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CIÊNCIAS AGRÁRIAS REVISÃO DE LITERATURA
1 Professor MS da Disciplina Obstetrícia Veterinária do Curso de Medicina Veterinária da Fundação Educacional de Andradina.
Andradina. SP. Brasil.
2 Professora Doutora da Disciplina Fisiopatologia da Reprodução e Inseminação Artificial do Curso de Medicina Veterinária da
Fundação Educacional de Andradina. Andradina. SP. Brasil.
A UTILIZAÇÃO DA CLONAGEM EM MAMÍFEROS E TÉCNICAS ASSOCIA-DAS
THE CLONAGE UTILIZATION IN MAMMALIAN AND ASSOCIATED TECH-NIQUES
Alexandre Wolf 1 e Sandra Helena Gabaldi 2
RESUMO
A clonagem tem amplas aplicações tanto na produção animal como na medicina humana e na ecologia. No entanto há vários problemas a serem resolvidos para esta técnica se tornar eficiente. Unitermos: clonagem, mamífero, transferência nuclear, xenotransplante.
ABSTRACT
The clonage has great applications in animal production, in human medicine and ecology. However there are several problems to be solved to improve this technique in order to be more efficient. Uniterms: clonage, mammalian, nuclear transfer, xenotransplant.
INTRODUÇÃO
Nos últimos 50 anos, a biotecnologia vem se aprimorando para suprir as novas ne-cessidades de produção, que aumentam a efi-ciência reprodutiva e aceleram o ganho ge-nético dos animais de produção.
Uma metodologia em desenvolvimen-to é a clonagem, cujos trabalhos em mamífe-ros iniciaram em 1981, com camundongos, mas somente em 1997 sofreu um importante alavanque com o relato da clonagem animal adulto, o nascimento da ovelha Dolly.
A clonagem tem amplas aplicações tan-to na produção animal (multiplicação de ani-mais elite e produção de transgênicos) como na medicina humana (xenotransplantes e te-rapia gênica) e na ecologia (preservação de espécies em extinção).
Para a produção animal, a precisa ma-nipulação genética é de grande interesse econômico, devido à possibilidade de se al-terar positivamente a taxa de crescimento, a composição corporal e a resistência a doen-ças e, a criação de biorreatores para a produ-ção farmacêutica. Uma das metodologias em ascensão, com grandes perspectivas para o fu-turo, é a transfecção de linhas celulares com a posterior utilização na produção de animais quiméricos ou clones transgênicos,
produzin-do animais que serão utilizaproduzin-dos em cruzamen-tos tradicionais.
Na medicina, a clonagem associada à biotecnologia das células tronco embrionárias abre novas perspectivas para a realização de xenotransplantes em indivíduos com doenças degenerativas ou por deficiências na produção de substâncias importantes para a vida.
Quanto à ecologia, a preservação das espécies em extinção ou de espécies já extin-tas torna-se uma realidade com a utilização da clonagem.
No entanto, a biotecnologia da clonagem necessita ser complementada por outras técnicas para obter maior sucesso e aplicabilidade. Desta forma, o objetivo deste trabalho é apresentar a utilização da clonagem em mamíferos, bem como citar as técnicas complementares.
HISTÓRICO DA CLONAGEM EM MA-MÍFEROS
O clone pode ser definido como um “...Indivíduo geneticamente idêntico ao ou-tro, desenvolvido a partir de uma célula somática deste por técnica artificial...” (9), ou
seja, geração de cópias animais geneticamente iguais.
72 Para muitos, a clonagem surgiu com o
nascimento da Dolly (32), mas ela se iniciou
há décadas em mamíferos, e a sua realização somente seguiu a ordem normal dos experi-mentos que deram origem a clones de embri-ões mamíferos entre as décadas de 70 e 80
(28,30), pela separação de blastômeros (1). No
entanto, esta técnica apresenta produção e viabilidade baixas dos embriões clones (14b).
Para contornar este problema, foi de-senvolvida a técnica de transferência nucle-ar, cujo primeiro clone mamífero foi produ-zido pela fusão de células de embrião de ove-lha em estádio de clivagem (célula embrio-nária indiferenciada) com oócitos de ovelha não fertilizados (29). Posteriormente esta
téc-nica foi também utilizada em bovino (6), em
coelho (21) e em suíno (11).
No entanto, o número de células nos embriões no estádio inicial de desenvolvi-mento limita a produção de um grande nú-mero de clones e também de transgênicos, surgindo a necessidade de manter estas célu-las em proliferação (cultivo celular). SIMS & FIRST (1994) (20) foram os pioneiros na
obtenção de embriões clones bovinos vivos pela transferência nuclear, utilizando-se cé-lulas da massa celular interna (MCI). Apesar de embriões derivados de linhas celulares sustentarem a gestação acima de 45 dias, ne-nhum nascimento foi obtido (23).
