Genoma do Frango Mapeamento de QTL

Genoma do Frango – Mapeamento de QTL

Genética e Melhoramento Animal

Embrapa Suínos e Aves, Caixa Postal 21, 89700-000, Concórdia – SC, Brasil email: mledur@cnpsa.embrapa.br

Resumo

O mapa genético da galinha contém hoje mais de 1889 loci, incluindo 235 genes identificados. Essa informação tem permitido a identificação de loci que influenciam características quantitativas (QTL) através de análise de genes candidatos e através de mapeamento do genoma usando marcadores anônimos. Vários QTLs foram identificados para características de desempenho e carcaça e resistência a doenças em aves. Esses QTLs devem ser validados em populações comerciais e experimentais visando confirmar suas localizações e efeitos sobre a característica. Em aves, essas informações ainda não estão sendo amplamente utilizadas em programas de melhoramento. Porém, com o avanço das pesquisas nessa área e em outras afins, vários QTLs serão descobertos e validados e os genes que afetam certas características de produção identificados. Pode-se esperar que nos próximos anos essas informações passem a ser incorporadas com sucesso nos programas de melhoramento de aves através da seleção assistida por marcadores ou genes.

Introdução

A genética quantitativa, aliada ao uso de técnicas computacionais e estatística, têm assegurado ganho genético contínuo de todas as características de produção em aves. Cerca de 80% das melhorias obtidas nas linhagens de aves de corte e postura foram decorrentes do melhoramento genético, acompanhadas pelo aprimoramento em instalações, manejo, nutrição, ambiente e sanidade.

A maioria do progresso genético obtido nas características quantitativas tem sido decorrente da seleção baseada no fenótipo do animal ou na estimativa do valor genético aditivo derivado do fenótipo. Essa seleção é realizada sem o conhecimento do número e do efeito dos genes que atuam na característica de interesse. Por isso, a arquitetura genética das características tem sido considerada como uma caixa preta, quando se utiliza a genética quantitativa no melhoramento animal (Dekkers, 1999). Apesar disto, as taxas de ganho genético que foram e ainda estão sendo obtidas em programas de melhoramento demostram claramente o poder do uso da genética quantitativa na seleção.

O desenvolvimento de técnicas moleculares tem permitido o avanço no conhecimento de como determinados genes influenciam características de interesse econômico. Nos últimos anos, essa nova dimensão tem tornado mais acessível a análise genética de animais através da habilidade de clonagem e seqüenciamento dos genes responsáveis pela expressão de características de produção, o que facilitou o reconhecimento e o uso de polimorfismos de DNA como marcadores genéticos. Novas biotecnologias têm permitido a identificação e manipulação direta de seqüências de DNA em grande escala. Nos próximos anos, o conhecimento sobre o controle genético de características econômicas irá aumentar drasticamente, possibilitando a complementação dos métodos tradicionais de melhoramento, visando ganhos genéticos adicionais.

A disponibilidade de um mapa do genoma da galinha, rico em informações sobre marcadores, permite uma análise sistemática da natureza da variação genética de características economicamente importantes em aves. O primeiro passo é identificar regiões do genoma que influenciam essa variação genética – loci de características quantitativas (QTL). A identificação desses QTL possibilitam seleção através de marcadores dessas regiões - seleção assistida por marcadores (MAS). A MAS pode ser usada com a seleção fenotípica e também na Introgressão de determinada característica de uma população para outra, mantendo as características desejáveis

da população receptora. A MAS seria mais efetiva para características de baixa herdabilidade e limitadas pelo sexo (produção de ovos) e características que não podem ser medidas diretamente ou de alto custo, como resistência a doenças, qualidade de carcaça e bem-estar animal (Muir, 1999). Segundo Plastow (2000), o uso de marcadores de DNA para auxiliar na seleção para melhorar a qualidade da carne é uma das melhores oportunidades para a indústria.

A meta final é identificar os genes que controlam as várias características. Entendendo como eles funcionam e como influenciam características econômicas poderá levar a um novo direcionamento para melhorar o desempenho e qualidade do produto final. A comparação entre mapas genômicos de outras espécies tem auxiliado a procura por genes importantes e potencialmente úteis em aves. Em suínos, muitos resultados obtidos já estão sendo aplicados nos programas de melhoramento. No caso de aves, pesquisas ainda são necessárias antes que essas informações possam ser utilizadas na prática. O objetivo deste trabalho é descrever os avanços obtidos nas pesquisas sobre o genoma do frango através do mapeamento de QTL, bem como suas perspectivas de aplicação.

