Estudo do potencial químicofarmacológico de metabólitos secundários de fungos da Costa Cearense: Aspergillus niger.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

PAULA KARINA SANTOS UCHÔA

ESTUDO DO POTENCIAL QUÍMICO-FARMACOLÓGICO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA COSTA CEARENSE: Aspergillus niger

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ESTUDO DO POTENCIAL QUÍMICO-FARMACOLÓGICO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA COSTA CEARENSE: Aspergillus niger

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Química. Área de concentração: Química Orgânica.

Orientador: Prof. Dra_{. Mary Anne Sousa Lima.}

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ESTUDO DO POTENCIAL QUÍMICO-FARMACOLÓGICO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE FUNGOS DA COSTA CEARENSE: Aspergillus niger

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Química. Área de concentração: Química Orgânica.

Aprovada em: 25 / 01 / 2017.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Prof. Dra_{. Mary Anne Sousa Lima (Orientador)}

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________ Prof. Dra_{. Fátima Miranda Nunes}

_________________________________________ Prof. Dra_{. Nilce Gramosa Pompeu Viana de Sousa Brasil}

_________________________________________ Prof. Dra_{. Antônia Fádia Valentim de Amorim}

Universidade Estadual do Ceará (UECE)

_________________________________________ Prof. Dra_{. Selene Maia de Morais}

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À Deus acima de tudo, por me conceder força e fé para caminhar.

À Prof. Dra_{. Mary Anne Sousa Lima pela excelente orientação, compreensão e tempo}

dedicado à produção dessa tese.

Ao professor Dr. Leslie Gunatilaka (University of Arizona), pela orientação durante o estágio de doutorado sanduíche.

Aos professores participantes da banca examinadora pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões.

Aos professores do programa de Pós-Graduação em Química pelos conhecimentos transmitidos.

Aos professores, Edilberto Rocha Silveira (UFC), Antônia Pimenta (UFC), Raimundo Braz-Filho (UENF), Leticia V. C. Lotufo (USP), Diego Wilke (UFC), pela contribuição no desenvolvimento desse trabalho, e em especial à Professora Conceição Oliveira por todo carinho, atenção e apoio.

Ao Dr. Kithsiri.Wijeratne, Dr. Yaming Xu e Dra_{. Patricia Espinosa pelo enorme ensinamento e}

contribuição na realização dos experimentos de epigenética.

À Dra_{. Natália Nogueira pelos primeiros ensinamentos na parte microbiológica, além das}

valorosas reflexões, críticas e sugestões recebidas.

Aos amigos e companheiros de laboratório, Honório Sousa, Regivaldo Gomes, Paulo Riceli, João Evangelista, Hélio Oliveira, por toda ajuda, ensinamentos e conselhos durante o curso. Aos colegas do Labs e Lafiplam, pela acolhida em seus laboratórios e suporte para a realização de muitos experimentos.

Aos operadores do infravermelho, espectrômetro de massa e de ressonância magnética nuclear pela obtenção dos espectros.

Às amigas Manuela e Macella pelo companheirismo nos momentos mais difíceis. À minha família por todo amor e apoio em todos os momentos.

Aos órgãos financiadores CNPq, CAPES, FUNCAP, FINEP E PRONEX. Em particular à CAPES e ao CNPq pelas bolsas de pesquisa a mim concedidas, proporcionando maior tempo de dedicação à pesquisa.

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O extrato AcOEt da cepa BRF074 (Aspergillus niger), cultivada em BD e isolada a partir de sedimentos coletados na praia do Pecém (Fortaleza-CE), apresentou alta atividade citotóxica (77%; IC50 0,95) frente à linhagem de células tumorais HCT-116 (cólon). Desta forma, um

estudo bioguiado de cultivo foi conduzido para este micro-organismo utilizando quatro meios de culturas distintos: BD (batata, dextrose), BDL (batata, dextrose e levedura), MPD (malte, peptona e dextrose) e MntPL (manitol, peptona e levedura), em quatro períodos de crescimento: 07, 14, 21 e 28 dias. A partir do cultivo de A. niger em meio de cultura BD por 28 dias, foram isolados sete metabólitos secundários: hidroxi-L-Pro-L-Leu), ciclo(4-hidroxi-L-Pro-L-Phe), ciclo(L-Pro-L-Leu), ciclo(L-Pro-L-Phe), pseurotin D, pseurotin A e clovalicina. O meio de cultivo BDL (14 dias) levou ao isolamento da dicetopiperazina ciclo(L-Pro-L-Val) e dos ciclopeptídeos malformina A e malformina C, enquanto que o meio MPD durante 7 dias forneceu um ester furânico, de caráter inédito na literatura. As malforminas A e C e o composto inédito apresentaram-se ativas frente a linhagem de células HCT-116. Um método quantitativo de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido e validado para a quantificação destes metabólitos citotóxicos em diferentes meios nutricionais e períodos de crescimento. A partir deste método, foi observado que no meio BDL, nos períodos de 21 e 28 dias as malforminas A e C foram produzidos em maior quantidade, enquanto que o ester furânico foi produzido em maiores teores no meio MPD em 28 dias. Em paralelo, foi realizado um estudo envolvendo epigenética utilizando o reagente SAHA e a cepa do fungo LG0949. A partir deste experimento foram isolados os compostos phomalactona, dihidrophomalactona e acetophomalactona, e os compostos acetanilida e dímero do reagente SAHA. O isolamento dos metabólitos secundários foi realizado através de cromatografia em fase reversa C18, utilizando cartucho para extração em fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A caracterização estrutural foi realizada através do uso de métodos espectrométricos, tais como espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear (1_{H e}13_{C) e infravermelho, além de comparação de dados da literatura.}

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EtOAc extract from the BRF074 strain (Aspergillus niger), cultivated in BD medium and isolated from sediments collected on Pecém beach (CE), showed high cytotoxic activity (77%, IC50 0,95) against the cancer cell line HCT-116 (colon). Thus, a bioguided study

aiming the optimization of the culturing conditions of A. niger was conducted in which four different culture media were evaluated: PD (potato, dextrose), PDY (potato, dextrose and yeast), MPD (malt, peptone and dextrose) and MntPY (mannitol, peptone and yeast), in four growth periods: 07, 14, 21 and 28 days. From the cultive of A. niger in BD culture medium during 28 days, seven secondary metabolites were isolated: cyclo(4-hydroxy-L-Pro-L-Leu), cyclo(4-hydroxy-L-Pro-L-Phe), cyclo(L-Pro-L-Leu), cyclo(L-Pro-L-Phe), pseurotin D, pseurotin A and chlovalicin. The BDL culture medium (14 days) led to the isolation of the diketopiperazine cyclo(L-Pro-L-Val) and cyclopeptides malformin A and malformin C, whereas the MPD medium for 7 days provided a new compound, an ester furanic first report in the literature. Malformins A and C and the new compound were active against the cancer cell line HCT-116. A quantitative method of high performance liquid chromatography (HPLC) was developed and validated for the quantification of these cytotoxic metabolites in different nutritional media and growth periods. This method reveal that in the BDL medium, within 21 and 28 days, greater amounts of malformin A and C were produced, whereas the furanic ester was produced in higher levels in the MPD medium with 28 days. In parallel, an epigenetic study was performed using SAHA as reagent and the fungus strain LG0949. This experiment led to the isolation of the compounds phomalactone, dihydrophomalactone and acetophomalactone, acetanilide and a dimer of the SAHA. Isolation of the secondary metabolites was conducted using C18 reverse phase chromatography using a solid phase extraction cartridge and high performance liquid chromatography (HPLC). The structural characterization was done using spectrometric techniques such as mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (1_{H and}13_{C) and infrared, in addition to comparison with literature data.}

