INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA CURSO DE GRADUAÇÃO EM FÍSICA - LICENCIATURA
Thaynara Stefany Vieira Ramos
INVESTIGAÇÃO DE COMPLEXOS
BASEADOS EM FÁRMACOS E PROTEÍNAS
Barra do Garças 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA CURSO DE GRADUAÇÃO EM FÍSICA - LICENCIATURA
Thaynara Stefany Vieira Ramos
INVESTIGAÇÃO DE COMPLEXOS
BASEADOS EM FÁRMACOS E PROTEÍNAS
Trabalho de Curso apresentado à Universidade Federal de Mato Grosso - Campus Universitário do Araguaia - Instituto de Ciências Exatas e da Terra, como parte dos requisitos para obtenção do título de Graduado em Física - Licenciatura.
Orientadora:Dra. Nara Cristina de Souza.
"A menina Desacordada, assustada, no passado ela estava... Adormecia um doce de menina... Que de repente sentia... Uma brisa! Forte e fria... Baixinha, chata, egoísta, que faria uma viagem desconhecida... Onde mudaria o rumo de uma família, mas ela
não sabia... Do nada então, uma doença sem compaixão...
De um alguém, que Ela amava sem ilusão. Um homem distante e distraído... Percebeu o que tinha acontecido... Por uma pequena questão, tornou-se um homem de grande coração... E a menina adormecida, agarrou-se,
à uma flor sem vida”.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela vida, saúde e oportunidade de concluir este trabalho.
A minha família que não mediram esforços para me ajudar nos momentos mais difíceis… Em especial, a minha mãe Marly, meu pai Osmar, minha irmã Giselly, minha madrinha María Helena, minha vozinha lá no céu Narcisia, minha avó Elza, meu cunhado Leonardo, meus tios e tias, enfim todos que torceram para esse grande dia.
Ao meu esposo lindo e atencioso Wesley pela paciência, companheirismo, cumplicidade, fidelidade, lealdade, disposição a caminhar junto comigo, pela luta ao mesmo propósito, pelo almejando do mesmo sonho, o mesmo alvo, pela confiança, respeito, união, casamento e por fim a admiração. Agradeço a minha filhotinha Lunna por ter comido alguns trabalhos, por me amar incondicionalmente e deixar meu lar mais alegre e feliz!
A Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) pelo acolhimento em especial ao Grupo de Materiais Nanoestruturados (GMN) pela oportunidade e confiança de amadurecer quanto pesquisadora.
Aos meus orientadores Dra. Nara Cristina de Souza e Dr. Josmary Rodrigues Silva, obrigada por me ensinarem que sonhos são possíveis de alcançar! Vocês são extraordinários. Obrigada pelos momentos de descontração e risadas principalmente com a pequena Alice… Pela dedicação e responsabilidade com a linda e maravilhosa Física.
Aos meus amigos e colegas de graduação, do grupo de pesquisa em especial, ao Marcos, Kevin, Thiego e João pela contribuição para o trabalho. Agradecer à cidade de Barra do Garças pelo acolhimento… Foram vocês que me deram forças para vencer cada obstáculo.
A palavra que expressa à admiração, respeito e carinho por meus professores é AGRADECIMENTO. Agradecer pela paciência, pela partilha de conhecimento, pelos ensinamentos para a vida. O professor não somente ensina, o professor disciplina alunos, aconselha, gerencia atividades, planeja o futuro e principalmente é formador de opinião. O professor nos faz pensar, refletir, colocar as ideias no lugar… Em especial, aos professores Marcio Lemes e Renato Ferreira do curso de Licenciatura em Matemática, aos professores Warley e Maurício do curso de Educação Física e a todos os professores da Física em especial ao professor Adellane, Josmary e Rosângela pelo tempo e contribuição para o trabalho, ao professor Fabrizio pela paciência e dedicação em ensinar. Agradeço ao Professor Ricardo por
aceitar o convite de suplente da banca e contribuição das simulações para as perspectivas do nosso trabalho.
“Se cheguei até aqui foi porque me apoiei no ombro dos gigantes”. Isaac Newton
RESUMO
Interações entre proteínas e fármacos podem levar à formação de complexos fármaco-proteína estáveis com implicações importantes em diversos processos relacionados à saúde humana. Estas interações podem afetar, por exemplo, a distribuição, a concentração livre, a atividade biológica e o metabolismo dos fármacos na corrente sanguínea. Neste trabalho é apresentado uma investigação de espectrofotometria de ultravioleta-visível (UV-Vis) sobre a interação de albumina do soro bovino (BSA) com heparina (HEP) em solução aquosa, sob condições fisiológicas. Foi observado o fenômeno de hipercromismo que sugere interação da BSA com a HEP. Utilizando a equação de Benesi-Hildebrand, constantes de ligação em diferentes temperaturas foram determinadas com valores que indicam afinidade moderada da HEP com a BSA. Filmes casting foram obtidos com diferentes concentrações de heparina e revelaram estruturas que foram caracterizadas pelo conceito de fractais.
