UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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TASSIANE ASSIRIA FONTES MARTINS LUEHRING

Avaliação da terapia de combinação do Itraconazol e Benznidazol

no tratamento da doença de Chagas experimental

Ouro Preto/MG 2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Avaliação da terapia de combinação do Itraconazol e Benznidazol

no tratamento da doença de Chagas experimental

AUTOR: Tassiane Assiria Fontes Martins Luehring

.ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria Terezinha Bahia CO-ORIENTADOR: Dr. Ivo Santana Caldas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.

Ouro Preto/MG 2012

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Martins, T.A.F. Dedicatória

IV

Dedico este trabalho aos meus pais, Jonas e Célia, pelo amor, educação e exemplo de vida que serviram de alicerce para minha formação; Aos meus irmãos e melhores amigos Thiago e Thaís, pelo apoio e carinho sempre;

Ao meu esposo Luciano, pelo companheirismo, confiança e compreensão; e por estar sempre ao meu lado apoiando-me em todas as decisões.

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Martins, T.A.F. Agradecimentos

V

À Deus, por estar sempre presente na minha vida e protegendo e guiando meus passos. Pela força e coragem concedidas para superar os obstáculos da vida.

À minha orientadora Maria Terezinha Bahia pelo apoio, orientação e confiança no desenvolvimento desse trabalho e, sobretudo, por ser responsável pela minha formação científica. Obrigada pela atenção, carinho e pelos bons momentos vividos.

Ao meu co-orientador Ivo Santana Caldas pela ajuda neste trabalho. Minha eterna gratidão pela amizade, confiança e principalmente pelos incentivos constantes.

Ao Professor André Talvani, sempre presente, atencioso e disponível a ajudar. Aos Professores Marta de Lana e Evandro Marques de Menezes Machado, pela boa convivência.

À Ana, Ludmilla e Daniela pela atenção, auxílio e por serem tão prestativas! À Fabiane, Isabel, Vívian, Magna e Maíra pela amizade, aprendizado e ajuda em todos os momentos que precisei! A Lívia, um exemplo de dedicação profissional. A todos os colegas do curso de pós-graduação, em especial Guilherme e Maykon, sempre presentes. Ao Álvaro e Aline pelo auxílio na histopatologia. E a todos os demais amigos do Laboratório de Doença de Chagas pela agradável convivência e por tornar nosso dia a dia sempre prazeroso!

À Cida, secretária do programa de pós-graduação do NUPEB, sempre disponível.

Aos funcionários do Biotério que auxiliaram, direta ou indiretamente, na realização deste trabalho.

À UFOP, CAPES e DNDi.

À querida república Patotinha, moradoras, amigas e ex-alunas, obrigada por todo apoio, amizade e sentimentos compartilhados! E a todos que, direta ou indiretamente, e de forma especial colaboraram comigo para vencer mais uma etapa da

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Martins, T.A.F. Índice

VI

1. Introdução...1

1.1. O Trypanosoma cruzi...2

1.2. A doença de Chagas...3

1.3. Quimioterapia da doença de Chagas...5

1.4. Inibidores da biossíntese do ergosterol...9

1.5. Terapia de combinação...13

2. Objetivos...15

2.1. Objetivo geral...16

2.2. Objetivos específicos...16

3. Animais, material e métodos...17

3.1. Parasito...18

3.2. Modelo Animal...18

3.3. Fármacos...18

3.4. Infecção e Esquema de tratamento...19

3.5. Controle de cura...20

3.5.1. Exame de sangue a fresco...21

3.5.2. Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real (qPCR)...21

3.6. Mortalidade...24

3.7. Avaliação sorológica...24

3.8. Necrópsia...25

3.9. Avaliação da presença de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco...25

3.9.1. Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)...25

3.9.2. Técnica de Tricrômico de Masson...26

3.10. Análise Estatística...26

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Martins, T.A.F. Índice 4.1. Avaliação do efeito de diferentes doses de Benznidazol e Itraconazol administradas em monoterapia na evolução da infecção de camundongos infectados pela

cepa Y do Trypanosoma cruzi...29

4.2. Avaliação do efeito da terapia de combinação do Benznidazol e Itraconazol na evolução da infecção de camundongos infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi.33 4.3. Avaliação da influência da terapia de combinação nos níveis de anticorpos da classe IgG...38

4.4. Análise da influência da terapia de combinação sobre a intensidade das lesões cardíacas...39

5. Discussão...46

6. Conclusão...57

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Martins, T.A.F. Resumo

VIII

Este trabalho teve como objetivo verificar a ocorrência do efeito sinérgico da combinação de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) no tratamento da doença de Chagas experimental. Camundongos Swiss fêmeas (n=10) inoculados pela cepa Y do

Trypanosoma cruzi. foram tratados via oral, por 20 dias consecutivos, com Bz ou Itz

(100, 75, 50mg/kg/dia) em monoterapia ou em combinação nas seguintes doses: Bz/Itz = 100/100, 100/50, 75/75, 75/50, 50/100, 50/50 mg/kg/dia. A avaliação do efeito do tratamento foi realizada pelo exame de sangue a fresco (antes e após a imunossupressão com ciclofosfamida) e PCR em tempo real, utilizando amostras de sangue coletadas 30 e 180 dias após o término do tratamento. Inicialmente foi avaliado o efeito do tratamento das diferentes doses de cada composto administradas isoladamente. Apenas o tratamento realizado com Bz 100mpk foi capaz de induzir cura, que foi de 70%. No entanto, todos os animais tratados com Bz ou Itz apresentaram redução dos níveis de parasitemia em relação ao grupo controle infectado e não tratado, sendo observado um efeito anti-T. cruzi dose dependente para ambas as drogas. Foi detectada redução da parasitemia em todos os grupos de animais tratados com a combinação Bz/Itz em relação aos animais tratados com Itz 100mpk, com exceção dos animais tratados com Bz/Itz 50/100mpk, sendo importante destacar as combinações Bz/Itz 100/100, 100/50 e 75/75mpk, as quais apresentaram níveis de parasitemia inferiores aos animais tratados com Bz 100mpk. Todas as combinações induziram maiores percentuais de cura em relação às mesmas doses administradas isoladamente, sendo importante destacar novamente as combinações Bz/Itz 100/100, 100/50 e 75/75mpk com 80% de cura. Nossos resultados mostram que a combinação Bz/Itz foi eficaz em induzir semelhante nível de cura em animais infectados pela cepa Y (80%) em relação ao melhor efeito da monoterapia com Bz (70%) com utilização de dose 25% menor deste fármaco. Adicionalmente foi observado nos animais tratados com a combinação Bz/Itz nas doses 100/100, 100/50 e 75/75mpk, níveis de IgG similares aos animais tratados com Bz 100mpk aos 30 dias após o término do tratamento e redução das lesões cardíacas. Estes resultados indicam a importância de avaliar a terapia de combinação utilizando o Bz e outros compostos, inclusive aqueles que atuam na via de síntese do ergosterol.