(9)

Figura 1 Exemplos de fármacos obtidos a partir de micro-organismos ... 27

Figura 2 Metabólitos bioativos obtidos a partir de fungos de origem marinha ... 29

Figura 3 Aspergillus niger ... 30

Figura 4 Inibição do crescimento celular (%) dos extratos do cultivo de A. niger em meio BD com 7, 14, 21 e 28 dias de crescimento, testado na concentração de

50 g/mL ... 57

Figura 5 Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em BDL ... 59

Figura 6 Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em MPD ... 59

Figura 7 Cromatogramas da análise por CLAE correspondente a 7, 14, 21 e 28 dias de cultivo de A. niger em MntPL ... 60

Figura 8 Inibição do crescimento celular (%) dos extratos do cultivo de A. niger nos meios de cultivo BDL, MPD e MntPL com 7, 14, 21 e 28 dias de crescimento,

testado nas concentrações de 5 e 50 g/mL para a linhagem de células H CT-116 ... 61

Figura 9 Estrutura química de BRF074 (3) - ciclo(L-Pro-L-Leu) ... 64

Figura 10 Espectro de IV de BRF074 (3) ... 66

Figura 11 Espectro de massa de alta resolução (EM-IES) no modo positivo de BRF074 (3) ... 66

Figura 12 Espectro de RMN 1_{H de BRF074 (3) (500 MHz, CD}

3OD) e expansões (B) e

(C) ... 67

Figura 13 Espectro de RMN 2D, 1_H,1_{H - COSY de BRF074 (3) (500 MHz, CD}

3OD) ... 68

Figura 14 Espectro de RMN 13_{C - CPD de BRF074 (3) (125 MHz, CD}

3OD) ... 69

Figura 15 Espectro de RMN 13_{C - DEPT 135º de BRF074 (3) (125 MHz, CD}

3OD) ... 69

Figura 16 Espectro de RMN 2D, 1_H,13_{C - HSQC de BRF074 (3) (500 x 125 MHz,}

(10)

CD3OD) ... 71

Figura 18 Estrutura de BRF074 (1) - ciclo(4-hidroxi-L-Pro-L-Leu) ... 73

3OD) (A) e expansões (B)

e (C) ... 75

3OD) ... 76

CD3OD) ... 76

Figura 24 Estrutura química de BRF074 (4) - ciclo(L-Pro-L-Phe) ... 78

e (C) ... 79

Figura 27 Espectro de RMN 13_{C de BRF074 (4) (300 MHz, CD}

3OD) ... 80

CD3OD) ... 81

Figura 30 Espectro de RMN 2D, 1_H,13_{C - HMBC de BRF074 (4) (300 x 75 MHz,}

CD3OD) ... 82

Figura 31 Estrutura química de BRF074 (2) - ciclo(4-hidroxi-L-Pro-L-Phe) ... 83

(11)

Figura 36 Estrutura química de BRF074 (8) - ciclo(L-Pro-L-Tyr) ... 89

Figura 38 Espectro de RMN 1_{H de BRF074 (8) (500 MHz, C}

5D5N) ... 90

Figura 39 Espectro de RMN 13_{C - CPD de BRF074 (8) (125 MHz, C}

5D5N) ... 91

C5D5N) ... 92

C5D5N) ... 93

Figura 42 Estrutura química de BRF074 (6) - Pseurotina A ... 96

e (C) ... 99

3OD) ... 100

3OD) ... 101

CD3OD) ... 102

CD3OD) ... 103

Figura 51 Estrutura química de BRF074 (5) - Pseurotina D ... 105

(12)

e (C) ... 109

3OD) ... 110

3OD) ... 111

CD3OD) ... 112

CD3OD) ... 113

Figura 60 Estrutura química de BRF074 (7) - clovalicina ... 117

3OD) (A) e expansão

(B) ... 119

3OD) ... 120

3OD) ... 121

CD3OD) ... 122

CD3OD) ... 123

Figura 69 Estrutura química de BRF074 (9) - Malformina A1 ... 126

5D5N) (A) e expansões (B)

(13)

e expansão (B) ... 129

5D5N) ... 130

Figura 74 Espectro de RMN 13_{C - DEPT 135º de BRF074 (9) (125 MHz, C}

5D5N) ... 130

C5D5N) (A) e expansão (B) ... 131

Figura 77 Estrutura química de BRF074 (10) - Malformina C ... 134

5D5N) (A) e expansões (B)

e (C) ... 137

Figura 80 Espectro de RMN 2D, 1_H,1_{H - COSY de BRF074 (10) (500 MHz, C}

5D5N) ... 138

5D5N) ... 139

Figura 82 Espectro de RMN 13_{C - DEPT 135º de BRF074 (10) (125 MHz, C}

5D5N) ... 139

Figura 85 Estrutura química de BRF074 (11) ... 144

3OD) ... 146

3OD) .... 147

3OD) ... 148

(14)

CD3OD) ... 149

CD3OD) ... 150

Figura 93 Compostos citotóxicos BRF074 (9), (10) e (11) produzidos por Aspergillus niger (BRF074) ... 152

Figura 94 Curvas analíticas dos compostos bioativos produzidos por A. niger BRF074. Figura 94A: curva analítica de BRF074 (9); Figura 94B: curva analítica de BRF074 (10) e Figura 94C: curva analítica de BRF074 (11) ... 154

Figura 95 Cromatogramas HPLC dos compostos puros BRF074 (9), (10) e (11) (Figura 95A) e extratos obtidos a partir do cultivo durante 28 dias de A. niger (BRF 074) em meio MPD (Figura 95B), meio BDL (Figura 95C) e meio MntPL (Figura 95D) ... 158

Figura 96 Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD sem adição de SAHA ... 160

Figura 97 Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 500 µM ... 160

(15)

BD com adição de SAHA na concentração de 200 µM ... 163

Figura 105 Espectros de RMN 1_{H de LG0949 (1) e LG0949 (2) (400 MHz, CDCl} 3) ... 164

Figura 106 Espectros de RMN 1_{H de LG0949 (1) e LG0949 (3) (400 MHz, CDCl} 3) ... 164

Figura 107 Espectros de RMN 1_{H de LG0949 (4) (400 MHz, DMSO-d} 6) ... 165

Figura 108 Espectros de RMN 1_{H de LG0949 (5) e SAHA (400 MHz, CD} 3OD) ... 165

Figura 109 Espectro de RMN 1_{H da fração LG0949-SAHA-A3 (400 MHz, CDCl} 3) ... 166