Palavras-chave: heparina, albumina, constante de associação, microscopia óptica, dimensão
ABSTRACT
Interactions between proteins and drugs, which can lead to formation of stable drug-protein complexes, have important implications on several processes related to human health. These interactions can affect, for instance, free concentration, biological activity, and metabolism of the drugs in the blood stream. Here, we report on the UV-Visible spectroscopic investigation on the interaction of bovine serum albumin (BSA) with heparina (HEP) in aqueous solution under physiological conditions. Binding constants at different temperatures obtained by using the Benesi-Hildebrand equation. We have found a hyperchromism, which suggested an interaction between BSA and HEP occurring through conformational changes of BSA caused by exposition of tryptophan to solvent. Films from BSA and HEP obtained at different HEP concentrations showed fractal structures, which were characterized by fractal dimension calculated from microscopic image analysis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Diferença e interações da Heparina não fracionada e Heparina de Baixo Peso Molecular (Adaptado Professor Sergio Araujo youtube). ... 15 Figura 2 – Representação da estrutura da BSA (Adaptado de BRITO E ANGARSKA, 2011 ). ... 17 Figura 3 - Representação de uma estrutura fractal sobreposta por malhas de quadrados de lado r cada vez menores. ADAPTADO DE ESQUEF ... 19 Figura 4 - Representação esquemática do processo de obtenção de filmes casting. ... 22 Figura 5 - Esquema do espectro de absorção e um gráfico da absorbância versus o comprimento de onda (Adaptado: www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-2-UV-Vis-1o-Sem-2016-Parte-1.pdf). ... 23 Figura 6 - Espectros UV-VIS das soluções de BSA, heparina (HEP) e BSA+HEP, bem como um espectro de filme casting de BSA+HEP. ... 26 Figura 7- Absorbância versus concentração de HEP em solução. Gráfico da diferença entre os espectros com e sem HEP (23 °C). A linha pontilhada representa um guia para os olhos. As absorbâncias foram avaliadas em 278 nm. ... 27 Figura 8 - Absorbância versus concentração de HEP em solução. Gráfico da diferença entre os espectros com e sem HEP (37 °C). A linha pontilhada representa um guia para os olhos. As absorbâncias foram avaliadas em 278 nm. ... 28 Figura 9 - Regressão linear para a reação de BSA (0,5 g/L) com HEP (0,03-0,5g/L) a 23 °C. 1/[HEP] valores de concentração em mol/L e Aabs variação da absorbância em 278nm. ... 28 Figura 10 - Regressão linear para a reação de BSA (0,5 g/L) com HEP (0,03-0,5g/L) a 37 °C. 1/[HEP] valores de concentração em mol/L e Aabs variação da absorbância em 278nm. ... 29 Figura 11 - Microscopia óptica de filmes casting de BSA e HEP com concentração 0,5 g/L, secos em 23 e 37ºC. As barras de escalas correspondem a 50 m. ... 30 Figura 12 - Microscopia óptica de filmes casting de HEP+BSA em 23 e 37ºC para diferentes concentrações de HEP. ... 32
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 12
2 OBJETIVOS ... 14
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA E REVISÃO ... 15
3.1 HEPARINA ...15
3.2 ALBUMINA DO SORO BOVINO (BSA) ...16
3.3 FRACTAIS ...17
3.4 DIMENSÃO FRACTAL (DF) ...18
3.5 AGREGAÇÃO LIMITADA POR DIFUSÃO ...20
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ... 20
4.1 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES AQUOSAS ...20
4.2 SUBSTRATOS ...21
4.3 FILMES ...21
4.4 ESPECTROSCOPIA DE ULTRAVIOLETA-VÍSIVEL (UV-VIS) ...22
4.5 MICROSCOPIA ÓPTICA ...23
4.6 DETERMINAÇÃO DA DIMENSÃO FRACTAL (DF) ...24
4.7 DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE LIGAÇÃO ...24
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 26
5.1 ISOTERMAS DE ADSORÇÃO ...26
5.2 ESTIMATIVA DA CONSTANTE DE LIGAÇÃO ...28
5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS FILMES ...30
6 CONCLUSÕES ... 34
1 INTRODUÇÃO
A interação entre proteínas e fármacos tem importantes implicações nos processos diretamente relacionados à saúde1. A interação pode resultar em formação de complexos
estáveis que podem exercer efeitos importantes na distribuição, concentração livre e atividade biológica. Uma maneira de investigar os mecanismos de interação entre essas moléculas é buscar compreender as propriedades físico-químicas desses materiais na forma de filmes2.
Em estudos relacionados aos mecanismos de interação entre fármacos e proteínas, as técnicas espectroscópicas, eletroquímicas e cromatográficas são amplamente utilizadas nesses estudos a albumina se destaca por sua capacidade de ligação e transporte de pequenas moléculas3. Neste trabalho, a interação da proteína albumina de soro bovino com o fármaco heparina será analisada, através de técnicas espectroscópicas e microscópicas.
A heparina, HEP, é uma molécula produzida naturalmente pelo organismo por células do sistema imunológico e é igualmente fabricada a partir de vísceras de porco ou gado. Possui propriedades anticoagulantes, e outras ainda pouco exploradas, tais como ação sobre o metabolismo de lipídios, ação anti-infecciosa, anti-inflamatória e antiedemas3.
A albumina de soro bovino (bovine serum albumin, BSA) foi escolhida por ser um componente importante do sangue e por atuar como uma proteína de transporte de várias substâncias endógenas e exógenas 4,5. A albumina possui a propriedade de se ligar com uma variedade de moléculas orgânicas e inorgânicas e essa propriedade define uma de suas funções fundamentais, a de transportar substâncias. A investigação dessas propriedades de ligação e suas mudanças frente a diferentes fatores são extremamente importantes6 por isso a
análise dos mecanismos de ligação de biomoléculas como as proteínas e fármacos é interessante do ponto de vista biomédico, farmacêutico e da bionanotecnologia5.
