Andrade, Patrícia Fernandes, Isabel Schausltz, Pedro Curioso, Leonardo Reis, Bruno Mariz, Alexandro Azevedo, Érika Graf e Danielle Morelli.
À Profa. Dra. Erika Martins Pereira da Universidade Federal do Maranhão (UFMA), pela oportunidade, dedicação, apoio nas decisões que tomei durante a graduação e por toda as conversas e momentos de tranquilidade nas horas da ansiedade por todos esses anos. À Profa Dra Melaine Mont’ Alverne Lawall Silva, pela oportunidade de ter trabalhado com ela durante a graduação e seu apoio na vida acadêmica, e sendo exemplo de profissional.
Aos meus avôs e avós maternos e paternos por terem me mostrarem o sublime exemplo de respeito ao próximo e amor mais sutil.
Ao Ravick Ferreira, por todo o companheirismo, carinho, risadas compartilhadas, por ser meu porto seguro e ser quem eu quero ter sempre ao meu lado. Obrigada por todo amor, paciência e incentivo dado, te amo.
Ao João Scarini, que esteve sempre ao meu lado durante o mestrado, compartilhando desde o primeiro dia todos os sentimentos nessa longa jornada acadêmica. Me ensinou a ser um ser humano melhor a cada dia, pois ele é um maior exemplo de amor que uma amiga pode ter. Nunca poderei dizer o quanto sou grata por tudo.
À Iara pela amizade por conseguir me entender tão bem, que as vezes nem precisamos explicar o que estamos sentindo, já sabemos apenas pelo olhar. Ao Bruno, que foi mais que um amigo, foi um grande companheiro quando achava que não iria dar conta ele estava sempre disposto a fazer tudo acontecer, sem dúvidas você ganhou uma amiga sincera. Ao Luan, pelas melhores risadas e coreografias que pude ter durante esses anos, você me faz lembrar todos os dias que devemos ser simplesmente felizes e só isso que importa. A Isabel, que sempre esteve disponível para as conversas, momentos de desabafo, uma amiga maravilhosa que ganhei e que torno ela um pouquinho maranhense a cada dia.
À Marisol, que desde o primeiro momento em Piracicaba me ensinou o que era ser pós-graduanda, me deu todo suporte para conseguir ir para São Paulo, mostrou cada lugar no hospital, ajudou desde o momento da construção do projeto até o final por muitas vezes me orientou e mostrou as melhores formas possível para realizar, sou muito grata por tudo.
À Juliana Campos, que veio comigo do Maranhão e que jamais imaginei que depois de 5 anos de graduação ela se tornaria uma irmã para mim, obrigada por estar presente todos os dias e compartilhar um lar comigo e principalmente por me tornar um pouco da sua família, obrigada Tio Hélio e Tia Laura.
Ao Pedro, nosso grande colega que partiu tão cedo de nossas vidas e que deixou grandes saudades.
Aos demais amigos da pós-graduação Rachel, Juliana, Patrícia, Maurício, Leonardo, Mariana, Diego, Carolina Carneiro, Nathalia, Rodrigo, Eliza, Joab e Gabriell por compartilhar todos os momentos de reflexão, ensinamento e diversão. Sempre me lembrarei dos nossos melhores momentos com muito carinho.
RESUMO
O Carcinoma de Células Escamosas oral é a sétima neoplasia maligna mais comum no mundo e afeta principalmente homens entre a quinta e sexta décadas de vida. Diversos fatores relacionados ao paciente, ao tumor e ao tratamento associam-se ao prognóstico. Atualmente, o microambiente imune é considerado parte do tecido neoplásico pois encontra-se em um estado dinâmico inter-relacionado com as células tumorais. As células imunes fazem parte do microambiente, pois essas células são sinalizadas para combater as células neoplásicas, e dependendo da localização e do tipo de célula imune, podem apresentar mecanismos de escape que tendo efeito antitumoral ou pró-tumoral, assim se relacionando com fatores de prognóstico e sobrevida. Devido a isso, este estudo teve como objetivo caracterizar as células imunes no microambiente tumoral do CCE de língua e correlacionar com as características clinico-patológico e avaliar o seu significado prognóstico. Realizamos um estudo retrospectivo com 48 casos de Carcinoma de Células Escamosas de língua em pacientes tabagistas e etilistas com tumores em diferentes estádios clínicos, sem radioterapia ou quimioterapia prévia ao tratamento cirúrgico. Foram realizadas as reações de imunohistoquímica contra CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD1a, CD83, PD-L e PDL-1 e correlacionado com as variáveis clinico-patológicas e de sobrevida. Os resultados apresentaram diferença estatística significante para CD3 (p=0,04), CD8 (p=0,05), CD20 (p=0,03), e CD83 (p=0,01) e esse aumento foi relacionado a melhores taxas de sobrevida global nos pacientes. Além disso, o CD3 foi identificado como fator prognóstico independente. Na análise de correlações entre os marcadores observou-se que CD8 estava significativamente correlacionada com CD3, CD20, CD68, PD-1 e PD-L1, a interação desses marcadores apresentou uma correlação forte, proporcional e estatística significante (p = 0,01 bilateral). As evidências sustentam que a alta expressão dos linfócitos infiltrantes em tumores e de células dendríticas maturas estavam associadas com melhores taxas de sobrevida e prognóstico, mostrando que o microambiente imune tumoral pode ser um importante alvo para intervenção terapêutica em pacientes com CEC de língua.
Palavras-chave: Microambiente tumoral. Linfócitos do interstício tumoral. CD3. CD8. Carcinoma de células escamosas oral.
ABSTRACT
Oral squamous cell carcinoma (OSSC) is the seventh most common malignant neoplasm in the world and affects mainly men between the fifth and sixth decades of life. Several factors related to the patient, the tumor and the treatment are associated with the prognosis. Currently, the immune microenvironment is considered part of the neoplastic tissue, since it is in a dynamic state interrelated with tumor cells. Immune cells are part of the microenvironment, as these cells try to oppose neoplastic cells, and depending on the location and type of immune cell, they possess escape mechanisms that may have an anti-tumor or pro-tumor effect, thus relating to to prognosis and survival. This study aimed to characterize in the immune cells in the tumor microenvironment of the Tongue Squamous Cell Carcinoma, and correlate with the clinical-pathological characteristics and to evaluate its prognostic significance. We performed a retrospective study with 48 cases of Tongue Squamous Cell Carcinoma in smokers and alcoholics with tumors at different clinical stages, where the first treatment should be surgical. The immunohistochemical reactions against CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD1a, CD83, PD-L, and PDL-1 were correlated with clinico-pathological and survival variables. The results showed statistically significant difference for high immune expression CD3 (p= 0.04), CD8 (p=0.05), CD20 (p= 0.03) and CD83 (p= 0.01) was associated with improvement in overall survival rate. Moreover, CD3 was identified as an independent prognostic factor in multivariate analysis. Evidence support the values higher of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and mature dendritic cells (DC) correlated with improvement in overall survival and prognosis in tongue squamous cell carcinoma.
