Interações bióticas e abióticas em feijão- caupi (Vigna unguiculata) pela técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

Texto

(1)Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Interações Bióticas e Abióticas em Feijão-Caupi (Vigna unguiculata) pela técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. Recife, 2010.

(2) Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. Interações Bióticas e Abióticas em Feijão-Caupi (Vigna unguiculata) pela técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Tese apresentada como requisito para obtenção de título de Doutor em Ciências Biológicas, junto ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas, área de concentração em Biotecnologia da Universidade Federal de Pernambuco. Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria BenkoIseppon Co-orientador: Prof. Dr. Éderson Akio Kido. Recife, 2010.

(3) Barbosa, Pedranne Kelle de Araújo Interações bióticas e abióticas em feijão- caupi (Vigna unguiculata) pela técnica de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) / Pedranne Kelle de Araújo Barbosa. – Recife: O Autor, 2010.. 152 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Ana Maria Benko-Iseppon. Co-orientador: Éderson Akio Kido Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas. Biologia Vegetal, 2010. Inclui bibliografia e anexos. 1. Feijão Caupi 2. Estresse abiótico 3. Genética vegetal 4. Biotecnologia . I. Título.. 581.38. CDD (22.ed.). UFPE/CCB-2010-123.

(4)

(5) Para a vida, as portas não são obstáculos, mas diferentes passagens. (Içami Tiba).

(6) Dedico.

(7) Agradecimentos Agradeço a minha mãe, Maria Araújo, a quem dedico esta tese. Mulher guerreira que se faz presente todos os dias na minha vida, incentivando, orientando, acalmando, instruindo e dando todo o suporte que sempre precisei para que mais esta etapa pudesse ser concluída. A ela, meu amor incondicional; Às minhas irmãs, Arianne Barbosa e Anne Barbosa, que em todos os momentos e decisões se fizeram presentes, me apoiando e me incentivando, fazendo com que a distância física entre nós sempre fosse pequena comparada à vontade de “chegar lá”. Ao meu pai, Edmar Barbosa, fonte de inspiração na busca deste objetivo; Agradeço a oportunidade de ter encontrado essa pessoa maravilhosa, Ricardo Castro, que hoje muito mais que meu “namorido”, é um companheiro que me ajudou dando todo o suporte necessário, abdicando horas do seu trabalho, para que eu pudesse concluir essa etapa da minha vida. E que com ele compartilho o maior tesouro da minha vida, nosso filho, Caio Barbosa e Castro; À Profa. Dra. Ana M. Benko-Iseppon pela oportunidade de trabalhar em seu grupo de pesquisa e pela confiança ofertada a mim para o desenvolvimento desse projeto; Ao Prof. Dr. Éderson A. Kido, que muito me surpreendeu nessa fase final do trabalho, e que sem dúvida, sem seu empenho tudo seria muito mais difícil e demorado. Agradeço a acolhida nesse momento; À Fofi (Dra. Valesca Pandolfi), uma grande companheira a quem tenho muito respeito. Uma pessoa que sempre se colocou prontamente a me ajudar para que nossos objetivos finais fossem alcançados; Ao Prof. Dr. Paulo Andrade, a quem tenho grande admiração por toda sua genialidade, presteza, criatividade e alegria. Obrigada pela paciência, os conselhos e as ajudas. Tirando o “Fau”, você é o “cara”! Agradeço a Amanda Martins, pela dedicação nas formatações finais, bem como o companheirismo nos trabalhos extra-laboratório (personal promoter); Ao João Pacífico.

(8) pela disponibilidade e paciência ofertada nos momentos de “socorro” auxiliando com os programas da bioinfo; A Nina Mota, por toda boa vontade e até mesmo paciência na análise inicial dos dados e por conseguir fazer dos momentos estressantes, momentos até divertidos; Ao Prof. Dr. Tercilio Calsa que se disponibilizou na orientação da construção das bibliotecas SAGE; Aos colegas e amigos de laboratório conquistados, tanto do LGM quanto do LGBV, e que hoje mesmo não fazendo mais parte do grupo (alguns), ainda fazem parte dessa minha história: “quarteto” fantástico (Thiago Souza, Rodrigo Assunção, Bruno Ribeiro), Celuza Castro, Riba (Neto Costa Ferreira), Renata Castro, Nayara Vieira, Marcelo Oliva, Marcelo Lucena, Michely Diniz, Rodrigo Gazzaneo, à Elite (Hayana Azevedo, Kênia Lucena, Mario Correia, Geyner Alves, Diego Sotero, Lidiane Amorim, Alberto Vinicius), Santelmo Vasconcelos, Ebénezer Bernardes, Claudete Marques; Aos amigos que fiz “No Recife” e com certeza me deram suporte psicológico ajudando no andamento dos trabalhos e deixando meus dias sempre mais alegres: as flores (Fátima Alves, Vanessa Oliveira), aos tios (Mércia Melo, Amaro Castro, Leila Martins), aos malinhas (Alexandre Campos, Tony Brito), as sem noção (Lidiane Freire, Marcella Oliveira), ao trio do Renault (Flávio Beltrão, Pedro Neto, Priscilla Belo), a docinho (Hayana Azevedo, Kenia Lucena, Joana Araújo); Aos amigos conquistados na vida acadêmica e familiares que me acompanham (mesmo à distância), sempre torcendo e me incentivando: Profa. Dra. Ana Brito (minha eterna orientadora e a quem tenho uma eterna admiração), Patrese Calheiros, Adriana Lima, Laura Souza, Luiz Fabiano, Maria Eugênia (Tia Gê), Luiz Araújo (tio Lula), Stanley Gonçalves, Genival Costa, Juliana Costa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de Doutorado e pelo suporte financeiro necessário à realização desta pesquisa; À Universidade Federal de Pernambuco, por meio do Departamento de Ciências Biológicas, pela oportunidade de realização do curso; A DEUS, causa primária de todas as coisas..

(9) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................... viii LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................................... ix RESUMO .............................................................................................................................................................. x ABSTRACT ........................................................................................................................................................ xi 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................... 12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................................. 13 2.1. A Cultura do Feijão-Caupi e sua importância econômica ............................................. 13 2.2. Taxonomia e Características Botânicas ................................................................................. 14 2.3. Estresses Bióticos e Abióticos e suas consequências ....................................................... 15 2.4. Interação Planta-Patógeno .......................................................................................................... 17 2.5. Interação Planta-Vírus ................................................................................................................. 18 2.6. Melhoramento Genético .............................................................................................................. 22 2.7. Técnicas de Avaliação da Expressão Gênica ....................................................................... 24 2.8. Aplicações da SAGE em Plantas ................................................................................................ 26 2.9. Transcriptômica do Feijão-Caupi ............................................................................................ 28 2.10. Bioinformática .............................................................................................................................. 31 2.10.1. Bancos de Dados e Ferramentas de Bioinformática ............................................. 32 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 36 4. CAPÍTULO 1 Transcriptional profiling of wound stress response in Vigna unguiculata (L.) Walp. revealed by SuperSAGE 4.1. Abstract ............................................................................................................................................... 59 4.2. Background ....................................................................................................................................... 60 4.3. Material and Methods ................................................................................................................... 62 4.4. Results and discussion ................................................................................................................. 64 4.5. References ......................................................................................................................................... 81 4.6. Additional file ................................................................................................................................... 94 5. CAPÍTULO 2 The analysis of differential expression in Vigna unguiculata (L.) Walp. to the severe mosaic virus (CPSMV) revealed by SuperSAGE 5.1. Abstract ............................................................................................................................................ 111 5.2. Background .................................................................................................................................... 112 5.3. Material and Methods ................................................................................................................ 113 5.4. Results and discussion .............................................................................................................. 115 5.5. References ....................................................................................................................................... 130 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................................. 142 7. Instruções para autores da revista BMC Genomics ........................................................ 143.

