Caracterizações Morfológica e Molecular de Bursaphelenchus fungivorus
(Nematoda: Aphelenchida), Detectado pela Primeira vez no Brasil
Claudio Marcelo G. de Oliveira1*, Juliana Eulálio1,2, Rosana Bessi3 & Ricardo Harakava4 1Laboratório de Nematologia, Centro Experimental Central do Instituto Biológico, Campinas (SP) Brasil.
2Bolsista do Consórcio Pesquisa Café, Acadêmica de Ciências Biológicas, PUC-Campinas (SP) Brasil. 3Bolsista do Consórcio Pesquisa Café, Pós-doutoranda, ESALQ / USP, Piracicaba (SP) Brasil.
4Laboratório de Bioquímica Fitopatológica, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Sanidade Vegetal do Instituto
Biológico, São Paulo (SP) Brasil.
*Autor para correspondência: marcelo@biologico.sp.gov.br Recebido para publicação em 02 / 10 / 2011. Aceito em 31 / 10 / 2011
Editado por Luiz Carlos C. B. Ferraz
Resumo - Oliveira, C.M.G., J. Eulálio, R. Bessi & R. Harakava. 2011. Caracterizações morfológica e molecular
de Bursaphelenchus fungivorus (Nematoda: Aphelenchida), detectado pela primeira vez no Brasil.
Bursaphelenchus fungivorus tem sido encontrado principalmente em associação a coníferas na Europa. No
presente estudo, uma população dessa espécie é relatada pela primeira vez no Brasil a partir de espécimes extraídos de fibra de coco (Cocos nucifera) provenientes de Belém (PA). Os nematoides foram caracterizados por meio do sequenciamento de fragmentos do terço final da região 18S rDNA e da expansão D2/D3 do 28S rDNA, e de estudos morfológicos, utilizando-se as microscopias eletrônica de varredura e de luz. Além disso, utilizou-se a tecnologia do código de barras do DNA na diagnose da população de Bursaphelenchus estudada. Com base nos estudos taxonômicos morfológicos dessa população, foram observadas as seguintes características: presença de machos com cauda recurvada pelo lado ventral, papila preanal única, localizada próximo aos espículos, espículos (dorsal e ventral) com pontas separadas, amplas e obtusas, sendo esta peculiar do grupo Bursaphelenchus hunti (grupo hunti). Fêmeas com campo lateral com quatro linhas, vulva sem a presença de dobra (flap) e cauda com término mucronado. De acordo com as análises moleculares, concluiu-se que a população estudada trata-se de B. fungivorus, uma vez que apresentou alto grau de homologia basendo-se nas sequências da região 18S e da expansão D2/D3 do 28S rDNA (100 % de similaridade para as duas regiões estudadas) com um isolado dessa espécie depositado no GenBank com acessos números AY508016.1 e AY508082.1. Trata-se da primeira ocorrência de B. fungivorus fora do continente europeu, ampliando a sua abrangência geográfica.
Palavras-chaves: código de barras do DNA, identificação, nova ocorrência.
Summary - Oliveira, C.M.G., J. Eulálio, R. Bessi & R. Harakava. 2011. Morphological and molecular
characterization of Bursaphelenchus fungivorus (Nematoda: Aphelenchida) detected for the first time in Brazil.
Bursaphelenchus fungivorus has been found mainly in Europe associated to conifer trees. In the present study we
Introdução
O Laboratório de Nematologia do Centro Experimental Central do Instituto Biológico, em Campinas (SP) recebeu, para análise, amostras de substrato composto de fibra de coco, procedentes de Belém (PA), que foram enviadas pelo serviço de sanidade vegetal do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA). Nessas amostras, detectaram-se exemplares de nematoides, identificados como do gênero Bursaphelenchus, com base nas características morfológicas. Por se tratar de gênero que engloba espécies de importância quarentenária, capazes de causar elevadas perdas, mas ainda não relatadas no Brasil (Ryss et al., 2005), a identificação específica dos nematoides presentes nas amostras afigurou-se de suma importância.