Figura 110 Cromatograma dos extratos LG0949-SAHA e LG0949-controle ... 167

Figura 111 Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F3 ... 176

Figura 115 Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F3 ... 181

Figura 116 Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F6 ... 182

Figura 117 Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-MPD-F5 ... 184

Figura 118 Cromatograma do fracionamento em CLAE de LG0949-SAHA-A2-f3 ... 189

Figura 119 Cromatograma do fracionamento em CLAE de LG0949-SAHA-A3 ... 190

(16)

Gráfico 1 Classes de metabólitos secundários identificados em A. niger ... 53

(17)

Tabela 1 Relação nominal dos metabólitos secundários identificados em Aspergillus niger e origem do micro-organismo ... 33

Tabela 2 Estruturas dos metabólitos secundários identificados em Aspergillus niger ... 39

Tabela 3 Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura BD com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento ... 56

Tabela 4 Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura BDL com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento ... 57

Tabela 5 Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura MPD com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento ... 58

Tabela 6 Massa dos extratos obtidos no cultivo de A. niger em meio de cultura MntPL com 07, 14, 21 e 28 dias de crescimento ... 58

Tabela 7 Dados de deslocamento químico (δ) de RMN 13_{C e padrão de hidrogenação de}

BRF074 (3) ... 62

Tabela 8 Dados de RMN 1_{H e}13_{C com correlações de}1_H,13_{C - HSQC e}13_C-HMBCn_J

(n = 2, n = 3) de BRF 074 (3) e comparação com os dados de RMN 13_{C da}

literatura para o ciclo(L-Pro-L-Leu) (FURTADO et al., 2005) ... 65

Tabela 9 Dados de RMN 1_{H e}13_{C de BRF 074 (1) e comparação com os dados de RMN} 1_{H e}13_{C da literatura para o ciclo(4-hidroxy-L-Pro-L-Leu) (FURTADO et al.,}

2005) ... 73

literatura para o ciclo(L-Pro-L-Phe) (FURTADO et al., 2005) ... 78

Tabela 11 Dados de RMN 1_{H e}13_{C de BRF 074 (2) e comparação com os dados de RMN} 1_{H e}13_{C da literatura para}_{ciclo(4-hidroxy-L-Pro-L-Phe) (FURTADO}_{et al,}

2005) ... 84

(18)

literatura para Pseurotin A (WIEMANN et al., 2013) ... 97

Tabela 14 Dados de RMN 1_{H e}13_{C com correlações de}1_H,13_C_–_{HSQC e}13_C-HMBCn_J

(n = 2, n = 3) de BRF 074 (5) ... 106

Tabela 15 Dados de RMN 1_{H e}13_{C de BRF 074 (5) e comparação com os dados de RMN} 1_{H e}13_{C de BRF074 (6) - Pseurotin A ... 107}

BRF074 (7) ... 114

literatura para clovalicina (TAKAMATSU et al., 1996) ... 117

literatura para Malformina A1 (KOJIMA et al., 2009) ... 127

(n = 2, n = 3) de BRF074 (10) e comparação com os dados de RMN 13_{C da}

literatura para Malformina C (VAROGLU et al., 2000) ... 135

Tabela 20 Dados de RMN 1_{H e}13_{C de BRF074 (10) e comparação com os dados de}

RMN 1_{H e}13_{C de BRF074 (9) - Malformina A}

1 ... 136

BRF074 (11) ... 142

(n = 2, n = 3) de BRF 074 (11) ... 145

Tabela 23 Concentrações dos analitos, BRF074 (9), (10) e (11), injetados em triplicadas e as áreas correspondentes para cada curva analítica ... 153

Tabela 24 Parâmetros da curva analítica utilizados na quantificação dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11) produzidos por A. niger (BRF074) ... 153

(19)

encontrados nos extratos MPD produzidos por A. niger (BRF 074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1_{... 156}

Tabela 27 Teores (µg.mL-1_{) dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11)}

encontrados nos extratos BDL produzidos por A. niger (BRF 074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1_{... 157}

Tabela 28 Teores (µg.mL-1_{) dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11)}

encontrados nos extratos MntPL produzidos por A. niger (BRF 074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1_{... 157}

Tabela 29 Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-BD ... 175

Tabela 30 Massas das frações coletadas no fracionamento em CLAE da amostra BRF074-BD-F3 ... 177

Tabela 33 Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-BDL ... 180

Tabela 34 Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-MPD ... 183

Tabela 35 Rendimento fracionamento cromatográfico em Sephadex de LG0949-SAHA .. 188

(20)

Rotação óptica específica

 Deslocamento químico

 Diâmetro

® Marca Registrada

TM _Trademark

% Porcentagem

AcOEt Acetato de etila

BD Batata Dextrose

BDA Batata Dextrose Ágar

BDL Batata Dextrose Levedura

BRF074-BD-7d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BD durante 7 dias BRF074-BD-14d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BD durante 14 dias BRF074-BD-21d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BD durante 21 dias BRF074-BD-28d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BD durante 28 dias BRF074-BDL-7d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BDL durante 7 dias BRF074-BDL-14d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BDL durante 14 dias BRF074-BDL-21d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BDL durante 21 dias BRF074-BDL-28d Extrato de Aspergillus niger cultivado em BDL durante 28 dias BRF074-MntPL-7d Extrato de Aspergillus niger cultivado em MntPL durante 7

dias

BRF074-MntPL-14d Extrato de Aspergillus niger cultivado em MntPL durante 14 dias

BRF074-MPD-7d Extrato de Aspergillus niger cultivado em MPD durante 7 dias BRF074-MPD-14d Extrato de Aspergillus niger cultivado em MPD durante 14

(21)

dias

BRF074-MPD-28d Extrato de Aspergillus niger cultivado em MPD durante 28 dias

C Carbono não hidrogenado

C5D5N Piridina deuterada

CH Carbono metínico

CH2 Carbono metilênico

CH3 Carbono metílico

CHCl3 Clorofórmio

CH2Cl2 Diclorometano

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CCD Cromatografia em Cama Delgada

CD3OD Metanol deuterado

CENAUREMN Centro Nordestino da Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear

CH3CN Acetonitrila

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

COSY Correlation Spectroscopy

CPD Composite Pulse Decoupling

d Dupleto

DAD Detector De Arranjo De Diodos

dd Duplo dupleto

ddd Duplo dupleto dupleto

DEPT Distortionless Enhancement by polarization Transfer

DPR Desvio Padrão Relativo

DQOI Departamento de Química Orgânica e Inorgânica

dt Duplo tripleto

Ecotox Laboratório de Ecotoxicologia

EM Espectrometria de massa

EtOAc Ethyl acetate

(22)

HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantun Coherence

Hz Hertz

ICH International Conference on Harmonisation IDH Índice de Deficiência de Hidrogênio

IES Ionização por electrospray

IT Ion Trap

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento

LaBBMar Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia Marinha LABOMAR Instituto de Ciências do Mar

LABS Laboratório de Biotecnologia e Síntese Orgânica LCMS Liquid chromatography - mass spectrometry