(10) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1. Principais mecanismos do reconhecimento do patógeno e da resposta de defesa em plantas superiores ................................................................................................................... 18 Figura 2. Folhas de Vigna unguiculata (Cultivar IT85F) apresentando sintomas severos após 23 dias da inoculação com vírus do Mosaico Severo (CPSMV) ....................................... 21. CAPÍTULO 1 Figure 1. Distribution of the 30 most represented GO terms in the category “Cellular Component”, including absolute values and percentage ............................................................ 65 Figure 2. Distribution of 30 most represented GO terms in the category “Biological Process”, including absolute values and percentage ...................................................................... 66 Figure 3. Table with the representative sequenced tag number …......................................... 67 Figure 4. Quantitative distribution of SuperSAGE tags ................................................................ 68 Figure 5. Best matches (in %) regarding differentially expressed tags that could not be annotated with the cowpea EST database .......................................................................................... 71 Figure 6. Distribution of the differentially expressed transcripts in absolute numbers within the three principal Gene Ontology categories ..................................................................... 72 Figure 7. Functional categorization of Vigna unguiculata unitags .......................................... 74. CAPÍTULO 2 Figure 1. Distribution of unique tags (axis Y) in relation to tag copy number (axis X). Only tags with a copy number ≥ 2 were plotted on the graph ………………………………. 116 Figure 2. Diagram Venn showed distribution of tags among the three SuperSAGE libraries for each stress treatment (1) BMCT123; (2) BMCT4; (3) BRC1 …………….…. 117 Figure 3. Functional categorization of Vigna unguiculata unitags ………………………….. 121 Figure 4. Response to stress category in SuperSAGE libraries from V. unguiculata … 122 Figure 5. Fold change in Vigna unguiculata tags showing significant changes in expression following BMCT123 and BMCT4 infestation of CPSMV ……………………..… 123 Figure 6. Heat map representing expression perfiles in subcategory response to stress of Vigna unguiculata ………………………………………………………………………………………..…. 129. viii.

(11) LISTA DE TABELAS. CAPÍTULO 1 Table 1. Differentially expressed tags after comparison of the control versus stressed libraries ..................................................................................................................................... 69 Table 2. Sequences of SuperTags (26 pb) differentially expressed ………….…..………. 95 Table 3. Functional classification of the differentially expressed genes …..….……..…. 97. CAPÍTULO 2. Table 1. Summary of SuperSAGE libraries of Vigna unguiculata …………….………… 116 Table 2. Annotation primary of tags SuperSAGE ……………………………………………… 118 Table 3. Summary of 30 most abundant antisense tags ……………………………..…….. 119. ix.

(12) RESUMO Danos provocados por estresses bióticos e/ou abióticos são fatores limitantes na produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata), favorecendo a redução no crescimento e na produtividade desta cultura. Uma alternativa a estes fatores limitantes é o uso de cultivares com características genéticas competitivas e eficientes contribuindo para alcançar um padrão de agricultura mais sustentável e com melhores condições de produção. Assim, pesquisas que possibilitem compreender funções específicas de genes preditos de plantas e seus perfis de expressão em resposta a uma dada condição, são de extrema importância. Com base nisso, uma das metas do projeto NordEST (http://www.vigna.ufpe.br) consistiu na análise funcional de genes de feijão-caupi associados a estes tipos de estresses. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo analisar o perfil de expressão diferencial de genes através da técnica de SuperSAGE a partir de transcritos de folhas de feijão-caupi submetidas a injúria mecânica (biblioteca C2) e ao estresse causado pelo vírus do mosaico severo do feijãocaupi (CPSMV) (biblioteca BRM), com o intuito de obter um melhor entendimento com relação à resposta específica a este tipo de estresse, comparativamente a um controle negativo (ausência de injúria; biblioteca C1). As tags que apresentaram 100% de identidade com sequências de EST do banco privado de Vigna (banco NordEST), foram analisadas quanto à sua expressão diferencial e os transcritos que tiveram seus genes superexpressados e/ou reprimidos, dentro dos parâmetros requeridos (escore ≥42) foram anotados em categorias funcionais, de acordo com os termos de ontologia gênica (Gene Ontology) relativos a processos biológicos, função molecular e componente celular. Os resultados demonstraram que muitas sequências, tanto das bibliotecas submetidas à injúria, quanto as bibliotecas inoculadas com CPSMV estão relacionadas à categorias associadas a estresse, seguido de categorias relacionadas ao processos de tradução, ligação de proteínas, regulação da transcrição, redução de oxidação, transporte, proteólise, entre outros. Estas categorias estão relacionadas a rotas metabólicas importantes na resposta a estresses bióticos, indicando que estas tags representam um potencial real para descobertas de novos genes responsivos à injúria ou à resistência ao CPSMV, talvez ainda não descritos e/ou caracterizados.. Palavras-chave: Vigna unguiculata, SuperSAGE, perfil transcricional, anotação funcional. x.

(13) ABSTRACT. Damage caused by biotic and / or abiotic factors are limiting factors in the production of cowpea (Vigna unguiculata), favoring a reduction in growth and productivity of this crop. An alternative to these limiting factors is the use of cultivars with genetic competitive and efficient helping to achieve a pattern of more sustainable agriculture and better production conditions. Thus, studies that allow for understanding specific functions of predicted genes of plants and their expression profiles in response to a given condition are of extreme importance. On this basis, one of the goals of the project NordEST (http://www.vigna.ufpe.br) was the functional analysis of genes of cowpea associated with these types of stress. In this context, this study aimed to analyze the profile of differential gene expression using the technique of SuperSAGE transcripts from cowpea leaves subjected to mechanical injury (C2 library) and the stress caused by severe mosaic virus cowpea (CPSMV) library (BRM), in order to gain a better understanding regarding the specific response to this type of stress, compared to a negative control (no injury; Library C1). The tags that showed 100% identity with EST sequences of the private bank of Vigna (NordEST bank), were analyzed for their differential expression and the transcripts whose genes were up and / or down regulated within the required parameters (score ≥ 42) were noted in functional categories, according to the terms of gene ontology (Gene Ontology) related to biological processes, molecular function and cellular component. The results showed that many sequences, both of libraries subjected to injury, as the libraries are inoculated with CPSMV related categories associated with stress, followed by categories related to the processes of translation, protein binding, transcription regulation, oxidation reduction, transport, proteolysis, among others. These categories are related to important metabolic pathways in response to biotic stresses, indicating that these tags represent a real potential for discovery of new genes responsive to injury or resistance CPSMV may not yet described and / or characterized. Keywords: Vigna unguiculata, SuperSAGE, transcriptional profile, functional annotation.. xi.

(14) 1. INTRODUÇÃO. Nas regiões Norte e Nordeste, o feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é a leguminosa com maior propagação, representando aproximadamente 80% da produção total de grãos para alimentação humana, sejam verdes ou secos, constituindo uma fonte importante de proteínas (23-30%) e carboidratos (56-68%) (Bressani, 1993; Hall et al., 2003). Entretanto, um dos fatores limitantes desta leguminosa são os estresses causados por fatores bióticos e abióticos, acarretando grandes perdas na sua produtividade. Qualquer uma destas condições pode retardar o crescimento e o desenvolvimento, reduzir a produtividade e, em casos extremos, levar a planta à morte (Qiang et al., 2000; Jiang e Zhang, 2002; Ozturk et al., 2002; Xiong et al., 2002). Além disso, os métodos de cultivo adotados, na maioria das vezes utilizando pouca tecnologia, reduzem a produtividade e qualidade do grão. Desta forma, o uso de cultivares com características genéticas competitivas e eficientes contribuem para alcançar um padrão de agricultura mais sustentável e com maior produtividade. As pesquisas que possibilitem compreender funções específicas de genes preditos de plantas e seus perfis de expressão em resposta a uma dada condição podem contribuir decisivamente no melhoramento de plantas. Neste contexto, os projetos de sequenciamento aumentaram não somente o conhecimento de sequências genômicas para muitos organismos, mas igualmente para sequências de ESTs/cDNA para muitas espécies vegetais, criando novas oportunidades para usar estas informações na compreensão de mecanismos genéticos e desenvolvimento do controle da planta e suas respostas aos estímulos ambientais. As técnicas utilizando a análise de expressão de genes em indivíduos com características diferenciais (por exemplo, resistência/suscetibilidade a doenças) vêm sendo adotadas com grande sucesso em várias culturas vegetais. Dentre elas enquadrase a SAGE (Serial Analysis of Gene Expression, Análise Serial da Expressão de Genes), que simultaneamente identifica e estuda genes expressos sob diferentes situações, sendo baseada no sequenciamento e quantificação de um grande número de regiões específicas (tags), obtidas de populações contrastantes de transcritos (Velculescu et al., 2000). Neste trabalho, o estudo do perfil de expressão diferencial de genes através da técnica de SuperSAGE em V. unguiculata, submetido a injúria mecânica e ao ataque pelo 12.