Mapeamento Genômico

O genoma da galinha doméstica apresenta 39 pares de cromossomos (n), totalizando 78 cromossomos (2n), consistindo em 8 macrocromossomos, 30 microcromossomos e os cromossomos sexuais (Cheng, 1997). De acordo com Bulfield (1997) a maioria dos programas de mapeamento do genoma animal estão envolvidos em 3 fases: 1) construção de um mapa altamente informativo, 2) uso do mapa para identificar a posição no cromossomo do QTL que controla característica economicamente importante e 3) identificar e clonar o(s) gene(s) que explica(m) o QTL. Maior ênfase será dada ao item 2 durante o decorrer deste trabalho.

O conhecimento do mapa genômico representa o primeiro passo necessário para fazer uso prático das tecnologias baseadas em DNA. O objetivo é a criação de diagramas descritivos dos cromossomos com uma resolução cada vez mais apurada, descrevendo de maneira ordenada a constituição genética das espécies, proporcionando um entendimento mais detalhado das funções biológicas dos organismos. O desenvolvimento de mapas genéticos foi acelerado pela introdução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), que amplifica regiões especificamente definidas do DNA, permitindo que essas regiões do genoma possam ser examinadas quanto ao seu polimorfismo.

A habilidade para realizar estudos de QTL em grande escala seguiu o desenvolvimento de marcadores moleculares, que são assim chamados porque suas diferenças no DNA não afetam a função do gene e, conseqüentemente, do fenótipo do indivíduo. Para maiores detalhes sobre marcadores o leitor poderá consultar Ferreira e Grattapaglia (1998). Os mapas de ligação, que definem a ordem e distância de marcadores e genes em um cromossomo, a partir das taxas de recombinação, são constituídos em sua maioria por marcadores microssatélites, devido ao seu amplo polimorfismo, facilidade de amplificação por PCR e de identificação de alelos (Montgomery, 2000).

O primeiro mapa de ligação genética de aves foi publicado há mais de 60 anos atrás por Hutt (1936) utilizando marcadores morfológicos. Somente após o desenvolvimento de um grande número de marcadores moleculares na última década a geração de mapas de ligação da galinha aumentou. Até hoje três mapas de ligação diferentes foram desenvolvidos: o de Compton (Bumstead e Palyga, 1992), East Lansing (Levin et al., 1994) e Wageningen (Groenen et al, 1998), baseados em suas respectivas populações referência, as quais são descritas resumidamente a seguir:

East Lansing (EUA): Consiste de 52 animais oriundos do retrocruzamento entre uma linha de galinha selvagem parcialmente endogâmica com uma linha White Leghorn altamente endogâmica, que diferem quanto a resistência a doença de Marek.

Compton (Reino Unido): Consiste de 56 animais derivados de um retrocruzamento entre duas linhas White Leghorn endogâmicas que diferem quanto a resistência a doenças.

Wageningen (Holanda): Consiste em 456 animais F2 originados de um cruzamento entre duas linhas fêmea de corte provenientes da raça White Plymouth Rock.

Como os 3 mapas têm marcadores em comum e devido ao aumento das densidades desses mapas, foi realizada uma integração de todos os dados disponíveis das 3 populações de mapeamento referência e feito um mapa de ligação único do genoma da galinha denominado de “Consensus Linkage Map”, o qual é um produto do “International Chicken Genome Project”, iniciado em 1994.

Consenso dos Mapas de Ligação

Nesse mapa, publicado por Groenen et al. (2000), o genoma da galinha apresenta um total de 1889 loci, dos quais 480 apresentam sua localização definida nos cromossomos e 235 representam genes identificados ou seqüências que tem identidade singificante com genes conhecidos. Desses 235 genes, 204 foram mapeados em humanos. A informação obtida desse mapa de consenso genético deve ser integrada com o mapa físico (que permite a localização de grupos de ligação em cromossomos específicos) da galinha, o que tem sido difícil devido a presença dos microcromossomos. O cariótipo padrão foi estabelecido somente para os 8 macrocromossomos grandes e para os dois cromossomos sexuais (Ladjali-Mohammedi et al., 1999). O mapa atual contém 801 marcadores microssatélites, que são os utilizados para mapeamento de QTL. Mais microssatélites são ainda necessários para cobrir todo o genoma, especialmente nos microcromossomos.

Informações detalhadas sobre as populações referência, marcadores disponíveis e demais bases de dados podem ser encontradas a partir da página do Poultry Genome Project da Michigan State University (http://poultry.mph.msu.edu/).