LEMANOR Laboratório de Espectrometria de Massa do Nordeste LG0949-SAHA Extrato do cultivo em grande escala de LG0949 em meio de

cultura BD com adição de SAHA na concentração de 200 µM LG0949-controle Extrato do cultivo em grande escala de LG0949 em meio de

cultura BD sem adição de SAHA

MeOH Metanol

MntPL Manitol Peptona Levedura MntPY Mannitol Peptone Yeast

MPD Malte Peptona Dextrose

m Multipleto

NPC Natural Products Center

ODS Octacedilsilano

PD Potato Dextrose

PDSE Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior

PDY Potato Dextrose Yeast

p.f. Ponto de fusão

ppm Ponto de fusão

PTFE Politetrafluoretileno

(23)

qt Quarteto de tripleto

RMN 13_C _{Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13}

RMN 1_H _{Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio}

s Simpleto

SAHA Ácido Hidroxâmico Suberoilanilida

sl simpleto largo

t Tripleto

td Triplo dupleto

tl Tripleto largo

TOF Time Of Flight

UFC Universidade Federal do Ceará UFLC Ultra Fast Liquid Chromatography UV-Vis Ultravioleta-Vísivel

(24)

1 INTRODUÇÃO ... 26 2 OBJETIVOS ... 31 2.1 Objetivos específicos ... 31 3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ... 32 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 55 4.1 Otimização do cultivo de A. niger para a produção de metabólitos

secundários com atividade citotóxica ... 55

4.1.1 Cultivo em pequena escala em meio de cultura BD ... 55 4.1.1.1 Atividade citotóxica dos extratos do cultivo em pequena escala em meio de

cultura BD ... 56

4.1.2 Cultivo em pequena escala em meio de cultura BDL, MPD e MntPL ... 57 4.1.2.1 Atividade citotóxica dos extratos do cultivo em pequena escala em meio de

cultura BDL, MPD e MntPL ... 60 4.2 Determinações estruturais ... 61

4.2.1 Determinação estrutural de BRF074 (3) ... 62

5 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE ANÁLISE

POR CLAE VISANDO A QUANTIFICAÇÃO DOS METABÓLITOS

SECUNDÁRIOS CITOTÓXICOS DE Aspergillus niger ... 151 5.1 Validação do método analítico ... 152

5.1.1 Linearidade ... 152

(25)

5.1.4 Exatidão ... 155 5.3 Aplicação do método - padrão de crescimento de Aspergillus niger

(BRF074) ... 156 6 EPIGENÉTICA ... 160 7 PARTE EXPERIMENTAL ... 168 7.1 Métodos cromatográficos ... 168

7.1.1 Cromatografia em camada delgada ... 168

7.1.2 Cromatografia por adsorção em fase reversa ... 168

7.1.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ... 168 7.2 Métodos espectroscópicos ... 169

7.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho ... 169

7.2.2 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear ... 169

7.2.3 Espectrometria de massa (EM) ... 170 7.3 Métodos físicos ... 170

7.3.1 Rotação óptica ... 170 7.4 Micro-organismo ... 170

7.4.1 Obtenção e identificação ... 170

7.4.2 Preservação ... 171 7.5 Preparação dos meios de cultura ... 171

717.5.1 Esterilização ... 171

7.5.2 Água do mar sintética (AM) ... 171

7.5.3 Batata dextrose ágar (BDA) ... 171

7.5.4 Batata-dextrose (BD) ... 172

7.5.5 Batata-dextrose-levedura (BDL) ... 172

7.5.6 Manitol-peptona-levedura (MntPL) ... 172

7.5.7 Malte-peptona-dextrose (MPD) ... 172

7.5.8 Levedura malte - yeast malt (YM) ... 172 7.6 Produção de metabólitos secundários ... 172

7.6.1 Cultivo em meio líquido para obtenção dos extratos brutos ... 172

7.6.2 Procedimento geral de extração ... 173

7.6.3 Otimização do cultivo ... 173

(26)

7.6.6 Cultivo em grande escala de BRF074 em meio de cultura MPD ... 174 7.7 Estudo químico ... 175

7.7.1 Estudo químico do extrato BRF074-BD ... 175 7.7.1.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato

BRF074-BD ... 175

7.7.1.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F3 ... 176 7.7.1.3 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F4 ... 177 7.7.1.4 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F5 ... 178 7.7.1.5 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F6 ... 179

7.7.2 Estudo químico do extrato BRF074-BDL ... 180 7.7.2.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato

BRF074-BDL ... 180

7.7.2.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F3 ... 181 7.7.2.3 Fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F6 ... 181

7.7.3 Estudo químico do extrato BRF074-MPD ... 182 7.7.3.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato

BRF074-MPD ... 183

7.7.3.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-MDD-F5 ... 183 7.8 Teste citotóxico ... 184 7.9 Quantificação ... 185

7.9.1 Amostras ... 185

7.9.2 Análise quantitativa por cromatografia líquida de alta eficiência (análise por CLAE) ... 185 7.10 Epigenética ... 186

7.10.1 Cultivo em meio líquido para obtenção dos extratos brutos ... 186

7.10.2 Procedimento geral de extração ... 186

7.10.3 Metodologia geral de triagem ... 186

7.10.4 Cultivo em pequena escala utilizando diferentes concentrações de SAHA ... 187

7.10.5 Cultivo em grande escala de LG0949 em meio de cultura BD+SAHA ... 187

(27)

(28)

1 INTRODUÇÃO

Os produtos naturais possuem uma rica história no desenvolvimento de medicamentos. Muitas drogas sintéticas usadas na prática clínica foram desenvolvidas, ao menos parcialmente, a partir de fontes naturais. Há muito tempo, compostos farmacologicamente ativos têm auxiliado no tratamento de doenças humanas, podendo ser utilizados como antibióticos (penicilina), analgésicos (aspirina, opióides), imunossupressivos (rapamicina), dentre outras aplicações. (CHERBLANC et al., 2013; NEWMAN; CRAGG; KINGSTON, 2008).

O número de exemplos bem sucedidos, na química de produtos naturais microbianos, vem crescendo ao longo dos anos, com os micro-organismos sendo conhecidos por produzir metabólitos secundários com elevado potencial terapêutico, incluindo exemplos como as cefalosporinas (Cephalosporium), ciclosporinas (Trichoderma), rapamicinas (Streptomyces) e estatinas (Aspergillus e Penicillium) (FIGURA 1, p. 20) (CRAGG; NEWMAN, 2013; CHANG et al., 2011).

Figura 1 - Exemplos de fármacos obtidos a partir de micro-organismos

Fonte: CRAGG; NEWMAN, 2013.

(29)

cultivados em grande escala, tornando-se uma fonte ilimitada e contínua de matérias-primas necessárias para o desenvolvimento de drogas. Além disso, os produtos naturais microbianos representam um enorme e inexplorado recurso de estruturas químicas únicas, produzidas para fins de proteção, comunicação e em resposta a mudanças em seu habitat (BAILLY, 2009; GUNATILAKA, 2006; MARIENHAGEN; BOTT, 2013).

Dentre o universo dos micro-organismos, é importante ressaltar a química dos fungos marinhos, os quais têm sido encontrados associados a algas, plantas, invertebrados, moluscos, e ainda presentes em sedimentos de costões e regiões de mangue. (FELÍCIO; OLIVEIRA; DEBONSI, 2012). Em uma revisão bibliográfica realizada por Blunt e colaboradores (2014, p. 237), somente no ano de 2012, cerca de 217 novos compostos com atividades biológicas relevantes foram isolados a partir de fungos de origem marinha. Esse grande potencial na produção de metabólitos secundários bioativos pode ser explicado devido aos avanços obtidos no campo da biotecnologia, aliados ao emprego de técnicas modernas de

fracionamento químico, elucidação estrutural e “screening” na busca por novos protótipos (VIEGAS JR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).