(15) vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV), foi aplicado com o intuito de obter um maior entendimento. a. respeito. da. relação. planta-estresse. e/ou. planta-patógeno,. representando uma fonte de informações que poderá ser utilizada em estudos de genes de resistência.. 2. REVISÃO. 2.1. A CULTURA DO FEIJÃO-CAUPI E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], também conhecido como feijão-decorda, feijão-vigna ou feijão-macassar (Freire-Filho et al., 2002), além de saboroso, apresenta alto valor nutricional, com baixos teores de fatores anti-nutricionais e outras toxinas (Kay, 1979; Quass, 1995). O grão do feijão-caupi possui baixos índices de gordura, sendo rico nos aminoácidos lisina e triptofano, apresentando teores protéicos de duas a quatro vezes maior que outros cereais (Viera, 1983; Fall et al., 2003). Seus grãos também são ricos em minerais e vitaminas (Hall et al., 2003), apresentando um dos mais elevados níveis de ácido fólico e vitamina B1, ajudando a prevenir defeitos no tubo neural (DTN) em fetos (http://www.cdc.gov/; Toriello, 2005). A semente ou “grão seco” (como é referida às vezes) do feijão-caupi compreende um dos produtos mais importantes da planta para consumo humano, embora os grãos frescos e vagens verdes frescas também sejam importantes em alguns locais (Nielson et al., 1997; Ahenkora et al., 1998). Seu cultivo é em grande parte praticado por pequenos produtores, desempenhando importante papel econômico-social na região Nordeste, onde constitui o feijão mais consumido (Frota e Pereira, 2000), gerando cerca de 2,4 milhões de empregos diretos e abastecendo a mesa de 27,5 milhões de nordestinos (Benevenutti, 1996; Maia et al., 2000). O feijão-caupi também possui uma resposta de crescimento favorável em condições de estresse como seca, temperaturas elevadas e outros estresses abióticos (Ehlers e Hall, 1997; Oliveira, 2006). Com base nisso, no período de seca, o feijão-caupi desenvolve particularmente um papel crítico na alimentação animal em muitas partes do oeste da África (Singh e Tarawali, 1997; Tarawali et al., 1997, 2002). 13.

(16) Além disso, devido à sua tolerância em solos com baixa fertilidade - em decorrência da sua capacidade de fixação de nitrogênio (Martins et al., 1997), bem como de realizar simbiose efetiva com micorrizas e habilidade para tolerar solos com grandes variações de pH, o feijão-caupi é um dos componentes mais valiosos em sistemas agrícolas, restaurando a fertilidade dos solos para sucessão de outras culturas (Carsky et al., 2002; Tarawali et al, 2002; Sanginga et al, 2003). Segundo estimativas da FAO a produção mundial da cultura de feijão-caupi é de aproximadamente 3,7 milhões de toneladas, em uma área cultivada de cerca de 8,7 milhões de hectares. A Nigéria é o maior produtor, com aproximadamente 57% do total da produção mundial, seguida pelo Brasil, que contribui com 17% da produção mundial (Pereira et al., 2001). O feijão-caupi é um componente importante nos sistemas de produção em especial no Norte e Nordeste do Brasil, no entanto, a produtividade é relativamente baixa (entre 300 a 400 kg/ha), sendo decorrente, principalmente, dos sistemas de produção usados, onde na maioria não são adotadas práticas adequadas de manejo do solo, de pragas e doenças (Freire-Filho et al., 1999; Pio-Ribeiro, 2005).. 2.2. TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS BOTÂNICAS O nome “caupi” advém do inglês “cowpea” e se deve, provavelmente, à sua importância na produção de feno para alimentação bovina no sudeste dos Estados Unidos e em outras partes do mundo. Ainda nos Estados Unidos, outros nomes usados para descrever os grãos incluem “southernpeas” “blackeyed peas”, “field peas,” “pinkeyes” e “crowders”. Estes nomes refletem a semente tradicional e algumas novas classes desenvolvidas no sul dos Estados Unidos (Timko et al., 2007). Na África ocidental são atribuídas as denominações “niebe”, “wake” e “ewa”. No Brasil, sua denominação varia conforme a região, sendo mais conhecido como “feijão-de-corda” e “feijão-macassar” na região Nordeste, “feijão-de-praia” e “feijão-de-estrada”, na região Norte, bem como “feijão-miúdo”, na região Sul. É também chamado de “feijão-catador” e “feijão-gerutuba”, em algumas regiões do estado da Bahia e norte de Minas Gerais. Já no estado do Rio de Janeiro é conhecido como “feijão-fradinho” (Freire Filho et al., 1983). O feijão-caupi é classificado dentre as Dicotyledoneae, na ordem Fabales, família Fabaceae, subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolinea, gênero Vigna, 14.

(17) secção Catiang e espécie Vigna unguiculata (L.) Walp.) (Verdecourt, 1970; Marechal et al., 1978; Padulosi e Ng, 1997). Trata-se de planta herbácea, autógama, anual (Singh et al., 2002) que apresenta dois tipos de ramificações. No primeiro tipo, o caule produz um número limitado de nós e para de crescer quando emite uma inflorescência. No segundo tipo (o mais cultivado no Brasil), o caule continua crescendo e emitindo novas ramas secundárias e gemas florais. Apresenta inflorescências simples, embora tenham sido identificados genes recessivos que condicionam a produção de inflorescências compostas (Araújo et al., 1981; Machado et al., 2007). As vagens apresentam entre oito e dezoito sementes, cujo formato pode ser cilíndrico, curvado ou em linha reta. As sementes das cultivares pesam entre 80 e 320 mg, podendo seu revestimento apresentar variações como textura (por exemplo, liso, áspero ou enrugado) e cor (branco, creme, verde, vermelho, marrom, preto, entre outros) (Timko e Singh, 2008).. 2.3. ESTRESSES BIÓTICOS E ABIÓTICOS E SUAS CONSEQUÊNCIAS. O desenvolvimento geral das plantas pode ser afetado por diferentes tipos de estresses, caracterizados por condições externas que adversamente afetam o crescimento, o desenvolvimento e/ou a produtividade. Estes podem ser bióticos, impostos por organismos, como vírus, bactérias, fungos, nematóides e insetos (Santos et al., 1999; Korth, 2003) ou abióticos, incluindo excesso ou deficiência de fatores do ambiente físico ou químico (Agrios, 1997; Sticher et al., 1997; Dias e Rangel, 2007; Soares e Machado, 2007). Dentre as condições ambientais que podem causar alguns desses tipos de danos estão o excesso ou a falta de água (estresse hídrico), variações na temperatura (frio ou calor), excesso de salinidade, deficiência mineral no solo, o excesso ou falta de luz, além da chuva e vento. Compostos fitotóxicos como o O3 (ozônio) também podem causar danos nos tecidos das plantas (Eckey-Kaltenback, et al., 1997; Sanz et al., 2002; Krupa et al., 2003). O dano ocasionado devido a esses fatores pode ter como consequência a redução da qualidade fisiológica da planta após a injúria (efeito imediato) e/ou após determinado período de armazenamento (efeito latente), no caso de sementes e frutos. O ferimento representa uma ameaça constante à sobrevivência da planta porque não 15.