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Martins, T.A.F. Abstract

IX

The aim of this study is to verify the occurrence of the synergistic effect of the combination of Benznidazole (Bz) and Itracolazone (Itz) in the treatment of experimental Chagas disease. Swiss female mice (n=10) inoculated with the strain Y of

Trypanosoma cruzi were treated orally, for 20 consecutive days, with Bz or Itz (100, 75,

50mg/kg/day) in monotherapy or in the combination of the following doses: Bz/Itz 100/100, 100/50, 75/75, 75/50, 50/100, 50/50 mg/kg/day. The evaluation of the treatment result was made using fresh blood (before and after the immunosuppression with Cyclophosphamide) and Real Time-PCR, using samples of blood collected 30 or 180 days after the end of the treatment. Initially it was measured the effect of the treatment in different doses of each compound administered alone. Only the treatment done with Bz 100mpk was capable of inducing the cure, which was of 70%. However, all the animals treated with Bz or Itz showed a reduction of the levels of parasitaemia when compared to the control group infected and untreated, being observed an anti-T.

cruzi effect, a dependent dose to both drugs. It was detected a reduction of parasitaemia

in all the groups of animals that were treated with the combination Bz/Itz in relation of the animals treated with Itz 100mpk, except of the ones treated with Bz/Iz 50/100mpk, being worth mention the combination of Bz/Itz 100/100, 100/50 and 75/75mpk, the ones which showed parasitaemia levels lower than the animals treated with Bz 100mpk. All the combinations induced higher percentage of cure in comparison to the same doses administered alone, being worth mention once more the combinations Bz/Itz 100/100, 100/50 and 75/75mpk with 80% of cure. The results show that the combination Bz/Itz was effective in inducing a similar level of cure in animals infected by the strain Y (80%) if compared to the best effect of the monotherapy with Bz (70%) with the use of a 25% smaller dose of this drug. Additionally, it was observed in the animals treated with the combination Bz/Itz in the doses 100/100, 100/50 and 75/75mpk, levels of IgG similar to the animals treated with Bz 100mpk to the 30 days after the end of the treatment and a reduction of cardiac injuries. These results indicates the importance of evaluating the therapy of combination using Bz and others compounds, including those acting on synthesis of esgosterol. ………

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Martins, T.A.F. Lista de Figuras e Tabelas

X

Figura 1. Estrutura química do Benznidazol……….………...18

Figura 2. Estrutura química do Itraconazol……….19

Figura 3. Representação cronológica do experimento utilizado para avaliação de cura: exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com Ciclofosfamida e da qPCR realizada no 1o e no 6o mês após o tratamento………...21 Figura 4. Percentagem de animais (n=10) inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi que apresentaram resultados positivos em pelo menos um dos testes realizados no controle de cura após o tratamento com 50, 75 e 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) por 20 dias consecutivos………....……….31 Figura 5. Log do máximo da parasitemia detectada até o 30o dia após o tratamento no

sangue periférico de camundongos (n=10) infectados pela cepa Y do Trypanosoma

cruzi e tratados com 50, 75 e 100 mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol - Bz (A) ou

Itraconazol Itz (B) por 20 dias consecutivos………32 Figura 6. Log do máximo da parasitemia detectada no sangue periférico de camundongos (n=10) que apresentaram reativação da parasitemia até 30 dias após o tratamento (antes da imunossupressão). Os animais foram inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) e com diferentes combinações destes compostos...35 Figura 7. Máximo da parasitemia detectada no sangue periférico de animais (n=10) que apresentaram reativação da parasitemia após a imunossupressão com Ciclofosfamida realizada 30 dias após o tratamento. Os animais foram inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados com Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) nas doses de 100mg/kg/dia (mpk) e com diferentes combinações destes compostos...………..36 Figura 8. Parasitismo sanguíneo detectado por qPCR 6 meses após o tratamento. Os animais foram inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma

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XI

cruzi e tratados com Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) nas doses de

100mg/kg/dia (mpk) e com diferentes combinações destes compostos………...…………...37 Figura 9. Percentagem de animais (n=10) inoculados com 5x103 tripomastigotas da

cepa Y do Trypanosoma cruzi que apresentaram resultados positivos em pelo menos um dos testes realizados no controle de cura após o tratamento com 50, 75 ou 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) em monoterapia ou em combinação………...……….38 Figura 10. Índices de reatividade de anticorpos da classe IgG, determinados através de ELISA no soro de camundongos inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados com diferentes doses de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) em combinação e com 100mg/kg/dia (mpk) de Bz ou Itz em monoterapia………...39 Figura 11. Análise morfométrica de secções do coração de camundongos curados infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi. Quantificação da inflamação no coração de camundongos não infectados e não tratados (NI), tratados com 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol em monoterapia e com diferentes doses de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) em combinação, aos 120 dias de infecção (d.i.) (A). Secções de miocárdio de camundongos não infectados e não tratados, infectados e curados tratados com Bz 100mpk, Bz/Itz 100/100mpk, Bz/Itz 100/50mpk, Bz/Itz 75/75mpk e Bz/Itz 75/50mpk, aos 120 d.i. (H&E, magnificação

x400)...41

Figura 12. Análise morfométrica de secções do coração de camundongos curados infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi. Quantificação da fibrose no coração de camundongos não infectados e não tratados (NI), tratados com 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol em monoterapia e com diferentes doses de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) em combinação, aos 120 dias de infecção (d.i.) (A). Secções de miocárdio de camundongos não infectados e não tratados, infectados e curados tratados com Bz 100mpk, Bz/Itz 100/100mpk, Bz/Itz 100/50mpk, Bz/Itz 75/75mpk e Bz/Itz 75/50mpk, aos 120 d.i. (Tricrômico de Masson, magnificação x400)...42

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XII

Figura 13. Análise morfométrica de secções do coração de camundongos não curados infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi. Quantificação da inflamação no coração de camundongos tratados com 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) em monoterapia e com diferentes doses destes compostos em combinação, aos 120 dias de infecção (d.i.) (A). Secções de miocárdio de camundongos infectados e não curados tratados com Itz 100mpk, Bz 100mpk, Bz/Itz 75/50mpk, Bz/Itz 50/100 e Bz/Itz 50/50mpk, aos 120 d.i. (H&E,

magnificação, x400)...44

Figura 14. Análise morfométrica de secções do coração de camundongos não curados infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi. Quantificação da fibrose no coração de camundongos tratados com 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol (Bz) e Itraconazol (Itz) em monoterapia e com diferentes doses destes compostos em combinação, aos 120 dias de infecção (d.i.) (A). Secções de miocárdio de camundongos infectados e não curados tratados com Itz 100mpk, Bz 100mpk, Bz/Itz 75/50mpk, Bz/Itz 50/100 e Bz/Itz 50/50mpk, aos 120 d.i. (Tricrômico de

Masson, magnificação, x400)...45

Tabela 1. Eficácia do tratamento com 50, 75 e 100mg/kg/dia (mpk) de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) na supressão ou redução da parasitemia e da mortalidade de camundongos infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi………...30

Tabela 2. Número de doses de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) administradas em monoterapia ou em combinação para a supressão da parasitemia e mortalidade de camundongos inoculados com 5x103 tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma

cruzi. Os animais foram tratados por 20 dias consecutivos com 100mg/kg/dia

(mpk) de Benznidazol (Bz) ou Itraconazol (Itz) isoladamente ou com 50, 75 e 100mpk das duas drogas em combinação………....34

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Martins, T.A.F. Lista de Abreviaturas XIII % Percentual Bz Benznidazol o C Graus Celsius Cy Ciclofosfamida d.i. Depois da infecção

DNA Ácido desoxirribonucléico DTU Discrete typing units

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

G Gramas

H&E Hematoxilina e Eosina IgG Imunoglobulina da classe G Itz Itraconazol

Kg Quilograma

LIT Liver infusion tryptose Log Logaritmo

mg Miligrama

m2 Micrômetro quadrado

µl Microlitros

mM Milimolar

Mpk Miligrama por quilograma NI Não infectado e não tratado Nfx Nifurtimox

ng Nanograma pb Pares de bases

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Martins, T.A.F. Lista de Abreviaturas

XIV

PBS Salina tamponada com fosfato

PBS-Tween Salina tamponada com fosfato acrescida de 0,05% Tween-20 PCR Reação da Polimerase em Cadeia

qPCR Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real RPM Rotações por minuto

SFB Soro fetal Bovino

T. cruzi Trypanosoma cruzi

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Martins, T.A.F. Introdução

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2 1.1. O Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909), agente etiológico da doença de Chagas, é um protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae.

