Estudo do encapsulamento do extrato bruto de acaros da especie Blomia tropicalis em lipossomas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO

DESENVOLVIMENTO

DE PROCESSOS··BIOTECNOLÓOICOS···~·~

ESTUDO DO ENCAPSULAMENTO DO EXTRATO

BRUTO DE ÁCAROS DA ESPÉCIE

BLOMIA TROPICALIS EM LIPOSSOMAS

Basilino Barbosa de Freitas Junior Autor

Porf'. Dr. Maria Helena Andrade Santana Orientadora

Dissertação submetida à comissão de Pós-graduação da Faculdade de Engenharia Química da lJNICAMP como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Engenharia Química

Campinas - SP Setembro, 1997

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li.' CHAMADA. : \ --·---~ .

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGE1>.11ARlA - BAE - UN!CAMP

FS84e

Freitas Junior, Basilino Barbosa de

Estudo do ençapsulamento do extrato protéico bruto de ácaros da espécie Blomia rropicalis efjllipossomas I

Basilino Barbosa de Freitas Junior--Campinas, SP: [s.n.],

1997.

Orientadora: Maria Helena Andrade Santana Dissertação (mestrado) -Universidade Estadual de Campina;, Faculdade de Engenharia Química

1. Acaro como transmissor de doenças 2.

Lipossomos 3. Membranas (Tecnologia) 4 Vacinas L Santana, l\laria Helena Andrade !I. UniYersidade

Estadual de Campinas. F acuidade de Engenharia Química lll Titulo

Eu ofereço este trabalho com muito amor e carinho aos meus pais Basiliuo B. Freitas e Francisca Lourenço de Freitas e a todas a pessoas que acredita em

um sonho e luta para realíza-lo de maneira justa e honesta.

Quero agradecer em especial neste trabalho à profa. Dra. Maria Helena Andrade Santana, pelo empenho e dedicação no desenvolvimento deste projeto.

Quero agradecer também aos professores Dr. Ricardo de Lima Zollner, Dr. Benedito de Oliveira e Dra. Angela Maria de Moraes por suas colaborações fundamentais na elaboração e conclusão deste trabalho

hotner1s que lutam um dia, e são bons. Há homens que lutam um ano, e são melhores ainda. Há aqueles que lutam muitos anos, e são muitos bons. Mas, há aqueles que lutam toda vida. Esses são imprescindíveis.

Dissertação defendida e aprovada em 25 de setembro de 1997 pela banca examinadora constituída pelos professores.

Pro:P Dra. Maríã/Herena Andrade Santana

7tof2 Dr. Benedíto de Oliveira Filho

I

I

Esta versão corresponde à redação fmal da Tese de Mestrado defendida por Basilino B. Freitas Junior e aprovada pela comissão julgadora em 25/09/98.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS I LISTA DE TABELAS Il LISTA DE ABREVIAÇÕES IH RES~O IV ABSTRACT V 1. O - INTRODUÇÃO 1 2.0- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4

2.1 - Considerações gerais sobre lipossomas 4

2.2 - Classificação dos lipossomas 7

2.3 - Mecanismos de formação de lipossomas 8

2.4 - Preparação de lipossomas li

2.5 - Preparação de lipossomas pelo método de hidratação do filme seco de

lipídios 12

2.6- Homogeneízação do tamanho dos lipossomas 13

2. 7- Métodos de caracterização de lipossomas 15

2.8- Estabilidade de lipossomas em fluidos biológicos 16

2. 9 - Lipossomas esteTicamente estabilizados 17

2.10 - Estabilidade de lipossomas em presença de tensoativos 19 2. J l - Interação de lipossomas com células 21 2.12 - Aplicações de lipossomas como veículo de liberação controlada de

medicamentos 22

2.13 - Aplicações imunológicas dos lipossomas 22 2.14 -Efeito da localização de proteínas encapsuladas e da carga dos

!ipossomas na resposta imune 26 2.15 - Proteínas como antígenos no tratamento de alergia 27

~·216:: Antigenicidade dos ácaros cío pó doméstico 28 2.17 - Lipossomas como veículos de alergenos no tratamento da alergia 29

