EFEITO DE AGENTE INDUTOR DE DIABETES NO PÂNCREAS DE RATOS WISTAR TRATADOS COM A FRAÇÃO AQUOSA DAS PARTES AÉREAS DA PLANTA PIPER ADUNCUM

Texto

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Anhanguera Educacional Ltda.

Correspondência/Contato

Alameda Maria Tereza, 4266 Valinhos, SP - CEP 13278-181 rc.ipade@aesapar.com

Coordenação

Instituto de Pesquisas Aplicadas e

Trabalho realizado com o incentivo e fomento da Anhanguera Educacional

Augusto Cézar Marins

Gomes

Prof. Doroty Mesquita

Dourado

Curso: Medicina UNIVERSIDADE ANHANGUERA - UNIDERP MATRIZ RESUMO

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do extrato aquoso das partes aéreas da planta Piper aduncum no pâncreas de ratos Wistar induzidos a diabetes por aloxana. Para a indução da Diabetes foram utilizados 28 animais em jejum por 24 horas. Nestes animais foi administrado a aloxana na dose única de 62,5 mg/kg, via intraperitoneal. Os animais foram divididos, de forma aleatória em grupo (n=5) diabético controle diabético (GD), grupo diabético tratado com extrato aquoso da planta Piper aduncum (L) (GDT), diariamente (1mL), através de uma sonda oroesofágica e o grupo controle (GC). Ao final de um período de tratamento de 14 dias os animais foram submetidos à eutanásia. Após a abertura da cavidade abdominal, o pâncreas foi avaliado macroscopicamente, pesado e medido e depois fixado em formol tamponado 10% à temperatura ambiente por 24 horas. Os animais do grupo diabético apresentaram ilhotas de Langerhans de vários tamanhos acompanhada de diminuição no número de células e com formato irregular. Algumas ilhotas mostravam poucas células e o espaço entre as células estava preenchido com material fibroso. No grupo tratado as ilhotas já apresentavam uma melhor arquitetura, tamanho normal e menor invasão por fibras colágenas.

Palavras-Chave: atividade hipoglicemiante; produtos naturais, Piperaceae.

A

NUÁRIO DA

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RODUÇÃO DE

I

NICIAÇÃO

C

IENTÍFICA

D

ISCENTE

Vol. 13, N. 19, Ano 2010

EFEITO DE AGENTE INDUTOR DE DIABETES NO

PÂNCREAS DE RATOS WISTAR TRATADOS COM A

FRAÇÃO AQUOSA DAS PARTES AÉREAS DA PLANTA

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1. INTRODUÇÃO

O diabetes melito situa-se entre as dez principais causas de morte nos países ocidentais e, apesar dos progressos em seu controle clínico, ainda não foi possível controlar de fato suas consequências letais. O termo diabetes melito descreve uma desordem metabólica de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica e distúrbios dos carboidratos, proteínas e gorduras resultantes de defeitos na secreção de insulina, ação da insulina ou ambos (ALBERTI, 2001).

Os recursos financeiros envolvidos no tratamento, recuperação e manutenção de pacientes portadores da doença são altos para a sociedade.

O pâncreas endócrino está situado abaixo e atrás do estômago, sendo uma glândula que pesa cerca de 250 g e é representado por aglomerados de células microscópicas denominadas ilhotas de Langerhans e numerosas outras células distribuídas na porção exócrina e no epitélio de revestimento dos canais excretores. No pâncreas são produzidos três hormônios importantes: insulina, glucágon e somatostatina (CLAYTON et al., 1993; GODOY, 2000).

Uma das alternativas para minimizar os efeitos da doença quando se instala é o uso de plantas com potencial medicinal. Muitas espécies de plantas têm sido usadas experimentalmente para tratar dos sintomas do diabetes melito (LAMBA et al., 2000; SYEM et al., 2002; HUO et al., 2003; ELDER, 2004).

A maioria das plantas que são utilizadas como antidiabéticas ao serem avaliadas farmacologicamente demonstraram ter atividade hipoglicemiante e possuir constituintes químicos que podem ser utilizados como modelos para novos agentes sensibilizadores da insulina. Entretanto, as análises posteriores revelaram grande variedade de mecanismos de ação que podem levar ao efeito hipoglicemiante, nem todos terapeuticamente úteis (HUO et al., 2003).

A busca de substâncias bioativas provenientes de plantas ou de substâncias isoladas pode ser considerada uma alternativa para o tratamento de doenças que acomete a população. No Cerrado e Pantanal Sul-mato-grossense, muitas espécies de plantas medicinais carecem de estudos, quer seja de forma direta ou por meio de seus produtos isolados.

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fúngica, atividade inseticida e efeito alelopático e comprovada ação analgésica e antiinflamatória com baixos níveis de toxicidade (BALDOQUI et al., 1999).