Projetos de Mapeamento do Genoma do Frango

Nos Estados Unidos, o Projeto de Mapeamento do Genoma de Aves é um esforço conjunto da Michigan State University e USDA, ARS, Avian Disease and Oncology Laboratory. Estes, por sua vez, estão vinculados ao Projeto Genoma Europeu (ChickMap), coordenado pelo Roslin Institute, no Reino Unido. Os laboratórios do Roslin, East Lansing, Wageningen e Compton coordenam as atividades e são auxiliados por cerca de outros 15 laboratórios de diversos países. Estes têm cooperado no mapeamento de marcadores polimórficos pela genotipagem de amostras das mesmas populações referência internacionais (Compton, East Lansing e Wageningen). O objetivo dessa colaboração é: 1) desenvolver mapas genômicos comparativos de alta resolução alinhados entre espécies que ligam os mapas de animais utilizados na agricultura com aqueles dos genomas humano e de camundongos. 2) aumentar a densidade dos mapas de ligação existentes usados no mapeamento de QTL e integrá-los com mapas físicos dos cromossomos dos animais e 3) disponibilizar uma base de dados pública do genoma. A meta final é desenvolver ferramentas e recursos para mapear e identificar genes que controlam características de interesse para a agricultura e para biologia.

Progressos: foi verificado que o mapa genômico da galinha cobre ao redor de 3900 cM, sendo esta uma estimativa do tamanho do genoma da galinha. As evidências continuam no sentido de que a ordem dos genes é conservada entre os genomas humano e de galinhas, mais do que é entre roedores e humanos. Uma versão atualizada do consensus map será publicada por Schimid

et al. (2001), contendo 1965 marcadores.

Planos para o futuro: gerar e mapear mais marcadores microssatélites e melhorar a densidade do mapa. Desenvolver mapa comparativo entre humanos e galinha e expandir análises de QTL. Continuar desenvolvendo mapas físicos em vários laboratórios, focalizando regiões de interesse especial baseado em análises de QTL ou interesse citogenético.

No Brasil, a Embrapa Suínos e Aves e a ESALQ-USP estão liderando um esforço nacional para a formação de um Projeto do Genoma do Frango, cujo objetivo inicial é o mapeamento de QTL para

várias características de importância econômica. Mais detalhes sobre o projeto serão discutidos no decorrer do texto.

Mapeamento de QTL

Ao contrário da pré-suposição de que características quantitativas são influenciadas por muitos genes de pequeno efeito, Lande (1981) sugeriu que poucos genes poderiam explicar uma proporção relativamente grande da variação genética para características quantitativas. Esses loci são conhecidos como loci que influenciam características quantitativas (QTL). Uma das maiores metas da pesquisa genômica de aves tem sido o mapeamento e identificação de QTL. A detecção de QTL pode ser feita através da análise de todo o genoma, utilizando-se microssatélites (Anderson et al.,1994), pode concentrar em genes candidatos (Rothschild et al., 1997) ou ainda em cromossomos específicos (Rothschild et al., 1995). Vantagens e limitações do uso de genes candidatos e análise de ligação com microssatélites foi discutido recentemente por Rothschild e Soller (1999).

Genes candidatos para uma determinada característica são genes seqüenciados, de ação biológica conhecida, que estão envolvidos com o desenvolvimento ou fisiologia da característica em espécies ricas em informações genotípicas, como em humanos e camundongos. Os genes candidatos são identificados na espécie de interesse e os polimorfismos detectados. Os polimorfismos são associados com a característica de interesse através de análise estatística apropriada, utilizando-se dados provenientes de uma amostra de população comercial. Exemplos bem sucedidos da utilização de genes candidatos são os do gene do Halotano e o RN, que afetam a qualidade da carne e, em certas populações, os genes receptores de estrogênio e da prolactina, que afetam o tamanho da leitegada em suínos. Este procedimento é, entretanto, limitado ao conjunto de genes conhecidos. Em aves, menos de 300 genes foram mapeados até hoje. Duun et

al. (2000) conseguiram mapear recentemente o gene receptor da leptina (LEPR) em galinhas no

cromossomo 8. Pitel et al.(2000) concluíram que o gene da leptina (LEP) da galinha ainda não foi mapeado, ao contrário do que foi divulgado pelos mesmos autores anteriormente (Pitel et al., 1999). Tanto o gene da leptina quanto seu receptor têm sido associados com o metabolismo da gordura em outras espécies, como camundongos, suínos e humanos, o que os torna genes candidatos para estudos de deposição de gordura em aves.