3 .O -MATERIAL E MÉTODOS 31

3.1 -Material 31

3.2- Métodos experimentais e equipamentos 33

3.2.1 -Extração das proteínas dos ácaros 33

3.2.2- Eluição das proteínas extraídas dos ácaros por cromatografia

de filtração em gel de sephadex glOO 34

3 .2.3 - Caracterização dos pesos moleculares das proteínas por

eletroforese 34

3. 2.4 - Determinação da concentração total de proteínas 3 5 3 .2. 5 - Determinação do coeficiente de partição das proteína total 37 3.2.6- Preparação de Jipossomas convencionais e estericamente

estabilizado 3 8

3.2.7- Preparação de lipossomas unilamelares 38 3.2.8- Determinação do teor de fosfolipídios 39 3.2.9- Análise da ruptura dos lipossomas com Triton XlOO 40 3.2.10- Determinação do raio hidrodinâmico e distribuição de tamanhos

das vesículas 41

3.2.11 -Encapsulamento do extrato protéico bruto em lipossomas 42 3 .2.12 - Separação dos lipossomas das proteínas não encapsuladas 42 3 .2.13 - Determinação das proteínas encapsuladas 44 3.2.14- Avaliação da estabilidade dos lipossomas em presença de

tensoativos 45

3.2.15- Síntese do DMPE-PEG 45

3.2.16- Cromatografia de camada delgada ( TLC) 48

4.0- RESULTADOS E DISCUSSÃO 50

4.! - Monitoramento da extração das proteínas dos ácaros 50 4.2 - Caracterização do extrato protéico bruto 51

4.2.1 -Distribuição de pesos moleculares 51

4.2.2 -Mobilidade e!etroforética 52

4.2.4- Coeficiente de partição no sistema octanol-água 54

4.3 - Preparação de lipossomas unilamelares 55

4.3.1 -Influência da razão dspc/col 55

4.3.2- Influência do numero de extrusões na estabilidade do lipossomas 56

4.4- Caracterização dos lipossomas 58

4.4.1 -Concentração de fosfolipídios 58

4.4.2 -Estabilidade dos lipossomas em presença de Triton XlOO 59 4.4.3- Raio hidrodinâmico e distribuição de tamanhos dos lipossomas 61 4. 5 - Separação dos lipossomas das proteínas não encapsuladas 64

4. 5 .I - Perfis de eluição da proteína pura BSA em coluna de gel 64

4. 5.2 - Separação por ultrafiltração 65

4.5.3- Eluição do extrato bruto em gel de sepharose CL6B 67 4.6- Eficiência de encapsulamento de BSA nos lipossomas 67 4. 7 - Influência da razão proteínas/lipídios no encapsulamento do extrato

de ácaro. 67

4. 8 -Adsorção de proteínas na superficie do lipossomas 70 4.9- Perfis de estabilidade de lipossomas convencionais 71 4.9.1 -Influência da razão proteína/lipídio 71

4 .lO -Resultados da síntese do DMPE-PEG 72

4.1 0.1 - Cromatografia em camada delgada 72

4.1 0.2 - Rendimento 73

4.11 -Eficiência de encapsulamento do extrato bruto em lipossomas contento

PEG 73

5.0- CONCLUSÕES 75

6.0- SUGESTÕES 78

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 -Interações das vesículas fosfolipídicas com as substâncias de deferentes polaridade.

Figura 2.2 -Classificação dos lipossomas quanto à morfologia . Figura 2.3-Formação de vesículas de acordo com a "teoria do

brotamento".

I

Figura 2.4 - Representação esquemática da formação de uma vesícula multilamelar através do filme seco.

Figura 2.5 - Apresentação esquemática das interações dos lipossomas convencionais e lipossomas estericamente estabilizados com liproteinas e opsomnas.

Figura 2.6. - Perfil caracteristico da solubilização dos lipossomas em presença de tensoativos

Figura 2. 7 -Interações dos lipossomas com as células.

Figura 2.8 - Representação da resposta imune contra circunsporozoite.

do

Figura 2.9. -Representação da resposta imune das glicoproteinas de 340 KDa gp 340.

Figura 2. - Localização topográfica das proteínas nos lipossomas. Figura 2.11 - Perfil de eluição do complexo proteico dos ácaros do gênero

Blomia Tropicalis em gel de Sephadex G-100.

