UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Agosto/2014 a Julho/2015 ( ) PARCIAL
( x ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Avaliação da atividade anti-inflamatória do ortobenzamol, análogo do paracetamol
Nome do Orientador: Luana Melo Diogo de Queiroz Titulação do Orientador: Doutora
Faculdade: Faculdade de Farmácia Unidade: Instituto de Ciências da Saúde
Laboratório: Laboratório de Avaliação de Fármacos e Produtos Naturais Título do Plano de Trabalho: Avaliação da atividade antiedematogênicado ortobenzamol, análogo do paracetamol.
Nome da Bolsista: Mayra Arouck Barros Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq
1 INTRODUÇÃO
A inflamação é uma resposta imune do organismo a um processo de infecção ou lesão tecidual. Tem início com a produção local de mediadores inflamatórios que promovem aumento da permeabilidade capilar e também quimiotaxia, processo químico pelo qual células polimorfonucleares, neutrófilos e macrófagos são atraídos para o foco da lesão. Estas células, por sua vez, realizam a fagocitose dos elementos que estão na origem da inflamação e produzem mais mediadores químicos, dentre os quais estão as citocinas, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), as interleucinas, quimiocinas, bradicinina, prostaglandinas e leucotrienos (MEDZHITOV, 2010).
Independentemente da causa, a inflamação presumivelmente evolui como uma reposta adaptativa para restaurar a homeostase e, o processo inflamatório é classificado de acordo com a velocidade de instalação: em inflamação aguda e inflamação crônica (MEDZHITOV, 2008).
Na resposta de fase aguda, que ocorre logo após a agressão, há aumento do fluxo sangüíneo e da permeabilidade vascular, com recrutamento de leucócitos no foco da lesão e liberação de mediadores inflamatórios. A transição para a fase crônica é caracterizada pelo desenvolvimento da resposta humoral específica e da resposta imune celular. Tanto na resposta de fase aguda quanto na crônica, mediadores inflamatórios agem de maneira local ou sistêmica, ativando outras células envolvidas com o processo inflamatório (células endoteliais, fibroblastos e células do sistema fagocítico mononuclear), ampliando assim, a resposta inicial contra o agente lesivo. (KHOVIDHUNKIT, 2004; KUMAR, 2004).
Tanto a COX-1 como a COX-2 formam um endoperóxido de prostaglandina instável, a PGH2, a partir do ácido araquidônico. A PGH2 é transformada por várias enzimas e também por mecanismos não enzimáticos em tromboxano e nas séries de prostaglandinas D, E, F e I, que são compostos coletivamente conhecidos como prostanoides. A COX é, portanto, responsável pelos dois primeiros passos na síntese de prostanoides, e as etapas posteriores são dependentes de enzimas tecido-específicas (MENDES, 2012).
Os prostanoides são importantes mediadores inflamatórios. Destacam-se as prostaglandinas PGE2 e a PGI2, por se apresentarem como potentes agentes vasodilatadores além de potencializarem o aumento de permeabilidade induzido por mediadores como bradicinina e histamina. Além disso, por essa potencialização do efeito da bradicinina e da histamina, essas PGs também estão envolvidas na hiperalgesia.Os prostanoides exercem seus efeitos por meio de receptores acoplados a proteína G,ativando diferentes vias de sinalização intracelular (MENDES, 2012).
Apesar da eficácia terapêutica, o uso dos AINES é limitado devido a seus efeitos colaterais comuns.
2 JUSTIFICATIVA
O Paracetamol (PAR) é um fármaco amplamente utilizado no mundo, como antipirético e analgésico. Embora seu mecanismo de ação ainda não tenha sido totalmente esclarecido, comumente é classificado com um AINE. Na clínica, este fármaco é selecionado como a primeira escolha para o tratamento da dor leve a moderada (PREESCOTT, 2000).
O Paracetamol é metabolizado principalmente no fígado e, é conhecido que seu consumo em altas doses pode provocar hepatotoxicidade devido à formação de metabólitos tóxicos. Quando uma parte do paracetamol é ativada pelo citocromo P-450 origina o metabólito altamente reativo, chamado N-acetil- P-benzoquinona imina (NAPQI). Em doses terapêuticas, o NAPQI sofre conjugação com glutationa reduzida (GSH) e é excretado sem causar danos (LAINE, 2009).