Esse parasito digenético, sob condições naturais, apresenta um complexo ciclo de vida que se alterna entre diferentes hospedeiros: vertebrados de diversas ordens e invertebrados pertencentes à família Reduviidae, subfamília Triatominae. Na natureza, a doença de Chagas se mantém como uma enzootia, passando de animal a animal através do inseto vetor. Entre os reservatórios estão os vertebrados domésticos (homem, cão, gato e roedores) e silvestres (marsupiais, quirópteros, carnívoros, edentados, roedores e primatas) (Ceballos et al., 2006; Gonzalez et al., 2006).

A principal via de transmissão é a vetorial, que corresponde a 80-90% dos casos de infecção humana, ocorrendo através da penetração das formas tripomastigotas metacíclicas em mucosas íntegras ou lesões de continuidade da pele (Schofield, 1994). Ao penetrarem no hospedeiro vertebrado, as formas tripomastigotas são capazes de invadir uma grande variedade de células, onde, no citoplasma, diferenciam-se em amastigotas, aproximadamente 35h depois. Após a multiplicação, no citoplasma das células hospedeiras, as amastigotas diferenciam-se em formas tripomastigotas. Posteriormente, são liberadas por ruptura celular, podendo infectar células adjacentes, ou cair na corrente sanguínea, infectando tecidos mais distantes. Essas formas podem ser novamente ingeridas pelo triatomíneo, transformando-se em epimastigotas, e posteriormente em tripomastigotas metacíclicas, completando o ciclo biológico do parasito (Brener, 1973; De Souza, 1984; Kirchhoff, 1989; Stuart et al., 2008).

O T. cruzi pode ser também transmitido ao homem por mecanismos alternativos como surtos ocasionais de transmissão oral, transfusão sanguínea, transmissão congênita, infecção acidental de laboratório e transplante de órgãos (Dias

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3 1.2. A doença de Chagas

A doença de Chagas abrange desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e do Chile, sendo uma das denças parasitárias com maior impacto social e econômico na America Latina (Dias e Schofield, 1999; Prata, 2001). Estima-se que existam cerca de 8 a 10 milhões de indivíduos infectados pelo T. cruzi nas Américas Central e do Sul e 75 a 90 milhões expostas ao risco de contaminação (WHO, 2010).

Nos últimos anos, muitos esforços tem sido realizados no sentido de controlar a transmissão do T. cruzi (Schofield e Dias, 1991). As iniciativas dos países do Cone Sul (Brasil, Argentina, Bolívia, Chile, Paraguai e Uruguai), em 1991, e dos países Andinos (Colômbia, Equador, Peru e Venezuela), em 1997, foram imprescindíveis na redução da transmissão vetorial pelo Triatoma infestans em vários países latino-americanos, o que proporcionou um decréscimo significante na incidência da doença (Moncayo, 2003; WHO, 2002). Apesar dos avanços, são muitos os desafios para se atingir o controle da doença, devido ao desigual progresso dos programas de controle vetorial e transfusional em outras partes do continente, limitações dos métodos de diagnóstico e da quimioterapia atualmente disponível (Urbina e Docampo, 2003; Pinto Dias, 2006; Reithinger et al., 2009).

A doença de Chagas apresenta duas fases distintas, uma de curta duração, denominada de fase aguda, que pode durar de 6 a 8 semanas, seguida por uma fase de longa duração que persiste por toda a vida do indivíduo na ausência de tratamento específico. A fase aguda é caracterizada por intenso parasitismo, tanto no sangue quanto nos tecidos, sendo assintomática ou oligossintomática na maioria das vezes. Em um menor número de indivíduos, após um período de incubação de cerca de sete a dez dias, podem ser observadas as primeiras manifestações clínicas da doença. Nestes casos podem ser evidenciados a ocorrência de sinais característicos de porta de entrada (Chagoma de inoculação ou Sinal de Romaña) e sinais e sintomas inespecíficos como febre, mal-estar, astenia, cefaléia, taquicardia, linfadenopatia, esplenomegalia e edema subcutâneo (Prata, 2001). Pacientes imunossuprimidos e crianças geralmente menores de dois anos de idade podem desenvolver uma fase aguda mais grave, com o desenvolvimento de meningoencefalite e miocardite severa (Zhang e Tarleton, 1999). Na maioria dos casos de infecção aguda, o parasitismo

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diminui como resultado do desenvolvimento de uma resposta imune celular e humoral efetiva, os sinais clínicos regridem, e o indivíduo evolui, então, para a fase crônica da doença (Brener, 1987).

Na fase crônica, a maioria dos pacientes permanece assintomática caracterizando a forma indeterminada ou inaparente. Nessa fase, o indivíduo apresenta baixo parasitismo sanguíneo e tecidual, presença de anticorpos específicos anti-T.

cruzi e exames eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdome normais (Dutra et al., 2005; Prata, 2001; Rossi e Bestetti, 1995). A forma indeterminada é a mais

frequente sendo encontrada em aproximadamente 60% a 70% dos indivíduos infectados (Coura, 2007). Contudo, cerca de 30% a 40% evoluem para as formas sintomáticas cardíaca e/ou digestiva da doença, em um período variável de 10 a 30 anos (Andrade, 1958; Prata, 2001).

A forma cardíaca é a manifestação mais comum, sendo a maior causa de morbidade da doença de Chagas crônica entre pacientes de 20-50 anos. Estes podem apresentar prognósticos e evolução variáveis, desde arritmias a sintomas de insuficiência cardíaca compensada ou descompensada resultando, muitas vezes, na morte súbita do paciente (Coura et al., 1983; Dias, 1992). Aproximadamente 10% dos indivíduos desenvolvem a forma digestiva, apresentando dilatações e alterações funcionais principalmente no esôfago e no cólon, resultantes da destruição das células nervosas do sistema entérico e da fibrose que se instala nesses órgãos (Tafuri, 1970; Tafuri, 1987; Dias, 1992). A forma crônica mista da doença é caracterizada pela ocorrência concomitante das manifestações cardíacas e digestivas (Prata, 2001).

Tanto fatores inerentes ao parasito, como a cepa e o tropismo tecidual, a carga parasitária, a virulência e a antigenicidade, bem como fatores inerentes ao hospedeiro como características genéticas e o perfil da resposta imune tem sido sugeridos como determinantes da evolução dos pacientes assintomáticos para as diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica (Dias, 2000; Andrade e Zicker, 1995).

Desde a descoberta da doença de Chagas, os processos patológicos gerados têm sido associados à presença de infiltrados inflamatórios focais ou difusos, acompanhados de necrose ou fibrose, destruição de células não parasitadas e escassez ou ausência do parasito, sugerindo o envolvimento de reações de hipersensibilidade (Vianna, 1911; Chagas, 1934; Higuchi et al., 1993a; Higuchi et al., 1997). Embora o

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papel do T. cruzi na patogênese da fase aguda da doença de Chagas e a importância do tratamento etiológico nesta fase sejam bem aceitos (Kirchhoff, 1993; Brener e Gazzinelli, 1997; Bahia-Oliveira, 2000), a participação do parasito na fase crônica tem sido alvo de controvérsias (Cunha-Neto et al., 1995; Kalil e Cunha-Neto, 1996; Tarleton e Zhang, 1999; Tarleton, 2001; Tarleton, 2003).