Keywords: Tumor microenvironment. Tumor-infiltrating lymphocytes. CD3. CD8. Squamous cell carcinoma. Cancer of tongue
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 13
1.1 CÂNCER ORAL ... 13
1.2 RESPOSTA IMUNE E MICROAMBIENTE TUMORAL ... 14
1.3 INFILTRADO INFLAMATÓRIO ... 15
1.4 IMUNOTERAPIA ... 17
2 ARTIGO: Prognostic and clinicopathological significance of tumor immune microenvironment in tongue squamous cell carcinomas ... 19
3 CONCLUSÃO ... 41
REFERÊNCIAS ... 42
ANEXO 1: Certificado de aprovação do comitê de ética em pesquisa ... 47
ANEXO 2: Comprovante de submissão do artigo ... 48
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER ORAL
O câncer oral é considerado um grave problema de saúde mundial, uma estimativa do surgimento de cerca de 350 mil casos novos e 170 mil mortes no mundo, das quais 77% ocorrem em países em desenvolvimento (Bray et al., 2018). No Brasil, o câncer oral é o sétimo tumor mais incidente na população. Segundo o Instituto Nacional de Câncer- INCA através do programa de epidemiologia e vigilância do câncer e seus fatores de risco, estimou para o biênio de 2018/2019, cerca de 14.700 novos casos de câncer oral, sendo 11.200 casos em homens e 3.500 casos em mulheres (INCA, 2018).
Dentre as neoplasias malignas orais o Carcinoma de Células Escamosas (CEC), é o tipo histológico mais comum, representando 94% de todas as malignidades orais e 40% dos tumores malignos da cabeça e pescoço (Kowalski et al, 2000). Ocorre com maior frequência em pessoas entre a quinta e a sexta décadas de vida, sendo mais comum em homens. A incidência entre homens, que sempre foi elevada, está diminuindo em relação a observada em mulheres (Stewart et al, 2014, Curado et al., 2016). Moore et al., realizaram um levantamento mundial em tumores malignos na cavidade oral e notou que a localização preferencial foi a língua, sendo a região mais propensas as suas bordas laterais (Moore et al, 2008).
Cerca de 70% dos casos têm como fatores de risco o consumo tabaco e de álcool, sendo considerados os principais agentes associados ao desenvolvimento dessa neoplasia (Barnes et al, 2004, Curado et al., 2016). O tabaco contém até 100 agentes cancerígenos potenciais, tais como nitrosaminas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Alguns deles podem causar mutações do gene supressor do tumor TP53 ou outros genes que perturbam a regulação do ciclo celular e a modulação do sistema imunológico (Bachar et al, 2011).
O álcool altera o metabolismo intracelular epitelial no local alvo, podendo atuar em sinergismo com o tabaco, alterando a permeabilidade da mucosa oral e aumentando o fluxo de agentes cancerígenos através das membranas celulares. Outro efeito do consumo de álcool (especificamente etanol) é sua interferir no reparo do DNA alquilado, além poder ter um efeito imunossupressor (Bachar et al, 2011).
14
1.2 RESPOSTA IMUNE E MICROAMBIENTE TUMORAL
Desde que Ehrlich, em 1909, propôs pela primeira vez a ideia de que as células nascentes transformadas surgem continuamente em nossos corpos e que o sistema imunológico varre e erradica essas células transformadas antes que elas se manifestem clinicamente, a vigilância imunológica tem sido um tópico controverso na imunologia do tumor. A hipótese de imunovigilância do câncer foi introduzida por Burnet e Thomas no século XX, que mostraram que as células tumorais devem ter antígenos reconhecíveis diferentes das células normais e, portanto, o potencial de depuração imunológica. Em seguida, foi demonstrado o papel funcional das células apresentadoras de antígeno na iniciação cruzada para a ativação das células T, e o modelo de vigilância imunológica do câncer foi desenvolvido (Kim et al., 2007; Ferris 2015).
Hanahan et al. (2000) mostraram que com o advento da biologia molecular os pesquisadores começavam a observar os sinais de alterações essenciais na fisiologia celular, que alteram a evolução da doença, o que foi considerado um grande avanço para a ciência. Na década seguinte essa noção foi solidificada e estendida, revelando que a biologia dos tumores não pode mais ser entendida simplesmente enumerando os traços das células cancerígenas, mas deve-se abranger as contribuições do microambiente tumoral para a tumoriogênese (Hanahan
et al, 2011).
No passado, estudos buscavam apenas compreender os sistemas das células tumorais, observando as características próprias delas, como mitose, apoptose, diferenciação celular, entre outras. Mas esses estudos não conseguiram esclarecer algumas questões, isso porque as células epiteliais neoplásicas encontram-se em um estado dinâmico inter-relacionado com o microambiente do tumor (MAT), que contém uma variedade de componentes como células não cancerosas: células imunes, fibroblastos e células vasculares angiogênicas; matriz extracelular (fibras de colágeno e fibronectina) e fatores solúveis (enzimas, fatores de crescimento e quimiocinas). Assim, o MAT passou a ser considerado parte do tecido maligno (Salo et al., 2014).
As células do estroma e os fibroblastos no MAT podem secretar fatores de crescimento, como fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento de fibroblastos e quimiocinas, que não só promovem crescimento e sobrevivência de células malignas, mas também funcionam como uma quimiotaxia que estimulam a migração de outras células para o MAT. Diferentes populações de células T e células B podem ser encontradas no fronte invasivo de tumores; no entanto, ainda é controverso se a presença dessas células no MAT reflete um bom ou mau prognóstico. Para muitos tumores sólidos, o aparecimento de linfócitos natural
killer e linfocitos T no MAT prevê um bom prognóstico. Por outro lado, os macrófagos associados a tumores são mais abundantes nos cânceres, e suas atividades geralmente são pró-tumorigênicas (Hui e Chen, 2015).
Historicamente, tais respostas imunes foram amplamente pensadas para refletir uma tentativa do sistema imunológico de erradicar tumores e, de fato, há evidências crescentes de respostas antitumorais a muitos tipos de tumores com pressão condicional sobre o tumor para evadir a destruição imune. (Hanahan et al, 2011). Até o ano 2000, já havia indícios de que a resposta inflamatória associada ao tumor tinha o efeito paradoxal em relação a sua progressão. Na década que se seguiu, a pesquisa sobre as interseções entre a inflamação e a patogênese do câncer floresceu, produzindo manifestações abundantes e convincentes dos efeitos de promoção de tumores funcionalmente importantes que as células imunes, em grande parte do sistema imune inato, têm na progressão tumoral (Hanahan et al, 2011).
1.3 INFILTRADO INFLAMATÓRIO
Dentre as células imunes peritumorais que envolvem o câncer e que podem ser avaliados como marcadores de prognósticos, pode destacar os macrófagos, os linfócitos e as células dendriticas (CD). Estas células são responsáveis pela resposta do organismo para o reconhecimento de células que não se apresentam na sua característica normal (Hadler-Olsen, 2019). Em tumores primários e em locais metastáticos, tumores associados a macrófagos (TAMs) participam de interações bidirecionais complexas com o fluxo das células tumorais, fibroblastos, células-tronco mesenquimais, células endoteliais e linfócitos T, linfócitos B e células dendriticas (Mantovani et al., 2015).