Figura 3.2- Síntese DMPE-PEG.

Figura 4.1- Ácaros antes da extração das proteínas.

Figura 4.2 -Ácaros na etapa final do processo de extração das proteínas .

...

Figura 4.3.- Perfil de eluição das proteínas extraídas dos ácaros do gênero

Blomia Tropicalis.

Figura 4.4 - Mobilidade eletroforética das proteínas extraídas dos ácaros e do extrato adquirido do Laboratório de Extratos Alergênicos.

I

Figura 4.5 - Perfis de estabilidade dos lipossomas compostos de DSPC/COL, razões 80/20% e 60/40%.

Figura 4.6- Perfis de estabilidades dos lipossomas compostos de DSPC/COL 60/40% em função do número de extrusões da amostra.

Figura 4.7- Curva de calibração típica de ensaio fosfato

Figura 4.8 - Perfil de estabilidade dos lipossomas vazios de composição DSPC/COL 60/40% em presença do tensoativo Triton XlOO.

Figura 4.9- Distribuição de tamanhos e diâmetro médio de lipossomas vazios, determinados por espalhamento quase elástico de luz, QLS.

Figura 4.

encapsulando proteínas, determinado de luz, QLS.

de lipossomas espalhamento quase elástico

Figura 4.10- Perfil de eluição de lipossomas e BSA em Sephadex G 100. Figura 11 - Perfil de eluição de lípossomas e BSA em Sepharose CL6B. Figura 4. - Razões proteína/lipídio inicial e após o encapsulamento. Figura 4.13 - Eficiência de encapsulamento das proteínas.

I

Figura 4.14- Perfis de estabilidade dos lipossomas em presença do tensoativo Cl2E5.

Figura 4.15- Perfis de estabilidade dos lipossomas em presença do tensoativo

Figura 4.17 - Analise em TLC da mistura reacional na produção do PEG-DMPE

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 -Classificação dos lipossomas quanto ao tamanho.

Tabela 3.1 - Pesos moleculares dos marcadores usados na Eletroforese Tabela 3.2- Programa de eluição das amostras no processo de ultrafiltração. Tabela 3.3- Gradiente de solvente para purificação do PEG-DMPE.

Tabela 4.1 -Dosagem da proteína total extraída dos ácaros.

Tabela 4.2 - Eficiência de encapsulamento detenninada após ultrafiltração. Tabela 4.3- Influência da razão proteína lipídio na eficiência de

encapsulamento do extrato bruto de ácaws.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

~' _ área superficial ótima

lc - comprimento crítico da cadeia hidrofóbica.

p -parâmetro de empacotamento

Te- temperatura de transição de fase dos lipídios. VML -Vesícula Multilamelar

VOL -Vesícula Oligolamelar

VUP - Vesícula Unilamelar Pequena VUG- Vesícula Unilamelar Grande VUGI- Vesícula Unilamelar gigante VMV -Vesícula Multivesicular gp - glicoproteínas

BSA - Albmnina de soro bovino PEG - polietileno-glicol

DSPC - L-a- distearoilfosfatidilcolina

DMPE - L-a-dimiristoilfosfatidiletolanamina COL - Colesterol

EPSON - s-ácido amino capróico EPMSF- Fenil meti! sulfonil fluoretro

DMPE - Dimirístoilfosfatidiletolanamina CD - Carbonil diimidazole

BCA - ácido bicincrônico

Rh -raio hidrodinãmico k - constante de Boltzman

- coeficiente de difusão translacional

11 - viscosidade TEA - trietilamina

IV

RESUMO

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que~~.~-~.<

representam uma das principais fontes desencadeadores de doenças alérgicas. Dentre esses ácaros existe a espécie Blomia Tropicalis, causadora de Rinite Alérgica. As glicoproteinas encontradas no corpo dos ácaros Blomia

Tropicalis são os componentes alergenos responsáveis pelo desencadeamento

do processo alérgico.

Um dos problemas enfrentados na imunoterapia de doenças alérgicas é a qualidade do alergeno empregado e a regularidade de exposição do alergeno ao sistema imunológico, a qual é ainda pouco definida.

