Efeitos cardiovasculares do citral, monoterpeno majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, em ratos

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. FLÁVIA VIANA MOREIRA. EFEITOS CARDIOVASCULARES DO CITRAL, MONOTERPENO MAJORITÁRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus, EM RATOS. ARACAJU 2013.

(2) FLÁVIA VIANA MOREIRA. EFEITOS CARDIOVASCULARES DO CITRAL, MONOTERPENO MAJORITÁRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus, EM RATOS. 2013.

(3) FLÁVIA VIANA MOREIRA. EFEITOS CARDIOVASCULARES DO CITRAL, MONOTERPENO MAJORITÁRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus, EM RATOS. Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana dos Santos. ARACAJU 2013.

(4) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. M838e. Moreira, Flávia Viana Efeitos cardiovasculares do citral, monoterpeno majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, em ratos / Flávia Viana Moreira ; orientador Márcio Roberto Viana dos Santos. – Aracaju, 2013. 76 f. : il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, 2013. 1. Hipertensão. 2. Essências e óleos essenciais. 3. Monoterpenos. 4. Citral. I. Santos, Márcio Roberto Viana, orient. II. Título. CDU 616.12-008.331.1.

(5) FLÁVIA VIANA MOREIRA EFEITOS CARDIOVASCULARES DO CITRAL, MONOTERPENO MAJORITÁRIO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus, EM RATOS. Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde. Aprovada em: _____/_____/_____ _________________________________________ Prof. Dr. Márcio Roberto Viana dos Santos _________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Isac Almeida Medeiros _________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo ___________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Valter Joviniano de Santana Filho _________________________________________ 4º Examinador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Júnior. PARECER ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

(6) Dedico este trabalho aos meus pais, Sérgio (in memoriam) e Eliene, por terem me ensinado o caminho do bem. Amo vocês!.

(7) AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado força e coragem para seguir em frente; Aos meus pais, Sérgio (in memoriam) e Eliene por sempre priorizarem minha educação e por me incentivarem em todos os momentos da minha vida; Ao meu filho amado, Felipe, por ser a motivação da minha vida, por compreender minha ausência e por me amar incondicionalmente; A minha sobrinha, Maria Eduarda, por ter enchido minha vida de alegria; Ao meu irmão, Júnior, e a minha cunhada, Érika, pelo amor, carinho e incentivo; Ao meu namorado, Cleodon, pelo amor, por ter me apoiado nos momentos de stress e por ter me escutado nos momentos difíceis; A Telma Brasil pela amizade, pelo apoio e por acreditar em mim; Ao meu excelente orientador, Prof. Dr. Marcio Roberto Viana dos Santos, pela dedicação, confiança, estímulo, paciência e pelos brilhantes ensinamentos; Aos professores Doutores Murilo, Waldecy, Válter, Enilton e Isac pela colaboração e pelas palavras de incentivo; A minha amiga, Bya, por compartilhar comigo os momentos bons e os momentos de angústia e aflição, pelas risadas, pelos choros e pelo companheirismo; Aos companheiros do LAFAC (Laboratório de Farmacologia Cardiovascular), em especial André, Ayslan e Patrícia, pela colaboração nos experimentos e a Robervan, pelo apoio e amizade; Ao Sr. Oswaldo, funcionário do biotério, pela boa vontade em nos ajudar sempre; Aos colegas da Turma de Doutorado; As minhas amigas “Curicas” e aos meus amigos das pedaladas; E a toda minha família, em especial minha Avó..

(8) RESUMO MOREIRA, F. V. Efeitos cardiovasculares do citral, monoterpeno majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, em ratos. Tese de Doutorado, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina, Doutorado em Ciências da Saúde - NPGME/UFS, 2013. O monoterpeno citral é o composto majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, planta medicinal conhecida popularmente como “capim-santo” ou “capim-limão”, e é utilizada na medicina popular brasileira para o tratamento da hipertensão. Este estudo buscou investigar os efeitos cardiovasculares do citral em ratos normotensos através de experimentos in vivo e in vitro. Em animais não-anestesiados, a administração i.v. do citral (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziu uma resposta transiente caracterizada por hipotensão associada à bradicardia. Estes efeitos foram significativamente atenuados em animais pré-tratados com atropina (2 mg/kg, i.v.), hexametônio (20 mg/kg, i.v.), tiopental (45 mg/kg; i.p.) ou indometacina (5 mg/kg, i.v.) após dose de 5 mg/kg do citral. Em animais pré-tratados com L-NAME (20 mg/kg, i.v.), o efeito hipotensor foi significativamente atenuado, enquanto que a bradicardia não foi alterada. Além disso, registros de ECG mostraram que o citral (10 e 20 mg/kg) foi capaz de induzir bloqueio sinoatrial e que este efeito foi inibido totalmente com a administração de atropina (2 mg/kg; i.v.). Em anéis de artéria mesentérica de rato précontraídas com FEN (10 M), o citral (10-5 - 10-2 M) induziu relaxamento (pD2 = 2,52 ± 0,10; Emáx = 103,4 ± 10,2%) que não foi alterado após a remoção do endotélio (pD2 = 2,34 ± 0,15; Emáx = 107,2 ± 4,3%), nem em preparações, sem endotélio, pré-contraídas com KCl 80 mM (pD2 = 2,04 ± 0,12; Emáx = 101,3 ± 7.1%) e nem em anéis, sem endotélio, após incubação com 100 M de TEA (pD2 = 3,25 ± 0,05; Emáx= 109,3 ± 9,8%). Nas concentrações de 3 x 10-4 e 10-3 M, o citral foi capaz de inibir significativamente as contrações induzidas por CaCl2 (10-5 - 10-2 M) e por ortovanadato de sódio (3 x 10-4 - 3 x 10-2 M) em 88,6 ± 3,1% e 93,3 ± 3,8%, respectivamente. Estes resultados demonstram que o citral induz hipotensão, que parece ser causada por ativação de receptores muscarínicos, liberação de NO e em parte, por liberação de PGI2, associada à bradicardia, que parece ser causada pela ativação de receptores muscarínicos cardíacos, nicotínicos ganglionares, envolvendo componentes do sistema nervoso central, e bloqueio sinoatrial. Além disso, o citral induz vasorelaxamento que parece ser causado por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ operados por voltagem associado à diminuição da sensibilidade ao Ca2+. Palavras-chave: efeitos cardiovasculares, canais de cálcio, citral e ratos..