(18) somente destrói fisicamente os tecidos, mas fornece um caminho para a invasão pelo patógeno (Cheong et al, 2002). As plantas são organismos sésseis e obtêm nutrientes e água através de suas raízes, e são assim desprovidos de mecanismos que impedem os ferimentos, sejam mecânicos ou causados por patógenos. No entanto, as plantas são dotadas de barreiras pré-existentes que limitam o dano, tal como a cutícula, número e disposição dos estômatos que podem com sucesso suportar a agressão de pequenos herbívoros, ou então os tricomas, os espinhos e outros órgãos especializados que podem restringir o acesso da praga às partes mais nutritivas da planta (Leon et al, 2001; Korth, 2003). Diante da situação de estresse, embora não há possibilidade de mobilizar células especializadas, as plantas evoluíram desenvolvendo células competentes para a ativação das respostas de defesa que dependem da ativação transcricional de genes específicos. Estas respostas são dirigidas a recuperação dos tecidos danificados e a ativação de mecanismos de defesa que impeçam danos adicionais. A maioria das respostas induzidas ocorre em um curto período de tempo entre alguns minutos a diversas horas após o ferimento e incluem a geração/liberação, percepção e transdução de sinais específicos para a ativação de genes de defesa relacionados à injúria (Leon et al, 2001). Em resposta aos danos causados pela injúria as plantas se defendem da mesma forma como se estivessem sendo atacada por patógenos, consequentemente supõe-se que o mecanismo de defesa das plantas nestas duas situações evoluiu integradamente. Na sustentação desta ideia, os estudos mostraram que a injúria utiliza um número de genes que são regulados igualmente e/ou que possuem um mesmo papel em resposta ao patógeno (Durrant et al., 2000; Reymond et al., 2000). Por exemplo, estudos mostraram que diversos hormônios de plantas são importantes nesta resposta, dentre eles, ácido jasmônico, ácido salicílico e o etileno (Dong, 1998, Thomma et al., 1998). Além destes, algumas horas após o ferimento, as plantas produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo o ânion superóxido no tecido danificado e água oxigenada (H2O2) ambos local ou sistemicamente. A produção do superóxido é máxima alguns minutos após o ferimento e 4-6 horas para a H2O2, declinando em seguida (Orozco-Cárdenas e Ryan, 1999). Na situação de ataque por patógenos, em geral, as plantas respondem a estes tipos de estresses através de uma cascata de respostas envolvendo desde a alteração da expressão gênica e do metabolismo celular; até a alteração da taxa de crescimento e 16.

(19) mudanças na produtividade (Staskawicz et al., 1995; Moraes, 1998). Entretanto, estas respostas (resistência, tolerância ou suscetibilidade) dependem não somente da duração, severidade, número de exposições e da combinação desses fatores de estresse, mas também do tipo de órgão e tecido, idade de desenvolvimento, genótipo e espécie ou variedade das plantas (Staskawicz et al., 1995). As plantas possuem mecanismos que, dependendo da virulência do patógeno e do efeito sinérgico entre o patógeno e a cultivar (McDowell e Dangl, 2000, Brioso, 2006) podem impedir ou minimizar os danos causados. Esses mecanismos são chamados de “resistência induzida” envolvendo a construção de barreiras histológicas para evitar a entrada ou progressão dos patógenos, principalmente reforçando a parede celular (Durrant e Dong, 2004).. 2.4. INTERAÇÃO PLANTA-PATÓGENO As plantas, diferentemente dos animais, não possuem sistemas imunológicos para enfrentar determinadas situações adversas. Esse fato, associado à sua imobilidade (condição séssil) fez com que elas aperfeiçoassem, ao longo da evolução, mecanismos de defesa, tanto pré-formados, como induzidos (Hammond-Kosack e Jones, 2000; BenkoIseppon et al., 2010). A defesa pré-formada constitui-se no principal mecanismo de resistência não específica, em que as plantas formam barreiras estruturais (estômatos, cutículas, vasos condutores e tricomas) ou bioquímicas (fenóis, alcalóides, glicosídeos fenólicos e fitotoxinas). Já na defesa induzida ou pós-formada também podem ser encontradas barreiras estruturais como, cortiça, halos, lignificação, calose, etc; e bioquímicas: a síntese de peptídeos, proteínas e metabólitos secundários, no combate à infecção por patógenos (Pascholati e Leite, 1995; Taiz e Zeiger, 1998; Heath, 2000). Quando ocorre uma interação planta-patógeno, uma série de sinais moleculares coordenados, que ativam regiões do genoma da planta são desencadeados, interferindo na severidade da doença causada pelo patógeno. Muitas dessas respostas requerem ativação transcricional de genes por enzimas que produzem uma forma de barreira físico-fisiológica (por exemplo, lignina) ou por enzimas que participam da rota biossintética que conduz à síntese de compostos de defesa, como por exemplo, as fitoalexinas (metabólitos secundários - como derivados fenólicos) (Kahn et al., 2002; Woolhouse et al., 2002; Wink, 2003; Benko-Iseppon et al., 2010). 17.

(20) A percepção inicial do patógeno pela planta ocorre a partir da síntese de um fator de avirulência (avr) pelo patógeno que pode ser percebida pela planta a partir dos chamados genes de resistência (genes R), em uma interação compatível ou não, denominada interação gene-a-gene. Havendo interação compatível (patógeno virulento e hospedeiro suscetível), os genes R induzem a ativação de uma cascata de sinais, incluindo proteínas relacionadas à patogênese, ou proteínas PR (Pathogenesis-Related) (Van Loon et al., 1994; Heath, 2000; Durrant e Dong, 2004). As proteínas PR, por sua vez, além de serem produzidas no local da infecção, são também induzidas sistemicamente (Dixon e Harry, 1990), tomando parte ativa na eliminação do agente patogênico e no desenvolvimento da Resistência Sistêmica Adquirida – SAR (Systemic Aquired Resistance), contra futuros ataques desse patógeno (Nimchuk et al, 2003; Vallad e Goodman, 2004). O amplo espectro de compostos da SAR promove uma imunidade integrada e de longa memória contra o patógeno indutor no local da infecção, bem como em tecidos não infectados. Infecções experimentais algumas vezes resultam nesta resistência patógeno-específica, embora a proteção induzida também possa ser inespecífica (Scherer, 2002; Vallad e Goodman, 2004; Benko-Iseppon et al., 2010). Nas interações incompatíveis (patógeno avirulento e hospedeiro resistente), o sistema de defesa da planta é eficientemente ativado, conduzindo à resistência (Nimchuk et al, 2003) . A Figura 1 sintetiza as principais etapas e mecanismos do reconhecimento do patógeno e da resposta de defesa em plantas superiores, incluindo uma ou mais das 17 categorias de genes PR (Pathogen Related), dentre os quais se incluem proteínas antimicrobianas (Antimicrobial Proteins, AMPs), compreendendo pequenos peptídeos ricos em cisteína (Benko-Iseppon et al., 2010).. 2.5. INTERAÇÃO PLANTA-VÍRUS. Durante a evolução, plantas e vírus desenvolveram mecanismos complementares de ataque e defesa, onde o fenótipo de resistência ou suscetibilidade das plantas à infecção por vírus irá depender do balanço entre estes mecanismos (Zerbini et al., 2005). Os vírus de plantas interferem nos processos normais da célula hospedeira, provocando modificações histológicas e fisiológicas, ruptura do balanço energético, 18.

