Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia
Introdução
a
Biologia
Molecular
Mestrado em Microbiologia e Parasitologia
Biologia Molecular consiste principalmente em estudar as
interações entre os vários sistemas da célula, partindo da
relação entre o DNA, o RNA e a síntese de proteínas, e o
Descoberta do Ácido nucleico
Descoberta da existência do ácido nucleico no núcleo
celular e a determinação de sua composição química
Identificação e aceitação do DNA como material hereditário
Johann Friedrich Miescher:
composto de natureza
ácida
, rico em
fósforo
e em
nitrogênio,
desprovido de
enxofre e resistente à ação da pepsina
nucleína
Identificando os componentes químicos do núcleo
1880
1889
1890
1912
Albrecht Kossel Descoberta das bases nitrogenadas Phoebus Levine e Walter Jacobs Descobrem os nucleotídeos Richard Altmann Purifica a nucleína, comprovando sua natureza ácida. Surge a denominação ácido nucléico Caracterização das bases nitrogenadas do DNA e da desoxiribose.Descoberta de outro tipo de ácido nucléico contendo uracila e
Experimentos de Frederick Griffith (1928)
Identificação do DNA como material hereditário
Cepa rugosa (Rough strain) Pouco virulenta
Cepa lisa (Smooth strain)
Experimentos de Oswald Avery, McCarty e MacLeod (1944)
Identificação do DNA como material hereditário
Confirmação da natureza genética do DNA
1952:
Hershey & Chase
DNA injetado por uma partícula de
fago em um bactéria, continha todas as informações necessárias
para se obter a progênie viral
1953:
Watson
& Crick
estrutura tridimensional
do DNA
Watson e Crick
até 1944: acreditava-se
que as proteínas eram o
material genético.
1953
Watson & Crick: modelo tridimensional para
a estrutura do DNA
Molécula de DNA:
açúcar (pentose)
grupo fosfato
base nitrogenada
Bases nitrogenadas
Purinas
Pirimidinas
DNA
RNA
DNA
RNA
O Nucleotídeo
ligação N-glicosídicaentre a base nitrogenadacom a OH ligada ao e a pentose: carbono 1 da pentose entre o grupo fosfato e a pentose: ligação fosfodiester coma OH ligada ao
carbono 5 da pentose
O grupo fosfato
e
o
açúcar (hidrofílica
):
localizados na parte
externa da molécula
-
As bases nitrogenadas
(hidrofóbica):
localizadas
na parte interna
Para que o pareamento
ocorra, as
DUAS FITAS
têm
que ser
ANTIPARALELAS
O DNA é uma molécula com
polaridade:
uma extremidade 5’-OH
uma extremidade 3’-OH
DNA: 2 cadeias helicoidais enroladas ao longo do
mesmo eixo para formar uma dupla hélice
A seqüência de bases é sempre
lida na direção 5’ ---> 3’
O pareamento
G
-
C
tem 3 pontes de H
O pareamento
A
-
T
tem 2 pontes de H
As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas
por
PONTES DE HIDROGÊNIO
Dogma central da biologia
DNA armazena a
informação
RNA transfere
a informação
Proteína executa
a função
Origem da vida....
Algumas descobertas posteriores não coincidiram com este princípio:
O RNA pode sofrer replicação em alguns vírus
O RNA viral através da enzima transcriptase reversa pode
ser transcrito em DNA
Walter Gilbert, 1986:
Hipótese do
“mundo do RNA” (
RNA world
)
Antes das células modernas: RNA
material genético
RNA
catalisava as reações químicas nas células primitivas
Existiu um período na evolução que o RNA
era ambos o catalisador
biológico e material genético
pareamento complementar dos nucleotídeos
o que promove a
cópia exata de uma seqüência, pois, por conta da complementaridade
das bases, uma seqüência serve de modelo para outra
descoberta das
ribozimas
, moléculas de
RNA que possuem atividade
catalítica
e participam de importantes reações nas células modernas
viróides
menores e mais simples
fitopatógenos
conhecidos,
consistem em um
RNA
pequeno (200 nucleotídeos), circular, fita
simples, não codificante que, através da maquinaria de transcrição da
célula hospedeira, é capaz de se auto-replicar.
virusóides
agentes sub-virais que, diferentemente dos viróides
não se replicam de forma autônoma, a replicação depende da
co-infecção de uma célula hospedeira com um vírus auxiliar
RNAs
satélites circulares
Mundo do RNA
Sidney Altman,Thomas Cech: Prêmio Nobel de Química em 1989
RNA com capacidade catalítica: poderia agir como
enzimas
(
ribozimas
)
Propriedade
catalítica da
ribonuclease P
enzima que
cliva RNA
Envolvida no
processamento
do tRNA
em vírus, em
procariotas e
em eucariotas.