Em particular, os fungos provenientes de habitat marinho associados a sedimentos ou animais constituem uma fonte importante de novos produtos com atividades anticâncer, antibacteriana, antiplasmódica e anti-inflamatória (BHATNAGAR; KIM, 2010). Du e colaboradores (2007) isolaram um derivado de antraquinona denominado de aspergiolide A a partir de Aspergillus glaucus, que apresentou uma potente citotoxicidade contra a exposição das linhagens celulares K562 e P388. Gai e colaboradores (2007) revelaram a Fusarielin E como um novo agente antibiótico a partir de Fusarium sp. As dioxopiperazinas com potente atividade antibacteriana, desidroxibisdetiobis-metiltio-gliotoxina, bisdetiobis-metiltiogliotoxina e gliotoxina, foram relatadas a partir de fungo do gênero Pseudallescheria. Nenkep e colaboradores. (2010), descreveram o isolamento de benzoquinonas halogenadas, bromoclorogentisilquinonas A e B, com significativa atividade contra DPPH. Por outro lado, o isolamento da ahalimida, uma dicetopiperazina descoberta na década de 1990 que age como agente de despolimerização da tubulina, serviu como molécula-chave para a síntese do plinabulina, um análogo sintético que está sendo testado na fase I de ensaios clínicos no tratamento de câncer do pulmão (FENICAL et al., 1998; KINGSTON, 2009; AREN et al., 2010).

(30)

de Aspergillus fumigatus, que agem na fase G2/M do ciclo celular (ZHAO et al., 2002) (FIGURA 2, p. 29).

Figura 2 - Metabólitos bioativos obtidos a partir de fungos de origem marinha

Fonte: Elaborada pelo autor

Os estudos mais recentes relacionados ao entendimento do genoma microbiano revelam informações valiosas sobre os princípios da biossíntese de metabólitos secundários microbianos. Através da manipulação de fatores nutricionais e ambientais no cultivo do micro-organismo, a biossíntese dos metabólitos secundários produzidos pode ser completamente alterada, permitindo a produção de vários compostos a partir de uma única cepa. Essa particularidade, frequentemente citada na literatura como OSMAC (one strain many compounds), quando aliada ao uso de compostos denominados de modulares epigenéticos, permitem a indução ou inibição de certas rotas biosintéticas, oferecendo novas oportunidades para maximizar a diversidade química dos metabólitos produzidos e mostrando-se como alternativa promissora na descoberta de novas moléculas. (PARANAGAMA; WIJERATNE; GUNATILAKA. 2007; SCHERLACH; HERTWECK, 2009).

(31)

seriam capazes de controlar a expressão de genes silenciados e contribuir para o desenvolvimento de novas moléculas (WILLIAMS et al., 2008). Desde então, vários estudos similares têm sido descritos na literatura, os quais corroboram o emprego de moduladores epigenéticos como uma ferramenta promissora a produção de novos produtos naturais (CHERBLANC et al., 2013).

O Brasil é apresentado como um imenso patrimônio genético de valor econômico-estratégico inestimável, principalmente no campo do desenvolvimento de novos medicamentos. Com uma fantástica biodiversidade que abrange 20% do total de espécies do planeta, onde somente a Amazônia detém cerca de 26% das florestas tropicais remanescentes no mundo, e ainda contando com uma faixa litorânea com cerca de 7400 km, estima-se que o Brasil também possui uma grande diversidade microbiana, que ainda encontra-se totalmente desconhecida. Este patrimônio natural oferece grandes possibilidades para o desenvolvimento de pesquisas que propiciem a sua preservação e inovação, através da descoberta de novos compostos de interesse industrial. Como consequência, atualmente vários grupos de pesquisa nacionais estão investigando substâncias isoladas de algas, fungos e invertebrados marinhos e seu potencial contra várias doenças, como câncer, trombose, aids e outras (Ministério da Saúde, 2010).

Fungos do gênero Aspergillus são amplamente distribuídos na natureza e compreendem patogênicos humanos, animais e vegetais, além de fungos com uma gama de aplicações industriais. O gênero Aspergillus é rico em espécies, cerca de aproximadamente 250 já foram descritas na literatura, e estas espécies são capazes de produzir um grande número de extrólitos, incluindo metabólitos secundários, peptídeos/proteínas bioativos, enzimas, etc (BHETARIYA et al., 2011; FRISVARD; LARSEN, 2015; KANG et al., 2013).

Entre os vários grupos de fungos, as espécies do gênero Aspergillus são amplamente estudadas tanto do ponto de vista genômico quanto proteômico, visando desvendar os mecanismos biológicos e moleculares atuantes nesses fungos. Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nidulans e Aspergillus terreus são algumas das espécies relevantes para aplicações humanas, agrícolas e biotecnológicas (BHETARIYA et al., 2011).

(32)

biotransformação, biorremediação e pré-tratamento de resíduos (NIELSEN et al., 2009; FRISVARD et al., 2011).

Figura 3 - Aspergillus niger

Fonte: Elaborado pelo autor

Estudos sobre a sequência genômica de A. niger revelaram a presença de 32 genes poliketídeos sintases (PKS), bem como 15 genes polipeptídios não ribossomais sintase (NRPS) e 9 genes híbridos PKS-NRPS, o que evidenciou a versatilidade e o potencial biossintético dessas espécies (CHIANG et al., 2011).

(33)

2 OBJETIVOS

Contribuir para o conhecimento químico do fungo Aspergillus niger BRF074

associado a amostra de sedimento proveniente da costa cearense e realização de experimentos de epigenética.

2.1 Objetivos específicos

 Avaliar o potencial citotóxico de fungos provenientes de sedimentos da costa cearense frente à linhagem de células tumorais do carcinoma colorretal humano HCT-116 visando a seleção de uma cepa para produção de metabólitos secundários bioativos;

 Otimizar as condições de cultivo microbiológico do fungo Aspergillus niger BRF074 em pequena escala variando-se os meios nutricionais e diferentes intervalos de tempo visando a produção de novos compostos bioativos;

 Realizar fermentações em grande escala utilizando as condições dos experimentos que se mostraram promissores na produção de metabólitos secundários em pequena escala;

 Isolamento e caracterização estrutural dos metabólitos secundários provenientes dos extratos produzidos nas fermentações em grande escala;

 Investigar a atividade citotóxica de extratos, frações e metabólitos isolados empregando modelos "in vitro", com vistas à descoberta de novas moléculas potencialmente ativas;

 Quantificação dos metabólitos secudários bioativos nos extratos provenientes das diferentes condições de cultivo de A. niger;

(34)

3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

Uma revisão bibliográfica realizada por Nielsen e colaboradores (2009) acerca dos metabólitos secundários produzidos por A. niger revelou a presença de aproximadamente 60 compostos, pertencentes a diferentes classes estruturais, tais como: fumonisinas, nafto- -pironas, bicumarinas, malforminas e etc. Desta forma, tendo em vista a grande diversidade de metabólitos secundários, foi efetuada uma minuciosa busca visando uma atualização e complementação dos dados reportados.