O uso do código de barras do DNA para a identificação de organismos foi proposto inicialmente nos Estados Unidos, em 2003, com base na percepção existente de que, em um pequeno trecho do genoma do organismo, específico para cada espécie, geralmente o DNA mitocondrial ou DNA ribossômico, haveria variação suficiente para separar as espécies que habitam o planeta atualmente (Powers, 2004). No Brasil, esta técnica já foi aplicada com sucesso no esclarecimento do status taxonômico de nematoides dos gêneros
Pratylenchus e Aphelenchoides (Oliveira et al., 2009; 2011b).
Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar os nematoides do gênero
Bursaphelenchus extraídos da fibra de coco, aliando a
técnica do código de barras do DNA à microscopia eletrônica de varredura e à de luz.
Material e Métodos
Caracterização morfológica. Microscopia de luz. Os nematoides foram extraídos pelo método
de Jenkins (1964) de 10 amostras de 250 cm3 de
substrato composto de fibra de coco, provenientes
de Belém (PA), sendo os espécimes obtidos mortos pelo calor, fixados e conservados em formalina 2 %. A estimativa populacional foi feita por contagem em lâminas de Peters.
Para a identificação da espécie, recorreu-se a lâminas permanentes (glicerina), preparadas através do processo de infiltração lenta (Hooper, 1986) e examinadas em microscópio de luz. A identificação baseou-se em dados morfológicos e morfométricos de machos e fêmeas aplicados à chave taxonômica proposta por Ryss et al. (2005).
Microscopia eletrônica de varredura. Os
estudos utilizando MEV foram realizados no Núcleo de Apoio à Pesquisa - Microscopia Eletrônica Aplicada à pesquisa Agropecuária, ESALQ / USP, Piracicaba, SP. Fêmeas e machos foram transferidos, um a um, dos recipientes originais a outros menores, que foram preenchidos com solução fixadora de glutaraldeído 3 % em tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,2, à 4 °C.
Os espécimes fixados foram transferidos para cápsulas “Beem” de polietileno, adaptadas segundo metodologia descrita por Eisenback (1991). Procedeu-se à lavagem dos espécimes em solução tampão pura, seguida da pós-fixação em tetróxido de ósmio 1 % por duas horas, à temperatura ambiente. A desidratação foi realizada em uma série de concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 80, 90, 95 e 100 %). As amostras completamente desidratadas foram secas ao ponto crítico utilizando-se CO2 como fluido de transição e, após a secagem, armazenadas em recipiente hermeticamente fechado, contendo sílica gel.
A montagem foi realizada sobre stubs contendo fita adesiva de carbono e utilizando-se um fio de cabelo e/ou cobre como suporte para os espécimes, que, em seguida, foram cobertos com fina camada de ouro e examinados ao microscópio LEO 435 VP, operando a 20kV.
terminus mucronate. According to the molecular analyses, it was concluded that the nematode studied was B.
fungivorus, since it showed high homology level based on 18S and D2/D3 expansion fragments (both with
100% of similarity) with an isolate of this species deposited in the GenBank (accesses AY508016.1 and AY508082.1). This is the first record of B. fungivorus outside Europe increasing the geographic distribution of this species.
Caracterização molecular. Extração do DNA.
Para a extração do DNA genômico, foi utilizado o método da Proteinase-K (WLB: Worm Lysis Buffer), segundo Williams et al. (1994). Separadamente, um único indivíduo, extraído do substrato de fibra de coco, foi seccionado em três partes (com auxílio de agulha) em uma gota de 15 μl WLB e colocado em tubo de microcentrífuga, sendo incubado à -20 ºC por 15 min. Posteriormente, os tubos foram incubados a 60 ºC por 1 hora, a 95 ºC por 15 min e resfriados à 4 ºC.
Reação de PCR. Foi utilizado kit de PCR tipo
puReTaq Read-To-Go Bead (Amersham Pharmacia
Biotech). Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 μl, foi adicionada uma esfera do kit de PCR, contendo os seguintes reagentes: 2,5 U puReTaq, 200 mM de cada dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2, quando dissolvida em 17,5 μl de água milli-Q. Em seguida, foram adicionados 5 μl de DNA genômico, 1 μl de cada par de primers [expansão D2/ D3 (D2A 5’ – ACAAGTACCGTGAGGGAAAG TTG – 3’; D3B 5’ – TCGGAAGGAACCAGCTAC TA – 3’) e terço final da região 18S (F02 5’ GGAAGGGCACCACCAGGAGTGG 3’; R81 5’ – TGATCCWKCYGCAGGTTCAC – 3’)], num volume final de 25 μl de reação. Esta mistura foi levada ao termociclador, pré-aquecido a 94 oC. As
condições de amplificação utilizadas para a expansão D2/D3 da região 28S encontram-se em Ye et al. (2007) e para a região 18S, em Oliveira et al. (2004).