Experimentos subseqüentes definiram as condições necessárias para a sobrevivên-cia e o desenvolvimento embrionário dos clones por transferência nuclear. Também, estenderam a doação nuclear para células de embriões em estádio de desenvolvimento mais adiantado, células germinativas primor-diais (PGCs) e, ultimamente para células de animais adultos. Desta forma, o conceito ini-cial de que uma célula mais diferenciada tor-na-se inviável para o desenvolvimento nor-mal do clone foi modificada (1).
TÉCNICA DA CLONAGEM
A produção do clone inicialmente era realizada pela separação de blastômeros ou secção de embriões em estádio inicial de de-senvolvimento, mas era limitada. Atualmente é realizada a reconstrução de um embrião pela transferência nuclear, onde o material gené-tico (nucleoplasto ou carioplasto) de uma cé-lula doadora é transferido para o citoplasma (citoplasto) de um oócito sem núcleo
(enucleado) não fertilizado (3,27,33). Desta
for-ma, o núcleo doador substitui os cromossomos normalmente provindos do espermatozóide e do oócito durante o proces-so natural da fertilização (1).
As células doadoras de núcleo podem ser embrionárias, fetais ou de animal adulto, utilizando a técnica definida como “transfe-rência nuclear de célula somática”. As célu-las somáticas devem estar no estádio G0 (quiescente) do ciclo celular, obtido com a remoção do soro fetal bovino do meio de cul-tivo, durante 4 a 5 dias (3,27,33). Sabe-se, que
quanto mais diferenciada for a célula doado-ra de núcleo, menor a eficiência do processo
(34). Já o oócito receptor deve estar em
metáfase II da meiose para poder ser enucleado com eficiência (3,27,33).
Uma baixa taxa de eficiência do pro-cesso se dá pela reprogramação nuclear im-própria e uma falha no desenvolvimento e nas funções normais das membranas placentárias
(27). Apesar disso, a clonagem apresenta um
enorme espectro de aplicação potencial, como a ilimitada multiplicação de embriões ou ani-mais elite, e na transgênese com precisão para a produção ou para o xenotransplante (27,33).
UTILIZAÇÃO DA CLONAGEM EM MAMÍFEROS
Produção animal
O melhoramento genético é limitado pelo intervalo entre gerações e pela eficiên-cia reprodutiva, mas com o advento da clonagem, a indústria bovina de criação fica dividida em duas partes: um ramo de criação produzindo melhoramento genético pela seleção acurada e, um segundo, com a utili-zação de animais clonados com valor genéti-co definido (33).
O seqüenciamento do genoma contri-bui para o entendimento da dinâmica gênica que controla os eventos da vida. Com estes conhecimentos, é possível determinar a fun-ção dos genes e sua alterafun-ção com precisão, gerando novos produtos animais (27).
Rápida multiplicação de animais genetica-mente superiores
Com a utilização de linhas celulares embrionárias ou de animais adultos, a disse-minação do material genético de indivíduos geneticamente superiores apresenta uma grande expectativa de aumento na produção,
73 reduzindo os riscos de produção e
garantin-do a qualidade garantin-do produto ao consumigarantin-dor (33).
Estima-se que a utilização da clonagem pode resultar na disseminação genética equivalen-te a 15 ou 17 anos de cruzamentos tradicio-nais (2).
A clonagem potencialmente permite uma rápida produção de grandes rebanhos, criando um volume econômico de produtos agrícolas para mercados específicos e/ou di-nâmicos, com uma produção mais uniforme, associada à identificação correta de indivídu-os superiores na população por seleção assis-tida por marcadores (27).
No entanto, uma das conseqüências da utilização da clonagem em larga escala é a re-dução da variabilidade genética na população. Isso seria contornado com a manutenção de grandes núcleos de seleção, preservando a va-riação genética (14a).
Apesar das expectativas, associada a baixas taxas de prenhez de embriões clones, os problemas com a técnica (reprogramação nuclear de células somáticas, efeito da fonte de carioplasto e as diferenças espécie-espe-cíficas) e com os produtos (alto peso ao nas-cimento, anormalidades neonatais e a baixa sobrevida pós-natal) claramente limitam a aplicação da clonagem em escala comercial até que estes entraves sejam resolvidos (18,22).
Além da produção em si, a clonagem com linhas celulares aprimorará a experimen-tação animal pela eliminação da diversidade genética, conseqüentemente, reduzindo o número de animais requeridos para um expe-rimento (11).