O desenvolvimento de terapias alternativas na forma de apresentação controlada do alergeno ao sistema imunológico é de extrema importância no entendimento do mecanismo de ação dos imunoterápícos e no tratamento de doenças alérgicas.

Lípossomas ou vesículas lipídicas, são estruturas ocas formadas por fosfolipídios agregados, capazes de encapsularem substâncias de natureza tanto hidrofilica como hidrofóbica. Essas características fazem dos lipossomas um sistema muito promissor para diversas aplicações, dentre as quais a liberação controlada de medicamentos.

Neste trabalho realizou-se a extração e caracterização das glicoproteínas alergênicas existentes no corpo dos ácaros da espécie Blomía

IV

Tropicalis, bem como o seu encapsulamento em lípossomas e caracterização das vesículas obtidas.

v

ABSTRACT

House dust mites represent one of the maJor sources of allergic diseases. Among them, there is a class named Blomia Tropicalis which causes Allergic Rhinítis. The substances maínly responsible for the beginning of the aUergic reaction are glycoproteins from Blomia Tropicalis.

One of the problems of immunotheraphy related to allergic diseases is the quality of allergen used and the regularity of exposition to immunological system. these parameters are not weU defined in immunotheraphy yet.

Developíng new immunotherapícis is a very important issue in order to excell the existing treatments and promote a comprehensive analysis of the mechanism o f immunotherapicis action. Liposomes or iipíd vesicles are empty particles composed of phospholípids able to encapsulate hydrophílíc and hydrophobic molecules.

Liposomes are very powerful systems for severa! applications including controlled drug delivery.

This work focuses on the encapsulation and characterization of lipossome containing glycoproteins extracted from Blomia Tropícalis mítes.

encapsulation and separation process has beer analyzed in terms efficiency as a function o f proteinllipid ratio in the initial solution.

Capitulo I - Introdução 1

1.0 -INTRODUÇÃO

à ·

ntilizaçltb

da

mmorta doslfiedtcamemos

é

um compromisso entré a

eficácia curativa e os efeitos colaterais tóxicos. A razão entre esses dois efeitos expressa o índice terapêutico, o qual é uma função complexa de parâmetros tais como a farmacocínética, farmacodinâmica e a biodistribuição de uma determinada droga.

Os lipossomas normalmente aumentam o índice terapêutico de medicamentos através de alterações do modo de liberação da droga e conseqüentemente dos parâmetros acima citados. No caso específico em que o sistema liberador tem habilidade de atingir células específicas ou órgãos com grande especificidade, o aumento do índice terapêutico é urna conseqüência da redução do espalhamento da droga em outros tecidos.

As principais desvantagens da utilização de lipossomas in vivo são os problemas de estabilidade, esterilização e dificuldade de reprodutibilidade das formulações com o aumento de escala. A estabilidade in vivo determina o tempo de duração da droga no organismo, e é uma função do tamanho, lamelaridade das partículas e principalmente da composição dos lipossomas e do composto encapsulado.

Devido às características dos lipossomas de encapsulamento e liberação controlada de medicamentos, a sua utilização como veículo para administração de alergenos purificados representa uma alternativa viável para contornar os problemas de qualidade e regularidade de exposição do alergeno ao sistema imunológico. Essa veiculação possibilita também um mator entendimento do mecanismo de ação dos imunoterápicos.

No presente trabalho foi feita a extração e caracterização do complexo protéico bruto do corpo dos ácaros da espécie Blomia Tropícalis, e

Capitulo I -Introdução 3

dimiristoilfosfatidiletonalamina ( DMPE ) com polietilenoglicol ( PEG ) de peso molecular 2000.

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 4

2.0 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste item, serão abordados aspectos relevantes do estudo sobre lipossomas, e suas aplicações como veículo de liberação controlada de medicamentos especialmente os antígenos.

2.1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE LIPOSSOMAS

Lipossomas, ou vesículas lipídicas, são estruturas ocas, constituídas de um volume aquoso central circundado por uma bicamada lipídica ( composta geralmente por fosfolipídios e colesterol), fmmando partículas com diâmetro da ordem de dezenas de nanômetros a dezenas de micra.