Os macrófagos representam até 50% de toda a massa tumoral, e quando ativados são os primeiros a tentar combater as células neoplásicas controlando o crescimento tumoral (Solinas et al, 2009). Os macrófagos podem ser classificados, de acordo com a sua ativação esquematicamente em tipo I (M1), classicamente ativado tipo II (M2) ou alternativamente ativado (Solinas et al, 2009; Mantovani et al., 2015). Já no microambiente tumoral, os macrófagos são estimulados por sinais para adaptar as novas células às necessidades tumorais, apresentando preferencialmente ativação alternada ou M2. Uma vez na intimidade do tumor, os macrófagos M2 estimulam direta e indiretamente o crescimento e progressão tumoral, além de promover a angiogenese (Brennan et al., 2010; Alves et al., 2018). Os macrófagos são componentes importantes nos CEC orais, sendo os macrófagos M2 estão relacionados a pior sobrevida. Porém não está claro em qual zona tumoral estas células estão mais correlacionadas aos fatores prognósticos (Alves et al., 2018).
16
Os linfócitos infiltrados em tumores (TIL, do inglês tumor infiltrating lymphocytes) são frequentemente encontrados em tumores, sugerindo o desencadeamento da resposta imune do hospedeiro. A chamada imunogenicidade do tumoral é mediada por antígenos, estes distinguem as células malignas das saudáveis, proporcionando assim um estímulo imunológico (Gooden et al, 2011). Os TILs apresentam funções distintas no microambiente tumoral. Os linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) são diretamente capazes de causar morte de células tumorais. Os linfócitos T CD4+ helper (th) secretam citocinas e tem perfil heterogêneo a depender de sua ativação. Os linfócitos TCD4+ Th tipo 1(Th1) ativam os CTLs, os Th tipo 2 (Th2) estimulam imunidade humoral e eosinófilos, tendo, portanto, atividade antitumoral menos efetiva. Além destes dois subtipos, há os linfócitos TCD4+ regulatórios (Treg) que suprimem a ativação dos linfócitos efetores (Hadler-Olsen, 2019).
O significado clinico-patológico do TILs em vários tipos de câncer humano tem sido uma questão de grande interesse. Estudos vêm demonstrando que a infiltração de linfócitos CD8+ se correlaciona significativamente com um tempo de sobrevivência prolongado de pacientes, pelo menos em certos tipos de câncer. No entanto, a capacidade dos linfócitos como células efetoras pode ser afetada pelo MAT. Por conseguinte, pode ser importante avaliar o estado funcional dos TILs em relação à sua localização no tecido tumoral (Katou et al, 2007).
A infiltração linfocitária global mais baixa (soma de células CD4 e CD8) mostra-se estar associada a taxas de recorrência mais altas, apoiando a alegação de que o equilíbrio de infiltrados celulares imunomediados pode ser mais importante na imunidade do hospedeiro a um câncer específico (Wolf et al., 2015). A atuação dos linfócitos B no microambiente tumoral não está completamente elucidado, sua presença pode estar correlacionada a melhora nas taxas de sobrevida e aumento na recorrência, contudo estudos em CEC oral ainda são poucos conclusivos no aspecto de compreender seu funcionamento e interações com a MAT (Taghavi
et al.,2018).
As células dendriticas atuam no microambiente apresentando antígenos aos linfócitos, principalmente aos TILs. Esse grupo de células dendriticas podem ser subdivididas em 3 grupos, as maturas (CD40, CD80, CD83), as imaturas (CD1a, CD207) e as células plasmocitoídes (CD303, ILT-3) (Mellman and Steinmam,2001; Kushwah and Hu, 2001). Dentre os grupos de células que mais interferem no MAT, temos os grupos de células maturas e imaturas, para os CEC orais, os marcadores preferenciais para o analise encontramos os CD1a e CD83 (Jardim et al., 2018).
1.4 IMUNOTERAPIA
O tratamento do câncer oral avançou consideravelmente com o tratamento cirúrgico sequencial abrangente que inclui a cirurgia em combinação com radioterapia ou quimioterapia. No entanto, a taxa de sobrevivência a 5 anos não melhorou significativamente nas últimas décadas, principalmente devido ao diagnóstico tardio. Assim, esforços mais substanciais estimularam no desenvolvimento de tratamentos mais efetivos para melhorar a taxa de sobrevivência. Devido ao progresso no campo da imunologia tumoral, a imunoterapia surge como uma opção promissora (Quan et al, 2016).
O conceito de que o sistema imunológico pode reconhecer e controlar o crescimento do tumor pode ser datado de 1893, quando William Coley usou bactérias vivas como um estimulante imune para tratar câncer, mas o entusiasmo pela imunoterapia contra câncer tem sido moderado devido à eficácia clínica limitada. Esta eficácia limitada é devido à capacidade das células tumorais para evitar o reconhecimento e a eliminação pelo sistema imunológico, permitindo que elas se estabeleçam no hospedeiro (Yang, 2015).
A imunoterapia ganhou entusiasmos devido a seus agentes usarem o próprio sistema imunológico do paciente para combater o tumor. Assim, compreender a interação das células imunológicas com o microambiente tumoral parece ser o começo para novas formas de tratamento (Linette et al., 2019). Em tumores de cabeça e pescoço a interação do sistema imunológico e as células neoplásicas está bem caracterizados, outro fator importante para esse tipo de tumor é a presença de HPV+, sabendo que seu comportamento tumoral é modificado, na presença do vírus (Solomon et al.,2018).
A principal descoberta para tratamento com imunoterapia foi a proteína de morte programada 1 (PD-1) que funciona bloqueando a interação do linfócito T e a célula neoplásica e o ligante da proteína de morte programada 1 (PD-L1) que impede a detecção das células neoplásicas pelo sistema imune. Assim a interação do PD-1 e PD-L1 formam um complexo de receptores que impedem a ativação e controle das células T (Chen et al., 2013; Muenst et al., 2015; Gong et al., 2018).
Alguns ensaios clínicos iniciaram protocolos imunoterapêuticos, mostrando bons resultados para tumores de cabeça e pescoço. Um estudo em fase Ib Keynote 012 avaliou Pembrolizumab (anti-PD-1) em pacientes com CCE de cabeça e pescoço metastático, esse estudo foi tão promissor que levou um estudo em fase III, Keynote 048 estar sendo acompanhado, com resultados promissores (Moskovitz et al., 2018; Gong et al., 2018; Solomon et al., 2018). Estudos sobre CCE oral estão sendo conduzidos, avaliando o comportamento desse microambiente imunológico, protocolos imunoterapêuticos avaliando apenas CEC orais
18
não foram bem estabelecidos (Wolf et al., 2015; Zhou et al., 2018; Solomon et al., 2018; Hadler-Olsen, 2019).