Técnicas de Biologia Molecular:
PRINCÍPIO
Todo microorganismo tem sequências de ácido nucléico que são específicas e
podem ser detectadas por uma reação de hibridização ou de amplificação
Estrutura da partícula viral:
Vírus não envelopados: genoma (RNA ou DNA) + capsídeo nucleocapsídeo
Para o estudo de vírus que não podem ser isolados em
cultura de células, como os papilomavírus e
alguns
agentes associados a gastrenterites,
Para vírus com alta diversidade antigênica, como os
enterovírus, o que dificulta a utilização de técnicas
sorológicas de detecção de antígeno,
A análise do genoma viral diretamente da amostra
clínica pode ser vantajosa principalmente para aqueles
vírus com genoma RNA, que podem sofrem mutações
através de sucessivas passagens in vitro.
- Usar sempre luvas e trocá-las constantemente
- Nunca usar a mesma ponteira para pipetar soluções
diferentes
- Usar sempre ponteiras e tubos Eppendorf novos.
-
Se possível, ter um conjunto de pipetas automáticas só
para extração.
-
Uso de ponteiras contendo algodão para bloquear a
produção de aerossóis
- Utilizar sempre água autoclavada e deionisada.
-
Irradiação UV do material dentro da capela (pipetas,
ponteiras, estantes, tubos)
-
Uso de pequenas alíquotas
-
Limpeza dos equipamentos e bancada com solução de
hipoclorito de sódio a 10%
www.starlab-france.com Manipulação dos reagentes dentro de capelasExtração do genoma
Método de escolha: depende da amostra clínica
tecido, fezes, urina, aspirado de nasofaringe, soro...
-
Amostra clínica
-
Controle positivo
Amostra + Tampão de lise
Tampão: - Proteinase K (tecido)
- Sal (hidrocloreto de guanindina)
Lisar as células e degradar proteínas
DNA na solução salina se liga a matriz (sílica)
Lavagem: para retirar contaminantes
Elui o DNA da matriz com solução tampão ou água
DNA purificado
Lavagem do DNA:
Adiciona tampão Homogeiniza: vortex Spin: centrifuga 10 segundos
•
Reação de hibridização
•
Reação de amplificação (PCR)
As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas. Esse processo é
denominado DESNATURAÇÃO.
A renaturação ocorre quando se volta às condições físico-químicas iniciais .
Melting temperature (Tm): temperatura de dissociação na
qual 50% da molécula de DNA está desnaturada
A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam
Tm: específica para cada molécula de DNA
Baseia-se na propriedade dos ácidos nucleicos de parear
suas fitas complementares
Utiliza “sondas” para detecção do genoma viral
(sequências)
Sonda
fragmento de ácido nucleico complementar a
uma dada sequência do genoma viral, marcado com uma
substância reveladora (radioisótopo ou enzima)
Hibridização
é a formação de
duplexes de bases pareadas,
seqüência-específicas, a partir de qualquer combinação de
fragmentos de ácidos nucleicos, usualmente “in vitro”.
Quase todos os plasmídeos atualmente utilizados derivam do
pBR322
O marcador de seletividade (genes de resistência a antibióticos) permite a identificação da bactéria que recebeu o plasmídeo. No vetor acima, são genes que codificam proteínas que degradam antibióticos.
