JÚLIO CEZAR DE OLIVEIRA
PROGRAMAÇÃO METABÓLICA INDUZIDA PELA MÁ
NUTRIÇÃO PROTÉICA PERINATAL PREJUDICA A ATIVIDADE
VAGAL E O METABOLISMO EM RATOS ADULTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
JÚLIO CEZAR DE OLIVEIRA
PROGRAMAÇÃO METABÓLICA INDUZIDA PELA MÁ
NUTRIÇÃO PROTÉICA PERINATAL PREJUDICA A ATIVIDADE
VAGAL E O METABOLISMO EM RATOS ADULTOS
Prof. Dr. Paulo Cezar de Freitas Mathias
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Júlio Cezar de Oliveira
D722a Programação metabólica induzida pela má nutrição protéica perinatal prejudica a atividade vagal e o metabolismo em ratos adultos/ Júlio Cezar de Oliveira. -- Maringá : [s.n.], 2009.
Erro! Auto-referência de indicador não válida.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar de Freitas Mathias
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá. Programa de
Pós-graduação em Ciências Biológicas. Departamento de Biologia Celular e Genética, 2009.
1. Restrisção protéica materna. 2. Programação metabólica. 3. Secreção de
insulina. 4.Sistema nervoso autônomo. 5.Ratos. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
BIOGRAFIA
Júlio Cezar de Oliveira nasceu em Olho D’água do Borges/ RN em 18/07/1980. Possui graduação em Biologia pela Universidade do Estadual do Rio Grande do Norte (2005). Tem experiência na área de Fisiologia Endócrina, Biologia Celular e Bioquímica, atuando principalmente nos seguintes temas: mecanismos fisiológicos e bioquimicos da secreção das celulas β-pancreaticas, regulação e homeostase metabólica
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, o responsavel por toda a força e determinação que me permitiu, a cada dia ao longo desse período, realizar um pouquinho da árdua tarefa para
a obtenção desse trabalho.
Aos meus pais e irmãos, que sempre estiveram ao meu lado, incondicionalmente, torcendo e apioando-me em cada decisão tomada.
Ao Prof. Dr. Paulo Cezar de Freitas Mathias, pela orientação, confiança e oportunidade que me deu ao me receber em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Francisco Barros Barbosa, o qual desde o meu tempo de graduação esteve me motivando a seguir pelos caminhos da ciência e por sua contribuição para com esse
trabalho.
A Dr. Clarice Gravena, pela sua contribuição em ceder alguns dados experimentais para a conclusão desse trabalho.
A cada uma das pessoas que fazem parte do Laboratório de Biologia Celular da Secreção – LBSC: pela contribuição, apoio, companherismo e amizade.
A todos os meus amigos, que independente do lugar, sempre me apoiaram.
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Há muitas maneiras para se viver, porém nenhuma delas é correta, se em qualquer uma delas, tentarmos viver sozinho. O rítmo dos avanços científicos e tecnológicos é muito mais rápido do que qualquer reflexão ética, o que faz crescer no homem a inquietude pelo conhecimento de verdades vitais.
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação é composta de um artigo científico. O qual aborda a questão da programação metabólica devida a uma restrição protéica materna durante os 2/3 iniciais da lactação. Sendo este período, de fundamental importância para o desenvolvimento do sistema nervoso central, o organismo submetido a tal situação, programa-se irreversivelmente, para diversas alterações metabólicas associadas a um desequilíbrio autonônomo do controle metabólico, massa corpórea e ingestão alimentar, que devem garantir sua sobrevivência a situações de extrema carência na vida adulta. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o artigo foi redigido de acordo com a revista The Journal of Nutrition, para a qual o mesmo será enviado:
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO
A subnutrição ainda hoje afeta inúmeros países em todo o mundo, sendo os subdesenvolvidos os principais alvos das conseqüências fisiopatológicas dessa injúria. Quando ocorrida no início da vida, a subnutrição é responsável por programar permanentemente o indivíduo para distúrbios metabólicos na vida adulta. Restrição protéica perinatal em ratos leva a profundas alterações na regulação glicêmica o que é decorrente de uma reduzida capacidade secretora das ilhotas pancreáticas. Como sugerido, por vários estudos epidemiológicos e experimentais a má nutrição nos primeiros dias de vida está relacionada com o risco de desenvolver obesidade na vida adulta, fato que é conhecido como programação metabólica. O estágio do desenvolvimento correspondente ao período lactacional na vida de um rato é um momento crucial para os processos de gênese, migração e diferenciação de células do sistema nervoso central (SNC), assim uma restrição protéica materna durante a lactação tem grande potencial para desenvolver uma programação metabólica na qual o indivíduo perde de maneira irreversível o controle autônomo da homeostasia energética, já que este sistema tem um papel imprescindível no controle da massa corpórea e mtabolismo. Dentre as diversas áreas cerebrais, o hipotálamo tem sido identificado como a principal área constituída por muitos neurônios responsáveis pela recepção de sinais periféricos, que induzem a emissão de sinais eferentes para corrigir, seja o excesso ou a carência da ingestão alimentar e estoques energéticos.
