UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ EDNA WISNIESKI ADAPTAÇÃO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE MARCADORES ORGÂNICOS E APLICAÇÃO EM SEDIMENTOS MARINHOS ANTÁRTICOS. PONTAL DO PARANÁ 2012

EDNA WISNIESKI

ADAPTAÇÃO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE MARCADORES ORGÂNICOS E APLICAÇÃO EM SEDIMENTOS

MARINHOS ANTÁRTICOS.

PONTAL DO PARANÁ

2012

EDNA WISNIESKI

ADAPTAÇÃO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE MARCADORES ORGÂNICOS E APLICAÇÃO EM SEDIMENTOS MARINHOS ANTÁRTICOS.

Dissertação apresentada ao curso de Pós- Graduação em Sistemas Costeiros e Oceânicos, Centro de Estudos do Mar, Setor de Ciências da Terra, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Sistemas Costeiros e Oceânicos.

PONTAL DO PARANÁ

2012

Agradecimentos

Primeiramente, agradeço meus pais por tudo que são e representam para mim, por sempre estarem presentes, mesmo a quilômetros de distância, vocês são meus alicerces.

Aos Profs. Drs Renato da Silva Carreira, do Departamento de Química da Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-RJ) e Marcelo Correa Bernardes, do Depto de Geoquímica da Universidade Federal Fluminense (UFF) pela contribuição na avaliação deste trabalho.

Ao laboratório de Química Orgânica Marinha do IO USP, especialmente a Profª Dra. Márcia C.

Bícego e a Dra. Satie Taniguchi pelas análises cromatográficas. Ao Felipe Sales de Freitas pela injeção das amostras no GC-FID e GC-MS.

Ao meu orientador César de Castro Martins, por mais uma vez confiar no meu trabalho, pela dedicação, pela paciência, por tudo que me ensinou, tanto na vida acadêmica como profissional, pelas oportunidades de crescimento e aprendizado. Ao total, foram cinco anos trabalhando juntos, e com certeza, sentirei falta dessa convivência. Obrigada por tudo César.

A Liziane Marcela. Sem você, não tenho muita certeza que esse trabalho sairia. Obrigada pelas horas e horas passando frio, cuidando de colunas, evaporando amostras, e acima de tudo, pela sua amizade.

Daia, obrigada pela companhia nesses últimos dois anos, dividindo o mesmo teto. E obrigada por toda ajuda que disponibilizou para mim nessa reta final, formatando, arrumando, corrigindo, etc..

E por fim, mas ainda assim, sem menos importância, obrigada a todos os meus amigos, que de alguma maneira também contribuíram com a conclusão desse trabalho, seja no próprio trabalho acadêmico, seja fora desse meio.

A CAPES pela Bolsa de Mestrado e ao CNPq pelo recurso financeiro através do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Antártico de Pesquisas Ambientais (INCT-APA).

SUMÁRIO GERAL

Resumo ... 8

Abstract ... 9

Introdução Geral ... 10

Referências ... 12

Capítulo 1 ... 13

Otimização de um método analítico para determinação de múltiplas classes de marcadores orgânicos geoquímicos em amostras de sedimentos marinhos. ... 13

Capítulo 2 ... 48

Fontes e variação temporal na entrada de matéria orgânica indicado por n-

alcanóis e esteróis em testemunhos de sedimentos da Baía do Almirantado,

Antártica. ... 48

Resumo

Este estudo é apresentado em duas partes. A primeira parte tem como objetivo principal

a otimização de um método alternativo para determinação de múltiplos marcadores

orgânicos em sedimentos marinhos e a segunda parte consiste na aplicação deste

método em testemunhos de sedimento para avaliar fontes e distribuição da matéria

orgânica na região da Península Antártica. Para isso, testes analíticos foram realizados

na etapa clean up do método, possibilitando a obtenção de n-alcanos (AHs), esteróis

(OLs) e n-alcanóis (ALCs) através de uma única extração. As alterações no método

possibilitaram uma redução no consumo de solventes e adsorventes, bem como na

produção de descartes e otimizaram o tempo de trabalho em laboratório. Os valores de

recuperações de padrões externos foram de 60 – 129% para n-alcanos, 52 – 67% para

OLs e 43 – 141% para ALCs, dentro da faixa de valores aceitáveis estabelecida. Os

testes de repetibilidade (todos com os compostos com variabilidade <25%) e

comparação com materiais de referência (resultados dentro da faixa aceitável) também

indicaram que o método é satisfatório para análise desses marcadores. Após a etapa de

validação, confirmada por esses testes citados, o método foi então aplicado em

sedimento coletados na Baía do Almirantado (Ponta Barrel-BAR, Refúgio-REF e

Ferraz-FER), localizados na Península Antártica. As concentrações de OLs totais

variaram de 0,91 a 13,99 µg.g

, dos ALCs totais entre 0,20 a 2,14 µg.g

e do fitol de

0,13 a 2,38 µg.g

. Colest-5-en-3β-ol foi o esterol mais abundante nos testemunhos da

Baía do Almirantado, indicando que a matéria orgânica da região recebe contribuição de

fito e zooplâncton, bem como animais superiores. Para os esteróis fecais 5β-colestan-

3β-ol e 5β-colestan-3α-ol, as concentrações foram abaixo dos valores de background da

região (<LDM a 0,15 µg.g

), assim como a razão coprostanol/epicoprostanol que

apresentou valores que condizem com uma origem natural (aves e mamíferos marinhos)

para esses compostos. Os valores da razão estanol/estenol indicaram a ocorrência da

diagênese do esterol insaturado, com menor intensidade em BAR. Os ALCs C

a C

foram predominantes, indicando que as maiores contribuições para a matéria orgânica

são de algas, bactéria e zooplâncton, e pouca contribuição de vegetação. Fitol registrou

variação ao longo dos perfis, e suas concentrações foram relativamente baixas podendo

ser reflexo da degradação do composto ao longo da coluna sedimentar. As variações nas

concentrações de alguns compostos foram comparadas com a variação da temperatura

média do ar ao longo do tempo no testemunho de FER. Os resultados parecem indicar

para uma tendência de aumento de alguns compostos em períodos em que a temperatura

média do ar estava mais elevada. Entretanto, os dados obtidos com esse trabalho não

são suficientes para permitirem afirmar tal tendência como verdadeira, sendo essa então

apenas uma observação, que pode ser confirmada com estudos futuros, focando nesse

objetivo, e com ferramentas adequadas e que gerem as informações necessárias. A

distribuição de todos os compostos aponta o predomínio de fontes marinhas, de origem

natural, com contribuições significativas do plâncton e animais superiores, condizentes

com trabalhos já realizados na região. Estes resultados indicam que o método otimizado

é válido e eficiente na determinação dessas classes de marcadores em sedimentos

marinhos.