(9) ABSTRACT MOREIRA, F. V. Cardiovascular effects of the citral, major monoterpene of the essential oil of Cymbopogon citratus, in rats. Tese de Doutorado, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina, Doutorado em Ciências da Saúde - NPGME/UFS, 2013. The monoterpene citral is the major constituent of the essential oil of Cymbopogon citratus, medicinal plant popularly known as “capim-limão” or “capim-santo”, widely used to treat hypertension. This study evaluated the cardiovascular effects induced by the citral in normotensive rats by using in vivo and in vitro approaches. In non-anaesthetized rats, citral (1, 5, 10, and 20 mg/kg, i.v.) induced transient hypotension and bradycardia. Both effects were significantly attenuated by the pre-treatment with atropine (2 mg/kg, i.v.), hexamethonium (20 mg/kg, i.v.), sodium thiopental (45 mg/kg; i.p.) or indomethacin (5 mg/kg, i.v.) after dose of 5 mg/kg of the citral. After pre-treatment with L-NAME (20 mg/kg, i.v.), hypotension was significantly attenuated, while bradycardia was not altered. Furthermore, electrocardiogram records demonstrated that citral (10 and 20 mg/kg) was also able to induce sinoatrial block, which was reverted by atropine (2 mg/kg). In rings of rat mesenteric artery pre-contracted with phenylephrine (10 µM), citral (10-5 - 10-2 M) was able to induce relaxations (pD2 = 2.52 ± 0.10; Emax = 103.4 ± 10.2%) that was not affected after removal of the endothelium (pD2 = 2.34 ± 0.15; Emax = 107.2 ± 4.3%) or in rings without endothelium pre-contacted with KCl 80 mM (pD2 = 2.04 ± 0.12; Emax = 101.3 ± 7.1%) or in rings without endothelium after tetraethylammonium (pD2 = 3.25 ± 0.05; Emax = 109.3 ± 9.8%). At concentrations of 3 x 10-4 and 10-3 M, citral was able significantly to inhibit the contractions induced by CaCl2 (from 105 to 10-2 M) or sodium orthovanadate (from 3 x 10-4 to 3 x 10-2 M) up to 88.6 ± 3.1% and 93.3 ± 3.8%, respectively. These results demonstrate that citral induces hypotension, which appears to be caused by activation of muscarinic receptors, NO release and, in part, by PGI2 release, associated to bradycardia, which seems to be due to an activation of muscarinic and nicotinic receptors, involving compounds of central nervous system, and sinoatrial block. Furthermore, citral induces vasorelaxation of mesenteric artery possibly caused by the inhibition of the Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels associated to a decrease of calcium sensitivity. Keywords: calcium channels, cardiovascular effects, citral and rats..

(10) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica superior. ...... 32 Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 mM (KCl 80). ..................................................................................................................................................... 33 Tabela 3: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 60 mM (KCl 60). ..................................................................................................................................................... 33 Tabela 4: Composição da solução de Tyrode nominalmente sem Ca2+. ...................................... 33 Tabela 5: Valores da linha de base da PAM e FC em ratos normotensos não-anestesiados antes (controle) e após administração aguda, i.v., de atropina (2 mg/kg), L-NAME (20 mg/kg), HEXA (20 mg/kg) e INDO (5 mg/kg). Os valores estão expressos como media ± E.P.M. de 6 experimentos (ANOVA de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni; *** p < 0,001 versus controle).............................................................................................................................. 41.

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estruturas química dos isômeros do citral, geranial (citral A) e neral (citral B). PM: 152,24. ...................................................................................................................................... 28 Figura 2: Rato Wistar ............................................................................................................. 31 Figura 3: Sistema de aquisição de dados de PA e FC em ratos. ............................................. 35 Figura 4: Sistema de aquisição de dados de reatividade vascular. .......................................... 38 Figura 5: Registro original mostrando as variações de pressão (mmHg) em função do tempo após a administração aguda intravenosas in bolus de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em um rato normotenso não-anestesiado controle. As setas indicam o momento da administração. ...................................................................................................... 42 Figura 6: Efeito hipotensor (A) e bradicárdico (B) induzido pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 4 experimentos (ANOVA de duas vias seguida de pós-teste de Bonferroni; ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs veículo). .................................................................................................................................... 43 Figura 7: Influência da atropina (2 mg/kg; i.v., 15 min) sobre a resposta hipotensora (A) e bradicárdica (B) induzida pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 4 experimentos (ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni; ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs controle). ................................................................................. 45 Figura 8: Influência do HEXA (20 mg/kg; i.v., 30 min) sobre a resposta hipotensora (A) e bradicárdica (B) induzida pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 5 experimentos (ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni; * p < 0,05; ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs controle). ............................................................... 46 Figura 9: Influência do tiopental sódico (45 mg/kg; i.p.) sobre a resposta hipotensora (A) e bradicárdica (B) induzida pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 6 experimentos (ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni; *** p < 0,001 vs controle). ....................................................................................................... 47.

(12) Figura 10: Influência do L-NAME (20 mg/kg; i.v., 30 min) sobre a resposta hipotensora (A) e bradicárdica (B) induzida pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 6 experimentos (ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni; *** p < 0,001)........................................................................................................................... 49 Figura 11: Influência da INDO (5 mg/kg; i.v., 30 min) sobre a resposta hipotensora (A) e bradicárdica (B) induzida pela administração aguda de doses randomizadas do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos não-anestesiados. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 5 experimentos (ANOVA de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni; ** p < 0,01 vs controle). ........................................................................................................... 50 Figura 12: Traçados originais mostrando um típico registro de ECG em rato normotenso não anestesiado: A - Controle; B - Após administração do citral (1; 5; 10 e 20 mg/kg; i.v.); C Após atropina (2 mg/kg; 15 min; i.v.); D - Após citral (10 e 20 mg/kg; i.v.) mais atropina (2 mg/kg; 15 min; i.v.). As setas indicam o momento da administração do citral. Esse traçados mostam que o citral (10 e 20 mg/kg; i.v.) foi capaz de induzir bloqueio sinoatrial, o qual foi abolido após atropina. ............................................................................................................... 51 Figura 13: Representação esquemática das ondas e intervalos de um traçado normal de ECG. .................................................................................................................................................. 52 Figura 14: Intervalo PR (ms) obtido a partir de registros de ECG em ratos normotensos nãoanestesiados antes e após a administração do citral (1 e 5 mg/kg; i.v.). Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 4 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguidos pelo pós-teste de Dunnet. ........................................................................ 53 Figura 15: Intervalo QRS (ms) obtido a partir de registros de ECG em ratos normotensos não-anestesiados antes e após a administração do citral (1, 5, 10 e 20 mg/kg; i.v.). Os valores foram expressos como média ± E.P.M. de 4 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguidos pelo pós-teste de Dunnet. *** p < 0,001 vs Controle. ............. 53 Figura 16: Intervalo QTc (ms) obtido a partir de registros de ECG em ratos normotensos nãoanestesiados antes e após a administração do citral (1, 5, 10 e 20 mg/kg; i.v.). Os valores foram expressos como média ± E.P.M. de 4 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguidos pelo pós-teste de Dunnet. * p < 0,05; *** p < 0,001 vs Controle. ................................................................................................................................... 54.