A ligação da proteína albumina com compostos químicos tem sido um campo de intensa pesquisa nas áreas de materiais, química, biologia e medicina. Processos como a absorção, excreção e toxidade de fármacos durante uma quimioterapia, por exemplo, podem ser afetados pela ligação destes compostos com a albumina3,7. Várias investigações do ponto de vista teórico e experimental3 sobre a ligação da albumina com fármacos tem sido realizadas. Entre elas podemos citar: 3’-azido-3’-desoxitimidina (AZT), aspirina, taxol, cisplatina, atrazina, 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), poliaminas, clorofila, clorofilina, polietilenoglicol (PEG), vanadil, hexamina-cobalto, trióxido de arsênio (As2O3) e astilbina3.
Estudos de interação entre proteínas e fármacos fornecem importantes informações sobre os sítios de ligação, transporte e metabolismo de moléculas no corpo humano, energia de ligação e formação de complexos8. Fármacos podem ser transportados para os seus sítios de ação, ligados a proteínas plasmáticas ou a hemácias sendo que uma pequena fração do fármaco permanece livre e o restante associado principalmente a proteínas. Uma vez que somente o fármaco livre pode exercer sua ação, a resposta terapêutica de um fármaco é diretamente dependente da quantidade de fármaco livre9.
Fármacos geralmente se ligam a sítios específicos de proteínas e alguns fatores influenciam esta interação. Entre eles, a afinidade do fármaco pela proteína: quanto maior for a afinidade, menor será a concentração de droga livre10. A afinidade do fármaco pela proteína pode ser medida pela constante de ligação (K) entre a droga e a proteína. A constante de ligação pode ser determinada através de estudos espectroscópicos. Ela pode ser calculada a partir de regressões lineares considerando-se a variação do valor da absorbância correspondente a formação do produto proteína-fármaco e descontando-se as absorbâncias dos reagentes neste mesmo comprimento de onda11.
2 OBJETIVOS
O principal objetivo deste trabalho é a investigação do sistema de interesse biológico formado de BSA e HEP com potencialidade para ser utilizado como modelo em estudos de interações de proteínas e fármacos. Para isso, investigou-se o fenômeno de interação molecular através de análises espectroscópicas das soluções e foi utilizado a técnica de obtenção de filmes casting para construir e caracterizar a variação morfológica da superfície e sua dependência com as condições de preparo de filmes, quando parâmetros como temperatura das soluções ou de secagem são alterados. O estudo foi complementado pela estimativa da constante de ligação do fármaco a proteína e da análise fractal dos complexos observados nos resultados microscópicos.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA E REVISÃO
3.1 HEPARINA
A heparina, HEP, é o anticoagulante mais utilizado no mundo e foi descoberta acidentalmente, em 1916, por McLeod e Howell, que pesquisavam um pró-coagulante em cérebro de gatos. Trata-se de um mucopolissacarídeo heterogêneo (vários pesos moleculares), com efeitos extremamente complexos sobre o mecanismo da coagulação, sobre os vasos sanguíneos, além de efeitos antiplaquetários15
A HEP atua por meio de dois mecanismos anticoagulantes diferentes: a inibição do fator Xa1 e a inibição direta da trombina. Se liga à antitrombina III, aumentando em mais de 1.000 vezes sua afinidade pelo fator Xa, inibindo assim a cascata da coagulação; adicionalmente, cadeias mais longas de heparina (>18 sequências de sacarídeos), também por meio da antitrombina III, são capazes de inibir diretamente a trombina.12
Figura 1 - Diferença e interações da Heparina não fracionada e Heparina de Baixo Peso Molecular (Adaptado Professor Sergio Araujo youtube).
A HEP também se liga de modo variável às proteínas plasmáticas, às células endoteliais e aos macrófagos, o que inativa parte da heparina circulante (Figura 1). Ela é utilizada nas ICP (Intervenções Coronárias Percutâneas) desde as primeiras angioplastias com o cateter-balão, em 197713. As heparinas denominadas não-fracionadas (HNF) são misturas heterogêneas com peso molecular médio de 15000 daltons e as heparinas de baixo peso
1Definição XA : Conhecidos como "xabans", são uma nova classe de fármacos antitrombóticos que
agem diretamente sobre o Fator X na cascata da coagulação, sem o uso de antitrombina como mediador.
molecular (HBPM) são preparadas por intermédio da despolimerização da HNF por meios químicos ou enzimáticos. O peso molecular médio está entre 3000 a 6000 daltons14.
Comercialmente, são extraídas de mucosa intestinal ou de pulmões de origem suína ou bovina. Como resultado dos recentes relatos do risco de contaminação por prions causadores da encefalopatia espongiforme de bovinos, a extração originária de porcinos é cada vez mais utilizada15.
Estima-se que no mundo aproximadamente 20 milhões de pacientes recebam o fármaco para tratamento ou profilaxia de tromboses venosas ou arteriais e, para isto, é estimada a necessidade de aproximadamente 200 milhões de porcos para produzir as heparinas necessárias para esse consumo. Atualmente, grande parte da heparina é produzida na China, pela grande criação de suínos e pela política de redução dos custos de sua produção16,17
3.2 ALBUMINA DO SORO BOVINO (BSA)
Albumina é uma proteína produzida pelo fígado. Um teste de albumina de soro mede a quantidade de proteína presente na porção de líquido limpo do sangue ela também ajuda a transportar alguns medicamentos e outras substâncias através do sangue e é importante para o crescimento de tecidos e cicatrização7. A albumina é necessária para manter tanto o crescimento quanto a reparação de tecidos. Durante a segunda guerra mundial, foram realizadas experiências para tratar os estados de choque com BSA mas, as reações adversas impediram a continuação dos testes porém, abriram amplo campo de investigação sobre as proteínas18.
