Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico

científico

Como se produz uma planta transgénica?

Sofia Duque

Agrobiotecnologia: ponto de vista técnico-científico

DNA

DNA- Ácido desoxirribonucleico (“deoxyribonucleic acid”)

Esta molécula armazena a informação genética do organismo e regula o processo metabólico da vida.

Encontra-se em todas as células dos organismos vivos e em alguns vírus (vírus de DNA).

Cromossoma

Estruturas constituídas por DNA e que permitem a transmissão da informação genética.

Cada espécie possui um numero característico de cromossomas (ex: 46 nas células humanas não reprodutoras).

Genes

Um gene é uma unidade hereditária constituída por uma sequencia de DNA e que ocupa uma posição especifica num cromossoma.

Um gene contem a informação necessária para a construção de uma proteína especifica. É responsável por uma característica geneticamente determinada (ex: resistência a um herbicida, resistência a vírus).

Informação genética

A informação genética está contida na sequencia de quatro moléculas (bases azotadas) que são: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T).

Estas unidades encontram-se ligadas a um açúcar C5 (desoxirribose) e a um ácido fosfórico, criando uma estrutura denominada nucleótido.

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Tradução da informação genética

A informação genética contida no DNA é copiada para o RNA, por emparelhamento das bases azotadas (C::G) e (A::U).

Nota: No RNA a base timina (T) é substituída pelo uracilo (U).

No RNA, estas unidades encontram-se ligadas a um açúcar (ribose) e a um acido fosfórico. O RNA e usualmente uma molécula linear.

RNA

RNA- Ácido ribonucleico (“ribonucleic acid”)

Esta molécula copia a informação que recebe do DNA e traduz essa informação de modo a que sejam produzidas as proteínas necessárias a vida.

DNA mRNA Proteína Característica

O código genético

O código genético; que é estabelecido pela ligação sequencial das quatro moléculas anteriormente referidas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T); é posteriormente transcrito para o RNAm (sob a forma de U, G, C e A) e traduzido para ligar aminoácidos com vista a formar proteínas.

Proteínas

Proteínas são longos polímeros de amino- ácidos ligados por ligações peptídicas. Existem 20 aminoácidos diferentes e é a ordem e tipo de aa ligados que caracterizam uma proteína.

Os genes codificam para diferentes proteínas, estas podem funcionar como enzimas (catalizadores de reacções químicas), como unidades estruturais ou de armazenamento na célula.

Agrobiotecnologia: ponto de vista tecnico-cientifico

Quais as vantagens?

Saúde: Produtos mais baratos e mais seguros; fonte mais barata de vacinas; aumento do valor nutricional em alimentos. Agricultura: Resistência a pestes e doenças; tolerância a factores ambientais; resistência a herbicidas; aumento de produtividade; maior tempo de armazenamento; alteração da cor e do sabor.

OGMs

Organismos geneticamente modificados são organismos que são manipulados por engenharia genética (EG).

A EG ou “tecnologia do DNA recombinante” é o processo de transferência de genes individuais, seleccionados, de um organismo para outro, com o objectivo de reproduzir características da espécie original.

O que é um OGM?

Produção de fármacos

- 1982 - Primeiro fármaco (insulina) produzido por engenharia genética (EG) consistiu na clonagem de DNA humano em bactérias.

(Inicialmente a insulina comercial era derivada de suínos).

Exemplos:

Alguns agentes biofarmacêuticos produzidos por EG e aprovados para comercialização.

Nome comercial

Substancia Finalidade Laboratorio

Humulin Insulina humana

Tratamento da diabetes (Dezembro, 1990). Lilly Farma Activase alteplase

recombinante

Tratamento enfarte do miocárdio (Novembro, 1987) e embolismo pulmonar agudo (Junho, 1990).

Genentech, Inc. Adagen adenosina

diaminase

Tratamento de bebés e crianças com imunodeficiência severa (Março, 1990).