A ferramenta de pesquisa empregada foi a base de dados Scifinder, que reúne informações registradas no Chemical Abstracts, utilizando-se como termos chave as palavras

“Aspergillus niger”, refinando os resultados para “secondary metabolites” e “natural products”, no período de 1λ66-2016.

(35)

Tabela 1 - Relação nominal dos metabólitos secundários identificados em Aspergillus niger e origem do micro-organismo

Composto Origem do

micro-organismo Referências bibliográficas Nafto--pironas (NGPs)

Aurasperona A (1) Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

Solo AKIYAMA et al., 2003

Aurasperona B (2) Fungo marinho LEUTOU; YUN; SON, 2016

Fungo endofítico BOURAS et al., 2005

Aurasperona C (3) Fungo endofítico BOURAS et al., 2005

Aurasperona D (4) Fungo endofítico BOURAS et al., 2005

Aurasperona E (5) Fungo endofítico BOURAS et al., 2005

Aurasperona F (6) Fungo endofítico BOURAS et al., 2005

Aurasperona G (7) Fungo endofítico BOURAS et al., 2007

Aurasperona H (8) Fungo endofítico Li et al., 2016

Dianidroaurasperona C (9) Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

Isoaurasperona (10) Fungo endofítico GHOSAL; BISWA;

CHAKRABARTI, 1979

Isoaurasperona A (11) Fungo marinho LI et al., 2016

Fungo endofítico LI et al., 2013 Isoaurasperona F (12) Fungo endofítico LI et al., 2013

Fonsecinona A (13) Fungo marinho LI et al., 2016

Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

Solo AKIYAMA et al., 2003

Fonsecinona B (14) Fungo marinho LI et al., 2016

Fonsecinona C (15) Fungo marinho LI et al., 2016

Fonsecinona D (16) Fungo marinho LI et al., 2016

Asperpirona A (17) Fungo endofítico LI et al., 2013

Asperpirona B (18) Fungo marinho LI et al., 2016

Asperpirona C (19) Fungo marinho LI et al., 2016

Asperpirona D (20) Fungo endofítico LI et al., 2013

Asperpirona E (21) Fungo endofítico LI et al., 2013

Nigerona (22) Fungo endofítico HAPPI et al., 2015

Nigerona ester metílico (23) - EHRLICH; DELUCCA;

CIEGLER, 1984 2-hidroxidihidronigerona (24) Fungo endofítico HAPPI et al., 2015

Nigerasperona B (25) Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

Nigerasperona C (26) Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

5,7-dihidroxi-2-[1-(4-metoxi-6-oxo-6H-

piran-2-il)-2-feniletilamino]-[1,4]naftoquinona (27)

Fungo endofítico ZHANG et al., 2007d

Nigerasperona A (28) Fungo endofítico ZHANG; LI; WANG, 2007a

TMC-256A1 (29) Fungo marinho LEUTOU; YUN; SON, 2016

Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Solo SAKURAI et al., 2002

TMC-256C1 (30) Solo SAKURAI et al., 2002

Flavasperona (31) Fungo marinho LEUTOU; YUN; SON, 2016

6,9-dibromoflavasperona (32) Fungo marinho LEUTOU; YUN; SON, 2016

Fonsecina (33) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Fonsecina B (34) Solo SAKURAI et al., 2002

(36)

Continuação

micro-organismo Referências bibliográficas Nafto--pironas (NGPs)

Rubrofusarin (35) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Fungo endofítico GHOSAL; BISWA; CHAKRABARTI, 1979

Rubrofusarin B (36) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

nor-Rubrofusarina (37) - TANAKA et al., 1966

Rubrofusarin-6-O-α-D-ribofuranosideo (38) Fungo endofítico LI et al., 2013 (R)-10-(3-succinimidil)-TMC-256A1 (39) Fungo endofítico LI et al., 2013

-pironas

Asnipirona A (40) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Asnipirona B (41) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nafuredina (42) Fungo marinho UI et al., 2001

Campirona A (43) Fungo endofítico LI et al., 2015

Campirona B (44) Fungo endofítico LI et al., 2015

Campirona C (45) Fungo endofítico LI et al., 2015

Pirofeno (46) Fungo endofítico HAPPI et al., 2015

Fungo marinho VAROGLU; CREWS, 2000

Isopirofeno (47) Fungo endofítico ZHANG et al., 2010

Nigerapirona A (48) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona B (49) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona C (50) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona D (51) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona E (52) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona F (53) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona G (54) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Nigerapirona H (55) Fungo endofítico LIU et al., 2011

Aspergillusol (56) Fungo endofítico ZHANG et al., 2010

Walterolactona A (57) Fungo endofítico LI et al., 2015 4-(hidroximetil)-5-hidroxi-2H-piran-2-ona

(58) Fungo endofítico HAPPI et al., 2015

4-hidroximetil-5,6-dihidro-piran-2-ona (59) Fungo endofítico LI et al., 2015

Bicumarinas

Bicumanigrina (60) Fungo marinho HIORT et al., 2004

Kotanina (61) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Demetilkotanina (62) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Funalenona (63) Solo INOKOSHI et al., 1999

Orlandin (64) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Azafilonas

Azanigerona A (65) - ZABALA et al., 2012

Azanigerona B (66) - ZABALA et al., 2012

Azanigerona C (67) - ZABALA et al., 2012

Azanigerona D (68) - ZABALA et al., 2012

Azanigerona E (69) - ZABALA et al., 2012

Azanigerona F (70) - ZABALA et al., 2012

Piranonogrinas

Piranonigrina A (71) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Piranonigrina B (72) Fungo marinho HIORT et al., 2004

Piranonigrina C (73) Fungo marinho HIORT et al., 2004

Piranonigrina D (74) Fungo marinho HIORT et al., 2004

Piranonigrina E1 (75) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina E2 (76) - RIKO; NAKAMURA;

(37)

Continuação

micro-organismo Referências bibliográficas Piranonogrinas

Piranonigrina F (77) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina G (78) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina H (79) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina I (80) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina J (81) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina K (82) - YAMAMOTO et al., 2015

Piranonigrina S (83) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Ciclopeptídeos

Malformina A1 (84) Fungo endofítico LI et al., 2013

Malformina A2 (85) - KIM et al., 1993a

Malformina B1a (88) - KIM et al., 1993b

Malformina B1b (89) - KIM et al., 1993b

Malformina B2 (90) - KIM et al., 1993b

Malformina C (94) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Fungo endofítico MIKUŠUOVÁ et al., 2014

Beauvericin (95) - BOECKER et al., 2014

EnniantinaB (96) - BOECKER et al., 2014

Dicetopiperazinas

Asperazina (97) Fungo endofítico LI et al., 2015

Fungo marinho VAROGLU; CREWS, 2000

Asperazina A (98) Fungo endofítico LI et al., 2015

ciclo(D-Phe-L-Trp) (99) Fungo endofítico LI et al., 2015 ciclo-(L-Trp-L-Ile) (100) Fungo endofítico ZHANG et al., 2010 ciclo-(L-Trp-L-Phe) (101) Fungo endofítico ZHANG et al., 2010 ciclo(L-Trp-L-Trp) (102) Fungo endofítico LI et al., 2015 ciclo-(L-Trp-L-Tyr) (103) Fungo endofítico ZHANG et al., 2010