Após a amplificação do DNA, 5 μl do produto da PCR foram utilizados para eletroforese em tampão 1X TAE em gel de agarose a 0,8 % com 0,003 % de brometo de etídio (0,02 mg / ml). O resultado da amplificação foi comparado com o marcador molecular 100 Base-Pair Ladder (Amersham). O gel foi visualizado num transiluminador de luz UV e fotografado.
Sequenciamento do DNA. Os sequenciamentos
obtidos no presente trabalho foram realizados no Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do Instituto Biológico, São Paulo (SP). O sequenciamento dos fragmentos amplificados das regiões D2/D3 e do terço final da 18S foi feito utilizando o kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems). Os fragmentos foram purificados por meio do kit Wizard® PCR
Preps DNA Purification System (Promega). Para cada reação, foi preparada mistura contendo 2 μl de reagente Big Dye, 3,2 pmol do primer para o sentido anverso ou para o sentido reverso, 3,0 μl do produto previamente amplificado contendo aproximadamente 400 ng de DNA e 2,0 μl de água. A reação para sequenciamento foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). Foi feita nova purificação do produto amplificado por precipitação com isopropanol em microtubos. Após a desnaturação das amostras a 95 ºC por 3 min., foi realizada eletroforese em aparelho ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystem).
As sequências obtidas foram alinhadas e comparadas com auxílio do programa BioEdit Sequence
Alignment Editor, com a finalidade de identificar
polimorfismo nas sequências nucleotídicas. As sequências “consenso” de ambos os fragmentos amplificados foram comparadas às sequências de outras espécies de nematoides depositadas no banco de dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para a identificação de homologia utilizando-se o programa BLASTN 2.2.19+ (Zhang et al. 2000).
Resultados
Caracterização morfológica. Os exemplares
recuperados das amostras apresentaram as seguintes características morfológicas, observadas tanto no microscópio de luz como no MEV: machos com cauda fortemente recurvada pelo lado ventral, asas caudais visíveis quando observadas em vista lateral, papila preanal única, localizada próximo aos espículos (Figura 1A), espículos (dorsal e ventral) com pontas separadas, amplas e obtusas, peculiares ao grupo
Bursaphelenchus hunti (grupo hunti) (Figura 1B). Fêmeas
vermiformes, com região labial elevada, destacada do corpo, campo lateral com quatro linhas, vulva sem dobra (flap) e cauda com término mucronado (Figura 2).
As mensurações dos machos e fêmeas estão na Tabela 1. No geral, os dados morfométricos estão de acordo com os da descrição original de
Bursaphelenchus fungivorus (Franklin & Hooper, 1962) e
Figura 1 - Fotomicrografias de machos de Bursaphelenchus fungivorus aos microscópios eletrônico de varredura (A) e de luz (B). A:
cauda recurvada pelo lado ventral e seta indicando a presença de papila preanal única (Barra = 5 µm). B: cauda com espículos (Barra = 10 µm).
Tabela 1 - Dados morfométricos da população brasileira de Bursaphelenchus fungivorus. Todas as mensurações estão em µm e representadas
pelas médias ± desvio padrão, seguidas pelos intervalos obtidos (nos parêntesis).