(21) alteração na síntese de proteínas, ácidos nucléicos e clorofila, supressão do silenciamento gênico pós-transcricional, transcricional, além de alteração nas taxas respiratórias (Flint et al., 2000; Voinnet, 2005; Soosaar et al., 2005).. Figura 1. Principais mecanismos do reconhecimento do patógeno e da resposta de defesa em plantas superiores. Organismos patogênicos (principalmente vírus, bactérias e fungos) sintetizam produtos avr (avirulence)) que podem ser compatíveis com produtos de genes R secretados retados pela planta. Interações compatíveis levam à ativação de uma cascata de sinais induzindo fatores da resistência sistêmica (como etileno e ácido jasmônico), bem como fatores da resistência adquirida, compreendendo uma ou mais das 17 categorias de genes PR (Pathogen Pathogen Related), Related), dentre os quais se incluem proteínas antimicrobianas (Antimicrobial Proteins,, AMPs). Fonte: Benko-Iseppon Benko et al. (2010).. A entrada dos vírus nas células vegetais é realizada por meio de um vetor biológico, como no caso de insetos, fungos, nematóides, ácaros ou após danos mecânicos 19.

(22) (Matthews, 1991; Medeiros et al., 2003; Ng e Falk, 2006 ). Estes utilizam dois processos para a invasão na planta; um decorrente do movimento de célula-a-célula pelos plasmodesmos e o outro pelo transporte em longa distância (sistêmico) pelos tecidos vasculares do floema. No movimento célula-a-célula, os vírus de plantas são dependentes, para sua sobrevivência, da transmissão eficiente por proteínas de movimento (MP) codificadas pelos vírus, bem como componentes codificados pelo hospedeiro (Atabekov e Taliansky, 1990; Lucas et al., 2001). Esta propagação assegura a sobrevivência do vírus, resultando muitas vezes em ocorrência de doença. Os primeiros estudos sobre transmissão de vírus de plantas por vetores demonstraram tanto a complexidade como a especificidade da interação vírus-vetor (Ng e Falk, 2006). Os patossistemas virais apresentam maior complexidade para o diagnóstico quando comparados àqueles causados por outros agentes etiológicos, pois de certa forma, há uma maior dificuldade em identificar precisamente os sintomas de viroses, uma vez que existem múltiplas doenças, pragas e deficiências nutricionais que causam sintomas semelhantes àqueles de vírus. Esta complexidade aumenta ainda mais quando se considera a existência da interação entre o vírus, a planta hospedeira e o vetor (Nutter, 1997; Zhang et al., 2000). Dentre os vírus que infectam plantas, mais de 70 gêneros foram descritos (Walkey e Payne, 1990), dos quais acredita-se que mais de 200 sejam disseminados por sementes em uma ou mais espécies de hospedeiros (Mandahar, 1981). No feijão-caupi, cerca de 30 gêneros virais envolvendo mais de 119 espécies foram citadas em diferentes partes do mundo (Thottappilly e Rossel, 1985; Brioso, 2006). Estima-se que a perda da cultura devido à infecção por vírus varie entre 10 e 100% (Shoyinka, 1974; Rachie, 1985; Shoyinka et al., 1988), dependendo da relação entre vírus-hospedeiro, assim como a prevalência de fatores epidemiológicos (Thottappilly e Rossel, 1988). No Brasil, os principais vírus que infectam o feijão-caupi são: o Cucumber mosaic virus (CMV) (família Bromoviridae), o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) (família Comoviridae), o cowpea golden mosaic virus (BGMV) (família Geminiviridae), o Bean common mosaic virus (BCMV) (família Potyviridae), o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) (família Potyviridae), o Cowpea green vein banding virus (CGVBV) (família Potyviridae), o Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) (família Potyviridae), o Cowpea. 20.

(23) severe mottle virus (CPSMoV) (família Potyviridae) (Kitajima, 1986; Kitajima, 1995; Lima et al., 1998), e o Blackeye cowpea mosaic virus (BICMV) (Lin et al., 1981). Dentre as espécies virais que possuem importância econômica, o gênero Potyvírus, com mais de 100 espécies, corresponde a 16% de todas as viroses de plantas. Sua transmissão se dá por meio de várias espécies de pulgões ou afídeos, através de picadas de prova (transmissão não persistente); portanto, a transmissão do vírus ocorre em segundos (Pirone, 1991; Gray, 1996). Outra virose que constitui um dos principais fatores limitantes na produção de feijão-caupi é a do Mosaico Severo, causada pelo CPSMV, família Comoviridae, gênero Comovirus (Chen e Bruening, 1992; Assunção et al., 2005). Estes vírus possuem forma isomérica com aproximadamente 28 nm de diâmetro, possui um genoma bipartido e é constituído de duas moléculas de RNA de fita simples que codifica proteínas para o movimento célula a célula e a longa distância (Hull, 2002; Pio-Ribeiro et al., 2005). Em condições naturais, no Nordeste brasileiro, os CPSMV são transmitidos por espécies do gênero Diabrotica e Cerotoma (Costa et al., 1978) embora o vírus se encontre disseminado em praticamente todas as regiões produtoras do país. Essa ampla distribuição geográfica do vírus é decorrente da numerosa gama de hospedeiros (espécies cultivadas e silvestres da família Fabaceae) e das dificuldades encontradas no manejo da doença (Paz et al., 1999). As plantas infectadas pelo CPSMV apresentam sintomas severos, como modificações da cor e no hábito das plantas, subdesenvolvimento e clareamento das nervuras principais, bolhosidade, manchas cloróticas, além de mosqueado e distorção foliar (Zerbini 2002; Lima et al., 2005). Tais características podem ser vistas na figura 2, em experimento realizado em casa de vegetação do Departamento de Genética da UFPE. As folhas da cultivar IT85F-2687 de V. unguiculata foi inoculada com CPSMV em vários tempos diferentes (30, 60 e 90 min e 16 h) para posterior utilização em bibliotecas de SuperSAGE utilizadas neste trabalho. Algumas fontes de resistência ao CPSMV no germoplasma de caupi já foram relatados por diversos pesquisadores (Umaharan et al., 1996, Paz et al., 1999), porém continua sendo um dos fatores limitantes da produção em se tratando de cultivares suscetíveis. Uma das alternativas como medidas de controle de doenças causadas por vírus fundamenta-se na introdução de resistência genética em cultivares comerciais através do melhoramento genético. 21.

(24) Figura 2. Folhas de Vigna unguiculata (Cultivar IT85F-2687) 2687) apresentando sintomas severos após 23 dias da inoculação com o vírus do Mosaico Severo (CPSMV). ( Foto cedida por Pandolfi (2007) em experimentos com feijão-caupi caupi sob estresses bióticos (CPSMV) ( em casa de vegetação da UFPE.. 2.6. MELHORAMENTO GENÉTICO Uma das principais finalidades do melhoramento genético de plantas é descobrir e testar novos acessos de germoplasma, desenvolver novas cultivares e variedades de culturas economicamente importantes, com vistas a garantir o suprimento de alimentos (Borém, 1998). Para alcançar seus objetivos, os melhoristas têm contado com o auxílio de algumas ferramentas valiosas. O uso dos sistemas de incompatibilidade nas plantas, para a criação de variedades híbridas e os cruzamentos interespecíficos, para a aquisição dee novos genes, também têm sido efetivos em algumas espécies (De Nettancourt, 1997). Dois dos principais fatores da evolução, a recombinação e a seleção, também têm sido intensivamente utilizados pelos melhoristas, com o emprego de métodos refinados desenvolvidos desenvolvidos na primeira metade deste século. As mutações – o terceiro grande fator da evolução – têm sido consideradas instrumentos adicionais, capazes de auxiliar os métodos convencionais de melhoramento, aumentando a variabilidade genética das espécies (Duvick, (Duvic 1986). Dentre as técnicas mais usadas estão a mutagênese e a transgenia. Com grande repercussão os transgênicos crescem de importância a cada ano e embora a área com 22.