A albumina é a proteína principal do plasma e representa 50% das proteínas sanguíneas. Sua principal função é a de regular a pressão osmótica do sangue19 realizando o
transporte de moléculas entre o sangue e os tecidos, por meio de mecanismos osmóticos. Das albuminas disponíveis no mercado, a do soro bovino (BSA) tem sido muito utilizada em estudos biomiméticos, devido à sua estabilidade, disponibilidade, baixo custo e semelhança estrutural com a albumina humana (HSA). A BSA (Figura 2) apresenta uma sequência homóloga de 80% e similaridade da estrutura terciária de 76% quando comparada à albumina humana. As estruturas das albuminas têm sido determinadas e as regiões de ligações preferenciais de fármacos têm sido caracterizadas por cristalografia. 20
Figura 2 – Representação da estrutura da BSA (Adaptado de BRITO E ANGARSKA, 201121 ). A albumina do soro humano é constituída por 585 aminoácidos, sendo 17 grupos de tirosina e apenas um fragmento de triptofano (Trp-214), que está localizado na posição 214 e no subdomínio IIA do arcabouço proteico, enquanto a bovina é composta por 582 aminoácidos, sendo 20 grupos de tirosina e dois fragmentos de triptofano denominados Trp-134 e Trp-212, localizados nos subdomínios IB e IIA, respectivamente, como representado na Figura 1.
Vários estudos sobre a interação da BSA e ligantes tais como 2-(4-N,N-dimetilamino)-fenilimidazo [4,5-b] piridina (DMAPIP-b)7, cloreto de imidazólio iônico líquido22, prednisolona23, aspirina24, resveratrol e genisteína25, curcumina26,27, malaquita verde28, vermelho brilhante 6C29 e drogas anticancerígenas30 foram realizados. Isto porque a albumina possui a propriedade de se ligar com uma variedade de moléculas orgânicas e inorgânicas e essa propriedade define uma de suas funções fundamentais: a de transportar substâncias pelos vasos sanguíneos31. A investigação dessas propriedades de ligação e suas mudanças frente a diferentes fatores são extremamente importantes32, por isso a análise dos mecanismos de ligação de biomoléculas como as proteínas e fármacos é interessante do ponto de vista biomédico, farmacêutico e da bionanotecnologia33.
3.3 FRACTAIS
A geometria fractal estuda as propriedades e comportamentos de figuras mais complexas que a geometria euclidiana (ou dimensão topológica) e descreve situações que não podem ser descritas pela geometria euclidiana, por esta falhar nesses casos. O nome deriva do
Latim fractus, que significa quebrado ou fraturado34. A dimensão de um fractal não é necessariamente um número inteiro, podendo ter dimensão fracionária. A maioria não se enquadra nas definições tradicionais, e gera dúvida em relação a comprimento, área e volume destas entidades matemáticas35.
Entre 1857 e 1913 um grupo de cientistas realizou um trabalho que catalogava alguns objetos como “demônios” por julgarem que não teriam valor significativo para a ciência. A partir deste trabalho surge a ideia de fractal. O desenvolvimento científico em relação aos fractais teve uma aceleração a partir dos anos 60 em consequência da computação, pois criou vários tipos de fractais36. Os primeiros fractais estudados foram o conjunto de Cantor, floco de neve de Koch e o triângulo de Sierpinski37. Existem muitos objetos naturais que são considerados fractais naturais devido ao seu comportamento ou estrutura, mas estes são fractais finitos o que os distingue dos fractais de tipo matemático criado por interações repetitivas38.
Objetos fractais podem ser classificados em duas formas, self-similar e self-affine. Os fractais self-similar são isotrópicos, ou seja, suas estruturas são invariantes se o fator de mudança de escala for o mesmo em todas as direções39. Enquanto que, os fractais self-affine
são anisotrópicos, ou seja, suas estruturas permanecem inalteradas quando o fator de mudança de escala se modifica com a direção40.
3.4 DIMENSÃO FRACTAL (DF)
Os fractais podem ser caracterizados por um parâmetro chamado de dimensão fractal, DF. Portanto, uma estrutura fractal apresenta 3 características fundamentais: auto-similaridade - parte de sua estrutura é semelhante ao todo; invariância de escala - sua forma não se altera com mudanças de escala de observação; e possui uma dimensão não inteira41.
A geometria fractal, em destaque a DF, tem utilização em várias áreas cientificas, como no estudo dos sistemas caóticos, reconhecimento de padrões em imagens, tecnologia, ciências, artes música, etc. Fractais são formas complexas que não podem ser medidas apenas por dimensão topológica42.
A DF surge então como uma alternativa de medição já que pode assumir valores fracionários, obtendo assim o grau de complexidade de uma forma. Pode-se afirmar que a dimensão fractal de um conjunto é um valor que diz o quão densamente um conjunto ocupa o espaço em que ele existe.
Dentre os vários cálculos de dimensão fractal existentes, o contagem de caixa (Box-counting) ou box dimension é um dos mais utilizados42. Sua grande popularidade se deve a sua facilidade de uso em cálculos matemáticos e em estimativas experimentais. O algoritmo para o cálculo dessa dimensão considera uma figura qualquer coberta por um conjunto de quadrados, e calcula o número de quadrados necessários para cobrir toda a figura que é representado por N(r), sendo r a escala, ou seja, número de vezes que o lado da imagem será dividido. Essa divisão pode ser observada nas figuras 2.a e 2.b.43
a)
b)
Figura 3 - Representação de uma estrutura fractal sobreposta por malhas de quadrados de lado r cada vez menores. ADAPTADO DE ESQUEF44
O método representado na FIGURA 2 consiste em sobrepor o objeto com uma malha de quadrados necessários para cobrir toda a imagem e se baseia na relação:
𝑁
𝑟𝐴 = 𝜇. 𝑟
−𝐷 (1)sendo µ uma constante, D a dimensão fractal e o número de caixas de lado r que contenham alguma parte da imagem. Pela relação acima, a DF pode ser escrita por:
𝐷 = −𝑙𝑖𝑚
𝑟→0 ln(𝑁𝑟 𝐴 )ln (𝑟) (2)
Traçando um gráfico log-log de Nr(A) por r obtém-se uma aproximação de uma reta de
coeficiente angular α. A DF pode ser definida45 por DF = - α. Os cálculos geralmente são realizados por meio de um software, que executa a contagem de caixa e gera um gráfico log-log, fornecendo o α, juntamente com a DF.