As moléculas de fosfolipídios são constituídas por uma região polar ou cabeça hidrofilíca (grupo fosfato ) e por uma parte apoiar ou cauda hidrofóbica (geralmente formada por duas cadeias de ácido graxos), exibindo assim uma característica anfifilica. Devido a essas características quando os fosfolip:ídios são colocados em um meio apoiar ou polar as suas moléculas tendem a organizarem-se de forma ordenada para que a intensidade das forças de interações iônicas, estérícas, Van der Waals e de hidratação sejam mínimas [ Lasic, 1992 ].

Os fosfolip:ídios em meio polar organizam-se na forma de lamelas ou bicamadas, expondo as cabeças hidrofilicas e escondendo as caudas hidrofóbicas, formando estruturas termodinamicamente desfavoráveis, que para adquirirem estabilidade fecham-se sobre SI mesmas formando

lipossomas. No processo de formação dos lipossomas ocorre o encapsulamento de parte do meio aquoso em que os fosfolipídios se encontram dispersos. A bicamada formada é capaz de acomodar moléculas

Capitulo Il - Revisão Bibliográfica 5

hidrofóbicas do meio e comporta-se como uma membrana semipermeável, em relação ao material encapsulado dentro do volmne aquoso central dos lípossomas,[ Lasic, 1992 ]. A figura 2.1 apresenta mna estrutura típica dos

Figura 2.1 - Estrutura de mna vesícula fosfolípídica, contendo substâncias encapsulando no cerne aquoso, na bícamada "P''""'" e ligada a sua superfície da bicamada.

Israelachvili em 1980 propôs que a morfologia das estruturas formadas por moléculas de lipídios e outros compostos anfifílicos em soluções aquosas pode ser predita através sua propriedade geométrica de empacotamento. Essa propriedade pode ser representada pelo parâmetro de empacotamento p, de acordo com a equação.

Capitulo II - Revisão Bibliográfica 6

(2.1)

o~~~~~,·~~~~~o:íf<te '\f• é

o voirnne da regiãO 'lrldMõtltca;·

li'; ê! ã

ID'elf"supefficiat

•ôfiinã~~-~~-~­ ( definida como a área ocupada pela porção hidrofilica quando a energia de

interação entre os lipídios é mínima) e

le

é o comprimento critico da cadeia hidrofóbica (comprimento efetivo que as cadeias podem assumir quando totalmente distendidas).

Assim, para p<l/3, a estrutura formada é a de micela esférica, e as moléculas podem ser geometricamente representadas por um cone. Moléculas com duas cadeias apoiares, são representadas por um tronco de cone, e para 1/3<p<ll2 podem formar micelas cilíndricas, enquanto que com 112<p<l podem formar lipossomas. Para p próximo a 1, a moléculas podem formar estruturas planas, enquanto para p> 1 formam micelas invertidas. Outros fatores que podem afetar as estruturas formadas pelas moléculas são: o tamanho da parte hidrofilica, a presença de ramificações e insaturações da parte hidrofóbica, a força iônica do meio aquoso e a temperatura.

A bicamada lipídica possui um arranjo líquido-cristalino ordenado, no qual as cadeias de hidrocarboneto apresentam mobilidade limitada, caracterizando uma fase ou fluidez da bicamada. O aumento da temperatma produz um grau de desordem no arranjo das moléculas, e consequentemente uma mudança de fase. A temperatma na qual esses efeitos ocorrem é chamada de temperatura de transição de fase, (Tm) . Cada tipo de lipídio possui uma temperatura característica de mudança de fase, a qual pode variar de -15

oc

para a fosfatidilcolina da gema do ovo até mais de 50 °C para distearoilfosfatidilcolina. A mistma de dois ou mais tipos de lipídios resulta em temperaturas de transição intermediárias, e a adição de colesterol na composição das vesículas pode eliminar a transição de fases.