Abstract

This study consists in two chapters. The first chapter is focused in the validation of alternative method for determination of multiple organic markers in marine sediments and the second chapter consists in the application of this method in sediment cores to evaluate sources and distribution of organic matter in the Antarctic Peninsula region. For this aims, analytical tests were performed in clean-up step, allowing to obtain n-alkanes (AHs), polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), sterols (OLs) and n- alkanols (ALCs) through a single extraction. These changes allowed the reduction of solvents and adsorbents consumed, as well as the discards produced and working time.

A spiked-recovery experiment showed values were 60-129% for n-alkanes, 50-115%

for PAHs, 52-67% for OLs and 43-141% for ALCs and were considered in the acceptable range values. The precision tests (standard deviation for all compounds <

25%) and the comparison with reference materials (results were in acceptable range)

also demonstrated that the method is appropriate for analysis of these markers. After the

validation, the method was applied to sediment samples collected in Admiralty Bay

(BAR, REF and FER), located on the Antarctic Peninsula. The total sterols

concentrations ranged from 0.91 to 13.99 µg.g

, the total n-alkanols between 0.20 and

2,14 µg.g

and the phytol concentrations from 0.13 to 2.38 µg.g

. Colest-5-en-3β-ol

was the most abundant sterol in cores of Admiralty Bay, indicating that the organic

matter in this region receives contribution of phyto- and zooplankton as well as higher

animals. The concentrations values of 5β-colestan-3β-ol e 5β-colestan-3α-ol (fecal

sterols) were below the region background value (>LDM a 0,15 µg.g

), as well as the

coprostanol/epicoprostanol ratio showed values that were consistent with natural

sources (birds and marine mammals) for these compounds. The stanol/estenol ratio

values indicated the occurrence of diagenesis in unsaturated sterol, with less intensity in

BAR. The C

a C

ALCs were predominant, indicating that the largest organic matter

contributions were algae, bacteria and zooplankton, and a little contribution of

vegetation. The phytol profiles showed little variation along the profile and the

concentrations were relatively low. These values may reflect the compound degradation

along the sedimentary column. Concentration variations of some compounds were

compared with the variation of average air temperature over time in FER core. The

results appear to indicate a increase tendency of some compounds in periods when the

air temperature was higher. However, the data obtained in this work are not sufficient to

allow to affirm this trend as true, then this is just an observation, which can be

confirmed by furthers studies, focusing on that main, and with tool that generate the

necessary information. The compounds distribution indicated marine sources

predominance, with natural origin and significant contributions of plankton and higher

animals, consistent with previous studies in the region. These results indicate that the

analytical method is valid and efficient in determining these markers in marine

sediments.

Introdução Geral

A geoquímica orgânica representa uma importante ferramenta na investigação de características ambientais baseada na variabilidade da matéria orgânica a partir de fontes aquáticas e terrestres (Holtvoeth et al., 2010).

A distribuição de lipídios em sedimentos pode fornecer informações a cerca da origem (marinha, terrestre ou antrópica) e padrões de transporte da matéria orgânica e condições oceânicas (ex. temperatura, níveis de nutrientes, estratificação, etc.) (Schefuβ et al., 2004). A composição e a distribuição vertical de lipídios nos sedimentos são determinadas pelas diferentes características das fontes (fito e zooplâncton, algas, animais, plantas terrestres, etc.), pela série de componentes específicos (estrutura química, reatividade) e pelas características específicas do ambiente (taxa de sedimentação, concentração de oxigênio e zonação redox) (Colombo et al., 1997).

Marcadores geoquímicos tais como n-alcanos, alcoóis, esteróis, alquenonas e ácidos graxos são frequentemente utilizados para identificar a entrada de carbono a partir de vários organismos em ambientes marinhos (Volkman et al., 1992; Belicka & Harvey, 2009), além de identificar fontes marinhas e terrestres como fitoplâncton, bactérias, macrofitas, plantas terrestres e fontes antropogênicas (Holtvoeth et al., 2010).

O estudo de marcadores geoquímicos em colunas sedimentares (ou testemunhos de sedimentos) de ambientes aquáticos é bastante difundido graças à possibilidade de obtenção de registros históricos relacionados a eventos ambientais (Laureillard et al., 1997). As informações que podem ser geradas remetem a períodos remotos onde as características naturais do ambiente não foram modificadas pela atividade antrópica até períodos recentes, fornecendo um panorama evolutivo de uma série de transformações ambientais (Buckley et al., 1995; Li et al., 2000).

O interesse científico pelos ciclos geoquímicos vem aumentando de maneira significativa, principalmente em áreas não poluídas, porque nessas regiões a ciclagem da matéria orgânica está relacionada aos processos de origem biogênica, e não há interferência de aportes expressivos de origem antrópica (Laureillard et al., 1997).

A região antártica vem sendo extensivamente estudada nas últimas décadas, em busca

de informações sobre o comportamento do ambiente ao longo do tempo. Essa região

apresenta características peculiares, como baixa temperatura anual, sazonalidade bem definida

e ausência de plantas superiores. Estas características garantem um elevado grau de

especificidade quanto às fontes naturais de lipídios (dos quais os esteróis constituem uma

classe), desde a coluna d’água até os sedimentos, correspondendo a diferentes impressões digitais da produção primária em escalas variáveis de tempo geológico (Laureillard et al., 1997).

Entretanto, para obter todas as informações que os marcadores orgânicos são capazes de fornecer como ferramenta de estudo, é necessária a obtenção de bons resultados, que dependem diretamente do método aplicado, que deve ser confiável e eficiente.

Atualmente existem diversos métodos descritos na literatura para a obtenção da fração lipídica dos sedimentos marinhos (Readman et al., 1986; UNEP, 1992; Kawakami &

Montone, 2002), sendo que no Laboratório de Geoquímica e Poluição Marinha da UFPR, o método rotineiramente aplicado apresentava algumas especificidades que poderiam ser aperfeiçoadas e melhoradas, tornando o método mais eficiente.

Nesse contexto, os objetivos desse trabalho foram: propor uma otimização do método

analítico para a determinação de múltiplos marcadores orgânicos geoquímicos em sedimentos

através de uma única extração. E a aplicação em testemunhos de sedimentos marinhos

antárticos, a fim de identificar fontes e variações no aporte de matéria orgânica ao longo do

tempo, através do uso de esteróis e n-alcanóis.

Referências

BELICKA, L.L., HARVEY, H.R. The sequestration of terrestrial organic carbon in Arctic Ocean sediments: A comparison of methods and implications for regional carbon budgets. Geochimica et Cosmochimica Acta, v. 73, p. 6231–6248, 2009.

BUCKLEY, D. E.; SMITH, J. N. & WINTERS, G. V. Accumulation of contaminant metals in marine sediments of Halifax Harbour, Nova Scotia: environmental factors and historical trends. Applied. Geochemistry. v. 10, p.

175-195, 1995.