3.5 AGREGAÇÃO LIMITADA POR DIFUSÃO
A agregação limitada por difusão (Diffusion-Limited Aggregation, DLA) é um dos modelos mais utilizados para descrever o crescimento de agregados. Neste modelo, uma partícula é fixada no centro de uma rede e outra partícula é liberada a partir de um local aleatório longe do ponto central. A partícula liberada move-se seguindo um movimento browniano até atingir um dos sítios mais próximo da partícula central e juntar-se a ela. Depois, outra partícula poderá se ligar em algum dos sítios vizinhos das duas partículas e repetindo-se o processo inúmeras vezes, a superfície vai sendo formada39,46.
Diversos estudos demonstraram que os aglomerados formados e descritos pelo modelo DLA são objetos fractais. O valor de DF foi calculado, utilizando o método de contagem de caixa, como sendo 1,71 0,01 para planos e 2,5 0,01 para estruturas tridimensionais47.
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Neste capítulo são descritos os materiais e os métodos utilizados para a obtenção das soluções e fabricação dos filmes, assim como as técnicas de caracterização utilizadas. Todo o desenvolvimento do trabalho foi realizado no laboratório do Grupo de Materiais Nanoestruturados (GMN).
4.1 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES AQUOSAS
A heparina utilizada foi adquirida da Santa Cruz Biotechnology® e utilizada como recebida. A BSA foi adquirida da Acros Organics®, fração V e 96-100% de pureza, sendo utilizada como recebida. A água utilizada foi obtida por um processo de tratamento em um sistema de osmose reversa da Quimis®, modelo Q842-210, que utiliza uma membrana
porcentagens de sais e matéria orgânica2. O sistema possui uma lâmpada ultravioleta germicida/bactericida de eficiência de 99% para eliminar as bactérias que ainda podem estar presentes na água.
Para os estudos de espectrofotometria no UV-Vis, a solução estoque de HEP e BSA foram preparadas por dissolução em água purificada, com concentração de 0,5 g/L e pH 7 ajustado por adição de hidróxido de amônio (NH4OH). Soluções com concentrações inferiores
foram obtidas a partir das soluções estoque.
4.2 SUBSTRATOS
Foram utilizadas lâminas de quartzo na fabricação dos filmes para os estudos de microscopia óptica e para as medidas de espectrofotometria UV-Vis. As lâminas foram lavadas com água purificada e detergente e em seguida, limpas com álcool isopropílico. Os substratos de quartzo foram escolhidos por não terem baixa absorbância eletrônica na região visível do espectro eletromagnético.
4.3 FILMES
Os filmes foram obtidos pela técnica de casting que é um dos métodos mais simples de obtenção de filmes finos, sendo utilizado, por exemplo, na fabricação de revestimentos superficiais48. Mesmo não apresentando organização molecular, estes tem sido utilizado como uma maneira rápida e fácil para obtenção de sensores eletroquímicos49.
O método consiste, basicamente, na deposição da solução precursora sobre um substrato liso, adequadamente limpo e após a evaporação de todo o solvente utilizado, o filme é formado sobre a superfície do substrato50. A evaporação do solvente também pode ser
acelerada por aquecimento utilizando uma estufa, por exemplo. A espessura do filme pode ser controlada, ajustando-se a concentração da amostra na solução. A representação esquemática da obtenção de filmes casting é apresentada na Figura 3.
Figura 4 - Representação esquemática do processo de obtenção de filmes casting.
Neste trabalho foram preparados filmes de BSA com HEP utilizando 100 µL de solução numa proporção 1:1 (volume), mantendo a concentração de BSA constante (0,5 g/L) variando a concentração da HEP. Com objetivo de investigar possíveis alterações na morfologia, filmes foram obtidos com secagem em temperatura ambiente 23°C e em 37ºC utilizando estufa.
4.4 ESPECTROSCOPIA DE ULTRAVIOLETA-VÍSIVEL (UV-VIS)
Espectroscopias nas regiões do ultravioleta, do visível e do infravermelho são utilizadas para identificar e determinar uma variedade de materiais51. Os métodos espectroscópicos são
classificados conforme a região do espectro eletromagnético. Quanto maior a frequência e menor o comprimento da onda, maior sua energia radiante. A região do visível compreende os comprimentos de onda num intervalo entre aproximadamente 400 – 700 nm, região a qual o olho humano é sensível51.
A absorção molecular na região do ultravioleta-visível do espectro eletromagnético depende da estrutura eletrônica da molécula, uma vez que moléculas diferentes absorvem radiação em diferentes comprimentos de ondas. Assim, a medida da absorção corresponde à radiação absorvida pelo material analisado em função do comprimento de onda. A absorção de energia por um átomo ou molécula conduz a passagem do elétron de um orbital de menor energia (estado fundamental) para um orbital de maior energia (estado excitado)52. Um espectro de UV-Vis obtido de um espectrofotômetro é um gráfico de comprimentos de onda versus a intensidade da absorção, conforme a figura 3.