(13) Figura 17: Registro original mostrando o efeito relaxante induzido por concentrações cumulativas crescentes do citral (10-5 - 10-2 M) em um anel de artéria mesentérica isolada de rato pré-contraído com FEN (10 µM). As setas indicam o momento da administração das concentrações.................. 55 Figura 18: Curva concentração-resposta para o citral (10-5 - 10-2 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato com (Controle) e sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM). Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 6 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via, seguidos pelo pós-teste de Bonferroni. ..... 55 Figura 19: Curvas concentração-resposta para o citral (10-5 - 10-2 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) ou com KCl 80 mM. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. de 6 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via, seguidos pelo pós-teste de Bonferroni. ................................................................................................................................ 57 Figura 20: Curva concentração-resposta para CaCl2 (10-5 - 10-2 M) em anéis de artéria mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após pré-incubação com citral (10-4, 3x10-4 e 10-3 M). Os valores foram expressos como média ± E.P.M., de 6 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. *** p < 0,001 vs CaCl2. ............................................................................................................ 58 Figura 21: Curva concentração-resposta para Na3VO4 (3 x 10-5 - 3 x 10-2 M) em anéis de artéria mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após pré-incubação com citral (10-4, 3x10-4 e 10-3 M). Os valores foram expressos como média ± E.P.M., de 6 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. *** p < 0,001 vs Na3VO4. ..................................................................................... 59 Figura 22: Curvas concentração-resposta para o citral (10-5 - 10-2 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) antes e após a incubação com TEA (100 µM). Os valores estão expressos como média ± E. P. M. de 6 experimentos. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Bonferroni. ............................................................................................................ 60.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACh - acetilcolina AMPc - monofosfato de adenosina cíclico ANOVA - análise de variância CaCl2.2H2O - cloreto de cálcio di-hidratado C6H12O6 - glicose Cavs - canais de cálcio operados por voltagem CEPA - Comitê de Ética em Pesquisa Animal COX - cicloxigenase ECA - enzima conversora da angiotensina FC - freqüência cardíaca FEN - fenilefrina FRDEs - fatores relaxantes derivados do endotélio GMPc - monofosfato de guanosina cíclico HEXA - hexametônio INDO - indometacina i.p. - intraperitoneal i.v. - intravenoso KCl - cloreto de potássio L-NAME - NG-nitro L-arginina metil éster MgCl2.6H2O - cloreto de magnésio hexa-hidratado MLCK - quinase de cadeia leve de miosina NaCl - cloreto de sódio Na3VO4 - ortovanadato de sódio NaHCO3 - bicarbonato de sódio NaH2PO4 - fosfato de sódio mono-hidratado NIF - nifedipina NO - óxido nítrico NTS - núcleo do trato solitário PAM - pressão arterial média PE - polietileno PGI2 - prostaciclina.

(15) PKA- proteína cinase A PKG - proteína cinase G PLC - fosfolipase C R.S. - retículo sarcoplasmático ROCCs - canais de cálcio operados por receptores SNC - sistema nervoso central SNA - sistema nervoso autônomo SNP - sistema nervoso parassimpático SNS - sistema nervoso simpático TEA - tetraetilamônio Vm - potencial de membrana.

(16) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16 1.1 Considerações Gerais ...................................................................................................... 16 1.2 Considerações sobre a Regulação da Pressão Arterial .................................................... 17 1.3 Hipertensão Arterial ........................................................................................................ 20 1.4 Considerações Gerais sobre Contração e Relaxamento do Músculo Liso ...................... 21 1.5 Plantas Medicinais........................................................................................................... 23 1.6 Cymbopogon citratus ...................................................................................................... 24 1.7 Óleos Essenciais .............................................................................................................. 25 1.8 Monoterpenos .................................................................................................................. 27 1.9 Citral ................................................................................................................................ 28 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 30 2.1 Geral ................................................................................................................................ 30 2.2 Específicos ...................................................................................................................... 30 3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 31 3.1 Animais ........................................................................................................................... 31 3.2 Obtenção do Citral .......................................................................................................... 31 3.3 Drogas ............................................................................................................................. 32 3.4 Soluções Nutritivas ......................................................................................................... 32 3.5 Ensaios Farmacológicos in vivo ...................................................................................... 34 3.5.1 Caracterização dos efeitos induzidos pela administração aguda (i.v.) do citral sobre a pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC) em ratos normotensos não-anestesiados e anestesiados ..................................................................................................................... 34 3.5.1.1 Preparação dos animais para as medidas diretas de PA e FC ................................ 34 3.5.2 Protocolos experimentais utilizados para medidas diretas de PAM e FC em ratos normotensos não-anestesiados e anestesiados ................................................................... 35 3.5.2.1 Verificação da participação muscarínica na resposta induzida pelo citral em ratos normotensos não-anestesiados ........................................................................... 36 3.5.2.2 Influência do bloqueio ganglionar sobre a resposta induzida pelo citral em ratos normotensos não-anestesiados ........................................................................... 36.

(17) 3.5.2.3 Verificação da participação do NO na resposta induzida pelo citral em ratos normotensos não-anestesiados .................................................................................... 36 3.5.2.4 Verificação da participação de metabólitos da COX na resposta induzida pelo citral em ratos normotensos não-anestesiados ............................................................ 36 3.5.2.5 Verificação dos efeitos da anestesia com tiopental sódico na resposta induzida pelo citral em ratos normotensos ................................................................................. 37 3.5.3 Registros eletrocardiográficos (ECG) acompanhados de medidas diretas da PAM e FC em ratos normotensos não-anestesiados ................................................... 37 3.6 Ensaios Farmacológicos in vitro ..................................................................................... 37 3.6.1 Preparação da artéria mesentérica superior isolada de rato com ou sem endotétlio . 37 3.6.2 Protocolos experimentais empregados nos estudos in vitro ..................................... 39 3.6.2.1 Avaliação do papel do endotélio vascular nas respostas induzidas pelo citral 39 3.6.2.2 Avaliação da participação dos canais de Ca2+ nas respostas induzidas pelo citral ............................................................................................................................. 39 3.6.2.3 Avaliação do efeito do citral sobre sensibilização dos elementos contráteis ao Ca2+.............................................................................................................................. 39 3.6.2.4 Avaliação da participação dos canais de K+ nas respostas induzidas pelo citral ..................................................................................................................................... 40 3.7 Análise Estatística ........................................................................................................... 40 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 41 4.1 Experimentos in vivo ....................................................................................................... 41 4.1.1 Caracterização dos efeitos induzidos pela administração aguda (i.v.) do citral sobre a PAM e FC em ratos normotensos ................................................................................... 41 4.1.2 Efeito do citral sobre a atividade elétrica cardíaca em ratos normotensos não anestesiados ....................................................................................................................... 50 4.2 Experimentos in vitro ...................................................................................................... 54 4.2.1 Caracterização dos efeitos do citral sobre a reatividade vascular em artéria mesentérica superior de rato .............................................................................................. 54 5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 61 6 PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 62 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 63 ANEXO A - Artigos publicados.

(18) ANEXO B - Artigo submetido.

(19) 16. 1. INTRODUÇÃO. 1.1 Considerações Gerais A progressiva destruição da flora brasileira representa uma ameaça de extinção para espécies vegetais nativas, que sequer são conhecidas ou avaliadas em suas propriedades medicinais (SOEJARTO, 1996). A necessidade do estudo das plantas conhecidas popularmente como medicinais, utilizadas empiricamente pela medicina popular, é urgente, pois é preciso selecionar aquelas que se apresentam ativas e dotadas de razoável grau de segurança, a fim de que possam ser utilizadas para aumentar o arsenal terapêutico disponível com medicamentos de baixo custo e ampliar a capacidade de atendimento médico-farmacêutico em saúde pública, especialmente no segmento da população de baixa renda. A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda o uso de plantas medicinais pelos sistemas públicos de saúde como forma de baixar os custos dos programas de saúde pública e ampliar o número de beneficiários destes programas, principalmente nos países em desenvolvimento onde persiste a pobreza (BRAJTBURG et al., 1990). No entanto, uma base mais racional para o uso destas plantas como medicamento somente foi lançada quando estas espécies começaram a ser estudadas de forma sistemática com o objetivo de extrair, isolar e identificar as substâncias cujas propriedades farmacológicas são, em última análise, responsáveis pelas propriedades curativas atribuídas à planta como um todo (ELIZABETSKY, 1986). A combinação entre as informações populares e os estudos sistemáticos das plantas medicinais permitiu a descoberta de grande número de fármacos hoje usados na clínica, entre eles, a morfina obtida da Papaver somniferum L., um eficiente analgésico central. Outros exemplos são: quinina, atropina, codeína, cocaína, efedrina, digoxina, reserpina (LIPSCHIK; KOVACS, 1992) e taxol, diterpeno isolado de Taxus brevifolia Nutt., utilizado como antitumoral (EINZIG et al., 1992). Uma das mais recentes descobertas da aplicação bem sucedida de produtos naturais foi o lançamento, em 2004, do fitofármaco Acheflan (Laboratório Aché), anti-inflamatório de uso tópico, produzido a partir da planta Cordia verbenácea (CALIXTO, 2005). Além disso, esse tipo de estudo tem fornecido a base científica para o uso de muitas plantas medicinais no tratamento de doenças crônicas, como por exemplo, a hipertensão..