Derivados do ácido itacônico

Ácido hexilitaconico (104) Fungo marinho VAROGLU; CREWS, 2000

Ácido itaconico (105) - HOSSAIN et al., 2016

Ácido Tensyuico (106) Solo HASEGAWA et al., 2007

Ácido Tensyuico B (107) Solo HASEGAWA et al., 2007

Ácido Tensyuico C (108) Solo HASEGAWA et al., 2007

Ácido Tensyuico D (109) Solo HASEGAWA et al., 2007

Ácido Tensyuico E (110) Solo HASEGAWA et al., 2007

Ácido Tensyuico F (111) Solo HASEGAWA et al., 2007

Esteróides

Nigerasterol A (112) Fungo endofítico LIU et al., 2013 Nigerasterol B (113) Fungo endofítico LIU et al., 2013 (22E,24R)-5α,8α

-epidioxiergosta-6,22-dien-3-ol (114)

Fungo endofítico ZHANG et al., 2007b

(22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona (115)

(22E,24R)-ergosta-5,7,22-trien-3-ol (116) Fungo endofítico ZHANG et al., 2007b (22E,24R)-ergosta-7,22-dien-3,5α,6-triol

(117)

Ergosterimida (118) Fungo endofítico ZHANG et al., 2007b

Pigmentos

(38)

Continuação

micro-organismo Referências bibliográficas Pigmentos

Asperenona (119) - JEFFERSON, 1967

Aspergillin (120) - RAY; EAKIN, 1975

Cicloleucomelon (121) Fungo marinho HIORT et al., 2004

Lipídeos

Ácido

14-hidroxi-13-(2-hidroxietoxi)-hentetetraconta-15,28-dienoico (122) Fungo marinho WU et al., 2008

Glicerolípideo (123) Fungo marinho WU et al., 2008

Asperamida A (124) Fungo endofítico ZHANG et al., 2007c

Asperamida B (125) Fungo endofítico ZHANG et al., 2007c

Asperiamida B (126) Fungo marinho WU et al., 2008

Asperiamida C (127) Fungo marinho WU et al., 2008

Ácido palmitico (128) Fungo endofítico SIDDIQUI et al., 2003 Ácido esteárico (129) Fungo endofítico SIDDIQUI et al., 2003

Micotoxinas

Fumonisina B2 (130) Fungo endofítico MIKUŠUOVÁ et al., 2014

Fumonisina B4 (131) - JØRGENSEN et al., 2011

Ochratoxin  (132) - NIELSEN et al., 2009

Ochratoxin A (133) Fungo endofítico MIKUŠUOVÁ et al., 2014

Ochratoxin α (134) - SØRENSEN et al., 2009

Gliotoxina (135) - LEWIS et al., 2005

Yanutonas

Yanutona A (136) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona B (137) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona C (138) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona D (139) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona E (140) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona F (141) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

Yanutona G (142) - HOLM et al., 2014

Yanutona H (143) - HOLM et al., 2014

Yanutona I (144) - HOLM et al., 2014

Yanutona J (145) - HOLM et al., 2014

Yanutona K (146) - PETERSEN et al., 2015

Yanutona L (147) - PETERSEN et al., 2015

Yanutona M (148) - PETERSEN et al., 2015

Yanutona X1 (149) - HOLM et al., 2014

Yanutona X2 (150) - PETERSEN et al., 2015

1-hidroxi-yanutona A (151) Fungo marinho BUGNI et al., 2000 1-hidroxi-yanutona C (152) Fungo marinho BUGNI et al., 2000 22-deacetilyanutona A (153) Fungo marinho BUGNI et al., 2000

7-deacetoxi-yanutona A (154) - HOLM et al., 2014

Terpenos

(1S,6S,10S)-6,10-dimetil

biciclo[4.4.0]dec-2-en-4-ona (155)

- PRIEGNITZ et al., 2015

(6S,10S)-6,10-dimetil

biciclo[4.4.0]dec-1-en-3-ona (156) - PRIEGNITZ et al., 2015 (8S,9R,10S)-8,10-dimetil-1-octalina (157) - PRIEGNITZ et al., 2015

2-metilisoborneol (158) - PRIEGNITZ et al., 2015

Geosmina (159) - PRIEGNITZ et al., 2015

Germacreno D (160) - PRIEGNITZ et al., 2015

Germacra-1(10)E,5E-dien-11-ol (161) - PRIEGNITZ et al., 2015

Asperrubrol (162) - RABACHE; NEUMANN;

LAVOLLAY, 1974

-copaeno (163) - PRIEGNITZ et al., 2015

(39)

Continuação

micro-organismo Referências bibliográficas Terpenos

-ylangeno (164) - PRIEGNITZ et al., 2015

6,11-epoxi-isodaucano (165) - PRIEGNITZ et al., 2015

Outros

Aspernigerina (166) - SHEN et al., 2006

Aspernigrina A (167) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Atromentina (168) Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Aspernigrina B (169) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Aspernigrina C (170) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

Aspernigrina D (171) Fungo marinho ZHOU et al., 2016

FK17-P2a (172) - ZABALA et al., 2012

Antafumicina A (173) - FUJIMOTO et al., 1993

Antafumicina B (174) - FUJIMOTO et al., 1993

10,23-dihidro-24,25-desidroaflavinina (175) Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Anominina (176) Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Nigerloxina (177) - SURESHA; SRINIVASAN,

2013 (Z)-4-{[(Z)-1-(hidroximetil)-2-fenil-1-etenil]

amino}-4-oxo-2-butenoato de metila (178) - YUAN et al., 2006

Nigerazina A (179) Solo IWAMOTO et al., 1985

Nigerazina B (180) Solo IWAMOTO et al., 1985

Nigragillina (181) Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Fungo marinho SCHLINGMANN et al., 2007

Averufina (182) Fungo marinho WU et al., 2008

Nidurufina (183) Fungo marinho WU et al., 2008

8,10,12-trihidroxi-9-metoxi-7α -metil-7,7α,1βα,13-tetrahidrobenzo

cicloheptaoxocin-6-ona (184)

Fungo endofítico ELFITA et al., 2012

Tensidol A (185) Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Solo FUKUDA et al., 2006

Tensidol B (186) Fungo endofítico FRISVAD et al., 2014

Solo FUKUDA et al., 2006

Asperaldini (187) - SEKHAR et al., 2003

Metanoato de

6-formil-benzofuran-5-carboxila (188) Fungo endofítico SIDDIQUI

et al., 2003

Ácido 5,8-dihidroxioctadeca-9,12-dienóico

(5,8-diHODE) (189) - LEE et al., 2013

4-[(3R)-hidroxi]-3,5,5-trimetil-ciclohex-2-en-1-ona (190) Fungo endofítico SIDDIQUI et al., 2003