O escasso parasitismo contrastando com a severidade das lesões encontradas em grande número de pacientes chagásicos durante a fase crônica, o prolongado período latente que precede a morbidade e a intrigante existência de diferentes formas clínicas levou a postulação de teorias auto-imunes para explicar a patologia da doença de Chagas crônica. Algumas hipóteses têm sido sugeridas para explicar o processo de formação das lesões resultantes de reações auto-imunes, como por exemplo, o envolvimento de auto-anticorpos ou linfócitos T auto-reativos derivados do mimetismo molecular entre epítopos antigênicos do parasito e do hospedeiro, ou a ativação bystander, com a ausência de envolvimento direto de antígenos do T. cruzi e participação ativa de antígenos provenientes de lesões teciduais do hospedeiro (Anselmi et al., 1966; Cossio et al., 1974; Teixeira et al., 1978; Leon et al., 2001; Kierszenbaum, 1999).

Contudo, a utilização de técnicas mais sensíveis como a imunohistoquímica e a reação em cadeia da polimerase (PCR), permitiram demonstrar associação da presença do T. cruzi com o desenvolvimento das lesões cardíacas e digestivas (Vago et al., 2000; Schijman et al., 2004; Benvenuti et al., 2008). Dessa forma, tem sido resgatada a importância da participação do parasito como estimulador de processos envolvidos na gênese das lesões da fase crônica da doença de Chagas (Tarlenton, 2003).

1.3. Quimioterapia da doença de Chagas

Desde a descoberta da doença pelo médico sanitarista Carlos Chagas, em 1909, até os dias atuais, inúmeras tentativas de tratamento foram realizadas, sem obter, no entanto, um medicamento totalmente eficaz tanto na fase aguda como crônica.

A história da quimioterapia da doença de Chagas pode ser dividida em três fases principais (de Castro, 1993; Rodriques e de Castro, 2002). A primeira

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compreende o estágio inicial da descoberta da doença, de 1909 até 1935, e é marcada pela morte de Carlos Chagas (em novembro de 1934) e pelo lançamento do “Manual de Doenças Tropicais e Infectuosas” (em 1935), escrito por Carlos Chagas em co-autoria com seu filho Evandro Chagas. A segunda fase, no período de 1936 a 1960, corresponde à avaliação biológica de inúmeras substâncias químicas, extratos e misturas de componentes, sendo marcada por resultados controversos e de significado clínico questionável (Dias e Dessoy, 2009). A última fase, a partir de 1961, é caracterizada por estudos que demonstram claramente, através de modelos experimentais de infecção com o T. cruzi em camundongos, a eficácia de alguns compostos como, por exemplo, a nitrofurazona (de Castro, 1993; Dias e Dessoy, 2009).

No fim da década de 60 e início da década de 70 dois fármacos obtiveram relativo sucesso para o tratamento da doença de Chagas: o Nifurtimox (Nfx) e o Benznidazol (Bz). Estes medicamentos foram disponibilizados clinicamente em 1967 pela Bayer (Nifurtimox, Lampit®) e em 1972 pela Roche (Benznidazol, Rochagan® ou Radamil®) (Pérez-Molina et al., 2009), permanecendo como a única estratégia terapêutica disponível até a presente data (Coura e Castro, 2002; Dias, 2006).

O mecanismo de ação do Nfx envolve a redução do grupo nitro em radicais nitroaniônicos instáveis que produzem metabólitos oxigenados reduzidos altamente tóxicos, como ânions superóxidos e peróxido de hidrogênio (Docampo, 1990). O Bz também age através de estresse redutivo, o qual envolve reações covalentes de macromoléculas pela nitrorredução de radicais intermediários e vários componentes celulares, como RNA, lipídeos e proteínas do T. cruzi (Diaz de Toranzo et al., 1988; Docampo, 1990). Ambas as drogas atuam sobre o genoma do parasito e inibem a síntese de DNA, RNA e proteínas além de acelerarem a degradação dessas macromoléculas. O menor potencial de atividade detoxificante do parasito contra os radicais livres formados o faz mais susceptível a tais intermediários oxigenados que as células dos vertebrados (Stoppani, 1999).

Os metabólitos formados através do mecanismo de ação do Nfx e do Bz podem atuar também em outros sistemas, especialmente do hospedeiro (humano), devido a sua alta reatividade. Esta baixa especificidade de ação em vias bioquímicas definidas do parasito contribui para os efeitos citotóxicos observados no tratamento

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7

dos pacientes. Os efeitos mais comuns para o Nfx são perda de peso, sonolência, além de algumas manifestações digestivas, tais como náuseas, vômitos e cólicas intestinais. Já para o Bz, os efeitos colaterais mais frequentes podem ser agrupados de três formas: (1) manifestações de hipersensibilidade, como dermatite com erupção cutânea (usualmente entre o 7o e 10o dia de tratamento), edema periorbital ou generalizado, febre, linfadenopatia, dores musculares e articulares, (2) depressão da medula óssea, incluindo neutropenia, agranulocitose e púrpura trombocitopênica; e (3) polineuropatia periférica, representada por parestesias e polineurite (Castro et al., 2006). A incidência de tais efeitos colaterais é variável dependendo da idade do indivíduo infectado, área geográfica e a qualidade da supervisão clínica do tratamento (Coura e Castro, 2002). Geralmente, crianças e adultos jovens apresentam menos reações adversas, tolerando melhor o tratamento (Cançado, 2002).

Diversos ensaios clínicos utilizando o Bz e o Nfx demonstraram variações da eficácia terapêutica de acordo com a fase da doença, a dose e o tempo do tratamento, idade e origem geográfica do paciente, bem como a metodologia utilizada para verificação da cura. Os resultados indicam claramente que quanto mais rápido o diagnóstico é definido e o tratamento iniciado, maior a chance de sucesso terapêutico (Guedes et al., 2006).

Na terapêutica da doença de Chagas congênita, o tratamento com Bz ou Nfx foi capaz de induzir um índice de cura de 93,8 a 100% em crianças com idade entre 0 e 6 meses (Russomando et al., 1998; Burgos et al., 2009), 66,7 a 90,09% em crianças entre 7 a 24 meses (Schijman et al., 2003; Chippaux et al., 2010) e 12,5% em crianças entre 3 a 15 anos de idade (Schijman et al., 2003). Estes resultados reforçam a importância do tratamento precoce e a necessidade do acompanhamento de todas as mulheres grávidas e crianças de áreas endêmicas com o propósito de diminuir ou eliminar o risco de progressão da doença e complicações tardias (Freilij e Altcheh, 1995).

Ensaios clínicos com Bz ou Nfx realizados durante a fase aguda pós-natal da infecção indicaram taxas de cura parasitológica entre 66,7 e 76%, (Shikanai-Yasuda et

al., 1990; Andrade et al., 1992; Bahia–Oliveira et al. ,2000; Cançado, 2002). Estudos

também mostraram evidências de sucesso na quimioterapia com Bz na fase crônica recente da doença. 62,2% a 93,3% de cura parasitológica foi obtida em crianças de 0 a

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8

14 anos no Brasil, Argentina e Honduras (Andrade et al., 2004; Sosa Estani et al., 1998; Sosa Estani e Segura, 1999; Streiger et al., 2004; Escriba et al., 2009). No entanto, Silveira et al. (2000) observaram apenas 8,3% de cura em pacientes de 7 a 12 anos. Durante a avaliação clínica longitudinal (8 a 20 anos) foi observada evolução clínica para as formas cardíacas ou digestivas da doença em 4 (33,3%) dos pacientes tratados. Yun et al. (2009) demonstraram que o tratamento realizado com Bz em crianças e adolescentes menores de 18 anos, provenientes de diferentes regiões geográficas induziu níveis de curas variáveis. Após 18 meses, foi observada a soroconversão negativa em 87,1%, 58,1% e 0% dos pacientes de Honduras, Guatemala e na região de Sucre na Bolívia, respectivamente. Na região de Entre Rios na Bolívia, após 60 meses, foi observada sorologia negativa em apenas 5,4% dos pacientes. As diferentes respostas ao tratamento podem ser justificadas pelas diferenças genéticas entre as populações de parasitos e de hospedeiros presentes nas distintas regiões geográficas (Andrade et al., 1992).