(20) 17. 1.2 Considerações sobre a Regulação da Pressão Arterial. A regulação da pressão arterial (PA) é uma das mais complexas funções fisiológicas, pois é resultante da ação integrada dos sistemas cardiovascular, renal, neural e endócrino, que trabalhando em conjunto são responsáveis pela redistribuição dos vários fluxos sanguíneos regionais através de alterações na resistência total e no débito cardíaco (CAMPAGNOLESANTOS; HAIBARA, 2001). O controle da PA consiste de mecanismos regulatórios que se processam principalmente a curto e a longo prazo. A longo prazo, o controle da PA está intimamente ligado à homeostasia do volume do líquido corporal, determinado pelo balanço entre a ingestão e a eliminação de líquido. Esse balanceamento é realizado por sistemas renais de controle do líquido corporal através de controles nervosos e hormonais, além de sistema de controle local, nos rins, que regulam a excreção de sal e água (GUYTON; HALL, 2006). A curto prazo, o controle de PA é exercido por mecanismos neurais. A modulação cardiovascular pelo sistema neural abrange a ativação de receptores periféricos (barorreceptores, receptores cardiopulmonares e quimiorreceptores), cujas aferências se projetam para o sistema nervoso central via nervos vagos e glossofaríngeos. O processamento dessas informações aferentes no sistema nervoso central produz uma consequente regulação das vias autonômicas eferentes, havendo, assim, o ajuste das variáveis cardiovasculares (frequência cardíaca, volume sistólico e resistência periférica) (COLOMBARI et al., 2001). Este controle neural está intimamente ligado à freqüência cardíaca (FC) e atividade reflexa barorreceptora (AUBERT et al., 2003). O reflexo pressorreceptor mantém a pressão arterial dentro de limites normais em períodos de segundos a minutos. A rapidez desse sistema regulatório é obtida através de um sistema de retroalimentação pelo sistema nervoso autônomo (SNA), o qual possui duas subdivisões anátomofuncionais: o sistema nervoso simpático (SNS) e o sistema nervoso parassimpático (SNP) (PASCHOAL et al., 2006). Os terminais barorreceptores não são estimulados pela pressão por si, são mecanorreceptores que respondem às alterações de estiramento da parede arterial causadas pelas alterações de pressão dentro do vaso (SHEPHERD; MANCIA, 1986; DAMPNEY, 1994). Os barorreceptores cardiopulmonares também são mecanorreceptores e, de modo geral, participam do controle da pressão arterial qualitativamente de forma semelhante aos barorreceptores arteriais. No entanto, por serem menos homogêneos e se situarem principalmente dentro de um sistema de baixa pressão, a sua estimulação se faz muito mais por expansão de volume sanguíneo do que por alterações de.

(21) 18. pressão (GRASSI ; MANCIA, 1994). Já os quimiorreceptores periféricos são constituídos por células altamente especializadas, capazes de detectar alterações da pressão parcial de oxigênio (pO2), pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2) e concentração hidrogeniônica (pH) do sangue (IRIGOYEN et al., 2005). Dessa forma, a ativação dos quimiorreceptores periféricos resulta em ajustes ventilatórios que se caracterizam por aumento do volume de ar corrente, aumento da freqüência respiratória e aumento do volume minuto respiratório, exercendo, portanto, um importante papel no controle reflexo da ventilação (IRIGOYEN et al., 2005). Além de promover respostas ventilatórias, a estimulação dos quimiorreceptores periféricos possuem uma influência tônica sobre o controle cardiovascular, estimulando o sistema nervoso simpático, contribuindo dessa forma para a manutenção dos níveis basais da pressão arterial e de parte da resistência periférica total (GUAZZI et al., 1968; FRANCHINI; KRIEGER, 1993). A partir das informações aferentes, por meio de uma complexa interação de estímulo e inibição, respostas das vias simpática e parassimpática são formuladas e modificam a FC, adaptando-a às necessidades de cada momento. O aumento da FC é consequência da maior ação da via simpática e da menor atividade parassimpática, ou seja, inibição vagal, enquanto que, a sua redução depende basicamente do predomínio da atividade vagal (AUBERT et al., 2003; PASCHOAL et al., 2003). A figura 1 apresenta um diagrama esquematizando as vias aferentes, principais áreas e integração bulbar e vias eferentes do reflexo pressorreceptor arterial.. Figura 1 – Representação esquemática das vias aferentes, principais áreas de integração bulbar e vias eferentes do reflexo pressorreceptor arterial. X = nervo vago; IX = nervo glossofaríngeo; nX = núcleo motor dorsal do nervo vago; nA = núcleo ambíguo, nTS = núcleo do trato solitário; RVLM = área ventrolateral rostral do bulbo; CVLM = área ventrolateral caudal do bulbo; APC = área pressora caudal; IML = células da medula intermediolateral; SNP = sistema nervoso parassimpático; SNS = sistema nervoso simpático. Modificado de Dampney, 1994..

(22) 19. De uma forma simplificada, as fibras dos nervos aórticos e carotídeos que trafegam através dos nervos glossofaríngeo e vago convergem para a região do núcleo do trato solitário (NTS), considerado então a primeira estação central dos sinais sensoriais originados no sistema periférico. A partir do NTS, neurônios de segunda ou terceira ordem projetam-se para dois grupamentos de neurônios no bulbo ventrolateral: 1) neurônios inibitórios na área ventrolateral caudal do bulbo (CVLM), que por sua vez projetam-se para neurônios prémotores do sistema nervoso simpático (SNS) na área ventrolateral rostral do bulbo (RVLM, neurônios simpatoexcitatórios). Finalmente, os neurônios da RVLM projetam-se para os neurônios pré-ganglionares do SNS localizados na coluna intermediolateral da medula espinhal (“fonte” do fluxo simpático para coração e vasos); 2) o outro grupamento de neurônios está localizado no núcleo ambíguo (NA) e núcleo dorsal motor do nervo vago, que contém os corpos celulares dos neurônios pré-ganglionares do sistema nervoso parassimpático (SNP). De cada uma dessas áreas e núcleos bulbares, neurônios projetam-se para áreas e núcleos mais rostrais do SNC, levando informações cardiovasculares (IRIGOYEN et al, 2005). Dessas regiões, de maneira recíproca, partem projeções para as regiões bulbares e até mesmo para os neurônios da coluna intermediolateral da medula, determinando a integração central do controle da pressão arterial. Resumindo, o reflexo pressorreceptor participa da homeostase hemodinâmica, principalmente por controlar o tônus simpático e parassimpático para coração e vasos. Exemplificando, a estimulação dos pressorreceptores arteriais produz redução reflexa da atividade simpática e aumento da atividade vagal, resultando em dilatação arteriolar,. venodilatação,. bradicardia. e. redução. da. contratilidade. miocárdica. (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA, 2001). Essas respostas ganham complexidade em decorrência da interação com outros mecanismos que podem amplificar ou atenuar a resposta do receptor a um determinado estímulo, discriminar respostas desencadeadas por baro carotídeo e aórtico ou, ainda, promover uma maior interação com outros reflexos ou outras áreas de influência na modulação do sistema cardiovascular (IRIGOYEN et al., 2005)..