COLOMBO, J. C.; SILVERBERG, N. & GEARING, J. N. Lipid biogeochemistry in the Laurentian Trough – II.

Changes in composition of fatty acids, sterols and aliphatic hydrocarbons during early diagenesis. Organic Geochemistry. v. 26, n. ¾, p. 257-274, 1997.

HARJI, R.R., BHOSLE, N.B., GARG, A., SAWANT, S.S., VENKAT, K. Sources of organic matter and microbial community structure in the sediments of the Visakhapatnam harbour, east coast of India. Chemical Geology, v. 276, p. 309–317, 2010.

HOLTVOETH, J., VOGEL, H., WAGNER, B., WOLFF, G.A. Lipid biomarkers in Holocene and glacial sediments from ancient Lake Ohrid (Macedonia, Albania). Biogeosciences, v. 7, p. 3473–3489, 2010.

KAWAKAMI, S. K. & MONTONE, R. C. An efficient ethanol-based analytical protocol to quality fecal steroids in marine sediments. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 13, p. 226-232, 2002.

LAUREILLARD J., PINTURIER, L., FILLAUX J., & SALIOT, A. Organic geochemistry of marine sediments of the Subantarctic Indian Ocean sector: Lipid classes – sources and fate. Deep-Sea Research II, v. 44, p. 1085- 1108, 1997.

LI, X.; WAI; O. W. H., LI; Y. S., COLES, B. J. RAMSEY, H. & THORNTON, I. Heavy metal distribution in the sediment profiles of the Pearl River estuary, South China. Applied Geochemistry, v.15, p. 567-581, 2000.

READMAN, J. W., PRESTON, M. R. & MANTOURA, R. F. C. An integrated technique to quantify sewage, oil and PAH pollution in estuarine and coastal environments. Marine Pollution Bulletin, v. 17, p. 298-308. 1986.

SCHEFUΒ, E., VERSTEEGH, G.J.M.M., JANSEN, J.H.F., SINNINGHE DAMSTÉ, J.S. Lipid biomarkers as major source and preservation indicators in SE Atlantic surface sediments. Deep-Sea Research I, v. 51, p. 1199–

1228, 2004.

UNEP. Determination of petroleum hydrocarbons in sediments. United Nations Environment Programme Reference Methods for marine pollution studies, v. 20, p. 1-75, 1992.

VOLKMAN, J.K., HOLDSWORTH, D., NEILL, G., BAVOR, H. Identification of natural, anthropogenic and petroleum hydrocarbons in aquatic sediments. Science of Total Environment, v. 112, p. 203–219, 1992.

Capítulo 1

Otimização de um método analítico para determinação de múltiplas classes de marcadores orgânicos geoquímicos em amostras de sedimentos marinhos.

Sumário

Abstract ... 14

Introdução ... 15

Parte Experimental ... 17

Reagentes ... 17

Otimização do Método Analítico ... 18

Testes da etapa de purificação e fracionamento (clean up) ... 19

Método Final Estabelecido ... 21

- Extração... 22

- Fracionamento e purificação (clean up) ... 22

- Derivação (Fração 3) ... 22

- Análise instrumental ... 24

Validação do Método Otimizado ... 26

Repetibilidade das Colunas... 26

Material de Referência e Exercício de Intercalibração ... 28

Matriz Fortificada ... 29

Limite de detecção do método ... 30

Brancos de Extração ... 32

Análise de Amostras de Sedimento Marinho ... 32

Esteróis, n-alcanóis e fitol ... 33

Conclusões ... 35

Referencias ... 36

Material Suplementar ... 38

Abstract

This paper describes the optimization of an alternative method for determination of n- alkanes, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), sterols (OLs) and n-alkanols (ALCs) in marine sediments, through adaptations of clean up. The method reduced the material consumption, the discards produced and working time. The recovery percentages were 60-129% for n-alkanes, 52-67% for OLS and 43-141% for ALCs, acceptable values compared to other studies. The application in Antarctic marine sediments presented satisfactory results indicating contribution of planktonic organisms, higher animals and a little contribution from vegetation.

Palavras-chave: marcadores orgânicos, sedimentos, cromatografia gasosa

INTRODUÇÃO

Marcadores orgânicos geoquímicos são compostos com características como natureza específica, estabilidade química e resistência à degradação, e por isso podem ser utilizados como indicadores de eventos e processos ao longo do tempo.

Entre os principais marcadores utilizados atualmente podemos citar os esteróis, hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, ácidos graxos, n-alcanóis, alquenonas, entre outros. São amplamente empregados na avaliação de origem e distribuição de matéria orgânica marinha, de alterações ambientais, assim como na identificação de contaminação ambiental associada às atividades antrópicas.

O principal destino de marcadores orgânicos após serem introduzidos em ecossistemas aquáticos são os sedimentos de fundo, constituindo um importante compartimento de acumulação destes compostos em níveis mais elevados que aqueles observados na coluna d’água adjacente.

Para estudos de transformações ambientais em diferentes escalas de tempo, são empregadas colunas sedimentares (ou testemunhos de sedimentos), que permitem obter registros históricos relacionados aos processos deposicionais.

As informações que podem ser geradas remetem a períodos remotos onde as características naturais do ambiente não foram modificadas pela atividade antrópica até períodos recentes, fornecendo um panorama evolutivo de uma série de alterações ambientais.

Os diferentes métodos de determinação de marcadores orgânicos utilizados em

estudos de geoquímica marinha adotam os seguintes passos: (i) extração, (ii) purificação

e fracionamento por cromatografia de adsorção em coluna (clean up), (iii) derivação,

que é a conversão de compostos que apresentam grupos hidroxila e carboxila, como é o

caso dos esteróis, n-alcanóis e ácidos graxos, em formas químicas mais apropriadas para

resolução cromatográfica e, por fim; (iv) a análise instrumental que é, geralmente,

baseada em cromatografia em fase gasosa e detectores específicos com a finalidade de separação, identificação e quantificação de cada composto.

O fracionamento e a purificação do extrato orgânico são passos fundamentais na determinação de compostos provenientes de matrizes sólidas, como os sedimentos marinhos, pois é responsável pela “limpeza” e separação dos constituintes presentes nas amostras.

Geralmente é utilizada uma coluna cromatográfica com adsorventes específicos (sílica e alumina, por exemplo), bem como solventes de diferentes polaridades na eluição dos respectivos compostos.

A eficiência do solvente em selecionar os compostos de interesse adsorvidos na coluna cromatográfica, após eluição do extrato orgânico concentrado, depende da afinidade química com as diversas classes de marcadores orgânicos, do ajuste na quantidade de adsorventes e nos volumes de solventes utilizados para eluição de cada fração. Esses fatores são cruciais para uma separação precisa das diferentes classes de marcadores orgânicos, necessários para uma caracterização ambiental.