(25) transgênicos esteja em constante crescimento em vários países, o uso desta ferramenta biotecnológica é alvo de discussão, devendo-se salientar que do ponto de vista do melhoramento genético, as técnicas convencionais e a transgenia não são mutuamente excludentes, ao contrário: são complementares (Paterniani, 2006). O feijão-caupi possui uma ampla variabilidade genética para praticamente todos os caracteres de interesse agronômico (Embrapa, 1990; Teófilo et al., 1990) sendo alvo importante em programas de melhoramento genético. Entretanto, embora os estudos para a seleção de feijão-caupi para a região Nordeste tenham se iniciado na década de 40 (Krutman et al., 1973), comparativamente a outras culturas, são poucas as cultivares recomendadas e lançadas comercialmente, devido principalmente aos múltiplos objetivos adotados pelos agricultores, visando não só a produtividade. No entanto, nos últimos anos a qualidade do grão e a arquitetura da planta também têm sido enfatizado devido as exigências do mercado quanto a qualidade para cozimento do grão comercializado (Carbonell et al., 2003), além das características relacionadas à produtividade e à resistência a patógenos, principalmente viroses (Miranda et al., 1996, Freire-Filho 2005). Algumas cultivares de feijão-caupi já foram relatadas como completamente resistentes aos vírus do mosaico amarelo, BICMV e CABMV. Destas, as cultivares IT96D659, IT96D-660, IT97K-1068-7 e IT95K-52-34 foram as que apresentaram melhores características de resistência e rendimento (Singh e Hughes, 1998; 1999). Van-Boxtel e colaboradores (2000) selecionaram 14 variedades de feijão-caupi, três isolados de BICMV e 10 isolados de CABMV com o intuito de identificar cultivares de caupi com resistência múltipla as viroses. Foi observado que as cultivares IT86D-880 e IT86D-1010 foram resistentes a três isolados de BICMV e cinco isolados de CABMV. As cultivares IT82D-889, IT90K-277-2 e TVu 201 se mostraram resistentes aos outros cinco isolados de CABMV. Esses resultados evidenciaram que é possível produzir novas variedades de caupi com resistência combinada aos 13 isolados virais. No Brasil, a resistência ao CPSMV, ao CABMV e ao BGMV também já foi relatada em algumas cultivares: BR 10-Piauí (Santos et al. 1987), BR 12-Canindé (Cardoso et al., 1988), BR 14-Mulato (Cardoso et al., 1990), BR 17-Gurguéia (Freire Filho et al., 1994), EPACE 10 (Barreto et al,. 1988), Setentão (Paiva et al., 1988), IPA 206 (IPA, 1989). Além destas, a BR 16-Chapéu-de-couro (Fernandes et al. 1990), BRS Paraguaçu (Alcântara et al., 2002) e BRS Guariba (Vilarinho, 2007) se mostraram resistentes ao CABMV. A 23.

(26) cultivar BRS Guariba se mostrou resistente também ao CGMV, moderadamente resistente ao oídio (Erysiphe polygoni DC.) e a mancha-café (Colletotrichum truncatum (Schw. Andrus & Moore)) e moderadamente tolerante à seca e a altas temperaturas (Vilarinho, 2007). Outra cultivar recentemente lançada foi a BRS Pujante, que submetida a cultivos em áreas de sequeiro ou sob irrigação no sertão nordestino, apresenta elevada produtividade sem adubações: 705 kg/ha e 1586 kg/ha, respectivamente. São quantidades que superam às obtidas por cultivos tradicionais na região e, além disso, apresentram valores próximos de 1,0 (sem sintomas) para as viroses do mosaico dourado (MDO), CPSMV e Potyvírus (Santos et al., 2008).. 2.7. TÉCNICAS DE AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA. Diferentes metodologias têm sido empregadas com a finalidade de medir a expressão global de genes em nível celular, tecidual, órgãos ou organismos em diferentes estágios de desenvolvimento e/ou sob várias condições ambientais (Velculescu et al., 1995), incluindo fatores bióticos e abióticos. Estas tecnologias estão divididas em duas categorias: técnicas “abertas” e técnicas “fechadas” (Matsumura et al., 2003). Na tecnologia fechada tal como arranjos de DNA (microarrays) as análises são baseadas em hibridização usando sequências completas ou parciais de DNA (cDNAs, produtos de PCR, plasmídeos ou bactérias contendo plasmídeos), previamente conhecidas e disponíveis em bancos de dados. Nesta tecnologia, sondas de cDNAs (a partir da transcrição reversa dos RNA mensageiros obtidos de células sob condições específicas) são submetidas à hibridização com o DNA fixado na membrana. A indução ou repressão de cada gene é medida em função desta intensidade de sinal emitido em cada condição testada, refletindo o nível de expressão de cada gene (Freeman et al., 2000). Assim, o “padrão de expressão” de milhares de genes pode ser comparado simultaneamente; entretanto, o espaço de análise é finito e o nível de análise da expressão do gene é limitado à sequência previamente caracterizada do transcrito para os quais corresponde a prova que foi colocada no microarranjo (Schena et al., 1995). Por outro lado, na tecnologia aberta, os métodos mais usados para análise do transcriptoma são baseados no sequenciamento do seu cDNA (ESTs – Expressed 24.

(27) Sequence Tags) ou de etiquetas representativas de transcritos denominadas “tags” (“etiquetas” em inglês). Dentre as estratégias desenvolvidas destacam-se a Differential Display - DDRT (Liang e Pardee, 1992), Serial Analysis of Gene Expression - SAGE (Velculescu et al., 1995) e algumas variantes, o cDNA-AFLP (Bachem et al., 1996); GeneCalling (Shimkets et al., 1999), Total Gene Expression Analysis - TOGA (Sutcliffe et al., 2000), e o Massively Parallel Signature Sequencing - MPSS (Brenner et al., 2000) (Matsumura et al., 2005; Hanriott et al., 2008). A SAGE ou Análise Serial da Expressão Gênica destaca-se por ser um método rápido e abrangente, estabelecido como uma técnica para análise quantitativa de um grande número de transcritos (Velculescu et al., 1995). Esta tecnologia é baseada em dois princípios: primeiro, uma sequência curta ou tag (9-11 pb) contém informação suficiente para identificar um transcrito único. Segundo, várias tags podem ser concatenadas. em. uma. única. molécula. formando. longos. clones. que,. após. sequenciamento resultam na identificação simultânea de muitas tags diferencialmente expressas (Saha et al., 2002; White, et al., 2008). Consequentemente, o padrão de expressão de qualquer população de transcritos pode ser quantitativamente avaliado pela abundância dos transcritos e pela identificação do gene correspondente a cada tag (Velculescu et al., 1997). Outra vantagem da Técnica SAGE, é que ela permite que as tags sejam utilizadas como primers ou sondas para identificar genes desconhecidos, como foi demonstrado na banana (Musa acuminata L.) por Coemans et al. (2005). A SAGE também apresenta grandes vantagens sobre os microarranjos, uma vez que possui maior potencial para discriminar entre transcritos homólogos e parálogos, revelando valores absolutos na expressão do transcriptoma e propiciando uma comparação direta entre os genes (Lu et al., 2004, Poole et al., 2008). Entretanto, um dos problemas da SAGE, quando comparada ao microarranjo, é que a SAGE é usada para poucas amostras ao mesmo tempo, existindo às vezes necessidade de comparar o perfil de expressão dos genes de múltiplas amostras (Matsumura et al., 2005). Outra deficiência na utilização da SAGE é o tamanho da tag de 15 pb, considerada demasiadamente curta para permitir a identificação inequívoca do gene de origem. Além disso, em organismos não modelos, isto é, com limitações ou sem sequências de DNA ou cDNA/ESTs disponíveis, a SAGE clássica de 15 pb não é devidamente prática devido à baixa casualidade e confiança da anotação das sequências. Isso é observado quando se realiza o alinhamento de sequências (BLAST). Usando uma sequência de entrada (query), 25.