Dentre as vantagens do uso de genes candidatos para mapeamento de QTL estão o maior poder estatístico, obtido com menor número de famílias e indivíduos quando comparado com as análises de ligação, a ampla aplicabilidade, pois não necessita de populações com 2 e 3 gerações, o baixo custo após o desenvolvimento dos primers e detecção do polimorfismo, a simplicidade operacional, pois pode-se trabalhar com um único gene e a utilização imediata na seleção assistida por marcadores na população testada.

As limitações desse procedimento são o pequeno número de genes conhecidos que controlam características de interesse, o efeito pleiotrópico de outros genes sobre o gene candidato, o alto custo da etapa inicial e a dificuldade no estabelecimento definitivo do efeito do gene candidato. Até que se estabeleça a variante causal do gene responsável pelo seu efeito quantitativo, sempre haverá a possibilidade de que o gene estudado não seja o gene que realmente esteja causando a diferença na característica, mas esteja ligado ao QTL. Isso pode levar a resultados contraditórios dependendo da população estudada, pois associações significativas em uma população podem não ser verificadas em outras. Por exemplo, Linville et al. (2001) não conseguiram demonstrar associação significativa do receptor do estrogênio e da prolactina com o tamanho da leitegada em suas populações de suínos, enquanto que associação significativa foi observada anteriormente nas populações utilizadas por Short et al. (1997) e Vincent et al.(1998).

O mapeamento do genoma para detecção de QTL utiliza marcadores genéticos espalhados por todo genoma para identificar genes que afetam as características quantitativas. Para tal é necessário estabelecer uma população que esteja segregando para as características de interesse, utilizando um delineamento apropriado para esse fim. Normalmente são utilizadas famílias de F2 ou de retrocruzamento, envolvendo o cruzamento de linhagens divergentes. Com a utilização de métodos estatísticos apropriados é possível identificar o QTL, bem como estimar sua

posição e efeito através da associação entre marcadores e as características econômicas. A precisão com que essas estimativas são obtidas depende, entretanto, de populações de grande tamanho. Quanto maior o número de microssatélites mapeados e utilizados na análise de ligação, maior será a resolução do mapeamento de QTL. A vantagem desse procedimento é que não exige conhecimento prévio dos genes envolvidos na expressão do fenótipo de interesse. Além disso, há grande probabilidade de sucesso, desde que o delineamento experimental, o número de animais e a distribuição dos marcadores sejam adequados. Esse procedimento pode revelar QTLs que não seriam identificados por genes candidatos, como é o caso de efeito quantitativo devido a pleiotropia. Utilizando-se esse procedimento em aves, QTLs foram localizados para várias características, tais como: percentagem de carcaça, coloração da carne, consumo de alimento e susceptibilidade à doença de Marek.

Algumas limitações desse método são o alto custo, devido ao grande número de indivíduos e famílias necessárias para uma análise acurada. A maioria das populações utilizadas são experimentais, envolvendo o cruzamento entre linhagens divergentes para determinadas características e não linhagens comerciais, havendo a necessidade de validação dos resultados obtidos antes de sua aplicação. Outra limitação é que a região do genoma que é identificada é relativamente grande e poderá conter muitos genes, tornando difícil a identificação dos genes que explicam o QTL.

Embora ambos procedimentos possam ser usados de forma alternativa na detecção de genes de interesse, eles também podem ser utilizados de forma complementar, identificando regiões do genoma que contenham possíveis QTLs através do mapeamento de todo genoma e pesquisando os genes localizados naquela região através de genes candidatos, identificados através de mapas comparativos com espécies ricas em marcadores e genes conhecidos, como o de humano e camundongo.

Na avicultura, estudos de mapeamento ainda não resultaram em genes ou marcadores que já estejam sendo utilizados em larga escala em programas de melhoramento de aves. Segundo Hillel (1997), a contribuição prática de marcadores de DNA na avicultura tem sido mínima, devido ao fato de que a maioria dos trabalhos não chegam ao estágio de aplicação ou porque os resultados não se confirmam. Como comentado anteriormente, há a necessidade de validação dos resultados obtidos em outras populações experimentais e em populações comerciais, o que em muitos casos não são realizados, ou quando são, menos de 20% são confirmados (Hillel, 1997).