O sistema nervoso central é fundamentalmente importante na manutenção da homeostase glicídica, atuando através das vias parassimpática, com efeito, insulinotrópico e simpática, com efeito, insulinostático. O nervo vago regula os níveis glicêmicos através da liberação da acetilcolina nos terminais pancreáticos, desse modo potencializando a secreção de insulina estimulada pela glicose. Por sua vez as catecolaminas; adrenalina secretada na corrente sanguínea pelas células cromafínicas da medula das glândulas adrenais e noradrenalina liberada pelos terminais simpáticos nas ilhotas pancreáticas atuam majoritariamente em receptores α2A-adrenérgicos nas células
beta, inibindo a secreção de insulina.
OBJETIVOS
Geral - Avaliar o efeito da restrição protéica perinatal sobre a atividade do sistema nervoso autônomo e o seu papel na regulação da glicemia de ratos adultos.
Específicos - Registrar a atividade elétrica vagal e do ramo simpático do gânglio cervical superior, avaliar a tolerância a glicose e sensibilidade a insulina, e a resposta secretora de insulina a estímulos colinérgicos e adrenérgicos de ratos adultos que tiveram restrição protéica nos 2/3 iniciais da lactação.
MÉTODOS
Animais Experimentais
Durante todo o período experimental os ratos foram mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e fotoperíodo (07h00 às 19h00).
Procedimentos Cirúrgicos
Todos os procedimentos foram realizados com ratos aos 81 dias de vida, previamente anestesiados. Uma cirurgia para implantar uma cânula de silicone na veia jugular direita foi feita, para posterior retirada de sangue durante o ivGTT e ipITT. Para o registro da atividade elétrica do sistema nervoso autônomo (SNA), fez-se uma pequena incisão na região ventrocervical, para a dissecação dos tecidos circundantes e isolamento do nervo vago. Quando usados para a retirada do pâncreas e medulas adrenais, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e em seguida laparatomizados. Ao termino de cada rpocedimento, foi medido o comprimento naso-anal e retiradas às gorduras retroperitoneal e epididimal.
Teste de Tolerância a Glicose intravenoso – (ivGTT) e Teste de Tolerância a Iinsulina intraperitoneal –( ipITT).
O ivGTT aconteceu 24h após a cirurgia com ratos conscientes e em jejum de 12h. O tratamento prévio com o uso de agonistas e antagonistas colinérgicos muscarínicos e/ ou adrenérgicos, se deu cinco minutos antes da infusão intaravenosa de (1g de glicose/ Kg de MC), sendo administrada intraperitonealmente uma das seguintes drogas: acetilcolina, (ACh) na concentração (27ηmol/ Kg de MC), atropina (Atr)
(20ηmol/ Kg de MC), yohimbina (Yoh - 20ηmol/ Kg de MC) e oxymetazolina (Oxy -
16ηmol/ Kg de MC). Os ratos não tratados com as drogas colinérgicas e adrenergicas
receberam salina (0,9% de NaCl).
Com outros ratos, realizou-se ipITT aos quais foi administrada intraperitonealmente uma dose de (1U de insulina/ Kg de MC).
Avalição do grau de sensibilidade à insulina
Foi feitos o Kitt, (0.693/(t1/2), o HOMA (Insulinemia basal (ηg/ml) x Glicemia
basal (mmol/l)/ 22.5) e o índice insulinogênico [( insulina ηg ml-1/45min)/ ( glicose mmol l-1/ 45min.)].