Existem diferentes métodos de obtenção da fração lipídica dos sedimentos marinhos, cada qual com especificidades quanto a quantidade de adsorventes e solventes;

quanto às classes de compostos que se pode obter;

e ainda entre as quantidades de amostra necessária e de material de laboratório e o tempo dispensado no processo laboratorial.

O método rotineiramente aplicado no Laboratório de Geoquímica e Poluição

Marinha (UFPR) apresenta algumas especificidades que acabam limitando-o em alguns

pontos, e com o intuito de minimizar essas limitações, o objetivo desse trabalho foi

otimizar um método analítico alternativo para a determinação de marcadores orgânicos

geoquímicos em sedimentos marinhos, através de adaptações na etapa de clean up, para

obter diferentes classes de marcadores (hidrocarbonetos alifáticos – AHs,

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos – HPAs, esteróis – OLs e n-alcanóis – ALCs) em uma única extração, e assim diminuir tempo de trabalho laboratorial, massa necessária de amostras, consumo de material de laboratório e descartes gerados.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes

Para todos os testes foram tomados cuidados prévios antes e durante as análises, tais como alto grau de pureza de solventes, a citar: etanol (EtOH) (99,9% pureza mínima), hexano (95% n-hexano) e diclorometano (DCM) (ambos com 99,9% pureza mínima) e metanol (MeOH) (100% pureza), todos fornecidos pela J.T. Baker e Mallinckrodt Chemicals; e dos reagentes inorgânicos utilizados como adsorventes, a citar: alumina (Al

O

– óxido de alumínio 90 ativo, 0,063-0,200 mm, Merck), sílica gel (SiO

– sílica gel 60, 0,063 - 0,200 mm, Merck) e sulfato de sódio (Na

SO

, 98% pureza mínima, J.T. Baker).

Os adsorventes foram calcinados (em forno mufla por 4 horas a 400 ºC) e armazenados adequadamente em dessecador sob vácuo até o uso. Para eliminação de possíveis interferências causadas por enxofre, foram utilizados fios de cobre, tratados por 30 minutos em solução de ácido clorídrico (HCl 2 mol L

, preparado de uma solução 37% P.A. – ACS, F.Maia), enxaguados com água destilada, emersos em etanol e por fim em mistura de 50% n-hexano:DCM, utilizada na extração.

Todo material utilizado nas extrações foi devidamente lavado antes de sua

utilização, ficando emerso por aproximadamente 12 horas em solução contendo

detergente alcalino Extran

(Merck) e, após seco em estufa a aproximadamente 150° C,

o material foi calcinado a 400 ºC por 4 horas. O material volumétrico foi seco a

temperatura ambiente, e no momento da utilização, lavado 3 vezes com os solventes

utilizados no processo, de forma a minimizar a possibilidade de contaminação orgânica do material.

Os padrões de 5α-androstan-3β-ol (98% de pureza), 5α-colestano (99% de pureza), 5β-colestan-3β-ol (> 98% de pureza), 5β-colestan-3α-ol (> 95% de pureza), colest-5-en-3β-ol (94% de pureza), 5α-colestan-3β-ol (95% de pureza), 24-etil-colesta- 5,22E-dien-3β-ol (> 95% de pureza), 24-metil-colest-5-en-3β-ol (ca. 65% de pureza) e 24-etil-colest-5-en-3β-ol (> 95% de pureza) foram obtidos da Sigma Aldrich. Os padrões sub-rogados eicoseno e hexadeceno e o padrão interno tetradeceno foram obtidos da Supelco (99,7 - 99,9 % de pureza). Os n-alcanos e isoprenóides (C

-C

+ pristano +fitano) – DRH-008S-R2 a mistura de HPAs (Z-014G-FL) bem como a mistura de padrões sub-rogados para HPAs (Z014-J foram obtidos da AccuStandard (98.7 – 100% de pureza). Os n-alcanóis n-C

OH a n-C

OH foram obtidos da Fluka e os n-C

OH a n-C

OH da Sigma-Aldrich, todos com pureza entre 95,7 e 99,9 %.

Otimização do Método Analítico

O método utilizado para determinar AHs, HPAS e esteróis OLs atualmente no LaGPom, assim como verificado em trabalhos recentes, a citar,

tem sido pela realização de duas extrações independentes, uma para obter os AHs e HPAs

e outra para OLs.

Cada extração parte da massa de 20 g de amostra, sendo necessárias então, no

mínimo, 40 g por amostra para a obtenção dos compostos listados anteriormente,

quantidade esta nem sempre alcançada dependendo do método de amostragem. A

utilização de solventes e adsorventes, bem como a quantidade de descartes resultantes,

também é maior, pois o procedimento de extração e clean up é repetido para cada

extração realizada de forma independente.

A etapa de purificação e fracionamento em cromatografia de adsorção em coluna foi escolhida para otimização do método analítico. O principal objetivo é remover outros materiais co-extraídos como macromoléculas biogênicas e pigmentos que possam interferir na determinação e quantificação final dos compostos de interesse.

Existem vários procedimentos de clean up, porém a cromatografia de adsorção em coluna é o mais usado na análise de marcadores orgânicos.

Testes da etapa de purificação e fracionamento (clean up)

O objetivo desse teste foi identificar no método rotineiro do laboratório, qual solvente e em qual volume é mais eficiente no fracionamento das diferentes classes de compostos orgânicos a serem eluídos na fração 3 (F3) (OLs e ALCs), uma vez que as frações 1 (F1) e 2 (F2) já são obtidas de maneira satisfatória com base no protocolo descrito em UNEP

. Embora tenha feito parte dos testes, os resultados de F2 não foram analisados e não constaram na discussão.

Em colunas cromatográficas (com dimensões de 0,5 cm diâmetro interno e 37 cm de altura) contendo 3,2 g de sílica 5% desativada com água isenta de compostos orgânicos, 1,8 g de alumina 5% desativada e sulfato de sódio, foram adicionadas uma mistura de padrões externos (analítos listados anteriormente, que se deseja quantificar nas amostras ambientais) de AHs, HPAs, OLs e ALCs, bem como padrões sub-rogados (eicoseno e hexadeceno (F1), HPAs deuterados (F2) e 5α-androstanol (F3)).

As etapas de eluição das frações F1 e F2 foram semelhantes para todos os testes, utilizando 10 mL de n-hexano para F1 e 15 mL de mistura 30% DCM/n-hexano para F2. Para F3, diferentes volumes e solventes foram testados em diferentes colunas, conforme apresentados na Tabela 1.

TABELA 1. SOLVENTES E VOLUMES UTILIZADOS NOS TESTES DO MÉTODO ANALÍTICO.