O mapa mostra as posições:
gene de resistência a amplicilina (amp R)
,
gene de resistência a tetracilina (tat R)
,
origem de replicação (ori)
e
sequência de reconhecimento para 7
enzimas de restrição (sítio de clonagem)
Origem de replicação: é uma sequëncia específica do plasmídeo que é reconhecida pelo aparato de duplicação do DNA, inicia a síntese de DNA
Padrão de restrição:
Sítios de reconhecimento para
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
são
curtas sequências de nucletídeos reconhecidas e clivadas
por várias endonucleases
Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento
As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias das quais foram isoladas
Digestão do DNA com diferentes enzimas de restrição:
Stick ends: extremidades coesivas
Ligação de fragmentos de restrição com extremidades coesivas
Inserção do DNA no gene de resistência a ampicilina: colônias contendo
plasmídio recombinante crescem somente na presença de tetraciclina
Agar com tetraciclina + ampicilina
Como obter a
sonda
(
probe
): Amplificação
PCR:
amplificar o fragmento desejado
Produto da amplificação
www.invitrogen.com.br
Sonda marcada com
biotina
Conjugado: estreptavidina ligada a enzima
Substrato Reação colorida
Reação de Hibridização in situ
Tecido: observação ao microscópio ótico
Triagem
X Tipagem
Triagem: sondas genéricas (detecção)
sondas
para genes conservados
Tipagem: sondas específicas
Sensibilidade: 100 cópias DNA/célula
Relevância clínica
Dot blot
Uso de sondas
marcadas para detecção de genoma em
membrana de nitrocelulose.
Amostra clínica: soro, fezes, tecido
Triagem
Sensibilidade: 10-50 cópias DNA/célula
Pode ocorrer
sonda marcada com P32 sonda marcada com biotina
Ensaio de captura de híbrido
Polymerase Chain Reaction: PCR
Método para produzir cópias de um segmento de DNA
específico
PCR Amplifica
uma
Seqüência
Alvo
Replicação do DNA in vivo
Replicação semi-conservativa
Enzimas envolvidas:
DNA polimerase (polimerização 5’-3’)
Primase
Topoisomerase
Helicase
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
DNA Polimerase
5’
3’
Primase
Fita Contínua
Fita Descontínua
Helicase
Helicase
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Fragmento de OkasakiMimetizando a replicação in vivo
Helicase para abertura das
fitas
Primase para adição de
primers
Temperatura (92°C)
Primers específicos +
temperatura ideal
Polimerização é feita por uma DNA
polimerase termoestável
São utilizados dois “primers”, o que
delimitam o segmento amplificado e
determinam o crescimento exponencial
do número de moléculas de DNA
Triagem X Tipagem
Sensibilidade : 10 cópias de genoma
Polymerase Chain Reaction: PCR
Protocolo original
Invenção do PCR: Kary Mullis (1985)
Protocolo
original
utilizava
DNA
polimerase de E. coli (termolábil)
Henry Erlich em
1988
: enzima termoestável
•
Taq polimerase
:
é uma
DNA polimerase
extraída da
bactéria
T
hermus
aq
uaticus
,
que
vive
em
água
com
temperatura de 75
oC.
DNA POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’
Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu
funcionamento:
Molécula de DNA - molde
“Primer” de oligonucleotídeo
Magnésio
DNA polimerase
Primer Sense
Reagentes do mix da PCR
Primer Antisense
Polymerase Chain Reaction: PCR
•
Água
autoclavada e deionizada: completa o volume final da
reação
•
Tampão 10X concentrado
: 10 mM Tris-HCl pH 8,0 , 50mM
KCl
mantém o pH ótimo para a reação
•
Solução de dNTP:
precursores das novas fitas do DNA
específico
solução com os quatro deoxinucleotídeos
trifosfatos
(deoxiadenosina, deoxitimidina, deoxicitidina,
deoxiguanosina, na concentração de 20 a 200
M de cada
dNTP).
A concentração
dos 4
deoxinucleotídeos
tem
que
ser
equivalentes para minimizar erros de incorporação.
Esta solução pode ser preparada segundo as especificações do
fabricante e estocada a -20oC
•
Cloreto de Magnésio (MgCl
2):
otimiza a atividade da Taq
polimerase. Concentração: 0,5 a 2,5 mM. Estocado a –20
oC.
A concentração de MgCl
2pode afetar: anelamento dos
primers, formação de primer-dimer, atividade da enzima
• Oligonucleotídeos iniciadores ou primers:
sintetizados por
fabricante a pedido do pesquisador (liofilizado) e normalmente
tem de 18 a 30 nucleotídeos. Concentração de 0,1 a 0,5
M.
Aliquotado e estocado a -20
oC.
A especificidade da reação é dada pelos
primers
Segmento de DNA alvo
Segmento de DNA alvo
Deve-se ter conhecimento prévio do fragmento alvo a ser
amplificado para desenhar os primers específicos.