Vários ensaios clínicos têm demonstrado que o tratamento com Nfx ou Bz apresenta pequena ou nenhuma atividade quando realizado na fase crônica tardia da doença, com índices de cura variando entre 0% e 19,1% (Lana et al., 2009; Viotti et

al., 1994; Lauria-Pires et al., 2000; Ferreira, 1990; Fabbro et al., 2000; Braga et al.,

2000; Ferreira et al., 2002; Fernandes et al., 2009). Considerando o risco de falha cardíaca e morte durante a fase crônica, o tratamento com drogas tripanocidas pode ser importante na prevenção e na progressão de lesões severas no miocárdio. No entanto, a eficácia do tratamento com Bz ou Nfx na prevenção do desenvolvimento da doença de Chagas crônica ainda é controverso. O projeto BENEFIT, Benznidazole

Evaluation for Interrupting Trypanosomiais, atualmente em andamento, constitui um

amplo ensaio clínico com o objetivo de melhor avaliar os efeitos do tratamento com benznidazol em indivíduos com cardiopatia chagásica crônica (Marin-Neto et al., 2009).

As razões para as diferenças marcantes no efeito antiparasitário desses compostos nas fases aguda e crônica da doença ainda não estão claras, mas podem estar relacionadas com as propriedades farmacocinéticas, como tempo de meia-vida terminal relativamente curto e penetração limitada nos tecidos (Raaflaub, 1980; Raaflaub e Ziegler, 1979; Workman et al., 1984), a qual limitaria sua ação na fase

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crônica da doença, quando os parasitos estão, em sua maioria, confinados nos tecidos e em lenta replicação (Urbina, 1999; Urbina e Docampo, 2003). Outros fatores associados à limitação da terapêutica seriam a grande variabilidade genética das populações de parasitos (Brener e Chiari, 1967) e a existência de cepas naturalmente resistentes às drogas (Filardi e Brener, 1987), o que pode estar relacionado à origem geográfica das mesmas (Murta et al., 1998). Além disso, verificar com eficácia a cura parasitológica em indivíduos tratados durante a fase crônica, quando os níveis de parasitos circulantes encontram-se extremamente baixos ou indetectáveis, permanece um problema desafiador, mesmo com a utilização de testes mais sensíveis como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Martins et al., 2008).

De acordo com a importância da presença do parasito na gênese das lesões durante a fase crônica da doença de Chagas, a administração terapêutica pode diminuir a carga parasitária em tecidos infectados, e dessa forma reduzir a severidade dos processos inflamatórios (Tarleton, 2001). Contudo, os baixos índices de cura detectados na fase crônica, associados aos efeitos adversos induzidos pelo tratamento com os nitrofuranos (Nfx) e nitroimidazoles (Bz), fazem ainda com que muitos clínicos permaneçam com forte resistência ao tratamento de indivíduos chagásicos crônicos (Urbina e Docampo, 2003).

Dadas as limitações significativas das drogas disponíveis atualmente, particulamente para a doença crônica, a identificação de novos alvos e/ou estratégias terapêuticas alternativas para o tratamento da doença de Chagas são necessárias (Urbina, 2009a).

1.4. Inibidores da biossíntese do ergosterol

A busca por uma terapia medicamentosa adequada ao tratamento da doença de Chagas continua a ser um desafio para muitos pesquisadores desde a descoberta da moléstia em 1909.

O desenvolvimento de uma droga antiparasitária pode surgir através de experimentos com produtos naturais ou sintéticos que tenham similaridade com compostos com reconhecida atividade para outras doenças ou através da determinação de alvos metabólicos específicos para um determinado parasito que se quer atingir

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(Coura e Castro, 2002). A busca por alvos mais específicos se baseia em diferenças fisiológicas, bioquímicas e moleculares entre o parasito e o hospedeiro. Estudos recentes sobre a bioquímica básica de T. cruzi permitiram a identificação de novos alvos para a quimioterapia, que incluem os inibidores ou substratos da biossíntese da via de salvação de purinas, inibidores de cisteíno proteases, inibidores do metabolismo de pirofosfatases e inibidores da biossíntese de ergosterol, entre outros (Urbina, 2009b).

Aparentemente, os inibidores da biossíntese de ergosterol são os candidatos mais promissores para novos tratamentos da doença de Chagas (Urbina, 2009b). Nos últimos anos, esses compostos provaram ser altamente eficientes contra a proliferação de eucariotos, tais como fungos, leveduras e protozoários (Lazardi et al., 1990). A composição de esteróis no T. cruzi é similar àquela encontrada em fungos, sendo o ergosterol e os esteróis tipo-ergosterol os principais componentes da membrana desse parasito (Furlong, 1989). O ergosterol é uma substância fundamental para o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência do T. cruzi, além de ser importante para sua proliferação in vitro. Por essa razão, é um alvo potencial para a pesquisa de quimioterápicos (Urbina, 1999).

A atividade anti-T. cruzi de quatro classes de inibidores da biossíntese de ergosterol foram testadas em experimentos realizados in vitro ou in vivo: inibidores da esqualeno sintase, inibidores da esqualeno epoxidase, inibidores da oxidoesqualeno sintase e os inibidores da C14- dimetilase. O que diferencia essas classes de compostos é o ponto de inibição na via de síntese do ergosterol.

A biossíntese de ergosterol e do colesterol seguem etapas comuns até a formação do lanosterol. As etapas seguintes seguem vias metabólicas exclusivas, envolvendo a produção de compostos distintos e a participação de enzimas específicas. Diferentemente dos inibidores da C14- dimetilase, as demais classes, por atuarem antes da formação do lanosterol, induzem maiores danos às células hospedeiras.

Os compostos mais importantes desse grupo são os derivados azólicos, incluindo os imidazóis e os triazóis. O mecanismo de ação dessas substâncias envolve a inibição da enzima lanosterol 14α-desmetilase dependente do citocromo P450 causando o acúmulo de 14α-metilesterol e a diminuição da produção de ergosterol

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(Joseph-Horne e Hollomon, 1997; White et al., 1998). A depleção deste esterol, em particular, leva a alterações irreversíveis da membrana plasmática e do complexo cinetoplasto-mitocôndria (Lazardi et al., 1990; Urbina et al., 1988a; Urbina et al., 1988b). Por agirem exclusivamente na via de síntese do ergosterol em fungos e no T.

cruzi, não afetam a síntese de outros esteróis, como o colesterol, em mamíferos.

Deste modo, sugere-se que induzam menos danos às células hospedeiras e, consequentemente, são esperadas menores reações adversas provocadas pelo tratamento.

Vários estudos têm mostrado que inibidores da biossíntese de ergosterol comercialmente disponíveis para o tratamento de doenças fúngicas, como o Cetoconazol, Itraconazol ou Terbinafina, apresentam atividade anti- T. cruzi tanto in

vitro quanto in vivo. Em camundongos infectados com várias cepas e tratados na fase

aguda, os níveis de cura variaram de 0% a 100%. Estudos no Brasil demonstraram que o Cetoconazol ou Itraconazol não são eficazes em curar a infecção crônica em camundongos e pacientes, nem mesmo interromper a progressão da doença (Brener et

al., 1993; McCabe, 1988; Moreira et al., 1992; Urbina, 2002). Apt et al. (1998) e

Zulantay et al. (1998) descreveram taxas de cura em 53% e 61,61% dos pacientes tratados com Itraconazol, na fase crônica da infecção, em áreas endêmicas do Chile. Seis anos após o tratamento, os mesmos autores, utilizando PCR e ensaio de hibridização mostraram 60% de positividade nos indivíduos xenodiagnóstico negativos (Zulantay et al., 2004). No entando, após nove anos de acompanhamento, foi demonstrado que o tratamento foi capaz de prevenir a cardiopatia e o desenvolvimento de alterações eletrocardiográficas (Apt et al., 2003).