(28) a mesma tag frequentemente combina dois ou mais genes, podendo confundir a análise (Matsumura et al., 2005). Diante disso, para aumentar a fidelidade do tag mapping, vários esforços foram feitos para aumentar o tamanho da tag, facilitando, desse modo, uma anotação mais acurada. Dentre estes aperfeiçoamentos estão as modificações da SAGE de 15 pb para 21 pb (LongSAGE) (Saha et al., 2002) e SuperSAGE (26pb) (Matsumura et al., 2003). Uma técnica desenvolvida comparável aos princípios da SAGE é a MPSS. No entanto, a MPSS utiliza a clonagem in vitro de fragmentos de cDNA em microgrânulos (microbeads), gerando pequenas etiquetas a partir desses cDNAs onde então é realizado o sequenciamento em larga escala dessas partículas sem a necessidade de separação física desses fragmentos. O resultado final da MPSS é uma abundância de milhares de tags de 17 ou 20 bases, a maioria das quais identifica um transcrito. Esta tecnologia permite a produção de um numero 100 vezes maior de tags em relação a SAGE, entretanto,. esta técnica. requer equipamento especializado e. possui. custos. extremamente elevados (Brenner et al., 2000; Christensen et al., 2003; Meyers et al., 2004).. 2.8. APLICAÇÕES DA SAGE EM PLANTAS A análise através da SAGE passou a ser aplicada com sucesso em um grande número de espécies eucariotas incluindo Saccharomyces cerevisiae (Velculescu et al., 1997), Homo sapiens (Zhang et al., 1997), Caenorhabditis elegans (Jones et al., 2001) e Drosophila melanogaster (Gorski et al., 2003). Em plantas, a técnica foi descrita pela primeira vez por Matsumura et al. (1999), ao analisar a expressão de genes de arroz (Oryza sativa L.) sob diferentes condições de germinação. Em seguida, Lorenz e Dean (2002) aplicaram a SAGE em pinheiro (Pinus taeda L.) para identificação dos genes envolvidos na formação da madeira e na caracterização das funções em relação à qualidade da madeira. Esses trabalhos representaram avanços por permitir a utilização da SAGE em plantas. Diversos trabalhos utilizando a planta modelo Arabidopsis thaliana também foram realizados. Jung et al. (2003) utilizaram a SAGE para comparar a expressão de genes sob diferentes estados fisiológicos e identificar genes que possuem papel importante na tolerância ao frio. Essa característica (tolerância ao frio) tem sido alvo de 26.

(29) diversos estudos em plantas. Com este objetivo, a tecnologia LongSAGE foi eficientemente aplicada na caracterização de genes associados ao estresse causado pelo frio em Arabidopsis (Byun et al., 2009). Os resultados revelaram que diversas estratégias são adotadas pela planta na regulação da transcrição em resposta à exposição ao frio. Ainda em Arabidopsis, seis bibliotecas SAGE contrastantes de raízes em crescimento hidropônico foram construídas para a identificação de genes expressos em grande escala, fornecendo novos conhecimentos das especificidades funcionais do sistema radicular (Fizames et al., 2004) Em cevada (Hordeum vulgare L.) a LongSAGE foi empregada para identificar a variação dos transcritos de RNAm desde o grão seco até a germinação, totalizando um período de 120 h. Os resultados forneceram dados na compreensão de como taxas relativas de modificação de proteínas e carboidratos contribuem na malteação (processo empregado para preparar o malte através da germinação sob condições controladas), exibida por alguns genes-chave para a germinação da semente da cevada (White et al., 2006; White et al., 2008). A SuperSAGE foi aplicada pela primeira vez em folhas de arroz infectado pelo fungo Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr. Os perfis de expressão dos genes do arroz e do fungo foram monitorados simultaneamente e foi visto que o gene da hidrofobina de M. grisea é o gene ativamente mais expresso no arroz, demonstrando o poder da SuperSAGE para a identificação simultânea da expressão de genes na interação entre dois ou mais organismos tais como patógeno-hospedeiro. Ainda nesse trabalho, a SuperSAGE foi aplicada na análise da mudança da expressão do gene elicitor IFN1 de Nicotiana benthamiana Domin. A técnica permitiu a identificação de genes superexpressos e reprimidos pelo elicitor em um organismo não-modelo, onde os genes mais reprimidos estavam envolvidos na fotossíntese (Matsumura et al., 2003). Outro organismo não modelo a qual a SuperSAGE foi aplicada foi em folhas de bananeira para caracterizar a expressão global de genes. As tags de SuperSAGE foram usadas como primers em 3’ RACE permitindo a identificação de transcritos desconhecidos e fornecendo uma ferramenta poderosa para a genômica funcional em organismos não modelo (Coemans et al., 2005). Um recente trabalho utilizando a SuperSAGE foi feito com grão de bico (Cicer arietinum L.). A técnica foi aplicada para analisar a expressão de genes de raízes de grão de bico em resposta a seca. Este estudo demonstrou que a transdução de sinais, a 27.

(30) regulação da transcrição, a acumulação de osmólitos e as espécies reativas a oxigênio estão sob remodelamento transcricional após 6h de estresse hídrico e que algumas isoformas destes transcritos que caracterizam estes processos são alvos em potenciais de tolerância a seca (Molina et al., 2008). Embora a aplicação mais importante da SAGE seja a identificação da expressão diferencial de genes, ela também tem possibilitado a identificação da ocorrência de regulação anti-senso, como foi demonstrado em arroz (Gibbings et al., 2003; Gowda et al., 2007), em Arabidopsis (Robinson et al., 2004) e na cana-de-açúcar (Saccharum L.) (Calsa e Figueira, 2007).. 2.9. TRANSCRIPTÔMICA DO FEIJÃO-CAUPI A caracterização de genomas foi uma das forças motrizes da ciência nos anos 90. Desde o sequenciamento completo do primeiro organismo de vida livre (Haemophilus influenzae) em 1995 (Fleishmann et al., 1995), a consolidação e a inovação das técnicas de análise genômica tornaram possível o sequenciamento do genoma de seres complexos como plantas, animais e seres humanos. Aliado a isso, os crescentes investimentos na área fizeram com que a lista de sequências de genomas completos tenha crescido a uma velocidade cada vez maior, contribuindo com um volume de dados disponíveis para acesso público (Binneck, 2004). Em plantas, embora o número de genomas completos disponíveis ainda seja limitado, quando comparado a outros organismos, um crescente número de sequências expressas como ESTs e tags têm sido disponibilizadas à comunidade científica, auxiliando no entendimento de processos genéticos em organismos com grandes genomas, como vegetais (Benko-Iseppon, 2001). Em função disso, em 2004, surgiu uma proposta de efetuar uma análise genômica funcional e estrutural no feijão-caupi (V. unguiculata), incluindo uma rede de laboratórios da região Nordeste do Brasil, denominada rede NordEST, visando identificar genes candidatos potencialmente úteis para fins de melhoramento desta cultura. Este projeto, coordenado pela Universidade Federal de Pernambuco (Profs. Ana M. Benko Iseppon e Ederson A. Kido), conta com a colaboração das Universidades Federais do Piauí, do Ceará, da Paraíba, das estações da Embrapa (Recursos Genéticos, Brasília-DF; CAPTSA, Meio-Norte) e da Universidade de São Paulo (ESALQ; CENA), tendo seu início oficial em junho/2005. O projeto contou 28.