(23) 20. 1.3 Hipertensão Arterial. A hipertensão está associada com anomalias estruturais no sistema cardiovascular (FOLKOW, 1987). Estas anomalias incluem aumento na relação parede versus luz das artérias,. aumento. na. resistência. periférica,. diminuição. da. complacência. venosa. (TAKESHITA; MARK, 1979), aumento da quantidade da massa cardíaca e muscular vascular lisa (FOLKOW, 1979; FOLKOW, 1987), além de anomalias intrínsecas na função renal (COLEMAM et al., 1975). Segundo critérios estabelecidos pelas VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (2010), é classificado com hipertenso o indivíduo que apresentar pressão sistólica. 140. mmHg e pressão diastólica 90 mmHg. A Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) tem alta prevalência e baixas taxas de controle, é considerada um dos principais fatores de risco (FR) modificáveis e um dos mais importantes problemas de saúde pública (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010) A HAS é comumente classificada em dois tipos: hipertensão primária (essencial), com causa desconhecida, ou secundária, com causa orgânica claramente desencadeadora da elevação dos valores pressóricos. Há indicação de que o tipo primário corresponde a cerca de 95% dos casos de hipertensão arterial, enquanto que o secundário representa os 5% restantes, tendo as doenças renais e endócrinas como suas principais causas (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010). A forma mais comum, a hipertensão essencial, caracteriza-se por uma elevação de causa desconhecida da pressão sanguínea (GUYTON; HALL, 2006) e está associada a vários fatores de risco, como uma predisposição genética, obesidade, consumo elevado de álcool e inatividade física (PAGE et al., 1999). Este tipo de hipertensão é também caracterizado por ter uma longa duração e por comprometer direta ou indiretamente órgãos nobres como, coração, rins e vasos, acarretando níveis elevados de morbidade. Até os dias de hoje, não se conseguiu conectar essa patologia a qualquer um dos mecanismos descritos anteriormente (PAGE et al., 1999). Acredita-se, portanto, que esse tipo principal de hipertensão esteja associado à disfunção endotelial que é encontrada em inúmeros acometimentos cardiovasculares tornando-se objeto de estudo terapêutico (ALCÂNTARA; RAMALHINHO, 2003). Atualmente existem diversos medicamentos utilizados no tratamento da hipertensão, os quais incluem vários grupos de drogas tais como: diuréticos, betabloqueadores, inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA), bloqueadores dos canais para Ca2+, antagonistas dos receptores da angiotensina II, além de vasodilatadores diretos (SOCIEDADE.

(24) 21. BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010). No entanto, algumas das substâncias desses grupos de drogas têm significativos efeitos colaterais, principalmente sobre o sistema nervoso central. Dentre elas pode-se citar: o propranolol (bloqueador não-seletivo dos receptores betaadrenérgicos), que pode provocar depressão do sistema nervoso central e alucinações (GREENBLATT; SHADER, 1972), a clonidina (agonista alfa-2 adrenérgico) que diminui a atividade motora do comportamento condicionado de fuga, possui propriedades antipsicóticas além de sedação acentuada, a nifedipina e o diltiazem (antagonistas dos canais para Ca2+), que além. de. tontura,. também. provocam. sedação. (SOCIEDADE. BRASILEIRA. DE. HIPERTENSÃO, 2010). Estes efeitos colaterais associados com o alto custo dos medicamentos estão entre as principais causas da elevada taxa de abandono do tratamento (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010). Desse modo, torna-se imprescindível o estudo das plantas medicinais com a finalidade de buscar alternativas terapêuticas eficazes, seguras e de baixo custo para o tratamento da hipertensão. Este estudo pode ser iniciado avaliando-se a atividade das plantas ou seus constituintes sobre o sistema cardiovascular utilizado modelos experimentais in vivo e in vitro.. 1.4 Considerações Gerais sobre Contração e Relaxamento do Músculo Liso. Fisiologicamente, a contração no músculo liso ocorre após a elevação da concentração do cálcio intracelular, [Ca2+]i, em virtude da abertura dos canais de Ca2+ presentes na membrana plasmática ou devido a sua liberação do retículo sarcoplasmático (R.S.), controlada por mensageiros secundários, como por exemplo, o 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3) e o Ca2+. A regulação funcional da [Ca2+]i para disparar uma resposta contrátil no músculo liso está relacionada com dois estímulos que levam a dois tipos de acoplamentos: (1) acoplamento eletromecânico, que está envolvido com a mudança de potencial de membrana (Vm) e (2) acoplamento fármaco-mecânico quando a contração induzida por um agonista é sempre maior que a observada só com a mudança de Vm (REMBOLD, 1996). Os mecanismos que levam a uma resposta contrátil através do acoplamento eletromecânico são devido a uma despolarização de membrana, seja diretamente pelo aumento da concentração externa de K+ ou indiretamente pela ligação dos agonistas aos seus receptores, levando a abertura de canais de cálcio operados por voltagem (Cavs) causando influxo de Ca2+ no citoplasma e conseqüentemente a contração (REMBOLD, 1996)..

(25) 22. Já os mecanismos que levam a uma resposta contrátil através do acoplamento fármaco-mecânicos incluem: (1) aumento de IP3 devido à ligação do agonista com o receptor, ativando a proteína Gq/11-fosfolipase C (PLC). Neste mecanismo, o IP3 liga-se a um receptor presente na membrana do R.S. permitindo a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, formação do complexo Ca2+4-calmodulina (CaM) e conseqüentemente contração (GARRET; GRISHAM, 1995); (2) aumento do influxo de Ca2+ através da abertura dos Cavs tipo L por um mecanismo que não envolve mudança no Vm; (3) liberação do Ca2+ induzida por Ca2+ através de receptores de rianodina (sensíveis à cafeína) presentes na membrana do R.S. (KOMORI et al., 1995) e (4) aumento do Ca2+ por ativação do trocador Na+/Ca2+ reverso (JACKSON, 2000). Com relação ao relaxamento muscular, o mecanismo eletromecânico envolvido é a hiperpolarização da membrana. Este mecanismo pode ser desencadeado por diversos eventos, entre eles podem ser citados a liberação do fator relaxante derivado do endotélio (óxido nítrico), que ativa diretamente a ciclase de guanilil solúvel; e a estimulação de receptores acoplados diretamente a uma ciclase de guanilil ou de adenilil. Em qualquer um destes eventos o resultado é a formação de segundos mensageiros tais como o monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) ou monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), respectivamente. Por sua vez, o aumento nas concentrações intracelulares destes segundos mensageiros ativa as proteínas cinase G (PKG) e A (PKA), o que resulta na abertura de canais de K+ da membrana plasmática e conseqüentemente, hiperpolarização (KOMALAVILAS; LINCOLN, 1996). A hiperpolarização reduz o influxo de Ca2+ através dos Cavs tipo L, diminuindo portanto a [Ca2+]i, a fosforilação da miosina e conseqüentemente a contração. Os aumentos na [Ca2+]i também inibem a atividade da quinase de cadeia leve de miosina (MLCK) por ativar uma proteína cinase II dependente de (Ca2+)4-calmodulina (CaM), que fosforila a MLCK, diminuindo a sensibilidade desta última à [Ca2+]i (REMBOLD, 1996). O aumento da fosforilação da cadeia leve da miosina e a capacidade da célula em produzir tensão em níveis sub-ótimos de Ca2+ é um mecanismo conhecido como sensibilização ao Ca2+, sendo a inibição da fosfatase da miosina o principal fator que contribui para este fenômeno (KUBOTA et al., 1992; SOMLYO; SOMLYO, 1994; 2000). Esta inibição resulta em uma redução da desfosforilação da cadeia leve de miosina, gerando um estado de ligação forte entre actina e miosina, produzindo a contração vascular (YU et al., 2004). O ortovanadato de sódio (Na3VO4), um potente inibidor da fosforilação da proteína tirosina (YU et al., 2004; ELBERG et al., 1994), também induz contrações mediadas por esta via (YU et.