Uma estratégia que pode ser definida é a utilização de cromossomos específicos na detecção de QTL visando validar QTLs encontrados em outros estudos e também verificar se QTLs sugestivos em estudos anteriores são ou não significativos. Wang et al. (1998) realizaram uma procura direta por QTL nos cromossomos 4 e 7 de suínos. Utilizaram mais marcadores que nos estudos anteriores e verificaram QTL significativo no cromossomo 7 relacionado com espessura de toucinho. Próximo a esta região do QTL foram encontrados dois genes que parecem afetar a deposição de gordura, o TNFalfa e a colipase.

Analise de QTL

Para testar a associação entre gene candidato e a característica de interesse pode-se utilizar teste de freqüência de alelos entre linhas, diferença nas freqüências dos alelos entre as extremidades da distribuição, modelo misto com o alelo ou genótipo como efeito fixo e ainda regressão múltipla quando vários genes candidatos são usados para uma certa característica (Rothschild e Soller, 1999).

A maioria dos estudos de QTL em aves tem utilizado o cruzamento de populações divergentes. O mapeamento de intervalo baseado nos quadrados mínimos é um método poderoso e robusto para análise de QTL com esse tipo de dados (Andersson et al, 1994; Haley et al., 1994). A análise baseada na máxima verossimilhança (ML) também pode ser utilizada. Entretanto, os resultados obtidos têm sido semelhantes aos observados utilizando-se os quadrados mínimos (Haley e Knott, 1992). Dependendo da estrutura da população, é possível a realização de uma análise conjunta utilizando dados de vários estudos para aumentar o poder de detecção do QTL e avaliar

diferenças das populações (Haley, 1999). O potencial da análise combinada para detecção de QTL foi demonstrado por Walling et al. (2000), que analisaram dados de cerca de 3000 suínos de 7 populações F2 diferentes.

Populações experimentais desenvolvidas para mapeamento de QTL

Além das populações mencionadas anteriormente, existem as desenvolvidas pelo Roslin Institute, na Escócia, que consiste de famílias F2 derivadas do cruzamento de duas linhas endogâmicas, uma de corte e outra de postura; na França, a partir do cruzamento de linhagens selecionadas com base no consumo alimentar residual e em Israel, a partir de cruzamentos de linhagens selecionadas divergentemente para resposta imune e deposição de gordura. No Brasil, a Embrapa Suínos e Aves desenvolveu populações F2 a partir do cruzamento recíproco de linhagens divergentes de corte e postura, que serão utilizadas para identificar marcadores associados a características de crescimento, produção de ovos, consumo, composição de carcaça, fertilidade, etc., em nossas condições de clima e manejo.

Resultados obtidos através de genes candidatos

Algumas mutações em aves foram caracterizadas precisamente com a identificação de um defeito molecular em um gene específico. A existência de um mutante com efeito fenotípico maior indica que um único gene desempenha papel crucial, independente da complexidade da função envolvida. O gene recessivo “dwarf” ou do nanismo (Dw) ligado ao sexo, levou pesquisadores a sugerirem que o receptor do hormônio de crescimento era o melhor gene candidato para o defeito primário em aves anãs. Este posteriormente foi mapeado no braço curto do cromossomo Z. Nesse caso, a técnica de genes candidatos obteve sucesso. Entretanto, freqüentemente poderá haver muitos genes candidatos ou mesmo nenhum e a procura pela mutação poderá ser iniciada mapeando-se o gene com marcadores anônimos. Genes candidatos para outras mutações em aves foram identificados ou sugeridos por estudos genéticos ou fisiológicos, como por exemplo a tirosinase, relacionada com o albinismo e o receptor da rianodina, associado ao “crooked neck dwarf”, cuja mutação causa severa má formação da musculatura esquelética levando ao desenvolvimento embrionário anormal (Tixier-Boichard, 2000).

Marcadores para os genes do hormônio do crescimento (GH) e receptor-GH foram associados com mudanças no peso corporal (Feng et al., 1998) e taxa de postura (Kuhnlein et al., 1997) em aves White Leghorn. O gene IGF-I (insuline-like growth factor I) foi mapeado no braço curto do cromossomo 1 da galinha. Nagaraja et al. (2000) identificaram um marcador genético próximo a esse gene associado com diferenças no peso do ovo e na espessura da casca em aves White Leghorn. Sourdioux et al. (1999) verificaram associação significativa de polimorfismos de genes envolvidos no metabolismo de lipídios com a variabilidade na deposição de gordura em perus.

QTL identificados através de análise de ligação

Estudos visando a identificação de QTL em aves, utilizando microssatélites, publicados até o momento, são os de Hu et al. (1997), Vallejo et al, (1998), Van Kaam et al. (1998, 1999a, 1999b), Zhu et al. (2000b) e os de Yonash et al. (2001).