Nos últimos 15 anos, novos derivados triazólicos, tais como o composto D0870 (Zeneca Pharmaceuticals) e o Pozaconazol (SCH 56592; Schering-Plough

Research Institute), foram capazes de induzir cura parasitológica em modelos

murinos, tanto na fase aguda como crônica da infecção. Estes foram os primeiros compostos relatados a terem atividade curativa em ambas as fases da doença, além de exibirem atividade contra cepas resistentes ao Bz e ao Nfx, mesmo na presença de imunossupressão (Urbina et al., 1996; Urbina et al., 1998; Urbina, 2002; Urbina e Docampo, 2003). Está previsto um estudo clínico de fase II com o Pozaconazol na Espanha, financiado pela Merck & Co (Buckner e Navabi., 2010). Entretanto, o

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desenvolvimento D0870 foi descontinuado, devido à variação do tempo da meia-vida da droga no modelo murino e sua elevada toxicidade (Liendo et al.,1998).

A notável atividade antiparasitária dessas substâncias resulta da potente e seletiva atividade intrínseca anti-T. cruzi (as concentrações inibitórias contra formas amastigotas intracelulares são da escala nanomolar a subnanomolar), aliada ainda às propriedades farmacocinéticas favoráveis como o longo tempo de meia-vida e o largo volume de distribuição (Urbina 1999, 2002; Urbina e Docampo, 2003).

Outros triazóis, tais como TAK-187 (Takeda Chemical Company) (Urbina et

al. 2003c, Corrales et al. 2005), UR-9825 (Uriach & Company) (Urbina et al. 2000,

Guedes et al. 2004) e Ravuconazol (ER-30346, Eisai Co.; BMS 207,147;

Bristol-Myers Squibb) (Urbina et al. 2003b) também apresentam atividade tripanocida in vitro

e in vivo.

A TAK-187, como os outros derivados azólicos descritos anteriormente, apresenta propriedades farmacocinéticas importantes, como longa meia-vida e grande volume de distribuição no organismo. Sua atividade induziu 60-100% de cura na fase aguda e 56% na fase crônica, em camundongos infectados com diferentes cepas do T.

cruzi, incluindo cepas resistentes ao Bz e Nfx (Molina et al., 2000a). Ademais, foi

demonstrada, ação superior ao Bz na diminuição da progressão das lesões cardíacas em modelo murino (Corrales et al., 2005).

A droga UR-9825, conhecida como Albaconazol apresenta atividade tripanocida, in vitro, comparável aos mais potentes EBI testados, o Pozaconazol. Apesar do tempo de meia-vida desse fármaco em camundongos ser muito baixo, impedindo o estudo neste modelo animal, no modelo canino foi verificada a supressão da parasitemia e a cura em 100% dos animais infectados com a cepa Y do T. cruzi, enquanto a cepa Berenice-78 foi resistente à droga. Entretanto, o composto ainda é uma possível abordagem terapêutica para a doença de Chagas humana devido ao seu tempo de meia vida de 120h, além de ser bem tolerado em esquemas prolongados de tratamento (60-150 dias), com mínima toxicidade (Guedes et al., 2004; Urbina et al., 2000).

O Ravuconazol também exibiu elevada atividade anti-T cruzi in vitro, principalmente contra as amastigotas intracelulares. Apesar de sua limitada atividade

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13

70% de cura parasitológica e 100% de sobrevivência em camundongos infectados com a cepa Y do T. cruzi (Urbina et al., 2003). No modelo canino, o Ravuconazol apresentou efeito supressor da parasitemia e preveniu as lesões cardíacas características da fase crônica da infecção, mas não foi eficaz em induzir cura parasitológica nos animais infectados com as cepas Y e Berenice-78 do T. cruzi (Diniz

et al., 2010). A Iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi-

Genebra, Suiça) está coordenando um estudo clínico na Bolívia do E1224, uma pró-droga do Ravuconazol, em parceria com a Plataforma de Chagas de Cochabamba.

Apesar da potente atividade contra o T. cruzi dos inibidores da biossíntese do ergosterol e da ausência de resistência cruzada com as drogas utilizadas correntemente, a resposta ao tratamento é extremamente variável entre diferentes cepas do parasito (Guedes et al., 2004, Toledo et al., 2003, Molina et al., 2000, Diniz

et al., 2010). Além disso, mesmo alguns compostos como o Posaconazol e o E1224,

uma pró-droga do Ravuconazol já estarem em estudos clínicos o alto custo e a complexidade de produção são fatores limitantes na utilização desses compostos no tratamento humano (Urbina, 2009).

1.5. Terapia de combinação

Fármacos para o tratamento da doença de Chagas não são do interesse das indústrias farmacêuticas, estando na raiz do problema o elevado custo dos investimentos e a falta de um mercado potencial e seguro nos países em desenvolvimento. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos foi para tratar alguma doença negligenciada (Chirac e Torreele, 2006).

Como as perspectivas para a introdução de novos compostos pela indústria farmacêutica são pobres, uma estratégia alternativa, envolve a identificação de candidatos entre os medicamentos já disponíveis no mercado que poderiam ser usados em combinação para fornecer um efeito sinérgico. Essa estratégia pode ajudar a evitar os gastos financeiros e tempo consumido em pesquisas direcionadas à toxicidade e à biodisponibilidade dos fármacos (Dias e Dessoy, 2009).

A terapia combinada pode ser uma valiosa alternativa para melhoria da eficácia terapêutica, uma vez que: (i) permite o uso de pelo menos dois compostos que

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14

podem atuar sobre diferentes elementos celulares e vias metabólicas; (ii) pode reduzir as concentrações das drogas e o número de doses, contribuindo assim para a diminuição dos efeitos tóxicos; (iii) pode minimizar o risco de resistência às drogas. (Vivas et al., 2008).

Derivados azólicos utilizados em combinação com inibidores da biossíntese de ergosterol que atuam em outros pontos da via de biossíntese do ergosterol conduziram a um efeito sinérgico anti-T. cruzi (Lazardi et al., 1990, Maldonado et al., 1993). Recentemente, Benaim et al. (2006) mostraram que a atividade anti-T. cruzi do composto antiarrítimico Amiodarona é potencializado pelo Posaconazol. Derivados azólicos também mostram efeito sinérgico com o Bz: Araújo et al. (2000) demonstraram que a combinação do Bz com Cetoconazol induz um efeito sinérgico na quimioterapia experimental da doença de Chagas.

Estes resultados enfatizam a importância de identificar esses compostos que estão disponíveis comercialmente, como o Itraconazol, para explorar o seu potencial em combinação para o tratamento específico da doença de Chagas.

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Martins, T.A.F. Objetivos

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Martins, T.A.F. Objetivos

16 2.1. Objetivo geral

Verificar a ocorrência do efeito sinérgico da terapia de combinação do Benznidazol e Itraconazol na fase aguda da infecção experimental pela cepa Y do T.

cruzi usando camundongos como modelo experimental.

2.2. Objetivos específicos

1. Avaliar o efeito do tratamento de camundongos infectados pela cepa Y do T.

cruzi em diferentes doses de cada composto para verificar a ocorrência do efeito dose-

dependente.

2. Avaliar o efeito da terapia de combinação do Itraconazol e Benznidazol na evolução da infecção de camundongos infectados pela cepa Y do T. cruzi, avaliando os seguintes parâmetros: parasitemia, mortalidade e cura parasitológica.

3. Verificar a ocorrência do efeito sinérgico do tratamento pela comparação dos resultados da terapia combinada em relação à monoterapia.

4. Avaliar o efeito das combinações na resposta imune humoral, através da dosagem dos níveis de anticorpos IgG detectados no soro dos animais.