Este potencial lesivo despertou o interesse no estudo e desenvolvimento de homólogos e análogos mais seguros que o paracetamol. Assim, partindo da estrutura química do paracetamol, o Ortobenzamol (OBZ) foi planejado através da modelagem molecular, na tentativa de diminuir sua toxidade, mantendo suas propriedades terapêuticas (QUEIROZ et al, 2012).
Através deste estudo, foi demonstrado que o ortobenzamol possui melhores propriedades terapêuticas e uma menor tendência à formação do intermediário NAPQI, indicativo de menor toxicidade. Consequentemente, este composto foi sintetizado e avaliado em animais. A avaliação biológica revelou que a atividades antinociceptiva superam ao seu protótipo. Além disso, em testes de triagem, o ortobenzamol apresentou atividade anti-inflamatória (QUEIROZ et al, 2012).
É importante ressaltar que, apesar de classificado como anti-inflamatório não esteroidal, tem sido descrito na literatura que o paracetamol não é indicado para esta finalidade devido sua fraca ação sobre a inflamação (AL-SWAYEH et al. 2000).
Desta forma, o projeto de pesquisa tem como objetivo estudar a atividade anti-inflamatória do ortobenzamol e, através deste plano de trabalho, conhecer a atividade deste composto sobre um dos processos da inflamação que é a formação de edema.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
Avaliar a atividade antiedematogênica do ortobenzamol e compará-la com a do paracetamol.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar a atividade antiedematogênica do ortobenzamol e do paracetamol, através do:
Edema induzido pela injeção intraplantar de carragenina, em ratos.
Edema induzido pela injeção intraplantar de dextrana, em ratos.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Levantamento bibliográfico
O levantamento bibliográfico foi realizado através de artigos científicos referentes ao tema, consultados on line em base de dados como PubMed, Scielo, Science Direct e o portal de periódicos da CAPES. Adicionalmente, também foram consultados livros de farmacologia e biologia celular, pertencentes a bibliotecas particulares de professores e da Universidade Federal do Pará.
Outras informações foram adquiridas através de explicações orais da professora orientadora e de outros professores do grupo de pesquisa e, ainda, através da discussão em grupo e em seminários científicos realizados no laboratório.
4.2 Animais
Foram utilizados ratos (Wistar) machos adultos pesando entre 180g - 200g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Pará, que foram mantidos em gaiolas de polietileno no biotério setorial da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal do Pará. Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 3ºC) e ciclo de claro/escuro de 12 horas, com livre acesso a água e ração.
O manejo e uso dos animais foram de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisas com Animais de Experimentação da UFPA (CEPAE-UFPA, Parecer BIO231-14).
4.3 Tratamentos
As soluções de tratamento (paracetamol ou ortobenzamol) foram preparadas em óleo de milho (veículo), cuja administração foi realizada em dose única pela via oral (v.o.), através de cânula orogástrica em volume de 0,1mL/100g de peso corporal.
Todos os experimentos foram complementados por grupos controle negativo (veículo) e positivo (fármaco padrão), nos quais os animais foram submetidos exatamente aos mesmos procedimentos que os grupos tratados com ortobenzamol ou paracetamol. Os grupos experimentais foram constituídos por 6 animais, que foram tratados uma hora antes da administração do estímulo flogístico.
4.4 Edema de pata induzido por dextrana
A dextrana é um polímero que induz a liberação de histamina e serotonina dos mastócitos, produzindo edema. Portanto, drogas que interferem com a ação edematogênica induzida por estes mediadores inflamatórios, são melhores estudadas através deste modelo experimental (WINTER et al., 1962; ESTEVES et al, 2005).
Assim, aos grupos experimentais de animais tratados (conforme descrito no tópico acima), foram administrada dextrana (100 µL a 1%) na região intraplantar da pata direita e igual volume de solução salina (0,9%) na pata esquerda (ESTEVES et al, 2005).
O desenvolvimento do edema foi avaliado em milímetros através do aparelho pletismômetro, medido imediatamente após a administração de dextrana e solução salina e, em intervalos de 30 minutos, durante duas horas (ESTEVES et al, 2005).
4.5 Edema de pata induzido por carragenina
O edema de pata produzido pela injeção de carragenina é induzido pela ação seqüencial e integrada de vários mediadores inflamatórios. Assim, aos grupos experimentais de animais tratados (conforme descrito no tópico acima) foram administradas carragenina (100 μL a 1%) na região intraplantar da pata direita e igual volume de solução salina (0,9%) na pata esquerda (WINTER et al, 1962; DI ROSA et al, 1971).