QTLs relacionados com produção e qualidade

Van Kaam et al. (1999a) utilizaram dados de desempenho de cerca de 2000 animais F3 oriundos do cruzamento de duas linhas fêmea de corte. As gerações F1 e F2 foram genotipadas para 420 marcadores microssatélites. Quatro QTLs fomam encontrados. O QTL mais significativo foi localizado no cromossomo 1 para consumo de ração entre 23 e 48 dias, além de apresentar ligação sugestiva para ganho de peso de 23 a 48 dias e peso corporal aos 48 dias. Um segundo QTL foi encontrado no grupo de ligação WAU26 com ligação sugestiva para consumo de 23 a 48 dias. O terceiro QTL foi encontrado no cromossomo 4 que também afeta o consumo de ração. O quarto QTL foi encontrado no cromossomo 2 que afetou o consumo de ração ajustado para o peso

corporal. Analisando características de carcaça, Van Kaam et al. (1999b) identificaram dois QTLs com ligação sugestiva. O mais significativo foi localizado no cromossomo 1, com efeito na porcentagem de carcaça e o outro no cromossomo 2, que afeta a coloração da carne.

Recentemente, na Sociedade Internacional de Genética Animal (ISAG-2000), foram divulgados mais 8 QTLs diferentes afetando a qualidade do ovo, produção de ovos, peso corporal e maturidade sexual em poedeiras (Honkatukia et al., 2000). Khatib et al. (2000) estão trabalhando no mapeamento de QTL para obesidade através de pool seletivo de DNA em uma população F10.

Na busca por genes que conferem resistência a doenças

A maioria das doenças apresenta diferenças genéticas quanto a sua susceptibilidade. Os mecanismos que influenciam essas diferenças são pouco estudados e os genes responsáveis são desconhecidos, com exceção dos receptores de certos grupos de vírus da leucose, que foram clonados, os quais são mediadores da resistência (Bumstead, 2000). A identificação de genes responsáveis por diferenças em resistência a doenças é importante, pois permite a seleção de animais mais resistentes e animais que respondam melhor ou mais homogeneamente a vacinação. O Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC), que está associado a resposta imune, é um dos poucos exemplos em que a genética molecular e quantitativa têm sido integradas em programas de melhoramento (Dodgson et al, 2000). Com os avanços no mapeamento do genoma avícola, análises de QTL e expressão gênica, muitas descobertas vêm sendo feitas no sentido de identificar e quantificar genes relacionados a resistência às principais doenças em aves.

A Salmonela é uma das maiores causas de infecção alimentar em humanos, sendo que ovos e carne de aves estão freqüentemente envolvidos. No melhoramento de aves, esforços vêm sendo feitos para identificar diferenças genéticas para salmonela entre e dentro de linhas. Mutações do gene NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1) têm sido associadas com susceptibilidade em salmonelas (Hu et al, 1997), porém explica apenas uma pequena parte das diferenças observadas. A resistência a salmonela nas aves parece ser herdada por um autossomo com dominância completa, que não é ligado ao genótipo do MHC (Bumstead, 2000). Isso foi verificado quando uma linhagem resistente a salmonela foi cruzada com outra susceptível. A diferença entre as linhagens quanto a contagem de bactérias foi cerca de 10 vezes, sendo que as F1 foram semelhantes a linhagem resistente. Após a genotipagem de animais selecionados dessa população, dois marcadores no cromossomo 5 (MCW81 e MCW29) foram identificados como possivelmente associados a resistência. Esses resultados foram testados em outras populações e gerações verificando-se associação significativa. Foram utilizados vários microssatélites próximos a região daqueles marcadores para tentar localizar genes de resistência. Foi encontrada forte associação entre alguns deles, principalmente com o gene CKB (creatinase).

A Doença de Marek (DM) apresenta grande resistência genética. Os diferentes haplótipos do MHC diferem grandemente em susceptibilidade. Pesquisas sugerem que a resistência a Marek possa ser devido a um pequeno número de genes com efeitos relativamente grandes (Bumstead, 2000). Através de análise de ligação, Vallejo et al. (1998), estudando uma população com o mesmo genótipo para o MHC, verificaram 2 QTLs significativos nos cromossomos 2 e 8 e 3 sugestivos nos cromossomos 4, 7 e 16, relacionados a resistência a Marek. Foram utilizados apenas 65 microssatélites na época em que o trabalho foi realizado, por isso, possivelmente outros QTL não puderam ser identificados. Yonash et al. (1999) encontraram 14 QTLs para DM, 7 significativos e 7 sugestivos, genotipando 272 aves F2, oriundas do cruzamento entre linhagens endogâmicas, com 127 marcadores. Cada QTL explicou cerca de 2 a 10% da variação na resistência a DM. Em outro trabalho visando a identificação de genes que conferem resistência a DM, populações com o mesmo haplótipo para o MHC foram mapeadas geneticamente associando-se a características de desenvolvimento do tumor e replicação do vírus (Bumstead, 1998, 2000). Várias regiões candidatas foram identificadas, sendo as mais importantes no cromossomo 1, havendo equivalência nas regiões em camundongos e humanos que contém o complexo NK (natural killer).