Características morfométricas (µm) Fêmeas (n= 14) Machos (n=13 )
L (comprimento do corpo) 519,8 ±27 (471-566) 568,6 ± 42,3 (499,5-653,5)
Estilete 12,1 ±1,1 (10-13) 11,5 ±0,8 (11,0-13,0)
Largura máxima do corpo 18,5 ±1,2 (17,5-20) 23,1 ±2,7 (17,5-27,5)
Comprimento da cauda 28,1 ±1,8 (26-31) 26,3 ±1,9 (22,0-29,0)
Diâmetro do corpo ao nível do ânus 8,7 ±1,3 (5-10) 11,9 ±1,0 (11,0-14,0)
V% 70,5 ±1,4 (68,5-73,8)
-a 28,1 ±1,7 (25,2-31,7) 24,8 ±2,1 (22,2-29,1)
c 18,5± 0,9 (16,7-19,8) 21,7 ±1,7 (19,4-25,1)
c‘ 3,3±0,7 (2,9-5,6) 2,2 ±0,2 (1,8-2,6)
Espículo - 14,0 ±1,8 (10,0-16,0)
de mucro no término caudal. Aliás, essa característica é variável dentro do gênero, havendo relatos, por exemplo, de populações de B. rufipennis (Kanzaki et
al., 2008) com presença ou ausência de cauda
mucronada.
Caracterização molecular. Para nematoides do
gênero Bursaphelenchus, a região genômica mais estudada é a expansão D2/D3 da região 28S (com maior número de sequências depositadas no GenBank), seguida da região 18S, ambas situadas no DNA ribossômico (rDNA). Portanto, procedeu-se ao estudo de tais regiões com o objetivo de elucidar a identificação da espécie presente nas amostras em análise, sendo que as sequências obtidas no presente
estudo foram depositadas no GenBank e receberam os seguintes códigos de acesso: JN903920 e JN903921.
As sequências das regiões estudadas foram individualmente confrontadas com as informações existentes no banco de dados GenBank até julho de 2011, para a identificação de homologia com sequências de outras espécies de nematoides. Baseando-se nessas comparações, elaboraram-se as Tabelas 2 e 3 contendo as porcentagens de homologia entre as populações coletadas e as sequências depositadas no GenBank.
Figura 2 - Fotomicrografias de fêmeas de Bursaphelenchus fungivorus ao microscópio eletrônico de varredura. A: região labial elevada,
destacada do corpo. B: campo lateral com quatro linhas. C: vulva sem a presença de dobra (flap). D: cauda com término mucronado. Barras= 2 µm.
Tabela 2 - Comparação da sequência parcial da região 18S do rDNA da população de Bursaphelenchus proveniente de Belém (PA),
com as sequências de outras espécies depositadas no banco de dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para a identificação de homologia (% de identidade genética).
Espécies % de identidade Código de acesso no GenBank
Bursaphelenchus fungivorus (Alemanha) 100 AY508016.1
Bursaphelenchus seani 99 AY508030.1
Bursaphelenchus arthuri 97 AM397010.1
Bursaphelenchus paraparvispicularis 96 GQ421483.1
Bursaphelenchus thailandae 96 AM397019.1
Bursaphelenchus willibaldi 96 AM397021.1
Bursaphelenchus cocophilus 96 AY509153.1
Bursaphelenchus braaschae 96 GQ845409.1
Bursaphelenchus vallesianus 96 AM397020.1
Bursaphelenchus sexdentati 96 AY508032.1
Bursaphelenchus conicaudatus 96 AB067757.1
Bursaphelenchus clavicauda 96 AB299221.1
Bursaphelenchus poligraphi 96 AY508028.1
Bursaphelenchus fraudulentus 95 AY508015.1
Tabela 3 - Comparação da sequência da expansão D2/D3 da região 28S do rDNA da população de Bursaphelenchus proveniente de
Belém (PA), com as sequências de outras espécies depositadas no banco de dados (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para a identificação de homologia (% de identidade genética).
Espécies % de identidade Código de acesso no GenBank
Bursaphelenchus fungivorus (Alemanha) 100 AY508082.1
Bursaphelenchus seani 91 AY508098.1
Bursaphelenchus arthuri 87 AM396564.1
Bursaphelenchus willibaldi 87 AM396579.1
Bursaphelenchus braaschae 86 GQ845408.1
Bursaphelenchus thailandae 82 AM396577.1
Bursaphelenchus rufipennis 82 AB368530.1
Bursaphelenchus yongensis 82 AM396581.1
Bursaphelenchus gerberae 82 AY508092.1
Bursaphelenchus anamurius 82 FJ768949.1
Bursaphelenchus clavicauda 82 AB299222.1
Bursaphelenchus hildegardae 82 AM396569.1
Bursaphelenchus tusciae 81 AY508104.1
Bursaphelenchus sexdentati 82 AY508103.1
Bursaphelenchus platzeri 81 AY508094.1
(PA) era de B. fungivorus, uma vez que apresentou alto grau de homologia (100%) com o isolado de B.
fungivorus proveniente da Alemanha (Ye et al., 2007)
para as duas regiões do rDNA estudadas.