Produção de animais geneticamente modificados (transgênicos)
A produção de camundongo quiméri-co pela utilização de células tronquiméri-co embrio-nárias (ES-cells) mutagênicas representou uma importante ferramenta na manipulação precisa da linha germinativa (16). No entanto,
apesar da produção de embriões e animais quiméricos com a utilização das ES-cells em suínos (17) e em bovinos (5), a transmissão pela
linha germinativa ainda não foi obtida nos animais de produção. Este fato restringia a criação de animais transgênicos de interesse zootécnico ao processo inicial da microinjeção do DNA no pró-núcleo ou em zigotos de uma célula, a qual apresenta uma baixa eficiência e um elevado custo para os
animais domésticos (1,6,33).
Os problemas com a transgenia (26)
leva-ram à necessidade do desenvolvimento da téc-nica de produção de animais com linhas celu-lares mantidas, modificadas e selecionadas em cultivo antes de serem usadas como doadoras de núcleo na clonagem (4,22).
Com o desenvolvimento da biotecnologia em cultivo celular, a clonagem atualmente possibilita a produção mais econômica e eficiente de animais transgênicos com a utilização de linhas celulares embrio-nárias, fetais ou de animais adultos como doadores de núcleo (1,33). Deste modo, com as
modernas técnicas moleculares (recombinação homóloga), estas linhas celu-lares podem ser manipuladas geneticamente com precisão para a produção de animais transgênicos (4,27). O primeiro animal de
pro-dução transgênico pela técnica da clonagem foi a ovelha Polly, em 1997, a qual secreta no leite o fator IX da coagulação para o trata-mento da hemofilia B (32).
As células em cultivo apresentam vári-as vantagens, como: conservação e armazenamento pela criopreservação (flexi-bilidade de utilização), determinação do sexo (produção de proteínas farmacêuticas na glân-dula mamária) e introdução, deleção ou mo-dificação específica de genes nas espécies domésticas (33)
Portanto, o impacto mais imediato da transferência nuclear será sua combinação com a tecnologia de transgênese. Com isso, a produção de rebanhos ou reprodutores transgênicos clonados, que possuem altera-ções genéticas herdáveis, permite uma disse-minação da característica desenvolvida facil-mente pela inseminação artificial (27).
Conservação de animais ameaçados de extinção ou extintos
A clonagem é uma ferramenta forte na preservação de espécies raras ou ameaçadas de extinção. Associada à tecnologia de criopreservação de material biológico (célu-las somáticas), ela promove uma importante segurança contra futuras perdas de diversi-dade ou possível extinção e, na manutenção da biodiversidade no planeta, o que será mais fácil que a preservação de gametas (25,34).
No entanto, para esta finalidade a clonagem necessita de pré-requisitos: conhe-cimento da biologia reprodutiva e da
74 embriologia da espécie em questão,
adequa-da fonte de oócitos receptores para a transfe-rência nuclear, tipo celular ideal para a trans-ferência nuclear em cada espécie, conheci-mento da reprogramação nuclear e susceptí-vel “barriga de aluguel” para gestar o em-brião. Embora a ciência esteja muito evoluí-da, a maioria destes conhecimentos é limita-da nas espécies ameaçalimita-das, sem falar nas já extintas (8,27).
Devido à escassez de material dos ani-mais em extinção, há uma possibilidade de utilização do citoplasto de outra espécie (12,19).
Seria, então, o momento de estabelecer estoques de material biológico criopreservado de espécies ameaçadas de extinção, constitu-indo-se bancos genômicos de células somáticas, gametas, zigotos e embriões de ani-mais e plantas domésticas e selvagens, os quais servirão para recuperar espécies extintas ou evitar sua extinção (8).
MEDICINA HUMANA
Transplante de órgãos e tecidos entre es-pécies animais (xenotransplante)
Há uma escassez internacional de ór-gãos humanos para a doação e o tratamento de doenças crônicas e degenerativas (10). Para
suprir esta necessidade, órgãos de animais podem ser utilizados para transplantes em humanos, mas a rejeição tem que ser evitada. Para isso, pode-se produzir clones transgênicos imunologicamente compatíveis com os seres humanos (xenotransplante) (12).
Futuramente, muitas alterações pode-rão ser introduzidas nos suínos para modular a completa cascata das respostas imuno-me-diadas (27), incluindo a introdução de genes
MHC (complexo maior de histocompatibilidade) humano e a remoção dos genes MHC suíno, possibilitando a “humanização” do suíno (10).
Notavelmente, a hemofilia, o diabetes, a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson podem ser tratadas utilizando-se células transplantadas, o que pressiona a ima-ginação para o transplante de células e órgãos animais para pacientes humanos em escala contínua (13), resultando em enorme avanço
na terapia celular (12).