(26) 23. al., 2004). Desta forma, o mesmo pode ser utilizado experimentalmente para avaliar efeito de drogas sobre a sensibilização dos elementos contráteis ao Ca2+. Com relação ao acoplamento fármaco-mecânico, os mecanismos que levam a uma resposta relaxante incluem: (1) aumento na atividade da Ca2+-ATPase (bomba de Ca2+) tanto da membrana do R.S. como da membrana plasmática através da PKG, levando a um aumento do seqüestro e da extrusão de Ca2+, respectivamente, diminuindo assim a [Ca2+]i; (2) diminuição da formação do IP3 e conseqüente diminuição da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares; (3) redução da [Ca2+]i pelo AMPc por diminuir o influxo de Ca2+, indiretamente por hiperpolarização ou por agir diretamente nos Cavs tipo L; e finalmente (4) diminuição da [Ca2+]i por estimulação do trocador Na+/Ca2+ (JACKSON, 2000).. 1.5 Plantas Medicinais. O uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido muito significativo nos últimos tempos. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam que cerca de 80% da população mundial utiliza, preferencialmente, a medicina tradicional nos cuidados primários da saúde, sendo que a maior parte das terapias tradicionais envolve o uso de plantas in natura ou produtos manufaturados a partir de seus extratos ou princípios ativos (WHO, 1991). As plantas medicinais são importantes para a pesquisa farmacológica e o desenvolvimento de drogas, não somente quando os seus constituintes são usados diretamente como agentes terapêuticos, mas também como matérias-primas para a síntese, ou modelos para compostos farmacologicamente ativos (PINTO et al., 2002). Além disso, nas últimas décadas, o interesse populacional pelas terapias naturais tem aumentado significativamente nos países industrializados e acha-se em expansão o uso de plantas medicinais e fitoterápicos (WHO, 2001). A avaliação dos efeitos dessas plantas no organismo além de contribuir para o desenvolvimento de bases científicas para sua aplicação terapêutica, também enriquece consideravelmente o arsenal terapêutico para o tratamento de inúmeras doenças (BARREIRO, 2009). Com base na evolução histórica do uso de plantas medicinais, a OMS, em 1978, passou a reconhecer a fitoterapia como terapia alternativa de eficácia comprovada (VIEIRA, 1992). Iniciaram-se então programas nacionais em instituições, visando a pesquisa e o desenvolvimento na área de plantas medicinais (MARTINS, 2000)..

(27) 24. A ampliação das opções terapêuticas ofertadas aos usuários do Sistema Único de Saúde, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde, é uma importante estratégia com vistas à melhoria da atenção à saúde da população e à inclusão social (BRASIL, 2005). Com o intuito de fortalecer a fitoterapia no SUS, após a década de 80, diversas políticas, resoluções, portarias e relatórios foram elaborados com ênfase na questão das plantas medicinais. Entre as mais recentes encontra-se a Portaria nº 971 de 3 de maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde, que recomenda, em caráter nacional, a adoção pela Secretaria de Saúde dos Estados, do Distrito Federal e dos Municípios, a implantação das ações e serviços relativos às Práticas Integrativas e Complementares (Fitoterapia, Acupuntura, Homeopatia e Termalismo Social/Crenoterapia).. 1.6 Cymbopogon citratus. A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, pertencente à família Poaceae, é uma erva perene originária da Índia e largamente distribuída por vários países tropicais. No Brasil, assume diferentes sinonímias conforme a região onde se encontra: “capim-limão” (MG), “capim-santo” (BA), “erva-cidreira” (SP) e outros como “capim-catinga”, “capim-de-cheiro”, “capim-cidrão”, “capim-cidrilho”, “capim-cidró” e “capim-ciri” (COSTA et al., 2005). Apresenta-se como uma erva acaule, cespitosa, de folhas longas, aromáticas, estreitas, agudas e ásperas, com nervura central grossa e acanalada (LEAL, 1998). Além de ser utilizado na medicina popular para tratamento da hipertensão, distúrbios nervosos e estomacais, o “capim-limão” tem emprego como matéria-prima industrial, principalmente, na indústria alimentícia para a fabricação de chás. Além disso, o óleo essencial, conhecido internacionalmente como óleo de “lemongrass”, tem emprego tanto na indústria alimentícia, como flavorizante e aromatizante, quanto na indústria farmacêutica na produção de fitoterápicos, inseticidas, cosméticos, perfumaria e para obtenção do citral, seu principal constituinte (CARVALHO et al., 2005). Como componentes de maior ocorrência na espécie estão citral, mirceno, limoneno, nonanal, nerol, geraniol, decanal, linalol, acetato de geranila e terpineol (ABEGAZ; YOHANNES, 1983; EL FATTAH et al., 1992; CARRICONDE et al., 1996). Entre os.