Figura 5 - Esquema do espectro de absorção e um gráfico da absorbância versus o comprimento de onda (Adaptado: www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-2-UV-Vis-1o-Sem-2016-Parte-1.pdf).
A relação entre a radiação incidente na amostra e a radiação absorvida é dependente da quantidade de moléculas da amostra que absorve num dado comprimento de onda, ou seja, quanto maior for a concentração e a quantidade de absorventes na trajetória do raio incidente, maior será a absorção do analito. Essa relação é expressa através da Lei de Beer-Lambert:
𝑨 = 𝒍𝒐𝒈 𝑰𝟎
𝑰 = 𝜺𝒄𝒍 (3)
A absorbância A é dada pelo logaritmo da razão entre a intensidade de radiação incidente I0 e
a intensidade de radiação transmitida I. A absorbância também pode ser relacionada em função da concentração molar do soluto c, do comprimento da cela de amostra (cubeta) e do coeficiente de extinção molar ε.
Utilizamos um espectrofotômetro Thermo Scientific® de duplo feixe modelo Genesys
10s. O equipamento está conectado a um microcomputador e é controlado por meio de software que recebe os dados oriundos das medidas.
Os microscópios ópticos são equipamentos que utilizam a associação de lentes para reproduzir uma imagem aumentada e detalhada de objetos que não são possíveis de serem visualizados a olho nu. Esta técnica é usada para caracterização de materiais e as informações são obtidas através de luz transmitida ou refletida2.
O microscópio utilizado para a investigação morfológica da superfície dos filmes de BSA+HEP foi um microscópio de fluorescência da Nikon® modelo Eclipse Ci/L. O equipamento possui uma câmera fotográfica digital acoplada, da qual as imagens das amostras são obtidas e armazenadas por um microcomputador.
4.6 DETERMINAÇÃO DA DIMENSÃO FRACTAL (DF)
O software ImageJ é uma poderosa ferramenta para processamento de imagens desenvolvido pela National Institutes of Health. O programa possui código aberto, é baseado em ambiente JAVA além de ser uma ferramenta inestimável para laboratórios de microscopias53 e um dos pioneiros como ferramenta aberta para análise de imagens científicas.
O software ImageJ foi aplicado nos estudos para determinar a dimensão fractal das estruturas formadas nos filmes casting. Utilizou-se a versão 1.45 do software, que está disponível para download no endereço eletrônico: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html.
A dimensão fractal foi obtida pelo método de contagem de caixas. Antes de o software calcular a dimensão fractal de uma imagem é preciso fazer a separação dos pixels que compõem os objetos e o fundo. Isto é feito a partir da segmentação por binarização da imagem que passa a ter dois níveis de luminância: preto e branco54. Por fim, para obtenção dos contornos do objeto aplica-se uma segmentação por detecção de bordas.
4.7 DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE LIGAÇÃO
O uso da espectrofotometria na análise de interações entre macromoléculas e ligantes é uma importante ferramenta, desempenhando um significante papel na área farmacêutica55.
As albuminas séricas promovem o transporte de materiais no sangue e são capazes de se ligar com diferentes compostos biologicamente ativos, como fármacos, esteróides e corantes. Como somente fármacos livres (não ligados) podem exercer sua ação, alguns fatores influenciam sua eficácia no local ativo. Um desses fatores é a afinidade do fármaco pela proteína que pode ser medida pela constante de ligação (K) entre ambos. A constante de
ligação entre proteínas e ligantes pode ser calculada usando uma regressão linear em função de algum parâmetro espectrofotométrico56. A determinação da constante de ligação da BSA com a HEP foi determinada utilizando um gráfico duplo recíproco (1/Aabs vs 1/[HEP]),
obtido em termos das alterações da absorbância em 278 nm em função da concentração de acordo com a equação de Benesi-Hildebrand:
(4)
sendo Aabs a alteração na absorvância a 278 nm, K a constante de ligação, [S] é a
concentração de BSA, [L] é a concentração de HEP, e o coeficiente de extinção ou absortividade molar.
Após 15 minutos de contato, as misturas das soluções foram colocadas em uma cubeta de quartzo para as medidas. Em todas as medidas utilizou-se o volume de 1 ml de BSA e o volume acrescentado de HEP foi constante e igual a 1,0 ml para todas as concentrações analisadas (0,031; 0,062; 0,125; 0,25 e 0,5 g/L). A solução resultante foi descartada após cada medida. Em experimentos com variação de temperatura a mistura das soluções de BSA e HEP foi realizada somente após atingirem a temperatura de investigação desejada: 37 ºC.
O experimento foi repetido em solução aquosa com pH ajustado para 7 sem BSA. Este procedimento tem como objetivo descartar o efeito de absorção da HEP A diferença entre os espectros com e sem BSA, revela o comportamento da BSA frente a HEP. Esse procedimento foi repetido para todas as concentrações de HEP investigadas.
Os espectros de soluções de BSA, HEP e HEP+BSA e o espectro de um filme casting da mistura HEP+BSA são apresentados na figura 5. É possível observar um pico de absorção eletrônica em 278 nm característico para a solução de BSA, o qual é atribuído aos aminoácidos triptofano e tirosina57, enquanto para a HEP a absorção máxima foi detectada em 190 nm58,59. Tanto para a mistura das soluções quanto para os filmes casting a absorção em
278 nm é observada. 200 250 300 350 240 260 280 300 320 0,04 0,05 0,06 0,07 Filme 278 nm A b s o rb â n c ia Comprimento de onda (nm) BSA BSA+HEP HEP Filme
Figura 6 - Espectros UV-VIS das soluções de BSA, heparina (HEP) e BSA+HEP, bem como um espectro de filme casting de BSA+HEP.