Coluna Teste 1 Teste 2 Teste 3

A 20 mL MeOH:DCM (1:9) 20 mL EtOH 5 mL EtOH:DCM (1:9)/ 20 mL de EtOH B 20 mL EtOH:DCM (1:9) 20 mL MeOH 5 mL MeOH:DCM (1:9)/ 20 mL de MeOH C 20 mL MeOH:DCM (3:7) 30 mL EtOH

D 20 mL EtOH:DCM (3:7) 30 mL MeOH E 20 mL MeOH:DCM (1:1) 30 mL MeOH:DCM (1:1)

A avaliação dos testes de clean up foi feita de forma qualitativa, comparando os cromatogramas obtidos em cada um dos testes com cromatogramas de soluções de padrão sub-rogado e de padrão externo de OLs e ALCs. Como esperado, a recuperação dos padrões externos da fração F1 foi satisfatório, visto que a etapa do fracionamento já é rotineiramente empregada.

Para a fração F3, a recuperação dos compostos não foi satisfatória, não sendo bem resolvidos os compostos em todos as variações de solventes e volumes (colunas A.1, B.1, C.1, D.1 e E.1) dentro do teste 1 (Figura 2).

No teste 2, a análise qualitativa dos cromatogramas mostrou que a melhor separação dos compostos ocorreu nas colunas D.2 e A.2, eluídas com 30 mL de MeOH e 20 mL de EtOH, respectivamente, como mostrado na Figura 2. As demais colunas não apresentaram uma boa recuperação. A coluna C.2 apresentou uma separação satisfatória, entretanto, como se trata de EtOH, mesmo solvente da coluna A.2, mas em volume maior, a coluna A.2 foi considerada mais eficiente, por apresentar bons resultados e menor consumo de solvente.

Nos cromatogramas das frações 1 e 2 dos testes D.2 e A.2, não foram identificados nenhum dos compostos esperados na fração 3, e portanto, pode-se concluir que estes não estão sendo eluídos nas etapas prévias do clean up (Figura 1).

Assim, com base nos resultados obtidos com o teste 2, dois solventes

mostraram-se mais eficientes na seleção dos compostos em F3, o EtOH e MeOH.

A partir dos resultados obtidos no teste 3, a coluna A.3 (5 mL da mistura EtOH:DCM (1:9), seguido de 20 mL de EtOH) foi selecionada para compor o novo método.

Método Final Estabelecido

Uma vez estabelecida a melhor maneira de se realizar a etapa de purificação e fracionamento dos marcadores orgânicos, o método analítico completo, incluído as etapas de extração e análise instrumental, foi validado e empregado na determinação de marcadores orgânicos em sedimentos marinhos da região Antártica. A seguir, são descritos os detalhes do método analítico utilizado.

Figura 1. Cromatogramas com exemplo do teste 1 (A) e com o método mais eficaz do

teste 2 (B), considerado o mais adequado para compor o novo método. Na parte inicial do cromatograma encontram-se os n-alcanóis, e no zoom os esteróis.

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min

30 35 40 45 50 55 min

30 35 40 45 50 55

Norm.

7 8 9 10 11 12 13 14

Norm.

min

30 35 40 45 50 55

7 8 9 10 11 12 13 14 Norm.

min

30 35 40 45 50 55 min

30 35 40 45 50 55

7 8 9 10 11 12 13 14

A

B

5a-androstanol (PS) 5a-colestano(PICG) 5a-colestano(PICG)

5a-androstanol (PS) 5a-colestano(PICG) 5a-colestano(PICG)

- Extração

A extração dos compostos foi feita com base no protocolo estabelecido por UNEP

e consiste na extração em sistema Soxhlet, por 8 horas, em 80 mL de solução n- hexano/DCM (1:1), partindo de aproximadamente 20 g de sedimentos, adicionado dos padrões sub-rogados para AHs, HPAs, OLs, ALCs e de cobre. Em seguida, as amostras foram concentradas em rotavapor a vácuo até aproximadamente 2 mL, e levadas para etapa de clean up.

- Fracionamento e purificação (clean up)

O clean up foi realizado pela passagem do extrato através de uma coluna cromatográfica (com dimensões de 0,5 cm diâmetro interno e 37 cm de altura) de vidro, preenchida com 3,2 g de sílica 5% desativada com água destilada isenta de compostos orgânicos, 1,8 g de alumina 5% desativada e sulfato de sódio. A eluição foi realizada utilizando 10 mL de n-hexano na F1 (AHs); 15 mL de 30% DCM/n-hexano para a F2 (HPAs); e 5 mL EtOH:DCM (1:9) seguidos de 20 mL de EtOH para a F3 (OLs e ALCs).

As frações 1 e 2 foram concentradas em rotavapor a vácuo até aproximadamente 0,5 mL, transferidas para ampolas adicionadas dos padrões internos (tetradeceno – F1 - e benzo(b)fluoranteno-d

– F2), com concentração final de 5 ng.µL

em F1 e 0,5 ng.µL

em F2, e aferidas para o volume final de 1 mL com n-hexano.

- Derivação (Fração 3)

A F3 foi evaporada até secagem total do extrato, sendo, em seguida, submetida

ao processo de derivação, através da adição de 40 µL do reagente N,O-bis (trimetil-silil-

triflúor-acetamida)/trimetil-cloro-silano (BSTFA/TMCS – 99:1), durante 90 minutos à

temperatura aproximada de 70

C, em banho-maria. O excesso de reagente foi

evaporado com N

e o sólido resultante foi dissolvido em cerca de 0,5 mL de n-hexano,

sendo transferido para ampolas, adicionada de padrão interno (5α-colestano), com concentração final de 2 ng.µL

, sendo aferido o volume final de 1 mL com n-hexano.

Desta forma, o método analítico otimizado, baseado nas modificações testadas e nos resultados obtidos pode ser esquematizado conforme mostrado na Figura 3.

As alterações propostas ao método modificado

tornaram viável a obtenção de mais de uma classe de marcadores com uma única extração, reduzindo em 50% o tempo de trabalho em laboratório. Com isso, os custos envolvidos nas análises acabam sendo menores, pois o consumo de materiais e produtos químicos nas extrações diminui. A ausência do uso de metanol, empregado em outros métodos

representa menor probabilidade de prejuízos à saúde, pois o etanol é menos tóxico. Outra vantagem é tempo de extração, estabelecido em 8 horas, enquanto em outros métodos, pode-se chegar até 24 horas.

Evaporação em rotavapor até aprox. 0,5 mL

20 g de sedimento + padrões sub-rogados

Extração em Soxhlet (8 h) em n-hexano:DCM (1:1)+ cobre

Evaporação do extrato até 2mL

Clean upem coluna cromatográfica: 3.2 g de silica, 1.8 g de alumina (ambas 5% desativadas) e sulfato de sódio

Fração 1:10 mL de n-hexano Fração 2:15 mL de 30% n-hexano:DCM Fração 3:5 mL de EtOH:DCM (1:9) 20 mL de EtOH

Adição dos PI / aferir volume para 1mL

Injeção em CG-FID – AHs Injeção em CG-MS – HPAs

Evaporação em rotavapor até secura

Ressuspensão com n-hexano e evaporação até secura em N2

Derivação: adição de 40 µL de BSTFA/TMCS (99:1) e reação a 65^oC por 90 min (banho-maria)

Adição do PI/ aferir volume para 1 mL

Injeção em CG-FID – OLs e ALCs

Figura 2. Procedimento analítico validado neste trabalho.