Registro da atividade elétrica do sistema nervoso autônomo
Quando isolado, o ramo cervical superior do nervo vago foi sobreposto a um par de eletrodos de prata para captar a taxa de despolarização e repolarização do nervo no interior de uma gaiola metálica condutora. O registro da atividade simpática foi realizado através do ramo cervical de um nervo simpático, imediatamente próximo ao gânglio cervical superior.
Dosagem da Atividade da Enzima Acetilcolinesterase (AchE)
Após a dissecação, os pâncreas foram homogeneizados por 5 minutos, o homogeneizado foi centrifugado a 5000 g/2min. e o sobrenadante armazenado a -20 oC para posterior determinação da atividade acetilcolinesterásica pancreática.
Perfusão das ilhotas pancreática isoladas
As ilhotas foram perfundidas, em uma câmara, com auxilio de uma bomba peristáltica, durante 90 minutos, em um fluxo de 1ml/min. em banho-maria a 37 oC, contendo solução tampão bicarbonato, pH 7.4) acrescida de glicose (Gluc) 8.3 mM e glicose 8.3 mM + carbamilcolina (Cch) 1.0 mM em cada um dos recipientes, para a perfusão com carbamilcolina; ou glicose 16.7 mM e glicose 16.7 mM + epinefrina (Epi) 0.1 µM + propranolol (Prop) 0.1 µM, para a perfusão com epinefrina.
Avaliação das catecolaminas adrenais
Análises Estatísticas
Todos os dados foram submetidos a um teste t de Student ou análise de variância (ANOVA®) seguida do pós-teste de Bonferroni, e representam a media ± EPM. Valores de P < 0.05 foram considerados estatisticamente significantes. Os testes foram realizados através do GraphPad Prism versão 5.0 for Windows (GraphPad Software®). RESULTADOS E DISCUSSÃO
O tratamento perinatal com restrição protéica durante os 2/3 iniciais da lactação foi responsável por reduzir, a massa corpórea, comprimento naso-anal, e estoques retroperitoneal e epididimal de gorduras; além disso, embora esses ratos tenham se mantido normoglicêmicos a insulinemia basal de jejum foi significantemente reduzida em 40,07% comparado aos ratos NP, (P < 0,01). O incremento glicêmico ( Glicose) foi 29,05% maior (P < 0,05), enquanto que o incremento insulinêmico ( Insulina) foi 48,51%, menor (P < 0,001) nos LP, os quais mostraram hipersensibilidade periférica à insulina, com Kitt 58,48% maior (P < 0,05); e insulina/ glicose 46,72% (P < 0,01), e HOMA 27,95% (P < 0,001) menores em comparação aos NP.
A administração de ACh exógena levou, nos ratos NP, a uma redução de 15,71% (P < 0,01) do incremento glicêmico em comparação aos NP não tratados com ACh, enquanto nos LP esse efeito foi 37,01% (P < 0,001) comparado aos LP sem tratamento com a droga. A Atr causou um efeito contrário ao da ACh sobre a glicemia nos NP (40,90% maior que os NP sem nenhum pretratamneto com a droga, P < 0,01), enquanto que nos LP não houve diferença entre tradados e não tradados com Atr. A Yoh reduizu o incremento glicêmico dos ratos NP em 15,57% e LP em 23,87% comparado aos seus respectivos controles. Porém, não houve diferença entre NP e LP tratados com Yoh. A Oxy aumentou em 50,83% o incremento glicêmico dos ratos NP em relação aos NP sem tratamento prévio com droga, (P < 0,001), enquanto o incremento glicêmico dos animais LP não foi afetado.
A atividade elétrica do nervo vago superior foi 42,56% menor (P < 0,001) e a atividade enzimática da acetilcolinesterase foi reduzida em 73,65% (P < 0,0001) no grupo LP. Além disso, as ilhotas dos ratos LP, perfundidas com carbacol, secretaram 74,78% (P < 0,001) menos insulina do que aquelas dos ratos NP.
A atividade eletrica superior simpática assim como o conteúdo total de catecolaminas não diferiu entre ratos LP e NP. A secreção basal das medulas adrenais do grupo LP foi 31,91%, (P < 0,001) menor, enquanto que a secreção estimulada por execesso de K+ foi 56,92% maior que a dos ratos NP (P < 0,01).