(28) 25. constituintes fixos encontram-se flavonóides (DEMATOUSCHEK; SATHLBISKUP, 1991), saponinas e alcalóides (D’MELLO; DUFFUS; DUFFUS, 1991; SOUZA et al., 1991). Vários efeitos terapêuticos do “capim-santo” foram relatados, citando-se entre estes as ações antimicrobiana (DUKE, 1997; FIORI et al., 2000; ONAWUNMI; YISAK; OGUNLANA, 1984) , analgésica (RAO; MENEZES; VIANA, 1990; LORENZETTI et al., 1991 ; VIANA et al., 2000), sedativa/hipnótica, ansiolítica e anticonvulsivante (BLANCO et al., 2009), estomáquica (EVANS, 1996),. anticancerígena (BALBOA; LIM, 1995),. hipoglicemiante e hipolipidêmico (ADENEYE; AGBAJE, 2007) e repelente de insetos (GILBERT et al., 1999). Além disso, o citral tem sido referido como substância de ação tranqüilizante e antiespasmódica (CRAVEIRO et al., 1988). Não foram observadas ações tóxicas das infusões de “capim-santo” administradas oralmente, tanto em ratos (SOUZA-FORMIGONI et al., 1986; ADENEYE & AGBAJE,. 2007), quanto em humanos (LEITE, 1986). Apesar da validação científica dos efeitos benéficos do C. citratus (BLANCO et al., 2009), Carlini et al. (1986) demonstraram que a administração oral do extrato das folhas desta espécie em camundongos é desprovida de efeitos sobre o sistema nervoso central, distúrbios intestinais e condições febris, mas quando administrado pela via intraperitoneal, tais efeitos foram observados. Além disso, também não foram observados efeitos ansiolíticos e hipnóticos em humanos quando administrado oralmente (LEITE, 1986). Sobre o sistema cardiovascular, alguns trabalhos têm demonstrado que o extrato aquoso das folhas de capim-limão apresenta efeito anti-hipertensivo e diurético (CARBAJAL et al., 1989) e efeito negativo sobre o ritmo cardíaco sem alteração da força de contração (GAZOLA et al., 2004). Além disso, foi verificado por Singi et al. (2005), através da administração endovenosa do extrato hidroalcoólico do C. citratus, uma redução da pressão arterial média em ratos anestesiados. Em artéria coronária de porco, os extratos metanólico, hexânico, diclorometano, butanólico e acetato de etila apresentaram efeitos vasorelaxantes significativos (DAIH-HUANG et al., 2007). Também foi relatado efeito vasorelaxante do extrato metanólico em artéria mesentérica e em aorta torácica de ratos (RUNNIE et al., 2004).. 1.7 Óleos Essenciais Os óleos essenciais são substâncias voláteis extraídas de plantas aromáticas, constituindo matérias-primas de grande importância para as indústrias cosmética,.

(29) 26. farmacêutica e alimentícia. Eles podem estar presentes em diversos órgãos da planta, difundindo pelas partes aéreas, nas flores, nas folhas, no lenho, nas raízes e nas sementes (CARDOSO et al., 2000). Nas plantas, os óleos essenciais apresentam-se em misturas de compostos em diferentes proporções, tendo, normalmente um composto majoritário. A grande maioria, no entanto, é constituído de derivados fenilpropanóides ou de terpenóides, preponderando os últimos. Os terpenóides constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo esse termo empregado para designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva de unidades do isopreno. Os compostos terpênicos mais freqüentes nos óleos essenciais são os monoterpenos, contribuindo com 90% dos óleos essenciais (JOSÉ, 1998; ARAÚJO, 1999; CARDOSO et al., 2000). Entre as principais ações farmacológicas sugeridas em diversos estudos disponíveis na literatura para os óleos essenciais estão os efeitos: miorrelaxante, principalmente em músculo liso, hipotensor, antimicrobiano, antiespasmódico, antidepressivo, anti-inflamatório, redutor da motilidade intestinal, ansiolítico e anticonvulsivante (LEAL-CARDOSO; FONTELES, 1999). Quanto ao mecanismo de ação dos óleos essenciais, Buchbauer e Jirovetz (1994) têm sugerido que estes compostos, quando inalados ou aplicados à pele, agem por meio de suas frações lipofílicas reagindo com a parte lipídica da membrana celular, e como resultado, modificam a atividade dos canais de Ca2+. Em determinadas concentrações, os óleos essenciais, através de suas propriedades físico-químicas e formas moleculares, saturam a membrana celular, podendo influenciar a atividade de enzimas, carreadores, canais iônicos e receptores (BUCHBAUER; JIROVETZ, 1994). Também são relatados na literatura efeitos dos óleos essenciais sobre o sistema cardiovascular e os mecanismos de ação envolvidos nestes efeitos. A hipotensão induzida pelo óleo essencial de Mentha x villosa é provavelmente devido a sua ação cardiodepressora direta e vasodilatação periférica, que podem ser atribuídas a uma via dependente de endotélio, através de mediadores como o óxido nítrico (NO) e/ou a prostaciclina (PGI2), ou a uma via independente do endotélio, através de bloqueio de canais de Ca2+ (GUEDES et al., 2004). Resultados semelhantes a estes também foram encontrados por Cunha et al. (2004), demonstrando que o óleo essencial das folhas de Ocotea duckei Vattimo induziu hipotensão em ratos devido à diminuição da resistência periférica vascular, e bradicardia devido à ativação indireta dos receptores muscarínicos cardíacos via estimulação vagal. Também foram observados efeitos cronotrópico e inotrópico negativos em átrio de rato devido à inibição do.

(30) 27. influxo de Ca2+, a qual parece contribuir também para a bradicardia. Além disso, foi observado que o óleo essencial de diferentes partes de Ocotea duckei (folhas, frutos, caule e raiz) induziu significante hipotensão seguido de bradicardia em ratos normotensos nãoanestesiados (BARBOSA-FILHO et al., 2008). O óleo essencial da Hyptis fruticosa também induz efeito hipotensor com aumento da freqüência cardíaca, provavelmente de origem reflexa. Este efeito hipotensor pode ser devido a uma vasodilatação direta e uma conseqüente diminuição da resistência vascular periférica. Esta vasodilatação parece ocorrer devido a uma inibição do influxo de Ca2+ através de canais de Ca2+ dependentes de voltagem (SANTOS et al., 2007). Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram ainda que o óleo essencial de Cymbopogon citratus foi capaz de induzir hipotensão e vasorelaxamento por diminuição do influxo de Ca2+ através de Cavs (MOREIRA et al., 2010).. 1.8 Monoterpenos Como relatado anteriormente, os compostos terpênicos mais freqüentes nos óleos essenciais são os monoterpenos, contribuindo com 90% dos óleos essenciais (JOSÉ, 1998; ARAÚJO, 1999; CARDOSO et al., 2000). Estes podem ser divididos em três subgrupos: acíclico (mirceno, linalol, geraniol), monocíclico (alfa-terpineol e terpinolene) e bicíclico (alfa-pineno, tujona, cânfora, fenchona). Existem outras classificações em cada um destes grupos: hidrocarbonetos insaturados (limoneno), álcoois (mentol), aldeídos ou cetonas (mentona, carvona), lactonas (os monoterpenos lactônicos são chamados de iridóides, ex. nepetalactona) e tropolonas (gama-tujaplicina) (SIMÕES et al., 2004). Assim como os sesquiterpenos e diterpenos, os monoterpenos são considerados metabólitos secundários por não serem essenciais à vida, entretanto, eles medeiam importantes interações entre as plantas e o meio ambiente (CHAPPELL, 1995). Muitos monoterpenos são amplamente utilizados na agricultura, indústrias de alimentos e de cosméticos, bem como antisséptico geral na prática médica (AESCHBACH et al., 1994; LEE et al., 1997; MANOU et al., 1998). Também são os principais responsáveis pelo aroma dos óleos de frutas cítricas, cerejas e hortelã, porém não possuem valor nutricional (SERRANO et al., 2006). Estudos têm demonstrado diversas propriedades farmacológicas dos monoterpenos, tais como antifúngica, antioxidante, antibacteriana, anticancerígena, espasmolítica, antiinflamatória, antinociceptiva e anticonvulsivante (GARCIA et al., 2008; KATO et al., 1990;.