2. OBJETIVO

Geral: Avaliar o efeito da fração aquosa das partes aéreas da planta Piper aduncum no pâncreas de ratos Wistar diabéticos aloxânico.

Específicos: Analisar o efeito do diabetes aloxânico na citoarquitetura da ilhota pancreática, bem como a ação das partes aéreas da Piper Aduncun no grupo tratado. Comparar e quantificar o número de células na ilhota pancreática dos grupos diabéticos, tratados e controle. Determinar as alterações inflamatórias e a deposição de colágeno no pâncreas dos animais. Avaliar dados clínicos dos animais e a glicemia.

3. METODOLOGIA

O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais e Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais. A metodologia usada na pesquisa foi experimental exploratória descritiva.

Piper aduncum

As partes aéreas de Piper aduncum foram coletadas na Fazenda Escola. O material coletado foi acondicionado em sacos de polietileno e transportado, em forma de câmara úmida, ao Laboratório de Morfologia Vegetal e, então, herborizado e a exsicata identificada, descrita, catalogada, registrada e incorporada ao acervo da (número do registro- 6941).

Indução ao diabetes aloxânico

Para a indução ao diabetes aloxânico foram usados 33 ratos da linhagem Wistar (Rattus

novergicus albinus), machos, adultos. Após, foram separados em 5 animais para o grupo

controle normal, os restantes seguiram os procedimentos para indução da diabetes.

Após permanecerem em jejum por 24 horas, os animais foram pesados em balança analítica (Fisatam®, Ohauf, 1987). O protocolo anestésico adotado foi a associação

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resultando em dose final de 62,5mg de Aloxana/kg de peso, conforme metodologia descrita por Carvalho (2000).

Seis horas após a indução, os animais receberam glicose a 10% ad libitum como única fonte de alimentação. Na indução ao diabetes com aloxano foram utilizados 28 animais, após o procedimento, os animais foram mantidos em gaiolas plásticas forradas com maravalha, com água e ração e a seguir monitorados por um período de 72 horas.

Ao término do período estabelecido, realizou-se a primeira leitura da glicemia, retirando-se uma gota de sangue da veia da cauda colocando sobre fitas reagentes da marca ADVANTAGE II e a leitura foi processada em aparelho especifico (GLUCOMETER). Os animais induzidos que não apresentaram níveis satisfatórios de taxa glicêmica foram eutanasiados e descartados em lixo hospitalar.

Os animais que apresentaram valores iguais ou superiores a 300mg/dl de sangue foram separados e identificados para dar andamento aos grupos experimentais.

Modelo experimental

No total de animais induzidos a diabetes pela aloxana foram utilizados 14 ratos com peso aproximado de 250g. Os animais foram mantidos em ambiente ventilado, com ração e água ad libitum, sendo separados em três grupos: grupo Controle (GC) tratado com solução salina estéril a 0,9% via gavagem (v.g.), 1 mL; grupo Diabético (GD) inoculado com solução à base de aloxana via intraperitonial (i.p.); grupo Diabético tratado com extrato aquoso da planta (1,0mg/mL) Piper aduncum (GDT), v.g. Os ratos GDT foram tratados diariamente com extrato aquoso de Piper aduncum via gavagem, com administração de 1mL por meio de sonda oroesofágica por um período de 14 dias de tratamento.

Após o término dos períodos pré-estabelecidos os animais foram submetidos à eutanásia (7 e 14 dias) com a utilização do anestésico Xilazina e Ketamina administradas por via intraperitonial em dose letal.

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As imagens das lâminas foram capturadas em microscópio Carl Zeiss acoplado a uma microcâmera Sansung conectada a um computador com placa de captura de imagens e o software IMAGELAB pertencente ao laboratório de Pesquisa Tecidual e Biologia Molecular.

Dosagem da glicose plasmática

A determinação da concentração de glicose circulante foi realizada pelo método enzimático colorimétrico, utilizando o kit glicose PAP Liquiform da Labtest Diagnóstica (SACKS et al., 2002) sendo que a intensidade de cor emitida é diretamente proporcional à quantidade de glicose na amostra do soro. A leitura de absorbância foi feita no espectrofotômetro BIOPLUS 200 e a concentração de glicose expressa em mg/dL.

Estatística

As medidas foram comparadas estatisticamente entre si para cada tratamento por meio de análises de variância. A comparação entre as médias dos tratamentos foi feita pelo teste ANOVA com pós-teste de Tukey (p< 0,5%).