Ex: Fragmento alvo – Gene L1 do HPV (450 pb)
Se a concentração do primer for alta, pode promover o acúmulo de
produtos não específicos e aumentar a probabilidade de ter artefatos:
primer-dimer. Os produtos não específicos e primer-dimer são substratos para a PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs e primers, resultando em uma concentração mais baixa do produto desejado
DNA polimerase
Reagentes do
PCR
Primer Sense Primer Antisense
Polymerase Chain Reaction: PCR
DNA molde
Extração prévia do DNA
PCR:
etapas em ambientes separados
Sala de extração:
2. Sala limpa:
Preparo da mistura
da reação (Mix)
4. Termociclador
5. Eletroforese em gel de
agarose
manipular os
produtos do PCR
1. Extração de DNA a
partir da amostra clínica
3. Adição do DNA
extraído ao tubos de PCR
contendo mix
(a) (b) (c) (d)
luvas de procedimento
conjunto de pipetas com volume variável de 10
l, 20
l,
200
l e 1000
l
estantes para tubos (refrigeradas)
ponteiras com filtro novas e autoclavadas
tubos para PCR 0,2ml novos e autoclavados
lenço de papel cortado
(para abrir os tubos)
dNTP mix
10x
buffer MgCl2 Taq pol
Primer S Primer AS
Polymerase Chain Reaction: PCR
Preparo do mix
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Manipulação dos
reagentes dentro
de capelas
O material usado na sala limpa não pode ser usado em outra sala
Concentração
final Volume/reação 10 Reações
H2O 27,0 L 270 L
dNTP 4,0 L 40 L
10xbuffer 1x 5,0 L 50 L
MgCl2 50mM 1,5mM 1,5 L 15 L
Mistura de iniciadores 2,0 L 20 L
Taq polimerase 5U/L 1U/L 0,5 L 05 L
Total 40 L 400 L
Preparo do mix: Em uma sala limpa
-
Determinar o número total de reações a serem executadas. Incluir ao menos uma reação sem DNA (água no lugar da amostra).- Identificar os tubos da reação (200l).
- Em um tubo eppendorf 1,5l: preparar a mistura de reação de acordo com o esquema abaixo:
- Mistura: vortex
- Spin (para retirar gotas da reação das paredes
- Aliquotar em 9 tubos com 40
L
Preparo do mix:
Em uma sala limpa
DNA polimerase
Reagentes do
PCR
Primer Sense Primer Antisense
Polymerase Chain Reaction: PCR
Adição do
DNA alvo
Na sala de extração:
- Adiciona 10
L de DNA extraído de cada amostra aos tubos
contendo 40
L de mix
- Volume final da reação: 50
L
DNA extraído das amostras
Tubos 0,2 L contendo mix
Tubos:
- amostra clínica
- controle positivo
- controle negativo PCR: H
2O utilizada no
preparo do mix
- controle negativo da extração: H
2O
Polymerase Chain Reaction: PCR
Na sala do termociclador:
- Centrifugar os tubos rapidamente para retirar gotas da
reação das paredes dos tubos.
- Colocar os tubos no termociclador para a execução da
reação de amplificação
1º ciclo 2º ciclo
Polymerase Chain Reaction: PCR
3 passos na reação que são repetidos de 30 a 40 vezes
ciclos
1 passo: desnaturação: 94oC por 30 seg
Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR. Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima.
Temperatura de “annealing”: usualmente 5oC abaixo do Tm real dos
“primers”
Tempo de “annealing”: 15 a 30 seg
Primer sense: se liga a fita antisense Primer Antisense: se liga a fita sense
Para calcular Tm de um primer : 2 (A + T) + 4 (G + C
)
2o passo: anelamento dos primers 55oC
3
opasso
Extensão a 72
oC:
temperatura ótima para Taq polimeraseIncorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo
1 minuto é suficiente para um amplicon de 1,2 kb
Como ambas as fitas são copiadas durante a PCR, há um aumento
exponencial do número de cópias do gene. Por exemplo: se há 1
cópia do gene antes da reação iniciar, após o1
ocliclo serão 2
cópias, após 2 ciclos serão 4 cópias, 3 ciclos serão 8 cópias e assim
por diante.
www.snv.jussieu.fr
Ciclos iniciais:
- Os primers (ou iniciadores) procuram a template de DNA com
as sequências que lhes são complementares
- Encontrar a sequência complementar não é tão difícil, pois os
primers estão em considerável excresso em relação à template
Fase intermediária:
- O processo de amplificação está ocorrendo, com os primers
agindo de modo permitir o acúmulo exponencial do fragmento de
DNA.