Para os carcinomas orais estudos recentes vêm buscando compreender a função do sistema imune e associa-los com sobrevida do paciente e níveis de metástase. O desenvolvimento de técnicas de imunohistoquímica e os novos marcadores vem auxiliando para compreender mais o comportamento dos tumores (Kotou et al, 2007; Zancope et al, 2009; Quan
et al, 2016; Hadler-Olsen, 2019).
Entender como cada estádio clínico diferente se comporta imunologicamente pode advir em um maior entendimento e assim trazer respostas para novas técnicas para serem usadas na individualização de tratamento para cada paciente, buscando aumentar a sobrevida.
ARTIGO
Title: Prognostic and clinicopathological significance of tumor immune microenvironment in tongue squamous cell carcinomas
Keywords: Tumor-infiltrating lymphocytes, immune microenvironment, tongue squamous cell carcinoma
Authors: Raísa Sales de Sá1,Pablo Agustin Vargas1, Marisol MirandaGalvis1, Bruno Augusto Linhares Almeida Mariz1, Amanda Almeida Leite1, Luciana Schultz Amorim²
, Oslei Paes de Almeida1, Alan Roger Santos Silva1 Clovis Antônio Lopes Pinto³, Kenneth John Gollob4 and Luiz Paulo Kowalski5.
1 Department of Oral Diagnosis, Piracicaba Dental School, University of Campinas; Piracicaba, São Paulo, Brazil.
2 Department of Anatomic Pathology, Instituto de Anatomia Patológica, Santa Barbara do Oeste- São Paulo, Brazil
3 Department of Anatomic Pathology, A. C. Camargo Cancer Center, São Paulo, Brazil. 4 International Research Center. A. C. Camargo Cancer Center, São Paulo, Brazil.
5 Department of Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology, A. C. Camargo Cancer Center, São Paulo, Brazil.
Corresponding author: Luiz Paulo Kowalski, MD, PhD
Department of Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology A.C. Camargo Cancer Center.
211, Professor Antônio Prudente St, São Paulo, Brazil Postal code: 01509-900
Phone number: +551121895172 E-mail: lp_kowalski@uol.com.br
20
Abstract
Objective: to characterize the immune cells in the tumor microenvironment of Tongue Squamous Cell Carcinoma (TSCC), and to evaluate its clinicopathological and prognostic significance. Study design: forty-eight cases of TSCC with no history of radiotherapy or chemotherapy prior to surgery were selected. Immunohistochemically reactions were carried out against CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD1a, CD83, PD-1 and PD-L1. The type of immune cells was correlated to clinical characteristics, such as tumor size, presence of local and distant metastasis and overall survival. Results: Analysis revealed that high expression of CD3 (p= 0.04), CD8 (p=0.05), CD20 (p= 0.03) and CD83 (p= 0.01), were statistically significant associated with improvement in overall survival rate. Moreover, CD3 was identified as a good independent prognostic factor. While, T proved to be a worse prognostic factor. Conclusion: Our findings evidence to support the values higher of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and mature dendritic cells (DC) correlated with improvement in overall survival in tongue squamous cell carcinoma.
Keywords: Tumor-infiltrating lymphocytes, immune microenvironment, tongue squamous cell carcinoma
Introduction
Oral cancer is a global public health issue which represents the seventh most prevalent cancer worldwide [1]. Oral squamous cell carcinoma (OSCC) originating in the mucosal linings accounts for more than 90% of cases [2]. Many patients have advanced-stage disease at diagnosis, which incur significant morbidity and mortality [3]. The most common site is the tongue, occurring mainly in male individuals, over the age of 50, with a long exposure to tobacco and alcohol [4].
Recently studies, most of the studies sought only to understand the tumor cell systems, observing their own characteristics, such as mitosis, apoptosis, cell differentiation, among others [5]. However, these studies failed to explain some issues, because neoplastic epithelial cells are in a dynamic state interrelated with the tumor's microenvironment (TME) and they are influenced by signals coming from non-cancerous cells [6,7].
TME contains a variety of components such as: immune cells (tumor-infiltrating lymphocytes-TILs, macrophages and dendritic cells), fibroblasts, and endothelial cells; extracellular matrix (fibronectin and collagen fibers), and soluble factors (enzymes, growth factors and chemokines). The function of all these cells makes up a system that tries to block tumor progression [8]. However, studies have showed that tumor cells have several immune escape mechanisms, using that system to favor tumor proliferation and progression [8,9]. Thus, TME became part of the malignant tissue and has an important role in carcinogenesis.
In conventional terms, TILs represent the heterogeneous population of T and B cells, both CD4+ and CD8+ subsets, present within the TME. It is now apparent that the composition of the immune infiltrate can be highly variable even within a group of patients with the same malignant histology [10]. Dendritic cells (DCs) are equipped with molecular sensors high phagocytic activity as immature cells and high antigen-producing machinery capacity as mature cells, working to maintain a balance between tolerance and protective immunity [11]. It has
22
been proposed that OSCC cells escape the antitumor response by several distinct mechanisms: (1) Reducing their inherent immunogenicity, (2) altering Human Leucocyte antigen (HLA) class I molecules and (3) altering immune checkpoint receptors4.
The programmed death receptor 1 (PD-1), programmed death-1 ligand (PD-L1), are immune checkpoints, responsible for inducing immune tolerance, preventing the progression of autoimmune diseases, and protecting tissues from immune aggressions. Currently, immunotherapeutic drugs are being used for breast cancer, small cells lung cancer, and melanoma [9]. For head and neck cancer, there are two approved immunotherapies that target immunological checkpoints, namely the PD-1/PD-L1 inhibitors nivolumab and pembrolizumab [12–14].Immunotherapeutic protocols evaluating only OSCC were not well established, concentrating the studies on to evaluate the behavior of the immune microenvironment in the OSSC [15,16].
Evidence suggests that TIL compositions are promising to complement the current TNM staging and to identify prognosis. Currently, the characterization of the tumor's immune infiltrate is based on the immunohistochemistry (IHC) of effector populations, such as CD8-positive cytotoxic T lymphocytes [12].
In this context, we aimed to evaluate immunohistochemically the immune tumor microenvironment in Tongue Squamous Cell Carcinoma (TSCC) patients and correlate it with clinicopathological features, prognosis and recurrence.
Patients and Methods
Study design and ethical approval
Surgical specimens of TSSC were retrieved from the archives of 33 cases of the A.C. Camargo Cancer Center (São Paulo, Brazil) and 15 case from the Instituto de Anatomia Patologica–IAP (Santa Barbara d’Oeste, Brazil) from 2010 to 2017. The eligibility criteria
included lack of previous treatment, lack of second primary tumor, and tobacco and alcohol consumption. Patients’ medical records were reviewed to retrieve clinicopathological characteristics and survival outcomes. One experienced pathologist (C.L.P) reviewed and classified the TSCCs according to the World Health Organization criteria [17]. This research study was approved by the Human Research Ethics Committee of A.C. Camargo Cancer Center (protocol 2.481.465).