4. DESENVOLVIMENTO

O estudo mostrou a interferência da aloxana na arquitetura da ilhota pancreática e uma atenuação deste efeito no grupo tratado, verificando haver diferença significativa no número, tamanho e distorção da citoarquitetura das ilhotas de animais diabéticos em decorrência da diminuição do número de células. Os dados de Lima, et al, (2001) mostram diminuição do número de células beta e aumento no número de células que expressam somatostatina nos ratos sob efeito de aloxana em relação aos ratos normais e não haver diferença quanto às células produtoras de glucagon.

Todos os animais induzidos ao diabetes apresentaram glicemia superior a 300mg/dl, sendo que Lerco et al., (2002) encontraram níveis de glicemia acima de 300 mg/dl em todos os animais induzidos ao diabetes.

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experimento, houve também uma redução significativa da glicemia dos ratos nos grupos tratados comparado ao grupo diabético controle, onde a média do GT foi de 178,35 ± 5,41 mg/dL e do diabético controle igual à 239,85 mg/dL. Novelli et al.,(1988) atribuem estes efeitos ao aumento da atividade de enzimas removedoras de radicais livres, o grupo dos flavonóides.Outro fator relatado é a deposição de colágeno nas áreas de vazios celulares na ilhota pancreática. Shino et al.,(1999) demonstraram que na presença de elevados níveis de glicose, a acumulação de matriz colágena ocorre por um desbalanço entre a síntese e degradação de glicosilação não enzimática, a produção de um fator endotelial ( CTGF ) pela diabetes, que inibe a degradação de matriz extracelular, por estimular a expressão gênica e proteínas de muitos componentes desta, é outro fator que favorece a fibrose.

5. RESULTADOS

No grupo controle normal (GC/NaCl) os animais apresentaram, ao longo do experimento, um bom estado geral, ativos, com apetite normal, tônus e reflexos conservados e manutenção da ingestão hídrica, ingestão alimentar e diurese, dentro dos padrões de normalidade para a espécie e em conformidade com outros trabalhos (LERCO et al., 2003).

Figura 1. Aspecto normal do pâncreas de ratos Wistar tratados com solução salina a 0,9% (GC). (A, B, C) Ilhotas de Langerhans (il); vasos sanguineos (vs); ácinos pancreáticos (ap) HE (A, B e C); TM (D, E e F),

400x.

Grupo de animais diabéticos aloxânico

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Avaliando-se os ductos e vasos sanguíneos pancreáticos verificou-se que estavam preenchidos por secreção proteinácea, observado.

Além disso, no parênquima de alguns animais havia infiltrado neutrofílico e hemorragia e todos mostravam hemácias congestas.

Estes resultados confirmam os de Dumm et al. (1995), que observaram marcada redução no número, tamanho e distorção da citoarquitetura das ilhotas de animais diabéticos em decorrência da diminuição do número de células.

Figura 2. Aspecto do pâncreas de ratos Wistar diabéticos. Ilhotas de Langerhans (il); vasos sanguíneos (vs), inflamação (i), fibras colágenas (fc). HE/400x.

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Figura 3 Aspecto do pâncreas de ratos Wistar diabéticos e tratados com extrato aquoso da planta P. aduncum (L). Ilhotas de Langerhans (il); vasos sanguíneos (vs), ductos com deposição protéica (dp), hemácias

levemente congestas (hc)); HE/400x.

Glicemia

No início do experimento, todos os animais (n=12) utilizados no grupo controle diabético (GD) e experimental (GDT) apresentaram glicemia superior de 300mg/dl (média de glicemia de 369,28 ± 10,67 gm/dL). Após 14 dias de tratamento foi encontrada diferença significativa entre

os grupos citados acima (p < 0,05). Já no grupo controle tratado com solução salina a 0,9% nível glicêmico estava dentro dos padrões normais.

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Os animais do GD apresentaram alterações laboratoriais representadas por glicemia de jejum acima de 300 mg/dL até o 7º dia. Esses parâmetros foram compatíveis com o estado diabético grave que se instalou no animal (SPADELLA, 1989). Entretanto, após 14 dias o grupo GD apresentava, ainda, glicemia de 239,85 mg/dL que pode ser considerada estatisticamente superior quando comparadas ao grupo diabético tratado com a fração aquosa de P. aduncum (L) (média de 178,35 ± 5,41 mg/Dl) e em relação ao grupo GC (média de 107,25 ± 1,19 mg/dL).

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A aloxana foi capaz de modificar a estrutura da ilhota pancreática, diminuindo o número de células, promovendo infiltrado inflamatório e áreas de hemorragia com presença de fibrose. O tratamento com fração aquosa das partes aéreas da planta Piper aduncun mostrou redução desses efeitos e ação hipoglicemiante.

PARECER DE APROVAÇÃO DE COMITÊ

Pesquisa autorizada pelo Comitê de ética no Uso de Animais da Anhanguera Educacional S/A – (CEUA)/AESA - por meio do parecer: 64-006/09-MS.