- O pareamento do primer com a sequência que lhe é
complementar já está bem facilitada, pois já existem várias
cópias das sequências alvos
Fase tardia ou fase de platô:
-
A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes
e à competição dos produtos gerados com primers.
Polymerase Chain Reaction: PCR
?
?
?
?
Eletroforese em gel de agarose
Preparo do gel de agarose:
Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X - pH 8,0 :
Agarose 1% em TBE 0,5%
-
Os géis de agarose são adequados para separar moléculas
de DNA entre 200 pb e cerca de 50 kpb
-
O tamanho dos poros depende da concentração de
agarose. A concentração em geral é dada como peso de
agarose por volume de água.
- A agarose é dissolvida em água fervendo e forma um gel
quando esfria. Durante a geleificação há formação de
espaçadores
Usar luvas no preparo do gel
Preparo do gel:
pente cuba
fonte
cabos
nível
Antes de preparar o gel é necessário nivelar a cuba
Dissolver a agarose no tampão. Deixar esfriar.
Preparo do gel:
Preparar a cuba: Colocar a
placa com espaçadores e pente.
Verter a agarose no gel.
Cuidado para não formar bolhas
Preparo do gel:
Se formar bolhas, empurrá-las para a extremidade com uma ponteira
Adicione o tampão
Preparo do gel:
Depois de solidificar o gel, retirar os espaçadores
Retire o pente com cuidado
Para aplicar no gel:
Marcador de DNA (ladder) : mistura de fragmentos de DNA de tamanho conhecido, a fim de comparar com os fragmentos obtidos no PCR.
Gel loading buffer:
Corante 6X : xileno cianol 0,25%
azul de bromofenol 0,25% glicerol 30%
O gel loading buffer :
- Aumenta a densidade da amostra, assegurando que a gota de DNA entre no gel
- Dá cor à amostra
- contém corantes que no campo elétrico movem para o anodio (bromofenol migra mais rápido que o xileno cianol)
Preparo da amostra para aplicar no gel
Antes de aplicar os produtos da PCR no gel centrifugar rapidamente Em um tubo fazer a seguinte mistura
:
TBE 0,5 X corante amostra
10 l 2 l 2 l marcador de PM
3 l 2 l 10 l produto da PCR
Abrir os tubos contendo produtos de PCR em uma capela para evitar contaminação do ambiente com amplicons. Irradiar UV na capela após manipulação.
Aplicar as amostras no gel:
Aplicar cada mistura em um slot do gel.
No 1o slot aplicar o marcador de PM e nos demais o produto da reação de PCR
- Ligar a cuba de eletroforese.
As amostras deverão correr na direção do catódio (preto) para o anódio (vermelho). O DNA tem carga negativa e migra para o polo positivo.
- A eletroforese é feita a 80 Volts por aproximamente 60 min, até que o corante azul atinja 3/4 do gel.
Visualizarão das bandas no gel:
- Transferir o gel para uma solução de brometo de etídio 0,5 g/mL de 10 a 15 min. Lavar 1X com água.
- Visualizar o gel em transiluminador sob luz UV e fotografar.
transiluminador
Máscara de proteção
Coloração com brometo de etídio
Visualização das bandas no gel:
www.marinebiotech.org
234 194
Marcador de PM
Produtos da reação
PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR)
-
Para vírus de genoma
RNA
-Realização da reação de transcrição reversa
Transcriptase Reversa
-Cuidados a tomar durante o preparo do c-DNA
- Primers específicos
Multiplex PCR: genotipagem
Genótipo G1 Genótipo G2 PM A B C PM = peso molecular Amostra A = G1 Amostra B = G1 + G2 Amostra C = G2
Dois ou mais pares de primers em um único tubo
Nested PCR
pode ser uma alternativa para melhorar a
especificidade e a sensibilidade da PCR
1o PCR: primers externos Produto do 1o PCR : template para o 2º PCR 2o PCR: primers internos Produto do 2º PCRNested PCR
Nested PCR
427bp
MW 1 2 3 4 MW 5 6 7 8
Primers externos Primers internos
Southern blot:
análise do DNA transferido para a membrana Eletroforese em gel de agarose do produto da PCR Transferência dos fragmentos de DNA do gel para a membrana de nitroceluloseMembrana com as bandas de DNA
Hibridização com probe específico Revelação:
banda onde o probe ligou a sequência específica
Padrão de restrição:
Sítios de reconhecimento para
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
são
curtas sequências de nucletídeos reconhecidas e clivadas
por várias endonucleases
Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento
As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias das quais foram isoladas
PM 1 2 3 4 5
1,2 : 1 sítio de restrição (tamanho esperado) 3: 1 sítio de restrição em posição diferente 4,5: 2 sítios de restrição
Eletroforese em gel de agarose após tratamento do DNA
com enzima de restrição
SEQÜENCIAMENTO DE DNA
Definição: processo que determina a ordem dos nucleotídeos
(A, C, T e G) na seqüência do DNA utilizado como molde.