5. Avaliar o efeito das combinações na evolução das lesões cardíacas, através da quantificação do infiltrado inflamatório e da fibrose.

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Martins, T.A.F. Animais, Material e Métodos

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18 3.1. Parasito

Foi utilizada a cepa Y do T. cruzi - DTUII (Zingales et al., 2009). Isolada de um paciente na fase aguda da doença de Chagas por Pereira de Freitas, em 1950, em Marília, São Paulo e posteriormente estudada e descrita por Silva e Nussenzweig (1953). Esta cepa é considerada parcialmente resistente ao tratamento com Bz (Filardi e Brener, 1987).

3.2. Modelo Animal

Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas, com idade entre 28 a 30 dias, pesando entre 18 e 22 g. Os animais foram fornecidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os experimentos e protocolos experimentais foram conduzidos de acordo as diretrizes para o uso de animais em pesquisa do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFOP (número 2009/17).

3.3. Fármacos

A estrutura química dos fármacos utilizados para o tratamento dos animais, isoladamente ou em combinação estão mostradas nas figuras 1 e 2.

Figura 1 - Benznidazol (Bz): N-benzyl-2-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)acetamida (Rochagan®, Roche). .

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19

Figura 2 – Itraconazol (Itz): 4-(4-(4-(4-((2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol- 1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy)phenyl)-1-piperazinyl)phenyl)-2,4-dihydro-2-(1-methylpropyl) (Brainfarma).

3.4. Infecção e Esquema de Tratamento

Os animais foram inoculados intraperitonealmente com 5 x 103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y. Os animais infectados foram divididos em grupos de 10 animais, os quais foram tratados com diferentes doses de Bz e Itz em monoterapia e com diferentes combinações destes compostos. Os fármacos foram suspensos em água destilada utilizando-se 4% metilcelulose (Sigma®) e cada animal recebeu, de acordo com seu peso corporal, a suspensão da droga por gavagem.

Os grupos experimentais utilizados para a avaliação da monoterapia foram:

i. 50 mg de Bz por quilo de peso ii. 75 mg de Bz por quilo de peso iii. 100 mg de Bz por quilo de peso

iv. 50 mg de Itz por quilo de peso v. 75 mg de Itz por quilo de peso vi. 100 mg de Itz por quilo de peso

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Os grupos experimentais utilizados para a avaliação do efeito da terapia combinada foram:

vii. 100 mg de Bz por quilo de peso + 100 mg de Itz por quilo de peso

viii. 100 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso ix. 75 mg de Bz por quilo de peso + 75 mg de Itz por quilo de peso

x. 75 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso xi. 50 mg de Bz por quilo de peso + 100 mg de Itz por quilo de peso

xii. 50 mg de Bz por quilo de peso + 50 mg de Itz por quilo de peso

O tratamento foi iniciado imediatamente após a detecção de parasitemia patente (quatro dias após a inoculação dos animais). O tratamento foi administrado por 20 dias consecutivos para todos os grupos. Foram utilizados como grupos controle animais não infectados e não tratados (n=5) e infectados e não tratados (n=10).

3.5. Controle de cura

A cura parasitológica foi determinada de acordo com a metodologia padronizada por Caldas et al. (2008) baseada em 2 testes independentes: exame de sangue a fresco antes e após imunossupressão com Ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha), seguida pelo teste de PCR em tempo real (qPCR) realizado no 1o e no 6o mês após o tratamento no sangue de camundongos com resultados negativos no exame de sangue a fresco. Os animais foram considerados curados quando apresentaram resultados negativos em todos os testes realizados. A parasitemia foi avaliada durante e até 30 dias após o tratamento para detectar a ocorrência da supressão e da reativação natural da parasitemia após o término do tratamento (Exame de Sangue a Fresco). Os animais que não apresentaram a reativação da parasitemia após a tratamento foram submetidos a 3 ciclos de 50mpk de Ciclofosfamida (Cy), sendo cada ciclo de 4 dias consecutivos, com intervalo de 3 dias entre cada. A parasitemia foi avaliada diariamente durante a imunossupressão e até 10 dias após seu fim (Figura 3).

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21

Figura 3 - Representação cronológica do experimento utilizado para avaliação de cura: exame de sangue a fresco antes e após a imunossupressão com Ciclofosfamida e da qPCR realizada no 1o e no 6o mês após o tratamento

3.5.1. Exame de sangue fresco

O exame de sangue a fresco foi realizado no sangue coletado da veia caudal dos camundongos. A quantificação dos parasitos foi realizada segundo a técnica descrita por Brener (1962).

3.5.2. Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real (qPCR)

Para a realização da qPCR, foram coletados aproximadamente 200 µL de sangue pelo plexo venoso retro-orbital dos animais e adicionados a 35 μL de solução de citrato de sódio com concentração de 129mM. O material coletado permanecia armazenado a 4-8ºC até o momento da extração, realizada no mesmo dia. Foi realizada a quantificação da carga parasitária das amostras coletadas no 6o mês após o tratamento. A seguir, encontra-se a descrição sucinta de cada etapa desta reação:

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22

i ) Extração do DNA

A extração de DNA genômico do sangue total dos animais infectados pelo T.

cruzi foi realizada utilizando-se o kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega. Foram transferidos 200 μL do sangue coletado de cada animal infectado

para microtubos de 1,5 mL contendo 600 μL de Cell Lysis Solution. O conteúdo dos tubos foi homogeneizado por inversão (5-6 vezes) e mantido a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida os microtubos foram centrifugados por 20 segundos a 13.000 x g e o sobrenadante removido, restando apenas 10-20 μL de líquido residual, os quais foram levados ao vórtex por 15 segundos, para a ressuspensão das células brancas do sangue. Posteriormente foram adicionados 200 μL de solução de lise nucléica aos microtubos, os quais foram incubados por 45 minutos em banho-maria a 37 oC. Ao atingir a temperatura ambiente, foram adicionados 67 μL da solução de precipitação protéica aos microtubos que foram homogeneizados em vórtex por 15 segundos e centrifugados por 3 minutos a 13.000 x g. O sobrenadante de cada amostra, contendo o DNA, foi transferido para um microtubo de 0,6 mL, contendo 200 μL de isopropanol. Os microtubos foram invertidos várias vezes para a precipitação do DNA e centrifugados por 1 minuto a 13.000 x g. O sobrenadante foi descartado e foram adicionados 300 μL de etanol 70% seguido de centrifugação por 1 minuto a 13.000 x g. Após o descarte do sobrenadante, o microtubo foi invertido sobre papel absorvente para secagem por 20 minutos, sendo o DNA reidratado em seguida com 67 μL da solução de reidratação e incubado a 4o

C por 48 horas.

ii) Quantificação do DNA e geração da curva padrão da qPCR

Os ácidos nucléicos extraídos foram quantificados pelo espectrofotômetro

NanoVue PlusTM (GE Healthcare) e as concentrações de DNA ajustadas para 25

ng/µL. A curva padrão foi gerada com 5 diluições seriadas em água do DNA proveniente do padrão sanguíneo contendo 5 x 106 parasitos/0,1 mL de sangue. O termo “padrão sanguíneo” refere- se ao DNA extraído de padronizadas quantidades de sangue proveniente de camundongos saudáveis acrescidos de quantidades conhecidas de parasitos.