A Coccidiose continua impondo um impacto econômico significante na indústria avícola. Quimioterápicos e vacinas são as estratégias atualmente utilizadas para o controle da doença. O

controle da doença baseado na resistência genética do hospedeiro torna-se uma boa alternativa (Zhu et al, 2000a). Pesquisas vêm sendo realizadas por Zhu et al. (2000b) no intuito de identificar QTL para resistência a Coccidiose. Para tal, foi utilizada uma população F2 originada do cruzamento entre uma população resistente e uma susceptível a Coccidiose. Até o momento, mais de 150 marcadores foram selecionados para conduzir a análise de QTL por todo o genoma. Yonash et al. (2001), utilizando cruzamento de 2 linhas de aves de corte selecionadas divergentemente para alta e baixa resposta a anticorpos para E. coli, encontraram 3 marcadores associados significativamente com a resposta imune: O ADL0146, no cromossomo 2, associado com anticorpos para hemáceas de carneiro e Newcastle; o ADL0290, no grupo de ligação 31, afetando anticorpos para Newcastle e o ADL0298, no grupo de ligação 34, associado com anticorpos para E. coli e sobrevivência.

O desenvolvimento de técnicas moleculares rápidas tem permitido a identificação de genes responsáveis pela resistência a doenças e o melhor entendimento de suas funções nesse processo. Com a identificação desses genes, as vacinas poderão ser melhoradas e também será possível selecionar animais resistentes diretamente pelo seus genótipos. A seleção assistida por genes ou marcadores trará grandes vantagens também para o melhoramento da resistência ao estresse calórico e problemas metabólicos, muito comuns nos dias de hoje em nossos sistemas de criação.

Mapeamento de alta resolução

Embora tenha havido um aumento no número de estudos de mapeamento de QTL, a resolução dos mesmos ainda é baixa, geralmente estando na ordem de 20 a 30 cM. Para o mapeamento de alta resolução desses QTLs, várias estratégias têm sido descritas, tais como a geração de pedigrees através de retrocruzamento, produção de linhas endogâmicas recombinantes ou linhas congênicas e cruzamentos avançados entre linhas (Groenen et al., 2000). Detalhes dessas técnicas, bem como suas vantagens e desvantagens são descritas por Darvasi (1998).

O grupo de Wageningen, dando continuidade a sua população F3, estão produzindo um cruzamento avançado entre linhas para a realização do mapeamento de alta resolução de QTL para características de produção e ligadas a saúde animal (Groenen et al., 2000). Eles já estão na geração F8 e esperam mapear os QTLs encontrados na F2, por Van Kaam et al. (1999a, b), com uma maior resolução dentro de 2 anos. Para tal, terão que utilizar marcadores microssatélites e SNPs (single nucleotide polymorphism), pois há a necessidade de pelo menos 1 marcador a cada 1 cM. Atualmente a densidade média do mapa de ligação é 2 cM, mas há regiões em que esse numero é bem maior. Segundo Montgomery (2000), a maioria da variação dentro de pequenas regiões cromossômicas será devido a mudanças de uma única base (SNPs), por isso, para uma série de aplicações do mapeamento genético, será essencial a descoberta desse tipo de marcador em grande escala.

Populações referência para mapeamento de QTL da Embrapa Suínos e Aves

Para validar regiões que apresentem QTL, bem como para identificar QTLs adicionais, foram criadas populações referência F2 a partir do cruzamento recíproco de duas linhagens experimentais divergentes: uma de corte e uma de postura, cuja descrição foi apresentada por Zanella et al. (2000). Será realizada a genotipagem de animais parentais, F1 e F2. Os F2, criados como frangos de corte, foram avaliados para características de crescimento, carcaça, órgãos e características relacionadas com gordura. Serão realizadas análises através de genes candidatos e análise de ligação com microssatélites para identificar regiões que contenham QTL. Para a análise de genes candidatos foram escolhidos genes que atuam no desenvolvimento muscular (MyoD, Myf5, miogenina, e MRF4), o que está diretamente associado ao ganho de peso.