Immunohistochemistry
Immunohistochemical reactions were performed on 3‐µm‐thick sections of paraffin‐ embedded tissues as specified in Table 1. Antigen retrieval was performed using an electric pressure cooker for 15 min. Endogenous peroxidase activity was suppressed using 6% H2O2 for 15 minutes, before the sections were incubated with primary antibodies for 2 hours. Immunohistochemical staining was performed with Advance (Dako, Hamburg, Germany) or Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, USA), according to manufacturer’s instructions. Slides were then exposed to diaminobenzidine tetrahydrochloride (Dako, Hamburg, Germany), and counterstained with Carazzi's haematoxylin.
Immunohistochemical analysis
All cases were quantified by a single pathologist using a light microscope (Nikon, Tokyo, Japan) with a 20X eyepiece in ten sequential fields randomly selected. A semi quantitative analysis was performed for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD83, CD1a and PD-L1 markers, classified as (1) negative, (2) weak, (3) moderate and (4) strong. CD83, CD1a and PD-1 markers were analyzed quantitatively, due to low number of positive cells. PD-L1 expression was evaluated in neoplastic cells, while CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD83, CD1a and PD-1 in the reactive cells and CD83 and CD1a were evaluated in both components.
24
Analysis of the association between immune expression and clinicopathological characteristics of the patients was performed using Student’s t-, Mann–Whitney U, Kruskal– Wallis, and Pearson’s chi-square tests, as appropriate. The determination of two group of observations with respect to a simple cut-point was estimated by use of the maximum of the standardized log-rank statistic proposed by Lausen and Schumacher[18]. Overall survival (OS) probabilities were calculated using the Kaplan–Meier method. Comparisons among survival functions were performed with the log-rank test. The Cox semiparametric proportional hazards model was used to describe the relationship between survival time and covariates[19,20]. In all cases, there is evidence that covariates have a constant effect over time. Statistical analyses were performed using SPSS (version 23) and R (version 3.2.1,) and the significance level was fixed at 5% for all statistical tests.
Results
Clinicopathological features and correlation with survival
Forty-eight cases of patients diagnosed with TSSC were retrieved. The sociodemographic and clinicopathological features are presented in Table 2. Briefly, the mean age was 61.2 years (range 43-86), and males were more affected (73%) than females (27%). All patients were smokers and regularly consumed alcohol. Sixteen (33,3%) patients had their tumors histologically classified as well differentiated, 25 (52.1%) as moderately differentiated, and seven (14,6%) as poorly differentiated.
Regarding tumor staging, 58.3% of patients had initial tumors (T1 and T2) and 41.7% had advanced tumors (T3 and T4). Lymph node metastasis was observed in 37.5% of patients, and no patients presented distant metastasis. Initial clinical stage (I and II stages) accounted for 47.9% and advanced clinical stage (III and IV stages) for 52.1%. Seventeen patients had recurrences and the mean time to recurrence was 37.5 months (range: 0,12- 97,2).
The univariate analysis revealed that immune expression of CD3, CD8, CD20, and CD83, besides clinical T stage (p<0,001), node metastasis (p=0.008), histological grade (p=0,008) and perineural invasion (p=0,037) were associated with overall survival (OS) rates.
Prognostic impact of tumor immune microenvironment
Representative images of immunohistochemical reactions are showed in Figure 1. The Kaplan‐Meier survival analyses showed that patients with higher CD3, CD8, CD20, CD83 had better prognosis (p=0.04; p=0.05; p=0,03; p=0.015), whereas CD4, CD68 and CD1a had no significant effects on OS, as shown in Figures 2 and 3. Furthermore, we included statistical significant variables in univariate analysis to performe a multivariate Cox proportional regression analysis. As shown in Table 3, CD3 expression and T stage were independent prognostic factors for OS in patients with TSCC (p=0.05 and p=0.015, respectively).
Correlation between proteins
The correlation analysis between the proteins showed that CD8 was the marker with higher interaction with the other evaluated markers, where we can see a strong and proportional relation with CD3, CD20, CD83, PD-1, and PD-L1, (p = 0, 01 bilateral), and with CD4 a moderate ratio (p = 0.05 bilateral (Table 4).
Discussion
The immune microenvironment function is to detect and eliminate tumor cells and prevent tumor progression and proliferation. The process of immune surveillance that fights cancer is an important process that comes as an inhibitor of the process of carcinogenesis and maintains homeostasis [8,21]. However, malignant tumors continue to grow even in the presence of immune system cells, using escape mechanisms, turning the immune system in their favor [6,16]. In this context, it is relevant to understand how the immune cells interact with the tumor microenvironment, and whats is its impact on survival.
26
The immune microenvironment consists mainly of macrophages, TILs (T and B lymphocytes), natural killer and dendritic cells [22,23]. Recently, TILs have been characterized by a series of biomarkers to assess the degree of infiltration or activation T cell within the TME. The presence of these cells were correlated with improved prognosis outcomes in a broad range of tumor[10,24]. The high expression of cytotoxic T lymphocytes were positively correlated with survival in head and neck and oral squamous cell carcinoma [25–28]. Zhou et
al., correlation high stromal T‐cell density at the periphery of the tumor as independent prognostic markers for OS and DFS [27]. Similarly, we evaluated the presence of cytotoxic T lymphocytes in the stromal region and found that its high expression is associated with an improvement in survival.
Another interesting result was that the presence of Pan-T cells that proved to be an independent prognostic factor, in addition, to correlate with a better overall survival rate. In concordance with our results, a recent study evaluated the abundance of CD3 + TILs at the invasive margins as an independent prognostic factor for OSCC [26]. Scarse studies have been showed CD3 as a prognostic marker for OSSC, but we have observed that its expression can be incorporated as a good prognostic factor.
The Th helper cell (CD4+) produce a set of cytokines that modulate the function of neighboring immune cells and release chemokines that attract inflammatory cells [23]. However, we did not observe CD4 expression as a prognostic factor [26,29]. Studies evaluating their presence did not achieve any significance when compared with survival data, which is in accordance with our results [15,29].
TIL-Bs can activate the humoral response, producing antibodies specific for the tumor. It is not known how this mediated response is beneficial for the eradication the tumor. B lymphocytes play an important role presentation antigens and producing antibody in the early stages of tumor development [16,23,30]. Our study correlated a high expression of CD20 with
an improvement in OS. Moreover, a strong correlation in between T and B lymphocytes, since B cells promote differentiation of Th1 cells and T cytotoxic might be positive to survival in TSSC [23,30]. Tumor-associated macrophages present two different phenotypes: M1, which exerts antitumor role; and M2-which exerts protumor the latter [31]. CD68 is a pan-macrophage marker, which was related to tumor-suppressor features [31]. In our study, it was not possible to observe any statistical difference between pan-macrophage marker and survival outcomes we believe that this marker is not specific to determine the M1 or M2 phenotype.