- Análise instrumental

Para a fração F1, foram injetados 1 μL da amostra em um cromatógrafo gasoso (Agilent GC System 7890A Series), equipado com um detector de ionização de chama (GC-FID), em modo sem divisão da amostra, utilizando H

como gás de arraste. A coluna cromatográfica utilizada foi HP-5 Agilent 19091J-413, com dimensões de 30,0 m x 0,320 mm x 0,25 μm d.i. As temperaturas do injetor e detector foram de 300 e 325

°C, respectivamente. A temperatura de programação teve início a 40 °C aumentando para 60 °C a uma taxa de 20 °C min

, em seguida para 290 °C a uma taxa de 5 °C min

1

, permanecendo por 5 minutos e, finalmente, para 300 °C a 5°C min

, permanecendo nessa temperatura por 11 minutos. O fluxo dos gases do detector foi de 40 mL min

para o H

, 450 mL min

para o ar sintético e 2 mL min

para o N

(complementar)

As amostras da fração F2 foram injetadas em um cromatógrafo a gás (Agilent GC System 6890 Series), equipado com um espectrômetro de massas (GC-MS Agilent Mass Selective Detector 5973 Network) com coluna cromatográfica HP-5 Agilent 19091J-015, com dimensões de 50,0 m x 0,25 mm x 0,25 μm d.i., no modo MSI (Monitoramento Seletivo de Íons), sendo registrados apenas os picos relacionados aos dois principais fragmentos (m/z) característicos de cada um dos compostos analisados.

A lista completa dos fragmentos característicos pode ser verificada em Martins.

As

condições operacionais no momento da injeção foram: temperaturas do injetor e

detector de 280 e 300 °C, respectivamente, e de 230 °C da fonte de íons. O programa de

temperatura foi o mesmo estabelecido na injeção dos AHs. Foram injetados 1 μL da

amostra no modo sem divisão da amostra, utilizando hélio como gás de arraste (1

mL.min

).

Foram injetadas amostras de sedimento, a título de confirmação, contendo compostos que seriam analisados e não dispunham de padrões (n-C

OH, 24-metil- colesta-5,22E-dien-3β-ol, 4α,23,24-trimetil-colesta-22E-en-3β-ol e fitol). A identificação foi realizada através da análise dos TICs (Total Ion Chromatogram), pela razão m/z (faixa de massas de 40 a 550 u. m. a.) característicos dos compostos de interesse.

A análise de F3 (OLs e ALCs) foi realizada através de um cromatógrafo a gás (Agilent Technologies 6890), equipado com um detector de ionização de chama (GC- FID) e uma coluna cromatográfica DB-5 (Agilent) com dimensões de 50m x 0.32mm x 0.17 µm d.i.. O programa de aquecimento teve início a 40 °C aumentando para 240 °C a uma taxa de 10 °C min

, em seguida para 245 °C a uma taxa de 0,15 °C min

, e, finalmente, para 300 °C a 10 °C min

, permanecendo nessa temperatura por 9,5 minutos. As temperaturas do injetor e detector, o fluxo de gases e demais condições de injeção foram semelhantes àquelas utilizadas na determinação dos AHs.

Para a quantificação, foram construídas curvas analíticas dos compostos, com concentrações da solução de padrões externos de n-alcanos e isoprenóides, variando de 0,25 a 10,0 ng.μL

, HPAs variando entre 0,10 a 1,50 ng.μL

e de OLs e ALCs entre 0,25 a 20,0 ng.μL

. Todos os compostos apresentaram índice de correlação linear de Pearson igual ou superior a 99,5% (r

= 0,995), critério este utilizado para aceitação das mesmas.

A integração dos picos dos compostos foi feita a partir do software ChemStation

3365, da Agilent Technologies, determinando o fator de resposta de cada composto em

relação aos padrões sub-rogados (eicoseno e hexadeceno, HPAs deuterados e 5α-

androstanol) adicionados no início da extração de cada amostra. A coincidência entre os

tempos de retenção dos compostos presentes nas amostras e nas soluções de padrões externos foi considerada como fator de identificação dos compostos nas amostras.

A quantificação foi feita a partir das áreas obtidas para cada composto analisado nas amostras, multiplicadas pelo fator de resposta da curva de calibração, em relação à razão massa/área do padrão sub-rogado adicionado em cada amostra. Todas as concentrações são expressas em µg g

de sedimento seco, exceto para HPAs, expressas em ng g

.

VALIDAÇÃO DO MÉTODO OTIMIZADO Repetibilidade das Colunas

Após definir o solvente mais apropriado para o clean up da F3, um teste de repetibilidade foi feito, para testar a precisão e eficiência do método.

Para tal, foi realizada a extração de 5 réplicas de sedimento, de uma amostra de sedimento coletada na região do Canal da Cotinga, Baia de Paranaguá, PR, (25°30'47.3"S; 48°29'46.6"O), caracterizada por 94,9% de areia, 5,1% de silte e 3,6%

de teor de matéria orgânica. Essa amostra foi escolhida por já ter sido analisada anteriormente, e ter suas concentrações conhecidas para OLs.

Em amostras de sedimento (10 g), foram adicionados os padrões sub-rogados para determinação de AHs, OLs e ALCs e submetidas ao método estabelecido.

Dos compostos analisados em F1, 83,3% apresentaram variabilidade menor do

que 25% (Tabela 1S), enquanto em F3, tanto OLs quanto ALCs apresentaram

variabilidade inferior a 20% para todos compostos avaliados (Tabelas 2S e 3S). De

acordo com Denoux et al.,

é considerado confiável o método que obtenha no mínimo

75% dos compostos analisados dentro da faixa de valores aceitáveis, com um desvio

padrão inferior a 25%.

A Figura 3 mostra a variabilidade individual de cada um dos compostos avaliados considerando as réplicas avaliadas. Segundo Wade & Cantillo,

um mínimo de três réplicas é necessário para validação do método, de modo que a avaliação de quatro réplicas satisfaz esta condição analítica.

Figura 3. Gráfico da porcentagem de variabilidade média de cada composto avaliado

através do teste de repetibilidade.

0 10 20 30 40 50 60

Desvio Padrão Relativo (%)

n-alcanos e isoprenóides Repetibilidade

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Desvio Padrão Relativo (%)

esteróis Repetibilidade

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Desvio Padrão Relativo (%)

n-alcanóis Repetibilidade

Uma vez que a principal mudança no método analítico previamente estabelecido se deu na obtenção da F3, os resultados encontrados para os esteróis no teste de variabilidade foram comparados com os obtidos pelo método proposto por Kawakami &

Montone.