Discussão
Por meio da aplicação da tecnologia do código de barras do DNA, Oliveira et al. (2009) relataram que tubérculos de batata provenientes do Canadá apresentavam-se com o nematoide Pratylenchus
penetrans. Nesse material, devido às condições de
transporte e armazenagem, os poucos nematoides presentes na amostra apresentavam-se com a morfologia alterada devido à anidrobiose, sem condições para a segura identificação específica. Para resolver tal questão, lançou-se mão de uma técnica bastante segura, mas que ainda não se encontra em uso rotineiro em laboratórios de diagnose de nematoides no Brasil, o chamado código de barras do DNA (DNA barcode), pelo sequenciamento de um pequeno trecho do genoma do organismo, específico para cada espécie.
No presente estudo, utilizou-se metodologia semelhante, demonstrando-se a utilidade da técnica do código de barras do DNA para a diagnose de população de Bursaphelenchus, identificada com segurança como B. fungivorus. Além disso, utilizando-se o conceito de taxonomia integrativa (Oliveira et al., 2011a), a identificação dos nematoides extraídos do
substrato de casca de coco foi confirmada pelo estudo de suas características morfológicas e valores morfométricos.
Bursaphelenchus fungivorus foi descrito pela primeira
vez no País de Gales, associado à parte aérea de
Gardenia sp. infectada por Botrytis cinerea (Franklin &
Hopper, 1962). Nesse mesmo relato, os autores observaram que espécimes do nematoide alimentavam-se das hifas do fungo. Mais tarde, baseando-se em técnicas moleculares (ITS-RFLP) e morfológicas, Braasch et al. (2002) relataram a ocorrência numerosa de B. fungivorus em meio de cultura proveniente de casa de vegetação na Alemanha e em cascas de coníferas importadas da República Tcheca e da Rússia. Durante levantamento de insetos xilófagos em coníferas, principalmente Pinus pinaster da Espanha, Arias et al. (2005) encontraram B. fungivorus associados foreticamente ao coleóptero escolitídeo
Orthotomicus erosus.
Embora os relatos indiquem que B. fungivorus seja espécie micófaga, Braasch et al. (1999), citados por Arias et al. (2005), demonstraram, em experimento conduzido sob condições controladas, que B. fungivorus causou 70 % de mortalidade em plântulas de Pinus
sylvestris com 3 anos de idade. No entanto, essa
spp., nunca foi possível associar a ocorrência do nematoide a quaisquer sintomas nas plantas.
No Brasil, o único relato de espécie do gênero
Bursaphelenchus restringe-se a B. cocophilus, o
nematoide-do-anel-vermelho. Essa espécie constitui problema muito sério em países produtores de palmáceas de interesse econômico, como o coqueiro (Cocos nucifera) e o dendezeiro (Elaeis guineensis), localizados na América Latina, inclusive no Brasil. Já foi relatado também em tamareira (Phoenix dactylifera), palmeira-real (Roystonia
regia) e Oenocarpus distichus, palmácea nativa da floresta
amazônica. No Brasil, ocorre predominantemente na região Nordeste (Bahia, Pernambuco, Sergipe, Alagoas e Ceará), mas há relatos no Rio de Janeiro e São Paulo (Curi et al., 1986; Costa-Manso et al., 1994, Duarte et
al., 2008, Oliveira & Bessi, 2010). O primeiro registro
de ocorrência de B. fungivorus no Brasil vem contribuir, portanto, para expandir o conhecimento da diversidade do gênero Bursaphelenchus no País. Cabe ressaltar que essa espécie somente havia sido relatada anteriormente na Europa (Braasch, 2001) e, portanto, trata-se da primeira ocorrência fora do continente europeu, ampliando sua abrangência geográfica.
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa de produtividade em pesquisa aos autores C.M.G. Oliveira e R. Harakava.
Literatura Citada
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