Dendritic cells (DC) are responsible for recognize and present antigens to immune cells, mainly T cells. Currently, there is a large number of markers directed to DCs [20,32]. In our study, we selected CD1a (immature DC) and CD83 (mature DC). We found that a higher expression of mature DC was associated with a better OS rate. Pellicioli et al., showed that the presence of mature DCs is associated with early stages of OSSC development [32]. We did not find any differences in immature DC expression related survival. However, Jardim et al., showed that a smaller number of peritumoral immature DC predicts higher recurrence rates and lower survival outcomes [20]. Apparently, infiltrating DCs prevent tumor growth, despite tumor cells have escape mechanisms that could prevent the accumulation of mature DCs during tumor progression [32,33].
The main finding for the field of tumor immunovigilance was the of programmed death protein 1 (PD-1) which blocking the interaction between T lymphocyte and the neoplastic cell and the programmed death-ligand 1 (PD-L1), present in neoplastic cells preventing their detection and elimination by the immune system. Thus, the interaction of PD-1/PD-L1 forms a complex of receptors the activation and control of T cells [13,28,34,35]. Although in our studies, there were no statistical differences for PD-1 and PD-L1 associated with survival rates in TSSC, we noticed a strong and intense correlation between the increase of PD-1/CD8 and PD-L1/CD8. The implications of PD-1/PD-L1 signaling on T cell differentiation are likely to
28
expand the accepted roles of PD-1 as an immunosuppressive pathway, being an new target for therapeutic intervention [21,28,36].
In conclusion, we determined the possible importance of immunological markers and their correlations with survival rates of patients with TSSC. Evidence to support the values higher of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and mature dendritic cells (DC) correlated with improvement in overall survival in TSSC, influenced by characteristics and behaviors tumor. CD3 was an independent marker of prognosis and few studies evaluated this immune marker as a prognostic marker. The PD-1/PD-L1 and CD8 ratio is a promising immunotherapeutic target, our study showed that its high expression is correlated. Finally, we provide more evidence to support the prognostic values of TILs as viable biomarkers for therapeutic targets in TSSC.
Acknowledgement: this work was supported by the Coordination of Superior Level Staff Improvement– Brasil (CAPES) – Finance Code 001.
References
[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2018;68:394–424. doi:10.3322/caac.21492.
[2] Curado MP, Johnson NW, Kerr AR, Silva DRM e, Lanfranchi H, Pereira DL, et al. Oral and oropharynx cancer in South America. Transl Res Oral Oncol 2016;1:2057178X1665376. doi:10.1177/2057178x16653761.
[3] Scully C, Bagan J. Oral squamous cell carcinoma overview. Oral Oncol 2009;45:301–8. doi:10.1016/j.oraloncology.2009.01.004.
[4] Ng JH, Iyer NG, Tan M-H, Edgren G. Changing epidemiology of oral squamous cell carcinoma of the tongue: A global study. Head Neck 2017;39:297–304. doi:10.1002/hed.24589.
[5] Hanahan D, Weinberg R a. The hallmarks of cancer. Cell 2000;100:57–70. [6] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 2011;144:646–74. doi:10.1016/j.cell.2011.02.013.
[7] Salo T, Vered M, Bello IO, Nyberg P, Bitu CC, Zlotogorski Hurvitz A, et al. Insights into the role of components of the tumor microenvironment in oral carcinoma call for new therapeutic approaches. Exp Cell Res 2014;325:58–64. doi:10.1016/j.yexcr.2013.12.029.
[8] Kim R. Cancer Immunoediting: From Immune Surveillance to Immune Escape. Cancer Immunother 2007:9–27. doi:10.1016/B978-012372551-6/50066-3.
[9] Lim B, Woodward WA, Wang X, Reuben JM, Ueno NT. Inflammatory breast cancer biology: the tumour microenvironment is key. Nat Rev Cancer 2018;18:485–99. doi:10.1038/s41568-018-0010-y.
30
[10] Linette GP, Carreno BM, Linette GP. Tumor-Infiltrating Lymphocytes in the Checkpoint Inhibitor Era 2019.
[11] Bennaceur K, Chapman J, Brikci-Nigassa L, Sanhadji K, Touraine J louis, Portoukalian J. Dendritic cells dysfunction in tumour environment. Cancer Lett 2008;272:186– 96. doi:10.1016/j.canlet.2008.05.017.
[12] Eckert AW, Wickenhauser C, Salins PC, Kappler M, Bukur J, Seliger B. Clinical relevance of the tumor microenvironment and immune escape of oral squamous cell carcinoma. J Transl Med 2016;14:1–13. doi:10.1186/s12967-016-0828-6.
[12] Polverini PJ, D’Silva NJ, Lei YL. Precision Therapy of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J Dent Res 2018;97:614–21. doi:10.1177/0022034518769645.
[13] Gong J, Chehrazi-Raffle A, Reddi S, Salgia R. Development of 1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: A comprehensive review of registration trials and future considerations. J Immunother Cancer 2018;6:1–18. doi:10.1186/s40425-018-0316-z.
[14] Solomon B, Young RJ, Rischin D. Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments. Semin Cancer Biol 2018;52:228–40. doi:10.1016/j.semcancer.2018.01.008.
[15] Wolf GT, Chepeha DB, Bellile E, Nguyen A, Thomas D, McHugh J, et al. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and prognosis in oral cavity squamous carcinoma: A preliminary study. Oral Oncol 2015;51:90–5. doi:10.1016/j.oraloncology.2014.09.006.
[16] Quan H, Fang L, Pan H, Deng Z, Gao S, Liu O, et al. An adaptive immune response driven by mature, antigen-experienced T and B cells within the microenvironment of oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer 2016;138:2952–62. doi:10.1002/ijc.30019.
[17] Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Eds SIA, Health W. Odontogenic and maxillofacial bone tumours. 2017.
[18] Society IB. Maximally Selected Rank Statistics Author ( s ): Berthold Lausen and Martin Schumacher Published by : International Biometric Society Stable URL : http://www.jstor.org/stable/2532740. Society 2010;48:73–85.
[19] Costa V, Kowalski LP, Coutinho-Camillo CM, Begnami MD, Calsavara VF, Neves JI, et al. EGFR amplification and expression in oral squamous cell carcinoma in young adults. Int J Oral Maxillofac Surg 2018;47:817–23. doi:10.1016/j.ijom.2018.01.002.
[20] Jardim JF, Gondak R, Galvis MM, Pinto CAL, Kowalski LP. A decreased peritumoral CD1a+ cell number predicts a worse prognosis in oral squamous cell carcinoma. Histopathology 2018;72:905–13. doi:10.1111/his.13415.
[21] Ferris RL. Immunology and immunotherapy of head and neck cancer. J Clin Oncol 2015;33:3293–304. doi:10.1200/JCO.2015.61.1509.
[22] Munn DH, Bronte V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol 2016;39:1–6. doi:10.1016/j.coi.2015.10.009.
[23] Hadler-Olsen E, Wirsing AM. Tissue-infiltrating immune cells as prognostic markers in oral squamous cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Br J Cancer 2019;120:714–27. doi:10.1038/s41416-019-0409-6.
[24] Barnes TA, Amir E. HYPE or HOPE: The prognostic value of infiltrating immune cells in cancer. Br J Cancer 2017;117:451–60. doi:10.1038/bjc.2017.220.