Enzon, Inc. Engerix-B - Vacina recombinante contra hepatite B

(Setembro, 1989).

SmithKline Beecham Humatrope somatropina Tratamento da deficiência na hormona de

crescimento em crianças (Março, 1987).

Eli Lilly & Co.

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Plantas geneticamente modificadas

Plantas geneticamente modificadas foram patenteadas em 1985. No entanto, só na década seguinte foram comercializadas as primeiras plantas transgénicas (tomate FlavrSavr, Calgene).

Fonte:USDA

Outros exemplos: Cultivares Bt resistentes a insectos

"Bt" de Bacillus thuringiensis.

Uma bactéria do solo cujos esporos contem uma proteína cristalina (CRY).

No sistema digestivo do insecto esta proteína degrada-se e liberta uma toxina, denominada delta-endotoxina.

Esta toxina paralisa o sistema digestivo provocando a morte do insecto.

Fonte:USDA Cultivares em que foi inserido, no

próprio DNA da planta, uma versão modificada do gene Cry da bactéria. A planta passa a produzir a toxina e quando o insecto se alimenta da planta, ingere a toxina e morre em poucos dias.

A utilização de variedades Bt reduziu drasticamente o uso de pesticidas químicos.

Broca do milho (esquerda) e do algodão (direita), são duas pestes controladas pelo milho e algodão Bt, respectivamente.

O que são cultivares Bt?

Milho Bt (esquerda) e convencional (direita)

Campo de milho Bt (Odemira, Portugal)-Out 05

Fonte:CIB

Fonte:CIB

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Como se produz uma planta transgénica?

Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante

Inserção estável, no genoma de uma planta, de uma sequência codificante e expressável. Essa sequência tem que ser transferida e expressa na descendência.

1) Seleccionar genes responsáveis por características de interesse:

• É o processo mais limitativo desta tecnologia.

• Consiste no isolamento e caracterização de sequencias de DNA responsáveis por

características agronomicamente relevantes.

• Conhecer os genes responsáveis pelo aumento da produtividade, melhoria na

tolerância os stress, alteração de propriedades químicas, ou outros, que possam afectar as características das plantas.

• Identificar um gene responsável por uma característica não e normalmente suficiente;

é necessário conhecer os mecanismos reguladores, que outros efeitos poderá ter na planta e como interactua com outros genes.

Que características se podem introduzir nas plantas com

recurso à Engenharia Genética

?

•Resistência a insectos, nematodes, fungos, bactérias e vírus.

•Resistência ao frio, à seca, à salinidade, a determinado

herbicida e a determinado metal pesado.

•Alteração do conteúdo nutricional em aminoácidos, vitaminas,

antioxidantes, fibras, ácidos gordos, hidratos de carbono,

micronutrientes.

•Alteração da cor, do sabor, da fragrância, e da textura

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2) Clonagem de genes seleccionados

Após selecção de um gene de interesse é necessário uma série de modificações antes da efectiva inserção na planta.

• Isolar e clonar as sequências do DNA • Escolher um promotor

• Possibilidade de alterar o gene clonado

(ex: no gene Bt, nucleótidos A-T foram substituídos por G-C, aumentando a produção da proteína em plantas)

• Incluir uma sequência terminadora

• Adicionar um gene marcador ou de selecção Acção da enzima de restrição EcoRI

As primeiras tentativas de transferência de genes para plantas consistiram na utilização do

Agrobacterium tumefaciens utilizando o sistema natural de transferência de DNA que na natureza produz a doença conhecida por “crown gall”

Agrobacterium tumefaciens

É uma bactéria do solo (Gram-), capaz de colonizar geneticamente as plantas devido a presença de um plasmídeo, plasmídeo Ti (“tumor inducing”). Uma região do plasmídeo Ti, T-DNA(“T ransferred-DNA”), é transferida e integrada no genoma da planta durante o processo de infecção.