4.6 Análise estatística.
Para comparação das médias entre os grupos, foi realizada análise de variância de uma via (ANOVA), seguida de um pós-teste (Tukey). Foram considerados estatisticamente significantes os valores de P<0,05.
5 RESULTADOS
5.1 Levantamento bibliográfico
O levantamento bibliográfico foi realizado conforme descrito no item 4.1. Simultaneamente às atividades previstas no cronograma do plano de trabalho, foi sendo construído o relatório final do PIBIC.
5.2 Desenvolvimento e apresentação de seminários
Foram pesquisados, elaborados e apresentados seminários em temas preparatórios à iniciação científica, assim como, de temas relacionados ao projeto para apropriação e discussão do conteúdo.
5.3 Reuniões semanais para avaliar o andamento do estudo
Foram realizadas reuniões semanais para discussão da bibliografia pesquisada, solidificação dos conhecimentos trabalhados e avaliação das atividades realizadas. Com base nos resultados de cada reunião foram decididos os passos seguintes.
5.4 Edema de pata induzido por dextrana
No teste de edema de pata induzido por dextrana, o Ortobenzamol não inibiu significativamente o edema.
O percentual de inibição do edema pelo Ortobenzamol foi de: 12,85% (0,95±0,09), 14,38% (1,43±0,13), 17,34% (1,24±0,14) e 24,47% (1,05±0,11), em 30, 60, 90 e 120 minutos respectivamente, após a injeção do agente flogístico, quando comparado com o grupo controle que foi de: 1,09±1,10; 1,67±0,24; 1,50±0,14 e 1,39±0,20, respectivamente.
Apenas o grupo Ciproeptadina (anti-histamínico, antagonista H1) inibiu significativamente o edema em 30, 60, 90 e 120 minutos respectivamente, apresentando percentual de inibição de: 69,73% (0,33±0,62; P<0,001), 76,65% (0,39±0,07; P<0,001), 72,67% (0,41±0,11; P<0,001) e 73,39% (0,37±0,13; P<0,001), quando comparado ao grupo controle (1,09±1,10; 1,67±0,24; 1,50±0,14 e 1,39±0,20, respectivamente)
Figura 1. Edema de pata induzido por dextrana (1%) em ratos tratados via oral com Paracetamol (127 mg/Kg), Ortobenzamol (22,5 mg/Kg) e Ciproeptadina (10 mg/Kg). Os valores representam a média ± erro padrão da média. (n=6) *** P <0,001 quando comparados ao grupo controle. ANOVA seguido de pós-teste de Tukey.
5.5 Edema de pata induzido por carragenina
O Ortobenzamol inibiu o edema de pata induzido por carragenina após 1, 2, 3 e 4 horas do estímulo flogístico, em respectivamente: 46,4% (0,43±0,06; P<0,001), 52,39% (0,57±0,08; P<0,001), 43,73% (0,70±0,09; P<0,001) e 35,17% (0,80±0,09;
P<0,001), quando comparado ao grupo controle (0,80±0,05; 1,19±0,16; 1,25±0,22 e 1,23±0,19), respectivamente (Figura 2).
Diferentemente, o Paracetamol não exerceu efeito significativo neste teste cujo percentual de inibição do edema foi de: 15,43% (0,68±0,12), 14,29% (1,02±0,22), 14,31% (1,07±0,11) e 0,17% (1,23±0,15), respectivamente.
P<0,001). Nas duas primeiras horas, não foi encontrada diferença estatística entre os efeitos exercidos pelo Ortobenzamol e a Indometacina na inibição do edema, ambos apresentaram ação semelhante.
Figura 2. Edema de pata induzido por carragenina em ratos tratados via oral com Paracetamol (127 mg/Kg), Ortobenzamol (22,5 mg/Kg) e Indometacina (10 mg/Kg). Os valores representam a média ± erro padrão da média. (n=6) *** P <0,001 quando comparados ao grupo controle. ANOVA seguido de pós-teste de Tukey.
6 DISCUSSÃO
A atividade antiedematogênicado Ortobenzamol foi avaliada através do modelo experimental de edema de pata em ratos, utilizando dois diferentes agentes flogísticos: a carragenina e a dextrana, com o objetivo de demonstrar a possível atividade antiedematogênicado fármaco e a sua provável via de ação.