[25] Nguyen N, Bellile E, Thomas D, McHugh J, Rozek L, Virani S, et al. Tumor infiltrating lymphocytes and survival in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck 2016;38:1074–84. doi:10.1002/hed.24406.
[26] Zhou C, Wu Y, Jiang L, Li Z, Diao P, Wang D, et al. Density and location of CD3 + and CD8 + tumor-infiltrating lymphocytes correlate with prognosis of oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 2018;47:359–67. doi:10.1111/jop.12698.
32
[27] Shimizu S, Hiratsuka H, Koike K, Tsuchihashi K, Sonoda T, Ogi K, et al. Tumor-infiltrating CD8 + T-cell density is an independent prognostic marker for oral squamous cell carcinoma. Cancer Med 2019;8:80–93. doi:10.1002/cam4.1889.
[28] Moskovitz JM, Ferris RL. Tumor Immunology and Immunotherapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J Dent Res 2018;97:622–6. doi:10.1177/0022034518759464.
[29] Dayan D, Salo T, Salo S, Nyberg P, Nurmenniemi S, Costea DE, et al. Molecular crosstalk between cancer cells and tumor microenvironment components suggests potential targets for new therapeutic approaches in mobile tongue cancer. Cancer Med 2012;1:128–40. doi:10.1002/cam4.24.
[30] Taghavi N, Mohsenifar Z, Baghban AA, Arjomandkhah A. CD20+ Tumor Infiltrating B Lymphocyte in Oral Squamous Cell Carcinoma: Correlation with Clinicopathologic Characteristics and Heat Shock Protein 70 Expression. Patholog Res Int 2018;2018:1–7. doi:10.1155/2018/4810751.
[31] Alves AM, Diel LF, Lamers ML. Macrophages and prognosis of oral squamous cell carcinoma: A systematic review. J Oral Pathol Med 2018;47:460–7. doi:10.1111/jop.12643.
[32] Pellicioli ACA, Bingle L, Farthing P, Lopes MA, Martins MD, Vargas PA. Immunosurveillance profile of oral squamous cell carcinoma and oral epithelial dysplasia through dendritic and T-cell analysis. J Oral Pathol Med 2017;46:928–33. doi:10.1111/jop.12597.
[33] Hansen M, Andersen MH. The role of dendritic cells in cancer. Semin Immunopathol 2017;39:307–16. doi:10.1007/s00281-016-0592-y.
[34] Chen DS, Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity 2013;39:1–10. doi:10.1016/j.immuni.2013.07.012.
[35] Muenst S, Soysal SD, Tzankov A, Hoeller S. The PD-1/PD-L1 pathway: biological background and clinical relevance of an emerging treatment target in immunotherapy. Expert Opin Ther Targets 2015;19:201–11. doi:10.1517/14728222.2014.980235.
[36] Gato-Cañas M, Ibañez-Vea M, Escors D, Kochan G, Breckpot K, Arasanz H, et al. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget 2017;8:51936–45. doi:10.18632/oncotarget.17232.
34
Table 1: Antibodies and specifications.
Antibody Company Clone Dilution Antigen
retrieval Staining
CD3 Dako Rabbit
Policlonal 1:300 Citrate buffer pH 6.0 ADVANCE
CD4 Dako Mouse monoclonal 4B12 1:100 EDTA/TRIS pH 9.0 ADVANCE CD8 Dako Mouse monoclonal C8/144B 1:100 EDTA/TRIS pH 9.0 ADVANCE CD20 Dako Mouse monoclonal L26 1:300 Citrate buffer pH 6.0 ADVANCE CD68 Dako Mouse monoclonal KP1 1:300 Citrate buffer pH 6.0 ADVANCE
CD1a Dako Mouse
monoclonal 010 RTU EDTA/TRIS pH 9.0 ADVANCE CD83 Monosan Mouse monoclonal 1H4b 1:50 EDTA/TRIS pH 9.0 ADVANCE PD-1 Abcam Mouse monoclonal NAT105 1:200 EDTA/TRIS pH 9.0 Vectastain PDL-1 Abcam Rabbit monoclonal 73-10 1:500 EDTA/TRIS pH 9.0 Vectastain
Table 2: Summary of clinicopathological features of oral squamous cell carcinoma patients. Parameters Age Range 43- 86 Mean 61.2 Median 61.5 Gender n % Male 35 73.0 Female 13 27.0 Tumor size T1/T2 28 58.3 T3/T4 20 41.7
Lymph node metastasis
N0 30 62.5 N1/N2 18 37.5 Distant metastasis M0 48 100 Clinical Stage I/II 23 47.9 III/IV 25 52.1 Histological grade Well differentiated 16 33.3 Moderately differentiated 25 52.1 Poorly differentiated 7 14.6 Status Alive 28 58.3 Dead 10 20.8 Lost to follow-up 10 20.8 Recurrence Yes 17 35.4 No 31 64.6
36
Figure 1. Immunohistochemical panel used in our study. Representative images showing positivity for (A) CD3; (B) CD4; (C) CD8; (D) CD20; (E) CD68; (F) CD83; (G) CD1a; (H) PD-1 and (I)PD-L1. Original Magnification 20X
38
Figure 2. Infiltrating lymphocytes in TSSC. (A) CD3+ cells in TSCC; (B) High CD3 expression indicating better overall survival; (C) Similar CD3 expression between initial and advanced tumors. (D) CD4+ cells in TSCC; (E) High CD4 expression indicating worsen overall survival; (F) Similar CD4 expression between initial and advanced tumors. (G) CD8+ cells in TSCC; (H) High CD8 expression indicating better overall survival; (I) Similar CD8 expression between initial and advanced tumors. (J) CD20+ cells in TSCC; (K) High CD20 expression indicating better overall survival; (L) Similar CD20 expression between initial and advanced tumors.
Figure 3. Infiltrating macrophages and dendritic cells in TSSC. (A) CD68+ cells in TSCC; (B) High CD68 expression indicating better overall survival; (C) Similar CD68 expression between initial and advanced tumors. (D) CD83+ cells in TSCC; (E) High CD83 expression indicating better overall survival; (F) Similar CD83 expression between initial and advanced tumors. (G) CD1a+ cells in TSCC; (B) High CD1a expression indicating worsen overall survival; (C) Similar CD1a expression between initial and advanced tumors.
40
Table 4. Correlation Spearman between the studied antibodies.
*Correlation significant at 0.05 (bilateral) ** Correlation significant at 0.01 (bilateral)
CONCLUSÃO
• CD3 foi um marcador independente para prognóstico de pacientes com CEC de língua.
• CD8 foi forte e intensamente correlacionado com os demais marcadores analisados neste estudo.
• A alta expressão dos TILs e células dendríticas maturas estavam associadas com melhores taxas de sobrevida e prognóstico, mostrando que o microambiente imune tumoral pode ser um importante alvo para intervenção terapêutica em pacientes com CEC de língua.
42
* De acordo com as normas da UNICAMP/FOP, baseadas na padronização do International Committee of Medical Journal Editors - Vancouver Group. Abreviatura dos periódicos em conformidade com o PubMed.