Essas populações irão contribuir para elucidar diferenças na expressão gênica e nos efeitos de QTL, devido a diferenças de clima e manejo, bem como possibilitar estudos sobre efeito materno, citoplasmático, ligados ao sexo e “gametic imprinting” (efeito gamético), como demostrado por

Ledur et al. (2000a) e Ledur et al (2000b). O fenômeno conhecido como “imprinting” é verificado quando a expressão de um gene depende da origem parental do alelo herdado. Em aves, esse tipo de efeito ainda não foi demonstrado (Tixier-Boichard, 2000). Porém, Koning et al. (2000) encontraram QTL com efeitos de “imprinting” em características de qualidade da carne em suínos. Esses efeitos de “imprinting“ têm influência na otimização de programas de melhoramento, pois esquemas tradicionais de seleção não levam em consideração esse efeito. A identificação de loci com efeito de “imprinting” abre novas perspectivas para cruzamentos, especialmente em espécies que utilizam linhas de fêmea e linhas de macho em seus esquemas de cruzamento, como é o caso de suínos e aves.

As análises de QTL em nossas populações serão baseadas no método dos quadrados mínimos para identificação de QTL segregando em cruzamento entre linhagens divergentes (Haley et al., 1994). Os genótipos dos marcadores serão utilizados para estimar probabilidades genotípicas da linhagem de origem de cada gameta nos indivíduos F2. Essas probabilidades serão usadas para estimar, através de regressão, os efeitos aditivo e de dominância do QTL.

No momento estão sendo realizadas as genotipagens dos animais F1, em colaboração com o Professor Luiz Lehmann Coutinho (ESALQ-USP), cobrindo os cromossomos 1, 2, 3, 4 e 5, com um espaçamento de aproximadamente 10 cM entre microssatélites. Experimentos estão sendo programados para identificação de QTLs associados a qualidade da carne e resistência a coccidiose em aves F3 de nossa população. Espera-se que, em breve, mais Instituições passem a participar desse esforço para a formação de um Projeto Brasileiro do Genoma do Frango, já que o Brasil é um dos maiores produtores e exportadores desse produto a nível mundial.

Perspectivas e Considerações Gerais

A aplicação da genética molecular em programas de melhoramento depende do desenvolvimento de quatro áreas distintas: da genética molecular, da detecção de QTL, da avaliação genética e da seleção assistida por marcadores. O sucesso da implementação de estratégias para a seleção assistida por genes (seleção baseada num gene conhecido), ou seleção assistida por marcadores (seleção baseada em marcadores ligados a um QTL) é dependente da ação conjunta dessas áreas ( Dekkers, 1999).

A identificação de genes de interesse através de estudos de mapeamento é apenas um dos primeiros passos necessários para a implementação de técnicas moleculares em programas de melhoramento. Para tal será necessária a estimação dos efeitos do QTL em populações comercias, estimação dos efeitos do marcador e QTL dentro de família, bem como a reestimação desses efeitos periodicamente. Mesmo quando o próprio gene for identificado, haverá a necessidade de reestimar seus efeitos regularmente para evitar possíveis associações negativas com outras características, com efeitos ambientais e com a própria composição genética do indivíduo. Outro passo importante que vem sendo pesquisado é quanto a melhor maneira de incorporar essa informação nas avaliações genéticas para a obtenção do melhor preditor linear não viesado (BLUP) para o valor genético aditivo do QTL identificado e do efeito coletivo dos outros genes de um indivíduo.

Os avanços nas pesquisas genômicas de diferentes espécies, na genética quantitativa e nas análises de expressão gênica em grande escala, tanto a nível de mRNA como de proteínas, irão acelerar o processo de descobrimento de novos genes e de suas funções e, conseqüentemente, seu uso na seleção assistida por marcadores ou genes. Entretanto, esses conhecimentos e tecnologias deverão ser integrados aos programas de melhoramento de forma apropriada, após estudos detalhados de esquemas e otimização de programas de melhoramento, sempre em conjunto com o aprimoramento dos programas de manejo, alimentação e sanidade. A tendência, com o aprimoramento genético dos animais, bem como das outras áreas afins, é de que os efeitos da interação entre o genótipo e o ambiente (GxE) se tornem cada vez mais importantes. Por isso, grande atenção deverá ser dada aos possíveis efeitos de interação GxE relativa a marcadores ou genes identificados, antes e durante sua utilização em programas comerciais.

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