Terapia celular
Uma vez que o controle dos mecanis-mos de diferenciação celular e a reprogramação da expressão gênica estiverem elucidados, um impacto significante da tecnologia de transferência nuclear será na área da terapia celular humana (32), o que
po-derá substituir a necessidade do xenotransplante (27).
O conceito do uso das células tronco embrionárias (ES-cells) como fonte de múl-tiplos tipos celulares para a utilização na re-posição de tecidos e órgãos já existe por mais de 20 anos. Recentes avanços na transferên-cia nuclear e na produção de ES-cells huma-nas produziram uma nova cogitação nessa área, com o reconhecimento de que as linhas ES-cells sejam utilizadas para o transplante autólogo (7).
As ES-cells são células obtidas de em-briões em estádio inicial de desenvolvimen-to e, apresenta-se na forma indiferenciada com capacidade de serem mantidas em culti-vo. Estas células são pluri ou totipotentes, podendo dar origem a qualquer tipo de teci-do (15).
Enxertos celulares podem ser obtidos se as células somáticas de um paciente forem utilizadas para produzir embriões clones, os quais serão usados para gerar ES-cells huma-nas. Estas células podem ser cultivadas e ter diferenciação direcionada em tipos celulares específicos in vitro, constituindo uma fonte universal de células para o transplante terapêutico, o qual corrigirá as deficiências genéticas que ameaçam a vida ou induzirá respostas imunes apropriadas. No entanto, esta tecnologia está apoiada no sucesso de outras, como a obtenção de quantidade sufi-ciente de oócitos, a produção in vitro de em-briões e de ES-cells humanas, a diferencia-ção controlada das ES-cells em cultivo e a transferência nuclear (24).
Portanto, estas abordagens são tecnica-mente difíceis e não apresentaram sucesso até o momento devido à necessidade da valida-ção das linhas ES-cells em humanos, a melhoria na taxa de transferência nuclear, a geração e a expansão de populações específicas de células tronco em cultivo e a diferenciação celular gui-ada para a terapia de doenças que necessitem de transplante (7).
75 Proteínas terapêuticas humanas e
nutracêuticos
A clonagem terá sua principal aplica-ção na criaaplica-ção de animais transgênicos (biorreatores) para uso comercial (1). Genes
específicos humanos poderão ser introduzi-dos em células cultivadas in vitro e, direcionados para serem expressos apenas na glândula mamária, da qual serão facilmente isoladas as proteínas farmacêuticas para uma variedade de doenças e patologias (24,27).
Com a possibilidade de alterações no genoma, a qualidade nutricional dos produ-tos alimentícios podem ser melhorados, ele-vando-se as proteínas do leite (ex. caseína) ou adicionando-se outras, como a lactoferrina humana para suplementação de ferro. Além disso, pode-se remover as enzimas que cau-sam reações alérgicas em algumas crianças, bem como, a alteração dos ácidos graxos do leite, tornando-o mais saudável (27).
Modelos animais para o estudo de doen-ças humanas
Com a possibilidade da alteração ge-nética, pode-se produzir animais modelos para o estudo de doenças humanas (entendi-mento de doenças, atuação de novas drogas e tratamentos antes de serem aplicados em hu-manos) (3,27).
Embora muita discussão ética seja ge-rada na criação de animais com doenças, os benefícios na pesquisa médica são enormes, justificando sua utilização em testes de no-vos medicamentos e tratamentos antes da li-beração para uso em humanos (27).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Há milênios que a composição de ani-mais e plantas é modificada pelo cruzamento seletivo. O avanço da biotecnologia apenas tenta conhecer, controlar e acelerar os even-tos do melhoramento genético.
O advento da técnica de clonagem as-sociado à transferência nuclear, utilizando-se células cultivadas, é um grande avanço na biotecnologia animal, proporcionando um ili-mitado número de animais geneticamente idênticos para a pesquisa e a produção. A as-sociação destas técnicas abre novas frontei-ras para a produção econômica de animais domésticos transgênicos.
Apesar de muitos problemas a serem resolvidos na maioria das etapas da clonagem
(sincronização do ciclo celular, ativação oocitária, reprogramação do núcleo e gesta-ção a termo), bem como na transgênese, elas abrem novas e excitantes oportunidades para a biotecnologia na geração de animais com várias aplicações biomédicas (biorreatores de proteínas farmacêuticas, alimento com eleva-do teor nutricional e propriedades de saúde, e órgãos para transplante), e rebanhos com incremento nas características de produção agrícola.
Quando estas biotécnicas e suas interações estiverem totalmente dominadas pelo ser humano, a compreensão e o domínio da biologia darão uma possibilidade imaginável de controle da vida.
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Recebido: 13/09/2004 Aceito: 28/09/2004