5.1 ISOTERMAS DE ADSORÇÃO
Uma isoterma pode ser representada como a medida da absorbância em função da concentração, em temperatura constante. Foram realizadas análises dos espectros da BSA em solução aquosa e suas modificações frente ao acréscimo de HEP em diferentes concentrações e temperatura. A concentração da solução de BSA (0,5 g/L) foi constante em todos os experimentos. Os experimentos foram realizados como descritos na seção 4. A diferença entre os espectros com e sem BSA revela o comportamento da BSA frente a HEP.
As figuras 6 e 7 mostram os gráficos da absorbância e das diferenças entre os espectros com e sem BSA, em função da concentração de HEP para diferentes temperaturas.
É observado que, mesmo com a concentração da BSA permanecendo constante, ocorre um aumento da absorbância em 278 nm. O hipercromismo, aumento da absorbância, pode ocorrer devido a uma alteração conformacional da BSA, causada pela exposição do triptofano60,61. Esse fenômeno indica interação entre BSA com a HEP 61,63.
A figura 6 mostra que para baixas concentrações, em 23 ºC, a absorbância aumenta mais rapidamente, indicando afinidade da HEP com a proteína. Há uma tendência a formação de um patamar de saturação indicando que a interação com a BSA não deve variar com o aumento da concentração de HEP a partir deste ponto. Por outro lado, a formação de patamares não é observada na figura 7. Para os experimentos realizados a 37 ºC a absorbância é aproximadamente quatro vezes menor que os resultados apresentados para 23 ºC o que pode indicar que nessa região de temperatura há uma menor interação entre a BSA e a HEP.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,240 0,242 0,244 0,246 0,248 0,250 Absorbancia 23 oC
Diferença entre os espectros
Concentração (g/L) A b s o rb â n c ia (2 7 8 n m ) 0,145 0,150 0,155 0,160 0,165 ( A b s )
Figura 7- Absorbância versus concentração de HEP em solução. Gráfico da diferença entre os espectros com e sem HEP (23 °C). A linha pontilhada representa um guia para os olhos. As absorbâncias foram avaliadas em 278 nm.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,050 0,055 0,060 0,065 0,070 0,075 0,080 0,085 Absorbância 37 oC
Diferença entre os espectros
Concentração (g/L) A b s o rb â n c ia (2 7 8 n m ) 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050 0,055 0,060 0,065 0,070 ( A b s )
Figura 8 - Absorbância versus concentração de HEP em solução. Gráfico da diferença entre os espectros com e sem HEP (37 °C). A linha pontilhada representa um guia para os olhos. As absorbâncias foram avaliadas em 278 nm.
5.2 ESTIMATIVA DA CONSTANTE DE LIGAÇÃO
A constante de ligação da HEP com a BSA foi estimada como descrito na seção 4.7, a partir dos valores dos coeficientes angulares e lineares determinados nas figuras 8 e 9.
0 1x104 2x104 3x104 4x104 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 23 oC 1/ ABS 1/[HEP] (mol/L) Equation Weight Residual Sum of Squares Pearson's r Adj. R-Square /delta 23 corr /delta 23 corr K = 2,5 x105 R2 0,99
Figura 9 - Regressão linear para a reação de BSA (0,5 g/L) com HEP (0,03-0,5g/L) a 23 °C. 1/[HEP] valores de concentração em mol/L e Aabs variação da absorbância em 278nm.
0 1x104 2x104 3x104 4x104 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 37 oC 1/ ABS 1/[HEP] (mol/L) K = 3.5 x 104 R2 0.85
Figura 10 - Regressão linear para a reação de BSA (0,5 g/L) com HEP (0,03-0,5g/L) a 37 °C. 1/[HEP] valores de concentração em mol/L e Aabs variação da absorbância em 278nm.
As constantes de ligação calculadas foram da ordem de 105 e 104 M-1 para 23 e 37 ºC, respectivamente. O valor de K para a interação de BSA com HEP (105 M) em T= 23 ºC é similar aos encontrados na literatura para os complexos de albumina com polietileno glicol, delfinidina e kaempferol7 e entre heparina e espermina e putrescina 64.
A constante de interação de albumina com clorofila 65 aspirina, taxol, atrazina e quercetina Erro! Indicador não definido. e entre heparina e ácido trinitrobenzeno sulfônico, é da
mesma ordem do valor encontrado para interação da BSA com HEP a 37 ºC (104 M-1). O menor valor de K encontrado corrobora os dados das isotermas que sugerem uma menor interação entre a proteína e fármaco em T= 37 ºC. Na verdade, deve haver uma forte interação repulsiva66 entre a BSA e a HEP nas condições experimentais utilizadas na
execução deste trabalho, visto que em pH fisiológico (~7) tanto a albumina quanto a heparina estão negativamente carregadas. A interação entre a proteína e o fármaco não devem então, ser governados por forças eletrostáticas e podem ser governadas por interações mais fracas como van de Walls, ligações de H ou outras interações específicas.
Valores de constante de ligação entre 1x104 M-1 e 15x104 M-1 são considerados moderados67 e neste caso a absorção e a distribuição do fármaco para os tecidos são viáveis. Quanto menor a afinidade do fármaco pela proteína maior será sua concentração na forma livre. Os resultados sugerem que em condições fisiológicas (pH 7 e T = 37 ºC), a absorção e
distribuição do fármaco em relação aos tecidos estão disponíveis, quanto em condições normais de saúde.
Do ponto de vista farmacológico apenas a fração livre pode ser distribuída isto é, transportada pelo sangue e outros fluidos a todos os tecidos do corpo. A fração da droga ligada a proteína plasmática pode formar um complexo reversível, passível de dissociação. Conforme a parte livre é utilizada pelo organismo, a parte ligada vai se dissociando. O aumento da concentração livre da droga aumenta seu efeito, mas também acelera sua eliminação68.