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iii) Amplificação do DNA

Para cada amostra, analisada em duplicata, a reação de PCR continha 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,35 μM de oligonucleotídeos iniciadores específicos para a repetição de 195 pares de bases (pb) do DNA do T. cruzi, TCZ-F GCTCTTGCCCACAMGGGTGC-3’, onde M = A ou C (Invitrogen), e TCZ-R 5’-CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3’, (Moser et al., 1989, modificado por Cummings e Tarleton, 2003) o qual amplifica um produto de 182 pb, 5 μL de

Sybr®Green PCR Mastermix, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10

μL. Separadamente, para cada amostra era também realizada uma reação em duplicata para dosar o TNF-α, utilizado como controle endógeno normalizador contendo 2 μL de DNA genômico (50 ng), 0,50 μM de oligonucleotídeos iniciadores TNF-5241

5’-TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA-3’ e TNF-5411 5’-CAGCA

AGCATCTATGCACTTAGACCCC-3’ (Cummings e Tarleton, 2003), o qual amplifica um produto de 170 pb, 5 μL de “Sybr® Green PCR Mastermix”, e água

Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. As reações foram distribuídas em

placas de 96 poços (Fast 96-Well Reaction Plate, 0,1 mL, MicroAmp™) e levadas ao termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems). O programa de termociclagem consistia de aquecimento a 95o C por 10 minutos, 40 ciclos de 94o C por 15 segundos e 64,3o C por 1 minuto, com aquisição da fluorescência a 64,3o C. A amplificação foi imediatamente seguida por um estágio de dissociação em que há uma desnaturação inicial a 95o C por 15 segundos, resfriamento a 60o C por 1 minuto e aumento gradual de temperatura de 0,3o C/s até 95o C. Cada placa continha um controle negativo da extração (proveniente de camundongo normal) em duplicata, e um controle negativo da PCR, em duplicata, com água no lugar de DNA, para a reação com oligonucleotídeos iniciadores do T. cruzi e do TNF-α. A média dos valores obtidos para o T. cruzi foi normalizada pela sua divisão com a média dos valores obtidos para o TNF-α, após a mensuração por sobreposição às curvas padrão de T. cruzi e TNF-α. As eficiências de amplificação foram determinadas pela fórmula: Eficiência (E) = 10(−1/slope), onde slope corresponde à inclinação da curva padrão (Stordeur et al., 2002).

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24 3.6. Mortalidade

A taxa de mortalidade foi calculada contando-se todos os animais que morreram durante o período de 30 dias após o término do tratamento. Os resultados foram expressos em percentagens.

3.7. Avaliação sorológica

Foram coletados aproximadamente 500µL de sangue não heparinizado do seio venoso retro-orbital dos camundongos e transferido para tubos eppendorf de 1,5mL, sendo estes centrifugados a 3500rpm por 10 minutos. Os soros foram armazenados em novos tubos e estocados a -80°C. A coleta foi realizada no 30o dia após o fim do tratamento.

Foram utilizados antígenos da forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi, obtidos de cultivo acelular em meio LIT. Como conjugado foram utilizadas anti-imunoglobulinas de camundongo IgG marcadas com peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery, USA).

O ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) foi realizado segundo a metodologia descrita por Voller et al., (1976), modificada de acordo com o protocolo descrito a seguir. O teste foi executado em placas de poliestireno com 96 poços de fundo chato. Cada poço da placa foi tratado com extrato antigênico de epimastigotas, na concentração definida previamente por titulação em bloco, diluído em solução tampão carbonato. As placas foram incubadas a 4oC por 18h e após este intervalo de tempo foram bloqueadas com PBS + SFB e incubadas a 37ºC. A próxima etapa consistiu na adição de soro de cada animal, e incubação a 37ºC.

Posteriormente foi adicionado o conjugado, diluído em PBS-Tween, conforme titulação prévia, e as placas foram novamente incubadas a 37ºC. Finalmente, foi adicionada a solução de substrato (O-fenilenodiamino-OPD, solução de ácido cítrico e H202) e posteriormente a reação foi interrompida com a adição de ácido sulfúrico. A leitura foi realizada em leitor de microplaca (BIO RAD, Modelo 3550) com filtro de 490nm. Em cada placa foram adicionados 10 soros controles negativos e quatro controles positivos. A absorbância discriminante, em cada placa, foi calculada

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se a média da absorbância dos 10 soros negativos somados a dois desvios padrões. Posteriormente foi calculado o índice de reatividade, dividindo o valor da absorbância de cada amostra encontrada pela absorbância discriminante, sendo os valores encontrados entre 0.9 e 1.1 considerados duvidosos, valores abaixo de 0.9, negativos e acima de 1.1, considerados positivos.

3.8. Necrópsia

Os animais foram necropsiados seis meses após o término do tratamento. A eutanásia foi realizada através do deslocamento cervical, e posteriormente foi realizada uma incisão ventral, para a retirada do coração. Os corações destes animais foram coletados, conservados em gelo e fixados em solução tamponada de formol 10%.

3.9. Avaliação da presença de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco

Para avaliação da presença de inflamação e fibrose no tecido muscular cardíaco, os corações fixados em formalina, foram desidratados e embebidos em parafina. Os blocos formados foram cortados em secções de 4 µm de diâmetro, corados pela Hematoxilina & Eosina e pelo Tricrômico de Masson para o exame morfométrico da inflamação e fibrose cardíaca, respectivamente.

3.9.1. Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)

Para evidenciação do infiltrado inflamatório, cortes seriados de fragmentos cardíacos foram desparafinizados em dois banhos de xilol, 15min cada, hidratados em soluções alcoólicas de concentrações decrescentes de álcool (100%, 90%, 80% e 70%), 10min cada, e lavados em água corrente por 10min e em tampão fosfato (PBS) pH 7,2 por cinco minutos. Em seguida, os cortes foram corados pela hematoxilina por 10 minutos, lavados em água corrente e diferenciados rapidamente em álcool acidulado, novamente lavados em água corrente e corados pela Eosina durante um minuto. Após o último processo de lavagem em água corrente, foram levados até a estufa 56oC para secagem. Posteriormente colocados em banho de xilol durante 6min, e então, montadas as lâminas com auxílio de entellan.

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Os núcleos celulares presentes nas lâminas confeccionadas com o coração dos camundongos foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida igual a 1,49  106m2). As imagens visualizadas pela objetiva de 40 foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3.

3.9.2. Técnica de Tricrômico de Masson

Para a observação de tecido conjuntivo fibroso e determinação da fibrose, fragmentos cardíacos foram corados pela técnica de Tricrômico de Masson. Após a desparafinização e a hidratação dos cortes, estes foram corados com hematoxilina por dois minutos, lavados em água corrente e corados durante cinco minutos pela solução número 1 (90ml Sudam 1% em solução alcoólica, 10ml fucsina ácida 1% em solução aquosa e 1ml de ácido acético glacial). Posteriormente foram lavados em água corrente e corados durante 10 minutos pela solução número 2 (2,5g ácido fosfotúngstico, 2,5g ácido fosfomolíbdico em 100ml de água destilada), novamente lavados. Em seguida, corados por 5 minutos pela solução número 3 (2,5g azul de anilina, 2ml ac. acético glacial em 100ml água destilada), lavados e submetidos à solução de água acética 10% durante cinco minutos. Realizado o último processo de lavagem, os cortes foram desidratados, secados em estufa (56oC) e colocados em xilol por 30min, seguindo-se a montagem das lâminas com auxílio de entellan.

Utilizando o analisador de imagens, foram obtidas 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida igual a 1,49  106m2) de cada fragmento cardíaco. As imagens visualizadas pela objetiva de 40 foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica Qwin V3.

3.10. Análise Estatística

Os resultados dos níveis de parasitemia, de anticorpos e da análise morfométrica foram expressos como a média + o desvio padrão para cada teste. Estas variáveis foram analisadas pelo teste Mann-Whitney. A verificação do efeito dose-dependente na

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redução da parasitemia foi realizada utilizando-se o Coeficiente de Correlação de Pearson. Os dados foram considerados significativos quando a probabilidade de erro foi menor que 5% (p< 0,05).

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Martins, T.A.F. Resultados