(31) ainda com o auxílio de dois grupos consultores: da Universidade de Frankfurt (Johann Wolfgang Goethe Universität) na Alemanha e da Universidade da Califórnia, em Riverside (EUA). As principais metas do citado projeto incluíram (a) a geração de no mínimo 100 mil transcritos diferencialmente expressos em tecidos e condições importantes pra o entendimento de processos de tolerância ou resistência a estresses bióticos e abióticos; (b) o desenvolvimento de um mapa genético de alta resolução e (c) o desenvolvimento de estratégias eficientes de cultivo, transformação e regeneração in vitro, de modo a propiciar a rápida conversão dos dados gerados em benefício da cultura vegetal em questão. Desta forma, técnicas modernas de mapeamento genético assistido por marcadores moleculares (incluindo CAPs, dCAPs, DAF, SSR, AFLP, ISSR e RGAs) vêm sendo utilizadas a fim de mapear as regiões responsáveis a resistência a viroses (CPSMV; família Comoviridae e CABMV; família Potyviridae), bem como estresse abiótico como salinidade e seca (incluindo QTLs) que envolvam a produtividade e a arquitetura da planta (Benko-Iseppon et al., 2005; Amorim et al., 2009). No âmbito do citado projeto, ferramentas de genômica expressa (EST e SAGE) relacionadas a estresses bióticos (Potyvírus e Mosaico Severo) e abióticos (salinidade) do feijão-caupi também foram utilizadas, incluindo a construção de 10 bibliotecas de EST submetidas a estresse biótico (vírus do mosaico severo) e abiótico (salinidade), nove bibliotecas de SuperSAGE submetidas ao estresse salino e ao Vírus do Mosaico Severo e quatro bibliotecas de LongSAGE submetidas ao estresse por Potyvírus (BenkoIseppon et al., 2008) (Tabela 1). Atualmente o projeto envolve atividades referentes à categorização das bibliotecas de ESTs de V. unguiculata (sequências do banco NordEST, HarvEST e NCBI) compiladas em um banco local e a análise das bibliotecas controles (injúriado e não injúriado) de SuperSAGE infectadas pelo Mosaico Severo, desenvolvidas junto à empresa GenXPro (Frankfurt am Main, Alemanha) no âmbito do projeto. Em setembro/2009 o referido projeto contava com mais de cinco milhões de transcritos para análise (Kido et al., 2009), número que atualmente excede 20 milhões de transcritos,. incluindo. SuperSAGE-tags,. Long-SAGE-tags. e. ESTs,. ultrapassando. largamente o número de 100 mil transcritos inicialmente planejado (Kido e BenkoIseppon, com. pess.).. 29.

(32) Tabela 1. Descrição das bibliotecas de ESTs de feijão-caupi sob estresse biótico (Vírus do Mosaico Severo do Caupi) e abiótico (estresse salino, NaCl 200mM) e das bibliotecas de LongSAGE sob estresse biótico (Potivírus) e biliotecas de SuperSAGE sob estresse biótico (CPSMV e Potyvírus) e abiótico (estresse salino, NaCl 200mM) – Projeto NordEST- RENORBIO.. I- Bibliotecas de EST (Expressed Sequence Tags) Biblioteca Descrição VUSS00 VUSS02 VUSS08 VUST00 VUST02 VUST08 VUBM90 VUBM01 VUIM90 VUIM01. Canapu Controle (2+8h s/ estresse) Canapu (2h após estresse) Canapu (8h após estresse) Pitiuba Controle (2+8h s/ estresse) Pitiuba (2h após estresse) Pitiuba (8 h após estresse) BR-14 mulato - Mosaico (30+60+90 min após estresse) BR-14 mulato - Mosaico controle 01 (30+60+90 s/ estresse) IT- 85F - Mosaico (30+60+90 min após estresse) IT – 85F - Mosaico controle 01 (30+60+90 s/ estresse). II - Bibliotecas de LongSAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Biblioteca Descrição IP+ IPBR+ BR-. IT – 85F - Potyvirus (30+60+90 min e 16h após estresse) IT – 85F - Potyvirus (30+60+90 min e 16h sem estresse) BR14-mulato- Potyvirus (30+60+90 min e 16h após estresse) BR14-mulato- Potyvirus (30+60+90 min e 16h sem estresse). III- Bibliotecas de SuperSAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Biblioteca Descrição BRC1 BRC2T123 BRC2T6 BRMT123 BRMT6 PTS3T BRS3T PTCtr BR14Ctr L1_CMV-2_16 L2_CMV-2_BRC1 L3_CMV-2_3090 L1_CPV1-3 L2_CPV_4 L3_CPV_5 L4_CPV_6. BR14-mulato - controle absoluto BR14-mulato, controle injuriado (30+60+90 min após estresse) BR14-mulato, controle injuriado (16h após estresse) BR-mulato - Mosaico (30+60+90 min após estresse) BR14-mulato - Mosaico (16h após estresse) Pitiuba, stress salino, (30+60+90 min, 2h, 8h após estresse) BR14-mulato, stress salino (30+60+90 min, 2h, 8h após estresse) Pitiuba controle (30+60+90 min, 2h, 8h) BR14-mulato (30+60+90 min, 2h, 8h) BR14-mulato, controle injuriado (16h após estresse) BR14-mulato - controle absoluto BR14-mulato, controle injuriado (30+60+90 min) IT – 85F (30+60+90 min após estresse) IT – 85F (16h após estresse) IT – 85F (30+60+90 min e 16h sem estresse) IT – 85F (16h após o estesse). Além da iniciativa que integra a rede brasileira de genômica do feijão-caupi (Rede NordEST), destaca-se uma iniciativa desenvolvida pelas Universidades de Virgínia e da Califórnia (USA), com sequências já disponibilizadas em bancos de dados públicos, 30.

(33) integrada no projeto HarvEST, tendo gerado cerca de 180.000 ESTs (Close, 2007; HarvEST, 2008). Atualmente estas sequências encontram-se integradas no servidor NordEST, onde foram clusterizadas com as sequências de EST do citado projeto, perfazendo 248.500 ESTs disponíveis para ancoragem das tags de SuperSAGE e LongSAGE, bem como para outras análises in silico. Adicionalmente, destaca-se um banco de dados genômico, o Cowpea Genespace / Genomics Knowledge Base (CGKB) derivado de análise e sequenciamento de porções ativas do genoma do feijão-caupi, a partir da filtração do DNA genômico metilado (Chen et al., 2007). O “Cowpea-Genespace” tem se mostrado como uma excelente ferramenta para anotação, caracterização e análise de SAGE e EST-tags, colocando projetos com feijão-caupi em posição de vantagem face a outras leguminosas de importância nacional, como o feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) e o amendoim (Arachis hypogea L.) (BenkoIseppon, 2009).. 2.10. BIOINFORMÁTICA A bioinformática tem sido referida como um campo interdisciplinar, agindo como interface entre o campo científico e tecnológico. É caracterizada por prover métodos computadorizados para interpretar os dados gerados em estudos de sequenciamento de genomas, gerando grande volume de informação, de forma a trazer novos avanços para a biologia molecular. A bioinformática representa um dos grandes desafios para se tentar decifrar o genoma (Lengauer, 2001), consistindo na criação, desenvolvimento e operação de bancos de dados associados a ferramentas computacionais que permitam coletar, organizar e interpretar dados (Ouzounis, 2002). Devido ao grande volume de informação gerado pelos projetos de análise de genomas e transcriptomas, tem se tornado cada vez mais complexo o armazenamento, acesso e a análise dos dados gerados. Para contornar tal dificuldade, bancos para armazenamento e processamento de dados, através de ferramentas de análise, têm sido implementados e disponibilizados (bancos abertos), aumentando ainda mais a aplicabilidade da pesquisa (Félix, 2002; Wheeler et al., 2002).. 31.