REFERÊNCIAS *
Alves AM, Diel LF, Lamers ML. Macrophages and prognosis of oral squamous cell carcinoma: A systematic review. J Oral Pathol Med. 2018;47(5):460–7.
Bachar G, Hod R, Goldstein DP, Irish JC, Gullane PJ, Brown D, et al. Outcome of oral tongue squamous cell carcinoma in patients with and without known risk factors. Oral Oncol [Internet].
2011 Jan;47(1):45–50. Available from:
http://cancerres.aacrjournals.org/lookup/doi/10.1158/0008-5472.CAN-16-3453
Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. World Health Organization Classification of Tumours Pathology & Genetics Head and Neck Tumours IARC WHO Classification Head and Neck Tumours. Urology [Internet]. 2004;65(1):214–5. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0090429504011148
Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin [Internet]. 2018;68(6):394–424. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30207593
Brennan MT, Elting LS, Spijkervet FKL. Systematic reviews of oral complications from cancer therapies, Oral Care Study Group, MASCC/ISOO: methodology and quality of the literature. Support Care Cancer [Internet]. 2010 Aug 20;18(8):979–84. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00520-010-0856-3
Chen DS, Mellman I. Oncology meets immunology: The cancer-immunity cycle. Immunity. 2013;39(1):1–10.
Curado MP, Johnson NW, Kerr AR, Silva DRM e, Lanfranchi H, Pereira DL, et al. Oral and oropharynx cancer in South America. Transl Res Oral Oncol. 2016;1(901):2057178X1665376.
Ferris RL. Immunology and Immunotherapy of Head and Neck Cancer. J Clin Oncol [Internet].
2015 Oct 10;33(29):3293–304. Available from:
http://ascopubs.org/doi/10.1200/JCO.2015.61.1509
Gong J, Chehrazi-Raffle A, Reddi S, Salgia R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: A comprehensive review of registration trials and future considerations. J Immunother Cancer. 2018;6(1):1–18.
Gooden MJM, De Bock GH, Leffers N, Daemen T, Nijman HW. The prognostic influence of tumour-infiltrating lymphocytes in cancer: A systematic review with meta-analysis. Br J Cancer. 2011;105(1):93–103.
Hadler-Olsen E, Wirsing AM. Tissue-infiltrating immune cells as prognostic markers in oral squamous cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Br J Cancer. 2019;120(7):714–27.
Hanahan D, Weinberg R a. The hallmarks of cancer. Cell [Internet]. 2000 Jan 7;100(1):57–70. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931
Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell [Internet]. 2011 Mar;144(5):646–74. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013
Hui, L; Chen, Y. Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil. Cancer Letters, [s.l.], v. 368, n. 1, p.7-13, nov. 2015. Elsevier BV.
Instituto Nacional de Câncer - INCA. Estimativas da incidência e mortalidade por Câncer no Brasil, [acesso 2018 Jan 15]. Disponível em URL: http://www.inca.gov.br/estimativa/2016.
Jardim JF, Gondak R, Galvis MM, Pinto CAL, Kowalski LP. A decreased peritumoral CD1a+ cell number predicts a worse prognosis in oral squamous cell carcinoma. Histopathology. 2018;72(6):905–13.
44
Katou F, Ohtani H, Watanabe Y, Nakayama T, Yoshie O, Hashimoto K. Differing phenotypes between intraepithelial and stromal lymphocytes in early-stage tongue cancer. Cancer Res. 2007;67(23):11195–201.
Kim R. Cancer Immunoediting: From Immune Surveillance to Immune Escape. Cancer Immunother. 2007;9–27.
Kowalski LP, Nishimoto IN. Epidemiologia do câncer de boca. In: Parise Jr. O. Câncer de boca: aspectos básicos e terapêuticos. São Paulo: Sarvier; 2000. P. 3-11.
Kushwah R, Hu J. Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system. Immunology. 2011; 133(4): 409-19.
Linette GP, Carreno BM, Linette GP. Tumor-Infiltrating Lymphocytes in the Checkpoint Inhibitor Era. 2019;
Mantovani A, Allavena P. The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages. 2015;212(4):435–45.
Mellman I, Steinman RM. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell. 2001; 106(3): 255-8.
Moore S, Johnson N, Pierce A, Wilson D. The epidemiology of tongue cancer: a review of global incidence. Oral Dis [Internet]. 2008 Jun 28;6(2):75–84. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10702783
Moskovitz JM, Ferris RL. Tumor Immunology and Immunotherapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J Dent Res. 2018;97(6):622–6.
Muenst S, Soysal SD, Tzankov A, Hoeller S. The PD-1/PD-L1 pathway: biological background and clinical relevance of an emerging treatment target in immunotherapy. Expert Opin Ther Targets [Internet]. 2015 Feb;19(2):201–11. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1517/14728222.2014.980235
Quan H, Fang L, Pan H, Deng Z, Gao S, Liu O, et al. An adaptive immune response driven by mature, antigen-experienced T and B cells within the microenvironment of oral squamous cell carcinoma. Int J Cancer [Internet]. 2016 Jun 15;138(12):2952–62. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/ijc.30019
Salo T, Vered M, Bello IO, Nyberg P, Bitu CC, Zlotogorski Hurvitz A, et al. Insights into the role of components of the tumor microenvironment in oral carcinoma call for new therapeutic approaches. Exp Cell Res [Internet]. 2014;325(2):58–64. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.yexcr.2013.12.029
Solinas G, Germano G, Mantovani A, Allavena P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. J Leukoc Biol [Internet]. 2009 Nov;86(5):1065–73. Available from: http://www.jleukbio.org/cgi/doi/10.1189/jlb.0609385
Solomon B, Young RJ, Rischin D. Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments. Semin Cancer Biol [Internet]. 2018;52(January):228–40. Available from: https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2018.01.008
Stewart BW, Wild CP. World Cancer Report. 2014. ISBN: 978-92-832-0443-5. 5.
Taghavi N, Mohsenifar Z, Baghban AA, Arjomandkhah A. CD20+ Tumor Infiltrating B Lymphocyte in Oral Squamous Cell Carcinoma: Correlation with Clinicopathologic Characteristics and Heat Shock Protein 70 Expression. Patholog Res Int. 2018;2018:1–7.
Wolf GT, Chepeha DB, Bellile E, Nguyen A, Thomas D, McHugh J, et al. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and prognosis in oral cavity squamous carcinoma: A preliminary study. Oral
Oncol [Internet]. 2015;51(1):90–5. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.oraloncology.2014.09.006
Zancope E, Costa NL, Junqueira-Kipnis AP, Valadares MC, Silva TA, Leles CR, et al. Differential infiltration of CD8+ and NK cells in lip and oral cavity squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med [Internet]. 2010 Feb;39(2):162–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19754647
46
Zhou C, Wu Y, Jiang L, Li Z, Diao P, Wang D, et al. Density and location of CD3 + and CD8 + tumor-infiltrating lymphocytes correlate with prognosis of oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med. 2018;47(4):359–67.
ANEXO 1: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
48