As ilhotas LP perfundindas com alta concentração de glicose na presença de propranolol e epinefrina teve decréscimo da secreção de insulina equivalente as ilhotas do grupo NP.
CONCLUSÕES
A restrição protéica perinatal, foi capaz de reduzir a atividade elétrica do nervo vago, afetando assim, negativamente, o efeito insulinotrópico das vias parassimpáticas sobre as células β pancreáticas. Fato que pode ser pelo menos parcialmente, o
GENERAL ABSTRACT
INTRODUCTION
Malnutrition still affects many countries around the world, being developing country the main targets of the pathophysiological consequences this injury. When done early in life, malnutrition is responsible for permanently to program metabolic disorders in adulthood. Perinatal protein restriction leads to profound changes in glucose regulation that is due to a reduced secretory capacity of pancreatic islets in rats. As suggested by several epidemiological and experimental studies the malnutrition in the first days of life is related to obesity in adulthood, which is known as metabolic imprimting. The stage of development corresponding to the lactation period in the life of a rat is a crucial time for the processes of genesis, migration and differentiation of cells in the central nervous system (CNS), as a maternal protein restriction during lactation have great potential to develop a metabolic imprinting in which the individual loses of the irreversible way autonomic control of energy homeostasis, since this system has a vital role in the control of body mass and mtabolismo. Among the several brain areas, the hypothalamus has been identified as the main area containing many neurons responsible for the Reception of peripheral signals, which induce the emission of efferent signals to correct either the excess or shortage of food intake and energy stocks. The central nervous system is fundamentally important in maintaining glucose homeostasis, acting through the parasympathetic pathways, with insulinotrópic effect, and sympathetic, with insulinostátic effect. The vagus nerve regulates blood glucose levels through the release of acetylcholine in pancreatic terminals, thereby increasing the secretion of insulin stimulated by glucose. In turn the catecholamines, adrenaline secreted in the blood by cromafínicas cells of the adrenal glands and norepinephrine released by sympathetic terminals in the pancreatic islets majoritariamnte act in α
2A-adrenergic receptor in beta cells, inhibiting of the insulin secretion.
AIMS
To evaluate the effect of perinatal protein restriction on the action of the autonomic nervous system and its role in regulating blood glucose in adult rats.
Thus, to register the vagal tonus and sympathetic branch of the superior cervical ganglion, to assess the glucose tolerance and sensitivity insulin, and secretory response to cholinergic and adrenergic stimuli.
METHODS
Experimental Animals
Wistar lactating rats fed hypoproteic (4% protein) during the initial 2/3 and commercial diet (23% protein) during the last week of lactation, LP group; and the control group (NP) received commercial diet throughout the lactation (21 days). After weaning the offspring of both groups received commercial diet ad libitum until the period of 81 days of age.
During all experimental period the rats were kept under controlled conditions of temperature (22 ± 2 ºC) and photoperiod (07h00 to 19h00).
Surgical Procedures
autonomic nervous system (ANS), was a small incision in the region ventrocervical for the dissection of the surrounding tissues and isolation of the vagus nerve.
When used for the removal of the pancreas and adrenal medulla, the rats were sacrificed by cervical dislocation and then laparatomizados. At the end of each procedure, was measured naso-anal length and removed the epididymal and retroperitoneal fat.
Intravenous glucose tolerance test- (ivGTT) and intraperitoneal insulin tolerance test - (ipITT).
The ivGTT occurred 24h after surgery in conscious and fasted for 12 hours rats. The pretreatment with the use of cholinergic muscarinic agonists and antagonists and / or adrenergic, was five minutes before the intravenous infusion of (1g glucose / kg of BM), and administered intraperitoneally one of the following drugs: acetylcholine (ACh) in concentration (27ηmol / kg of BM), atropine (Atr) (20ηmol / kg of BM),
yohimbine (Yoh - 20ηmol / kg of BM) and oxymetazolina (Oxy - 16ηmol / kg of BM).
The rats not treated with the cholinergic and adrenergic drugs received saline (0.9% of NaCl).
In other rats, there was ipITT which was administered intraperitoneally a dose of (1U of insulin / kg of BM).