5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS FILMES
O efeito da temperatura de secagem na morfologia dos filmes casting foi investigado. A figura 10mostra as imagens de microscopia óptica dos filmes casting de BSA e HEP para concentrações de 0,5 g/L obtidos em 23°C e 37ºC. A HEP em filmes secos a 23 ºC apresenta formação de estruturas que não são observadas no filme de BSA e nem em filmes de HEP secos a 37 ºC.
Figura 11 - Microscopia óptica de filmes casting de BSA e HEP com concentração 0,5 g/L, secos em 23 e 37ºC. As barras de escalas correspondem a 50 m.
Os filmes casting da figura 11não cobrem completamente o substrato, mas as imagens são representativas das formações encontradas. Desta análise é possível observar que a morfologia dos filmes é completamente afetada pela variação da temperatura de secagem. Foi observado estruturas fractais em todas as concentrações usadas, para os filmes de BSA+HEP secos a 23 ºC, porém menores e em menores quantidades que os de HEP pura. Estes resultados mostram que as estruturas fractais observadas surgem a partir da interação da BSA com a HEP mas são dependentes da temperatura de secagem dos filmes. Provavelmente, a alta taxa de evaporação do solvente, quando os filmes são secos a 37 oC, inibe a formação de estruturas fractais na superfície do substrato. Exceto para a maior concentração de HEP onde é possível observar a formação de algumas estruturas.
Organizações espontâneas são comuns em sistemas naturais e o entendimento dos mecanismos de ligação de pequenas partículas para formar grandes agregados é interessante na análise e controle dos processos de interação biomolecular. Os filmes secos a 23 ºC possuem habilidade de auto-organização com padrões fractais que dependem da concentração da solução de HEP. Para baixasconcentrações os agregados se organizam na superfície como estruturas discretas e “porosas” (com vazios entre uma formação e outra) ao passo que para maiores concentrações os agregados se organizam mais compactamente e as estruturas vão ficando mais densas.
Figura 12 - Microscopia óptica de filmes casting de HEP+BSA em 23 e 37ºC para diferentes concentrações de HEP.
O conceito de dimensão fractal foi utilizado para caracterizar as estruturas e investigar os mecanismos de formação. As dimensões fractais foram determinadas usando o método de contagem de caixa descrito na seção 3.4.
Tabela 1 - Valores de dimensão fractal para os filmes preparados a partir de BSA+HEP a 23 ºC em diferentes concentrações de HEP.
BSA+HEP (g/L) DF 0,03 1,65 0,06 1,68 0,12 1,67 0,25 1,71 0,50 1,71
A TABELA 1 mostra os valores da dimensão fractal, DF, referente as micrografias da figura 11para filmes obtidos em T = 23 oC. O valor da DF para o filme de HEP pura a 23 oC é 1,72. É possível notar que a dimensão fractal tende a aumenta em função da concentração de HEP. Isto se deve provavelmente ao aumento do tamanho das estruturas fractais com o acréscimo da concentração. Estes valores estão próximos do valor previsto para o modelo de agregação limitada por difusão (DLA), sugerindo que a formação dos fractais obtidos é governada por este modelo69,70.
Este resultado confirma a formação de complexos de BSA com HEP mas, que não foi identificado em filmes secos a 37 ºC, provavelmente devido à alta taxa de evaporação que inibe a organização dos agregados na superfície dos filmes. Outros trabalhos sugerem que a investigação dos agregados pode estar relacionada a habilidade de dissolução de um complexo de fármaco com proteína. Quanto mais denso os agregados (maior valor de DF) mais difícil seria a dissolução ou disponibilização do fármaco em sua forma livre71,72. Nossos
valores são similares ao encontrado para agregados de BSA que também foram descritos pelo modelo DLA72 considerados mais susceptíveis a dissolução.
6 CONCLUSÕES
Este trabalho foi conduzido na tentativa de avaliar a interação da heparina com a proteína albumina. Em solução foi possível identificar a formação de complexos HEP+BSA confirmados pelo fenômeno de hipercromismo, que pode ocorrer através da mudança conformacional da BSA causada pela exposição do triptofano ao solvente, dependente da concentração do fármaco. A estimativa da constante de ligação da HEP com a BSA indica maior concentração de fármaco na forma livre. Estes reduzidos valores de K, podem estar relacionados a alta densidade de carga negativa dos domínios da proteína associado ao fármaco também carregado negativamente. A 37 ºC, há uma diminuição no valor da constate de ligação, que pode indicar uma afinidade mais moderada entre BSA e HEP, que é adequada para a absorção e o transporte do fármaco.
Filmes casting apresentaram dimensão fractal dependentes da temperatura de secagem dos filmes. Apenas filmes secos em condições ambientes apresentarem padrões fractais dependentes da concentração de HEP, que estão associadas ao aumento do tamanho e número das estruturas. O valor da dimensão fractal encontrada para todas as estruturas analisadas estão próximos do previsto pelo modelo de agregação limitada por difusão (DLA). Este resultado indica que a interação da HEP com a BSA pode desenvolver padrões fractais similares ao encontrado em crescimento de agregados.
A investigação da interação de proteínas e fármacos na forma de filmes possibilita a análise dos complexos formados, através de técnicas não convencionais a farmacocinética, como a microscopia e análise fractal, contribuindo para a identificação da natureza da interação da proteína com fármacos. Como sugestão para trabalhos futuros, a influência do tempo de contato entre as soluções além da caracterização espectroscopica na região do infravermelho podem ser investigadas.
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