3) Métodos de transferência

Transformação mediada pelo Agrobacterium

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Transformação de uma planta com Agrobacterium tumefaciens.

Nota: A transformação é feita célula a célula

Plasmídeo Ti

T-DNA region

vir

genes

ori

12-24 kbp

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Como se constrói

um vector para

Transformação de uma planta com Agrobacterium tumefaciens.

1 - Co-cultura; 2 - Diferenciação em presença de agente selectivo; 3 - interacção entre a bactéria e a célula vegetal. (adaptado de várias publicações)

1

2

3

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Em meio selectivo sobrevivem apenas as plantas que integraram o transgene. • Após a inserção do transgene na célula vegetal os

tecidos são transferidos para um meio selectivo.

• Este meio contém um antibiótico ou herbicida,

dependendo do gene de selecção que foi introduzido no plasmídeo.

• Apenas as plantas que expressam o gene de

selecção irão sobreviver, assumindo-se que essas plantas também possuem o transgene de interesse.

• Nos passos subsequentes do processo apenas

serão utilizadas plantas que sobreviveram a selecção.

A indução e diferenciação de embriões somáticos em Medicago truncatula

5) Sistema de regeneração

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Transformação da M. truncatula

• Ferimento dos explantes com lâmina

infectada numa suspensão de Agrobacterium

• Meio de indução de embriões (com

fitoreguladores : 2,4 –D e Zeatina)

• 5 dias co-cultura, escuras

• Selecção tecidos transgénicos em 100mg/l

Canamicina

• Eliminação do Agrobacterium em 500 mg/l

Carbenicilina

• Diferenciação e maturação dos embriões

Aclimatação e transferência para a estufa das plantas in vitro.

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Resultados

Um processo relativamente moroso…..

154 explants

75 Can

_agregados

embriogénicos

64 embriões

somáticos

40 linhas Can

enraizaram em

50 mg/l Can

33 potenciais linhas

transgénicas

Transferidas para a

estufa para obter

sementes

6) Análise dos Transformantes

Diferentes passos numa reacção de

PCR

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PCR (“Polymerase Chain Reaction”)

Extracção

DNA

Usando “primers”

específicos para o

transgene

1.5 Kbp

WT

Transformantes

C+

Análise da descendência (segregação de sementes)

(Plantas auto-polinizadas)

Plantas T

Semente

Plantas T

Semente

Plantas

Can

_T

Plantas

T

₂

Homozigóticas

6) Análise dos Transformantes

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No entanto, não basta analisar as plantas

transgénicas por métodos de Biologia Molecular

É preciso verificar se a expressão

destes genes resulta numa

alteração

fenotípica

de valor acrescentado

Processo de avaliação exaustivo:

• Actividade do gene introduzido.

• Estabilidade do gene introduzido (transmissão e expressão na descendência). • Inexistência de efeitos indesejáveis no crescimento, qualidade e produtividade.

Mesmo que uma planta “passe” nestes ensaios, provavelmente não será utilizada directamente na agricultura, mas será cruzada com variedades agronomicamente relevantes. (Apenas algumas variedade podem ser eficientemente transformadas e essas não são por vezes as de maior interesse comercial !)

O próximo passo no processo são os ensaios em estufas e no campo com vista a testar o efeito do transgene e a “performance” geral.

Nesta fase também se inclui a avaliação do impacto ambiental e segurança alimentar.

7) Avaliação e Melhoramento

• Library of Crop Technology Lesson Modules

http://croptechnology.unl.edu

• Biotechnology & GMOs

http://gmoinfo.jrc.it/

• Agroecology/ Sustainable Agriculture Program

http://www.aces.uiuc.edu/asap/

•Transgenic Crops: An Introduction and Resource Guide

http://cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/index.html • AgBiotechNet http://www.agbiotechnet.com

Fontes:

• Centro de Informação de Biotecnologia - CIB