Evaluation of the degree of sensitivity to insulin
The Kitt was made the (0693/ (t1/2), the HOMA (basal insulin (ηg/ml) x basal
Glycemia (mmol/l)/ 22.5) and insulinogenic index [( insulin ηg ml-1/45min)/ ( glucose
mmol l-1/45min.)].
Record the electrical activity of the autonomic nervous system
Once isolated, the upper cervical branch of the vagus nerve was superimposed on a pair of silver electrodes to capture the rate of depolarization and repolarization of the nerve inside a metal cage conductor. The registry of the sympathetic activity was conducted through the branch of a cervical sympathetic nerve, immediately next to the superior cervical ganglion.
Determination of activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE)
After dissection, the pancreas was homogenized for 5 minutes, the homogenate was centrifuged at 5000 g/ 2min. and the supernatant stored at -20 oC for later determination of pancreatic acetylcholinesterase activity.
Infusion of isolated pancreatic islets
The islets were perfused in a chamber, with the aid of a peristaltic pump, for 90 minutes in a flow of 1ml/ min. in water bath at 37 °C containing bicarbonate buffer, pH 7.4) plus glucose (Gluc) 8.3 mM and 8.3 mM glucose + carbamilcholine (Cch) 1.0 mM in each of the containers for infusion with carbamilcholine, or glucose 16.7 mM and 16.7 mM glucose + epinephrine (Epi) + 0.1 mM propranolol (Prop) 0.1 mM to the perfusion with epinephrine.
Evaluation of adrenal catecholamines
The adrenal glands were removed and the total content of catecholamines was quantified by fluorimetry method trihindoxindol. After dissection, the medulla was kept for 1h in a standard solution of Krebs-Hepes and incubated for further quantification of secretion stimulated with K + to 50mM.
Statistics Analiseses
RESULTS AND DISCUSSION
Treatment with perinatal protein restriction during the 2/3 of the lactation beginning was responsible for reduced in LP rats, the body mass, naso-anal length, and store of epididymal and retroperitoneal fat, in addition, although these rats remained normoglycemic to have baseline fasting insulin was significantly reduced (P < 0.01) in 40.07% of the NP. Increased glucose ( Glucose) was 29.05% higher (P < 0.05), while increasing insulin ( Insulin) was 48.51% lower (P < 0.001) in LP. The LP rats showed hypersensitivity to peripheral insulin, with Kitt 58.48% higher (P < 0.05) and insulin/
glucose 46.72% (P < 0.01) and HOMA 27.95% (P < 0.001) lower compared to NP. The exogenous administration of ACh resulted in NP, a reduction of 15.71% (P < 0.01) increase of glucose in comparison to NP without any pretreatment, whereas in LP this effect was 37.01% (P < 0.001) compared to LP without no drugs. The Atr caused an opposite effect to that of ACh on blood glucose in NP (40.9% higher than the NP pretratamneto with no drug, P < 0.01) while the LP there was no difference between trade, not trades. The Yoh reduizu the increase of glucose in rats NP and LP 15.57% and 23.87% in comparison to their respective controls. However, no difference between NP and LP treated with Yoh. The Oxy increased by 50.83% the glycemic increment of NP for NP without prior treatment with drugs, P < 0.001. While the increase glycemic of the animals LP was not affected.
The electrical activity of the superior vagus nerve was 42.56% lower in LP (P < 0.001) and enzymatic activity of acetylcholinesterase was reduced by 73.65% (P < 0.0001) in LP group. Moreover, in perfused islets with carbachol, the LP secreted 74.78% (P < 0.001) less insulin than the NP.
The sympathetic tonus as well as the total content of catecholamines did not differ between LP and NP. The percentage of basal secretion of adrenal medulle LP was 31.91% (P < 0.001) lower, while the percentage of stimulated secretion was 56.92% higher than that of NP rats (P <0.01).
The LP perfused islets with high concentrations of glucose in the presence of propranolol and epinephrine has equivalently decreased to NP insulin secretion.
CONCLUSIONS
The perinatal protein restriction, was able to reduce the electrical activity of the vagus nerve, thus affecting, adversely, the insulinotropic effect of parasympathetic pathways on pancreatic β cells. Fact that may be at least partially responsible for the