Ácido aspérico (191) Fungo marinho VAROGLU; CREWS, 2000

Anidrido 2-carboximetil-3-hexilmaleico

(192) - ALMASSI; GHISALBERTI; ROWLAND, 1994

Ácido 2-metileno-3-hexilbutanodióico (193) - ALMASSI; GHISALBERTI; ROWLAND, 1994

Agglomerin F (194) - YANG et al., 2014

Ácido carlósico (195) - YANG et al., 2014

Carlosiato de metila (196) - YANG et al., 2014

Ácido fenilacetico (197) Fungo endofítico NAIR; BURKE, 1988

Ácido fenoxiacetico (198) Fungo endofítico NAIR; BURKE, 1988

Ácido kojico (199) Fungo endofítico HAPPI et al., 2015

(40)

Continuação

micro-organismo Referências bibliográficas Outros

2-feniletanol (202) Fungo endofítico WANI et al., 2010

4-[1-(4-hidroxifenil)-1-metiletil]-3-metilfenol (203) - SEKHAR et al., 2002

Ácido dihidrocarolico (204) Solo ALVI et al., 2000

Penitricina D (205) Solo ALVI et al., 2000

Ácido oxálico (206) - ANDERSEN; LEHMANN;

NIELSEN, 2009

Ácido cítrico (207) - ANDERSEN; LEHMANN;

NIELSEN, 2009

Ácido gluconico (208) - ANDERSEN; LEHMANN;

NIELSEN, 2009

Manitol (209) Fungo endofítico NAIR; BURKE, 1988

3-metil-8-hidroxi-4-decenoato de metila

(210) Fungo endofítico NAIR; BURKE, 1988

Oct-1-en-3-ona (211) - PRIEGNITZ et al., 2015

Oct-1-en-3-ol (212) - BORJESSON; STOLLMAN;

SCHNURER, 1993

2-metilpropan-1-ol (213) - BORJESSON; STOLLMAN;

SCHNURER, 1993

Dissulfeto de dimetila (214) - BORJESSON; STOLLMAN;

SCHNURER, 1993 Fonte: Elaborada pelo autor

(41)

Na Tabela 2 abaixo, encontram-se as respectivas estruturas químicas dos metabólitos secundários relacionados na Tabela 1 (p. 39).

Tabela 2 - Estruturas dos metabólitos secundários identificados em Aspergillus niger

Nafto--pironas (NGPs)

OH OCH3

H3CO

H3CO OCH3 O OH O CH3 O O CH3 (1) OH OCH3 H3CO H3CO OCH3 O OH O CH3 OH O O CH3 OH (2) OH OCH3 H3CO

HO OCH3

O OH O CH3 OH O O CH3 OH (3) OH OH

H3CO

H3CO OCH3 O OH O CH3 O O CH3 (4) OH OCH3 H3CO H3CO OCH3 O OH O CH3 O O CH3 OH (5) OH OCH3

H3CO

HO OCH3

O OH O CH3 O O CH3 OH (6) OH OCH3

H3CO

HO OCH3

O OH O CH3 O O CH3 HO HO (7) OCH3 H3CO O OH O CH3 O H3CO OCH3

OH

O

CH3

(8)

O CH3 O OCH3

H3CO

HO OCH3

(42)

Continuação

Nafto--pironas (NGPs)

O CH3 O OCH3 OH

H3CO

H3CO OH

OCH3

O O

CH3

(10)

O CH3 O OCH3

H3CO

H3CO OCH3

OH O O CH3 OH (11)

O CH3 O OCH3

H3CO

HO OCH3

OH

O O OH

H3C OH

(12)

O OCH3

H3CO

H3CO OCH3

OH O CH3 O OH O CH3 (13) O OH O OCH3

H3CO

OH

CH3

O H3CO OCH3

OH O CH3 (14) O O O OH CH3 OCH3 H3CO

OH

CH3

O OH OCH3 H3CO

(15)

OH OCH3

H3CO

H3CO OCH3 O OH O

CH3

O

H3C OH O

(16)

O OCH3

H3CO

HO OCH3

OH O CH3 O OH O CH3 (17) O O CH3 O OH OCH3 H3CO H3CO OCH3 OH O CH3 (18) O OH CH3 O OH OCH3 H3CO

H3CO OCH3

O CH3 O (19) O OH CH3 O OH OCH3

H3CO

HO OCH3

O CH3 O (20) O O CH3 O OH OCH3

H3CO

HO OCH3

OH O CH3

(43)

Continuação

Nafto--pironas (NGPs) O O O O OH OCH3

H3C H3C

OH OH (22) O O O O OH OCH3

H3C H3C

OCH3 OH

(23)

O

O CH3

O OH OCH3

OCH3 OH CH3 O OCH3 H3CO OH (24) OH H3CO

H3CO OCH3

OH OCH3 O O CH3 OH O

H3C OH

O

(25)

O CH3 O

H3CO

HO OCH3

OH

O O

CH3 OCH3 OH

OH (26) HN O O OCH3 O O OH OH (27) O O OH OH OCH3

H3CO

(28) O O CH3 OH OCH3 HO (29) O O CH3 OH HO OCH3 (30) O O CH3 OH H3CO OCH3 (31) O OCH3 Br

H3CO

Br OH O CH3 (32) OH HO OCH3 O O CH3 OH (33) OH

H3CO OCH3 O O CH3 OH (34) O

O CH3 H3CO

OH OH

(35)

O

O CH3 H3CO

OCH3 OH

(36)

O

CH3

(44)

Continuação

-pironas

H3C

CH3 O O OCH3 CH3 (40)

H3C

CH3 O O OCH3 (41) O CH₃ CH₃ CH₃

CH₃ O

OH O

H3C

(42)

O CH3 CH3 HN O CH3 H3CO O (43) O HN O CH3 H3CO

O

H3C CH3

(44) O HN O CH3 H3CO O CH3 CH3 (45) O O OCH3 NH O

H3C

(46) HN O CH3 O O OCH3 (47) O O OCH3 H3C

CH3

(48)

O O

OCH3 H3C

CH3 CH3 (49) O O OCH3 H3C

O CH3

(50) O O OCH3 CH3 H3C

O CH3

(51)

O O

OCH3 H3C

O CH3 (52) O O OCH3 CH3 CH3 CH3 (53) O O OCH3 CH3 CH3 (54) O O OCH3 H3C

CH3 (55) OH O OCH3 O (56) O O

(45)

Continuação

Bicumarinas

O

O OCH3

CH3 OCH3 O OH O CH3 HO (60) O O O

OCH3 CH3 OCH3

O OCH3 CH3

H3CO

(61)

O O CH3 OCH3

H3CO O

O OCH3 HO CH3 (62) HO CH3 HO

H3CO

O HO OH (63) O O CH3 HO OCH3 O OH CH3 O OCH3 (64) Azafilonas O O OH O O O CH3 O CH3 CH3 H3C

(65) O O O O CH3 O CH3 CH3 H3C

OH CH3 (66) O O O O CH3 O CH3 CH3 H3C

OH CH3 OH (67) N O OH O O O CH3 O CH3 CH3 H3C H (68) O O O HO CH3 OH CH₃ (69) O O O O CH3 OH CH3 O

H3C

(70) Piranonogrinas O HN CH3 OH O O HO (71) O N CH3 OH O HO HO H3CO (72) O N CH3 OH O H3CO

HO HO