A dextrana é um polissacarídeo que tem como mecanismo a degranulação de mastócitos com liberação de histamina e serotonina, as quais contribuem para aumentar a permeabilidade vascular e o extravasamento de fluido, apresentando pico máximo na 2° hora (SARTORI et al, 2003). A dextrana apresenta mecanismo distinto da carragenina, como por exemplo, o exsudato, que ocorre como consequência desse processo, é mais carente de proteínas e leucócitos (LO et al, 1982).
antagonista dos receptores histamina e serotonina, inibiu significativamente o edema em todos os tempos testados. Além do mecanismo de antagonismo dos receptores, as drogas antiedematogênicas podem atuar por outras formas, como por exemplo, inibição da permeabilidade tissular ou da dinâmica de fluidos e também interromper os processos nervosos ou humorais.
O edema de pata induzido por carragenina é um modelo utilizado tradicionalmente para avaliar a atividade anti-inflamatória de novos compostos, sendo caracterizado pela indução de uma resposta inflamatória persistente após a administração intraplantar de carragenina em animais (NANTEL et al, 1999; PASSOS et al, 2007). A carragenina é mais utilizada do que outros agentes flogísticos, pois o edema produzido é menos influenciado por fatores não específicos, tais como vasodilatação, bloqueio ganglionar e diurese (MALHOTRA et al, 2013).
O edema induzido por carragenina possui diferentes fases, começando com liberação inicial de histamina e serotonina, sendo a segunda fase mediada por cininas e a terceira mediada por prostaglandinas, apresentando pico máximo entre 2 e 3 horas após a aplicação (DI ROSA et al, 1970). A inibição do edema causado por carragenina envolve mecanismo relacionado com a síntese de prostaglandinas, em especial PGE2α e PGF2α, sendo essa atividade comparada a do anti-inflamatório não-esteroidal (SARTORI et al, 2003).
No teste de edema de pata inuzido por carragenina, o Ortobenzamol exerceu efeito significativo na diminuição do edema até a quarta hora após a indução do agente flogístico. Sugerindo que o modo de ação do Ortobenzamol pela inibição de alguns mediadores envolvidos no edema de pata induzido por carragenina, como por exemplo, histamina, serotonina, bradicinina e prostaglandinas.
Diferentemente, o Paracetamol não apresentou diminuição significativa do edema em nenhum tempo testado, corroborando com a literatura, que já evidenciou a sua fraca atividade anti-inflamatória (AL-SWAYEH et al. 2000).
A fraca ação do Paracetamol na inibição do edema induzido por dextrana e por carragenina era esperada, pois de acordo com a literatura, apesar do Paracetamol ser comumente classificado como um AINE, ele apresenta fraca ação anti-inflamatória, sendo aconselhado o uso de outros medicamentos dessa classe de anti-inflamatórios não-esteroidais para tratar inflamação (MALHOTRA et al, 2013).
Apesar de sua ampla utilização, o mecanismo de ação do Paracetamol ainda não foi completamente compreendido, embora estudos in vitro demonstrarem uma capacidade de inibir a COX 1 e 2, porém seu fraco efeito anti-inflamatório sugere que outros mecanismos não relacionados com a COX também estão envolvidos. Pode-se sugerir também que a ação farmacológica do Paracetamol pode estar relacionada com a formação do metabólito AM404 (N-arachidonoylaminophenol), que interfere com alvos envolvidos na dor e termorregulação, incluindo a síntese de prostaglandinas mediadas pela COX e sistemas de receptores vanilóides e canabinóides (VACCARINO et al, 2007).
7 CONCLUSÃO
O Ortobenzamol apresentou atividade antiedematogênica sobre o edema induzido por carragenina e, esta ação foi superior a do paracetamol.
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9 DIFICULDADES
Houve dificuldade para a execução das técnicas, as quais foram superadas ao decorrer do treinamento e da padronização da metodologia.
10 PARECER DO ORIENTADOR
A aluna obteve evolução científica ao decorrer do estágio e, apresenta perfil para as atividades científicas. Seu desempenho foi satisfatório e indico seu nome, para a renovação da bolsa de iniciação científica, na modalidade PRODOUTOR.
DATA : 10/08/2015
_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR
FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :
1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?
2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ?
3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?
4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?
5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório
6. Parecer Final:
Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( )
7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________
Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.
Data : _____/____/_____.