Molécula
Clewley JP. J. Clin. Virol., 29:2-12, 2004.
Microarray (Microarranjo)
Os microarrays são utilizados na detecção de ácidos nucleicos em amostras clínicas: Hibridização do ácido nucleico extraído da amostra com o DNA fixado no array. Adetecção é possível pois os DNAs das amsotras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5)
www.Virology.net/Big-Virology/BVRNAreo.html
ROTAVÍRUS
4 9P
G
(23) (31) VP4 VP7RV gp A: Classificação binária
Classificação binária de RV-A
VP7
VP4
23 Genótipos (G1-G23)
31 Genótipos (P[1]-P[31])
672 Combinações possíveis !!!!
Khamrin et al., 2007; Martella et al., 2007; Matthijnssens et al., 2008; Albe et a l., 2009
Humanos:
Genótipos usuais:
P[8]
G1
,
P[8]
G3
,
P[8]
G4
,
P[4]
G2
,
P[8]
G9
Genótipos não-usuais:
G5
,
G8
,
G10
, G12, P[6], P[9] e P[10]
Bovinos:
P[1]
G6
, P[5]
G6
, P[11]
G10
Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos de RT-PCR para obtenção dos fragmentos consensuais para os genótipos G (a) e P (b) de RV
Linha 1: marcador de peso molecular de 100 pb; Linhas 2,3,4,5,6,7 e 8: fragmento consensual para genótipos G (906 pb) e P (876 pb); Linha 9: controle negativo de extração e amplificação.
(a) (b)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
RV gp A
Genotipagem:
Eletroforese em gel de agarose a 1,5% de produtos de Nested-PCR para para determinar o genótipo G e P de RV
(a) Linha 1: marcador de peso molecular 50 pb; Linhas 2,4,5: G1
(b) Linha 1: marcador de peso molecular 100 pb; Linhas 6,7,8,10,11: G9
(c) Linha 1: marcador de peso molecular 100 pb; Linhas 2,3,4,5: P8
(a) (b) 1 2 3 4 5 G9 110pb G1 158 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 P8 345pb (c)
RV gp A
Genotipagem:
• Infecções heterólogas
• Rearranjo entre amostras de RV gp A
- combinações dos antígenos P e G
Gx
-
P[x]
-
Ix
-
Rx
-Cx-
Mx
-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx
VP7
-
VP4
-
VP6
-
VP1
-
VP2
-
VP3-
NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6
VERDE/ AZUL Wa-like
VERMELHO DS-1-Like LARANJA AU-like
AMARELO AVIAN PO-13-Like LILÁS SA-11-like
Detecção do vírus:
Isolamento viral:
Amostras clínicas: sangue, soro, swab de orofaringe, swab de nasofaringe, tecidos (autópsia)
Cultura de células Inoculação em CRN
Vero-E6, NCI-H292, HELA, MDCK, (IC e IP)
HUT-292, LLC-MK2, B95-9
CPE +
Microscopia eletrônica
RT-PCR
Master seed Imunohistoquímica
(propagação) Imunofluorescência
ELISA
OBS: coleta de soro de fase convalescente dos pacientes
(a) CPE
(b) Reação de imunofluorescência: Células Vero com soro de paciente convalescente
Fig 1: Células Vero E6 inoculadas com material de orofaringe de pacientes com SARS
Fig 2: Características estruturais do coronavírus associado a SARS propagados em células Vero E6
T G Ksiazek et al., N. Eng. J. Med., April 10,2003
(a) T G Ksiazek et al. N. Eng. J. Med., April 10, 2003 (b) Drosten et al. N. Eng. J. Med., April 10, 2003
Comparação do coronavírus associado a SARS com outros Coronavírus de animais e humanos