Os resultados mostram que o desvio padrão relativo para a mesma amostra analisada por dois métodos diferentes ficou abaixo de 20% para 92,3% dos compostos analisados (Tabela 4S), indicando que não houve diferença significativa entre os dois métodos de análise para a maioria dos OLs. Portanto, os dados obtidos com o método testado fornecem resultados semelhantes a um método específico, empregado na análise de OLs.

Material de Referência e Exercício de Intercalibração

Foi realizada a análise de uma amostra de material de referência certificado para os hidrocarbonetos alifáticos e policíclicos aromáticos (IAEA-417)

preparado pela Marine Environment Laboratory (MEL), International Atomic Energy Agency (IAEA).

Ao material de referência IAEA 417 (2 g), foram adicionados os padrões sub- rogados para determinação de AHs, OLs e n-alcanóis e submetidas ao método estabelecido anteriormente.

Comparando os valores obtidos para o material certificado IAEA-417 com seus valores de referência, todos os resultados dos compostos analisados nesse trabalho encontram-se dentro da faixa aceitável estabelecida no relatório de avaliação deste sedimento (Tabela 5S), indicando que o método testado pode ser empregado na determinação de AHs.

Para os OLs não há um material de referência reconhecido, porém existe um

exercício de intercalibração (IAEA-408), também preparado pela Marine Environment

Laboratory (MEL), International Atomic Energy Agency (IAEA). Por não ser certificado para OLs, o método é considerado confiável se 80% dos compostos analisados estiverem dentro da faixa apresentada no relatório do exercício, acrescido de

± 30%.

A avaliação geral dos resultados mostra que 80% dos compostos encontraram- se dentro da faixa de valores aceitável (Tabela 6S).

Matriz Fortificada

Com o objetivo de avaliar o comportamento dos compostos a serem analisados, durante o processo de extração, clean-up e cromatografia, um teste com uma matriz fortificada, ou seja, amostras adicionadas de analítos de interesse, foi realizado.

Para a análise da matriz fortificada (a mesma amostra utilizada para o teste de repetibilidade), os sedimentos foram calcinados em forno mufla a 400 ºC, por 5 horas, para remoção de componentes orgânicos. Uma mistura contendo padrões externos, com concentração conhecida, de n-alcanos, isoprenóides, OLs, ALCs e HPAs, foi adicionada a estes sedimentos calcinados, sendo que a concentração final dos compostos deve corresponder a essa adicionada no início do processo.

Das sete amostras de sedimento fortificadas, todas apresentaram recuperações satisfatórias para os n-alcanos e isoprenóides (Tabela 7S), com valores entre 60,6 (n- C

) a 129,1 (n-C

) com média de 94,2 ± 15,4% (Figura 5).

Já os OLs avaliados em seis réplicas da F3 apresentaram valores entre 52,3 (24-

etil-colestan-3β-ol) a 66,7 (colest-5-en-3β-ol)%, com média de 53,1 ± 5,2% (Figura 5)

(Tabela 8S), enquanto ALCs avaliados em cinco réplicas encontraram-se dentro da faixa

aceitável, com valores entre 42,9 (n-C

OH) e 140,8 (n-C

OH)% e média de 95,2 ±

29,5% (Figura 5) (Tabela 9S). Desta maneira, todas as frações apresentaram valores

dentro da faixa aceitável sugerida por Qian & Jackson,

onde 80% dos compostos

analisados devem apresentar recuperação entre 40 e 140%.

Os valores de recuperação encontrados são compatíveis com aqueles reportados por outros trabalhos. Damas et al.

verificou valores de 65,1 a 105,6% para AHs. Em Freitas

, a recuperação foi de 67,6 a 139% para AHs. Martins et al.

apresentou recuperações de 45 a 120% para AHs e de 41 a 125% para OLs. Para esteróis foram verificados valores de 50 a 120% em Kawakami & Montone

enquanto que Carreira et al.

apresentou o valor médio encontrado de 80,1 ± 13,2%. Ainda, Carreira et al.

apresentou valores médios de recuperação de 99 ± 18% para OLs e 76 ± 15% para ALCs.

Limite de detecção do método

O limite de detecção do método (LDM) consiste na concentração mínima de uma substância que pode ser determinada pelo método com 99% de confiança em uma matriz.

Uma das maneiras de calcular o limite de detecção é através do desvio padrão (DP) de, no mínimo, cinco replicatas da mesma amostra (LDM = 3x DP).

O cálculo do LDM levou em conta as amostras adicionadas de padrões externos, utilizadas no teste de matrizes fortificadas. Para os compostos que são analisados, mas que não se dispõem de padrões, foi considerado o LDM de um composto com estrutura química semelhante (por exemplo, número de carbonos), e presente na amostra.

A partir destes cálculos, o LDM para os n-alcanos e isoprenóides presentes na

F1 foi estabelecido entre 0,004 µg.g

(n-C

) e 0,012 µg.g

(n-C

), com valor médio

de 0,007 ± 0,002 µg.g

(Tabela 10S).

Figura 4. Gráfico da recuperação de padrões externos nos sedimentos adicionados,

para hidrocarbonetos alifáticos, esteróis e cetonas e n-alcanóis.

Para os OLs (F3), o valor do limite de detecção variou de 0,002 µg.g

(5β- colestan-3α-ol e 24-metil-colesta-5,22E-dien-3β-ol) até 0,006 µg.g

(5β-colestan-3β-ol, colest-5-en-3β-ol e 24-etil-colest-5-en-3β-ol), sendo a média de 0,005 ± 0,002 µg.g

(Tabela 11S), enquanto para os ALC (F3), os valores ficaram entre 0,011 µg.g

(n-

20 40 60 80 100 120 140 160

% de recuperação

n-alcanos e isoprenóides Recuperação de padrões nos sedimentos adicionados

0 20 40 60 80 100 120 140

% de recuperação

esteróis

Recuperação de padrões nos sedimentos adicionados

0 20 40 60 80 100 120 140 160

% de recuperação

n-alcanóis

Recuperação de padrões nos sedimentos adicionados

C

OH, n-C

OH, n-C

OH e n-C

OH) e 0,020 µg.g

(n-C

OH), com média de 0,018

± 0,007 µg.g

(Tabela 12S).

Os valores de LDM obtidos nesse trabalho são compatíveis com aqueles reportados por outros trabalhos. Damas et al.

encontrou valores variando entre 0,019 a 0,036 µg.g

para AHs; enquanto que Freitas

verificou valores entre 0,001 a 0,006 µg.g

para AHs. Já Martins et al.

apresentou o valor médio de 0,001 µg.g

para Ahs e 0,01 µg.g

para OLs.