(31) 28. SINGH et al., 2010; KARKABOUNAS et al., 2006; MAGALHÃES et al., 1998; BRITO et al., 2012; MELO et al., 2010; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Além das atividades descritas acima, os monoterpenos também desempenham efeitos significativos no sistema cardiovascular, dentre eles, vasorelaxamento, diminuição da freqüência cardíaca e hipotensão (SANTOS et al., 2011). Desta maneira, os monoterpenos podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento das doenças cardiovasculares (DCV), principal causa de morte nos países desenvolvidos e em desenvolvimento (AMERICAN HEART ASSOCIATION, 2008; BRAZILIAN SOCIETY OF CARDIOLOGY, 2007), causando impacto não só na saúde humana, como também nas áreas econômicas e sociais (LEFKOWITS; WILLERSON, 2001). Na tentativa de reduzir este impacto, vários grupos de pesquisa nas últimas décadas têm trabalhado extensivamente à procura de avanços no tratamento das DCV, tais como a descoberta de novos tratamentos terapêuticos (LEFKOWITS; WILLERSON, 2001).. 1.9 Citral O citral, monoterpeno majoritário do óleo essencial de Cymbopogon citratus, é formado por uma mistura de isômeros, conhecidos como citral A ou isômero E (geranial) e citral B ou isômero Z (neral), (Figura 1). Seus nomes químicos são, respectivamente, (2E)3,7-dimetilocta -2,6-dienal e (2Z)-3,7-dimetilocta-2,6-dienal.. Figura 1: Estruturas química dos isômeros do citral, geranial (citral A) e neral (citral B). PM: 152,24. Além de ser amplamente utilizado como agente aromatizante na indústria de perfumaria e cosmético, na preparação de sabonetes, colônias e desodorantes, bem como na indústria química, como matéria-prima para a síntese de ianonas e vitamina A (GUENTHER,.

(32) 29. 1992), estudos farmacológicos têm mostrado que o citral apresenta atividades antioxidante (GUIMARÃES et al., 2011), anti-inflamatória (LEE et al., 2008), espasmolítica (SADRAEI, et al., 2003), antimicrobiana (SADDIQ; KHAYYAT, 2010; SILVA et al., 2008; MESAARANGO, et al., 2009), larvicida e repelente (SOUZA et al., 1991). Estudos também têm demonstrado efeitos do citral sobre o sistema nervoso central (SNC), tais como sedativo (DO DO VALE et al., 2002) e anticonvulsivante (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Apesar do óleo essencial de Cymbopogon citratus ter sido capaz de induzir hipotensão e vasorelaxamento (MOREIRA et al., 2010), nenhum estudo relatando a ação do citral sobre o sistema cardiovascular foi encontrado na literatura..

(33) 30. 2 OBJETIVOS. 2.1 Geral. Avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos pelo citral em ratos normotensos através de abordagens in vivo e in vitro.. 2.2 Específicos. In vivo:. I - Caracterizar os efeitos da administração intravenosa (i.v.) aguda do citral sobre a pressão arterial (PA), freqüência cardíaca (FC) em ratos normotensos não-anestesiados; II - Caracterizar os efeitos da administração intravenosa (i.v.) aguda do citral sobre eletrocardiograma (ECG) em ratos normotensos não-anestesiados.. In vitro:. I - Caracterizar o efeito do citral sobre a reatividade vascular em artéria mesentérica superior isolada de ratos normotensos; II - Avaliar o papel do endotélio vascular e o envolvimento dos canais de Ca2+ e K+ nos efeitos induzidos pelo citral; III - Avaliar o efeito do citral sobre a sensibilização dos elementos contráteis ao Ca2+..

(34) 31. 3 MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Animais Foram utilizados em todos os experimentos ratos Wistar machos (Rattus norvegicus) (Figura 1) pesando entre 200 e 300 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS), e mantidos sob condições ambientais de temperatura e ciclo claroescuro de 12 horas (6 - 18 horas), tendo livre acesso à alimentação e água. Todos os procedimentos descritos foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (CEPA/UFS), sob o número de protocolo 37/2009, e estavam de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US National Institutes of Health (NIH publicação 85-23, revisado em 1996).. Figura 2: Rato Wistar (Foto: Luana Maynard, 2011) 3.2 Obtenção do Citral O citral (pureza: 96%) foi comercialmente obtido da SIGMA CHEMICAL CO (St Louis, MO, USA). A solução estoque de citral foi preparada emulsificando o citral com cremofor (0,1%, v/v) na concentração de 100 mg/mL. Antes dos experimentos, o citral foi diluído, nas concentrações desejadas, em solução salina/cremofor (0,1% v/v) para experimentos in vivo e Tyrode/cremofor (0,1% v/v) para ser utilizado nos experimentos in vitro. Todas as soluções foram mantidas a 0ºC. O cremofor, nas concentrações utilizadas neste estudo, não apresentou efeito sobre as preparações controles..

(35) 32. 3.3 Drogas Durante a realização dos experimentos, foram utilizadas as seguintes drogas: tiopental sódico (Cristália), sal sódico de heparina (Roche), cloridrato de L (-) fenilefrina (FEN), sulfato de atropina, cloridrato de acetilcolina (ACh), brometo de hexametônio (HEXA), NGnitro L-arginina metil éster (L-NAME), indometacina (INDO), brometo de tetraetilamônio (TEA) e ortovanadato de sódio (Na3VO4), todas da SIGMA CHEMICAL CO, St Louis, MO, USA. Para a preparação das soluções estoques, a INDO foi dissolvida juntamente com bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 5 N em salina. Todas as soluções foram mantidas a 0ºC. Quando necessário, as drogas foram diluídas em solução nutritiva, para os experimentos in vitro, ou em solução salina, para os experimentos in vivo, nas concentrações desejadas. O NaHCO3, nas concentrações utilizadas neste estudo, não apresentou efeito sobre as preparações controles (dados não-mostrados).. 3.4 Soluções Nutritivas As soluções nutritivas de Tyrode foram preparadas utilizando-se as seguintes substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de Ca2+ di-hidratado (CaCl2.2H2O), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O), bicarbonato de sódio (NaHCO3), fosfato de sódio mono-hidratado (NaH2PO4), todos da Vetec, e glicose (C6H12O6), da Qeel. Na solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 ou 60 mM, a concentração de Na+ foi equimolarmente substituída. Nas soluções nominalmente sem Ca2+, o CaCl2 foi omitido. As tabelas a seguir mostram as composições das mesmas: Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica superior. Substância. Concentração (mM). NaCl. 158,3. KCl. 4,0. CaCl2. 2,0. MgCl2. 1,05. NaHCO3. 10,0. NaH2PO4. 0,42. Glicose. 5,6.

(36) 33. Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 mM (KCl 80). Substância. Concentração (mM). NaCl. 82,3. KCl. 80,0. CaCl2. 2,0. MgCl2. 1,05. NaHCO3. 10,0. NaH2PO4. 0,42. Glicose. 5,6. Tabela 3: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 60 mM (KCl 60). Substância. Concentração (mM). NaCl. 102,6. KCl. 60,0. CaCl2. 2,0. MgCl2. 1,05. NaHCO3. 10,0. NaH2PO4. 0,42. Glicose. 5,6. Tabela 4: Composição da solução de Tyrode nominalmente sem Ca2+. Substância. Concentração (mM). NaCl. 158,3. KCl. 4,0. CaCl2. 0,0. MgCl2. 1,05. NaHCO3. 10,0. NaH2PO4. 0,42. Glicose. 5,6.