REFERÊNCIAS

ALBERTI, K.G.; ZIMMET, P.; SHAW, J. Global and social implications of the diabetes epidemic. Nature, 414:782-787, 2001.

ARAMBEWELA, L.S.R.; ARAWWAWALA, L.D.A.M.; RATNASOORIYA, W.D. Antidiabetic activities of aqueous and ethanolic extracts of Piper betle leaves in rats. J. Ethnopharmacol., 102:239-245, 2005.

BALLDOQUI, D.C.; KATO, M.J.; CAVALEIRO, A.J.; BOLZANI, V. da S.; YPUNG, M.C.M.; FURLAN, M. A chromene and prenylated benzoic acid from Piper aduncum. Phytochemistry, 51:899-902, 1999.

BRIGSTOCK, D.R. Regulation of angiogenesis and endothelial cell function by connective tissue growth factor (CTGF) and cysteine-rich 61 (CYR61). Angiogenesis. 5:153–165, 2002.

CARVALHO, P.T.C.; MAZZER, N.; REIS, F.A.; BELCHIOR, A.C.G.; SILVA, I.S. Analysis of the influence of low-power HeNe laser on the healing of skin wounds in diabetic and non-diabetic rats. Acta Cirurgica. Brasileira, 21: 2006.

CLAYTON, H.A.; JAMES, R.F.; LONDON, N.J. Islet microencapsulation: a review. Acta Diabetologica, 30:181-189, 1993.

DUMM, C.L.A.G. et al. Quantitative immunocytochemical study of islet cell population in diabetic calmodulintransgenic mice. Virchows Archives. 425: n.1. 73-77, 1994.

(10)

HUO, Y.; WINTERS, W.D.; YAO, DA-LIN. Prevention of diet-induced type 2 diabetes in the C57BL/6J mouse model by an antidiabetic herbal formulae. Phytotherapy. Research., 17: 48-55, 2003.

LAMBA, S.S.; BUCH, K.Y.; LEWIS, H.; LAMBA, H.J. Phytochemicals as potential hypoglycemic agents. Studies in Nationals Plants Chemistry, 21: 457- 495, 2000.

LERCO, M.M.; SPADELLA, C.T.; MACHADO, J.L.M.; SCHELLINI, S.A.; PADOVANI, C.R. Caracterização de um modelo experimental de Diabetes Mellitus, induzido pela aloxana em ratos. Estudo clínico e laboratorial. Acta Cirúrgica Brasileira. 18: 132-142, 2003.

LIMA, M.A.; LIMA, LMB.; RITA, D.P.C.; NAVARRO, F.C.; TATSUKAWA, R.S.; PEREIRA, G.A.; REIS, L.C.; ABREU, M.E.A.; BORGES,M.F. Análise quantitativa das células das ilhotas pancreáticas em ratos sob efeito de aloxana. Revista de Medicina de Ribeirão Preto, 34: 308-314, 2001.

LUNA, L.G. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York: McGraw-Hill, 1968.

NOVELLI, E.L.B.; RODRIGUES N.L.; RIBAS, B.O. Brazilian Journal of Medical Biology Research 21: 129-32, 1988.

PEINADO, M.A.; PEDROSA, J.A.; RODRIGO, J. Avances em immunocitoquíma y téc. relacionadas. Jaén: Gráfica La Paz, 1996. 401 p.

SACKS, D.B., BRUNS, G.;MACLAREN, N.K.; MCDONALD, J.M.; PARROTT, M. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabete mellitus. Clinical Chemistry, 48: 436-472, 2002.

SHIMO, T.; NAKANISHI, T.; NISHIDA, T.; ASANO, M.; KANYAMA, M.; KUBOKI, T.;

TAMATANI, T.; TEZUKA, K.; TAKEMURA, M.; MATSUMURA, T.; TAKIGAWA, M. Connective tissue growth factor induces the proliferation, migration, and tube formation of vascular

endothelial cells in vitro, and angiogenesis in vivo. Journal of Biochemistry 126: 137–145, 1999. SILVA, R.V. da. Estudo químico e biossintético em Piper arboreum Aublet (Piperaceae). Tese de Doutorado do Instituto de Química, Universidade Paulista, Campus Araraquara-UNESP, Araraquara, 2004.

SPADELLA, C.T. Avaliação funcional do transplante pancreatoduodenal no rato diabético: estudo clínico, laboratorial, anátomo-patológico e imunohistoquímico [Tese . Doutorado]. Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Medicina de Botucatu; 1989.

SYIEM, D.; SYNGAI, G.; KHUP, P.Z.; KHONGWIR, B.S.; KHARBULI, B.; KAYANG, H.H.

Hypoglycemic effects of Potentilla fulgens L. in normal and alloxaninduced diabetic mice. Journal of Ethnopharmacology., 83: 55–61, 2002.

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