Brancos de Extração

Para análise de possíveis interferências externas nos procedimentos de laboratório, foi feito um branco de extração para cada grupo de aproximadamente nove amostras extraídas, utilizando 20 g de sulfato de sódio, que foi analisado da mesma maneira que as amostras.

Em nenhuma das frações extraídas foram observados compostos com concentração maior que três vezes o valor do limite de detecção, enquadrando-se no critério estabelecido (Figura 1S). Entretanto, no branco de ALCs, o n-C

OH apresentou valores fora da faixa aceitável, sendo identificada uma contaminação por ftalato. Assim, apenas o n-C

OH foi excluído dos resultados e não considerado nas discussões desse trabalho.

ANÁLISE DE AMOSTRAS DE SEDIMENTOS MARINHOS

Uma vez que o método analítico foi validado, o procedimento foi então aplicado em sedimentos marinhos, oriundos da região Antártica. Como a principal alteração do método ocorreu na obtenção da F3, esta seção apresentará apenas os resultados de OLs e ALCs.

As amostras de sedimentos foram obtidas de um testemunho (tubos de alumínio

com 25 mm de diâmetro) coletado em Ponta Barrel (62º10,274’S; 58º35,504’W), em

uma profundidade aproximada de 20 a 30 metros, localizado na porção mais interior da Enseada Ezcurra (Baía do Almirantado, Península Antártica) (Figura 2S), local distante das principais atividades antrópicas desenvolvidas na região. A coluna sedimentar coletada possui 17 cm de profundidade, sendo subdividida em seções de 1 cm.

Esteróis, n-alcanóis e fitol

A recuperação para a F3 (OLs e ALCs) foi de 101,1 ± 29,6%. Foram identificados 15 esteróis (5β-colestan-3β-ol, 5β-colestan-3α-ol, colesta-5,22E-dien-3β- ol, colesta-22E-en-3β-ol, colest-5-en-3β-ol, 5α-colestan-3β-ol, 24-metil-colesta-5,22E- dien-3β-ol, 24-metil-colesta-22E-en-3β-ol, 24-metil-colest-5-en-3β-ol, 24-metil- colestan-3β-ol, 24-etil-colesta-5,22E-dien-3β-ol, 24-etil-colesta-22E-en-3β-ol, 24-etil- colest-5-en-3β-ol, 24-etil-colestan-3β-ol e 4α,23,24-trimetil-colesta-22E-en-3β-ol), e como observado no cromatograma (Figura 3S), todos os compostos foram bem resolvidos, e apresentam distribuição e abundância já observadas em amostras de sedimentos marinhos dessa região.

A concentração máxima dos OLs totais foi de 14,65 µg.g

, com média de 1,47 ± 0,40 µg.g

(Tabela 13S). Colest-5-en-3β-ol foi o esterol mais abundante neste testemunho, resultado verificado em outros estudos na região antártica,

uma vez que esse composto é abundante em sistemas marinhos devido à sua distribuição no plâncton marinho.

Além dessa fonte, animais superiores como aves e mamíferos marinhos também são uma importante fonte desse composto para os sedimentos na região antártica.

A distribuição dos esteróis ressalta a contribuição de organismos do fito e do

zooplâncton, com predomínio do colest-5-en-3β-ol, e com a presença de 24-etil-colest-

5-en-3β-ol, 24-etil-colesta-5,22E-dien-3β-ol, 24-metil-colesta-5,22E-dien-3β-ol e

4α,23,24-trimetil-colesta-22E-en-3β-ol indicando que cianobactérias, diatomáceas,

algas primnesiófitas e dinoflagelados compõem os principais contribuintes da matéria orgânica na região.

O cromatograma dos ALCs (Figura 4S) também apresenta os compostos bem resolvidos, sendo identificados 15 compostos (n-C

OH; n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n-C

OH, n- C

OH e n-C

OH).

A concentração dos n-alcanóis totais foi de 2,79 µg.g

, com média de 0,31 ± 0,11 µg.g

(Tabela 14S). A distribuição observada é tipicamente marinha, com predomínio dos ALCs leves (C

a C

), enquanto as concentrações dos ALCs pesados (C

a C

) estiveram próximas ou abaixo do LDM. Essa distribuição é esperada para a região antártica, onde a ausência de plantas superiores limita a contribuição de compostos oriundos de plantas, liquens e musgos.

Fitol, composto formado a partir da degradação da clorofila-a,

esteve presente em todas as seções do testemunho. Esse composto geralmente aparece como o principal álcool no ambiente Antártico, e uma vez que é encontrado de maneira ubíqua em plantas, tem sido empregado como um marcador de vegetação.

Especificamente neste caso, reflete contribuições de plantas da região, como musgos, algas e plantas vasculares, embora em quantidades não significativas.

Os perfis verticais tanto de ALCs como de OLs totais são similares, com

exceção dos ALCs pesados que apresentaram concentrações próximas ou abaixo do

LDM. De maneira geral, houve variações nas concentrações dos ALCs leves e OLs

totais com a profundidade, sendo possível verificar as concentrações mais elevadas

entre as profundidades de 10-11 cm, possivelmente associadas a um evento natural que

favoreceu a produção de matéria orgânica pelos organismos anteriormente citados, ou

ainda, condições físico-químicas favoráveis a preservação da matéria orgânica sedimentar.

O fitol apresentou um perfil mais regular, com variações pouco significativas ao longo do tempo, sugerindo um aporte constante desse composto ao longo do período deposicional. O perfil do fitol com a profundidade também pode ser reflexo de processos de degradação da matéria orgânica, sendo observadas maiores concentrações nos sedimentos mais recentes, próximos a superfície, diminuindo a concentração em direção aos sedimentos mais antigos, localizados na base do testemunho.

CONCLUSÕES

O método analítico testado foi considerado satisfatório para análise de múltiplos marcadores orgânicos geoquímicos (hidrocarbonetos alifáticos, esteróis e n-alcanóis) em sedimentos marinhos. O processo de clean up mostrou-se eficiente na separação de todas as frações e classes de marcadores, inclusive na fração 3, nova etapa incluída no processo. Com as alterações realizadas é possível obter em uma única extração, as principais classes de compostos utilizados em trabalhos de geoquímica orgânica marinha, colaborando com os estudos da matéria orgânica e contaminação ambiental. A otimização e avaliação de métodos analíticos são essenciais para proporcionar bons resultados analíticos e reduzir consumo de material, especialmente em estudos de monitoramento ambiental, que envolvem grande número de amostras.

A aplicação em amostras de sedimentos marinhos trouxe resultados similares

aos obtidos em outros trabalhos, indicando a alta contribuição dos organismos

marinhos, principalmente do fito e zooplâncton, e a contribuição pouco significativa de

plantas, indicando, portanto, que o método analítico empregado resolve de maneira

adequada os componentes de amostras ambientais.