Capítulo li - Revisão Bibliográfica 7

O conhecimento da temperatura de transição dos lipídios é de fundamental importância para a preparação dos lipossomas, pois esta detennina propriedades importantes como permeabilidade da bicamada, fusão,

- d . ' ' . - • c _, 1-. . , _ , .>

...•...••...••••• ~gaçao _as '«:ilCU•a" e.sua 1nte.raçao com protewas, a.etan..o a estaw .... a .. e ... .

dos lipossomas e o seu comportamento em sistemas biológicos. A preparação dos lipossomas deve ser feita acima da temperatura de transição dos lipídios, a frm de obter uma bicamada mais fluida e mais estável, [ New, 1990

l

2.2 - CLASSIFICAÇÃO DOS LIPOSSOMAS

Os lipossomas podem ser classificados quanto ao tamanho e número de lamelas, tal como apresentado na Tabela 2.1. Bare:nholz e Crommelin ( 1994) sugeriram que vesículas grandes são aquelas em que a curvatura da bícamada lipídica não apresenta efeitos detectáveis nas propriedades fisicas dos lipossomas como transição de fase gel-líquido e distribuição de lipídios entre as bicamada, Este efeito não seria pronunciado em lipossomas de diãmetros maiores do que l OOnm.

Tabela 2.1 -Classificação dos lipossomas quanto ao tamanho Classificação dos lipossomas Diãmetro Vesícula Multilamelar (VML) > 0,5 Jlm Vesícula Oligolamelar (VOL) 0,1 a l 11m Vesícula Unilamelar Pequena (VUP) 20al00mn

Vesicula Uuilamelar Grande (VUG) > 100nm Vesícula Unilamelar gigante (VUGI) > 1 pm

Capitulo II - Revisão Bibliográfica 8

figura 2.2 apresenta uma classificação dos lipossomas quanto á morfología.

e

Figura 2.2- Classificação dos lipossomas quanto à morfologia (a) vesícula unílamelar pequena, VUP; ( b) vesícula unilamelar grande, VUG; (c) vesícula multilamelar, ML V; ( d ) vesícula oligolamelar, VOL ; ( e )

vesícula multivesicular VMV.

f

Figura adaptada de Moraes, 1996]

2.3 -MECANISMOS DE FORMAÇÃO DE LIPOSSOMAS

Ao contrário do aspecto experimental da preparação dos lipossomas, no qual é bem conhecida a influência dos diferentes métodos de preparação e outros parâmetros, os mecanismos do processo de formação das vesículas são bem pouco entendidos. V árias modelagens e simulações computacionais têm sido feitas para tentar explicar a estabilidade termodinâmica e a distribuição de tamanhos de diferentes substâncias liotrópicas, micelas normais e reversas, microemulsões e lipossomas, porém considerações energéticas de estruturas intermediárias têm sido feitas somente para !ípossomas preparados pelo método de remoção de detergente [ Lasic; 1993].

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 9

Sabe-se que existem quatro tipos de forças envolvidas no processo de formação de lipossomas: forças eletrostáticas, forças de Van der Waals, forças de hidratação e forças estéricas.

lipídios com cabeças polares carregadas, e agem tanto de forma a desestabilizar a bicamada lipídica através da repulsão entre as cabeças polares, como evitando a aproximação de outros lipossomas e posterior fusão e agregação. A intensidade das forças eletrostáticas depende do pH, da constante dielétrica e da forca iônica do meio.

As forças de Van der Waals atuam na parte apoiar do lipídios e são forças atrativas, que agem de maneira a estabilizar a bicamada e agregar duas ou mais vesículas.

As forças de hidratação aparecem com a hidratação das cabeças polares, e são forças repulsivas que não permitem a agregação de lipossomas constituldos lipídios com cabeças não carregadas. Essas forças assim como as eletrostáticas agem tanto intermembrana como intramembrana.

As forças estéricas em sistemas de lipossomas são também repulsivas e são mais pronunciadas em vesículas compostas de lipídios com grandes cabeças polares, dos quais são associados polissacarideos e polímeros. A origem destas forças são ainda obscuras, mas acredita-se que as forças estéricas agem na bícamada e entre as vesículas, aparecendo devido ao movimento térmico ondulatório vertical das cabeças polares da bícamada, pelo simples contato e ao entrelaçamento entropicamente e osmoticamente desfavorável das cabeças polares. Com o entrelaçamento das cabeças polares há mna redução da entropia e da concentração de água nas suas proximidades, originando mna corrente de moléculas de água entre as cadeias poliméricas desfavorável osmoticamente ao entrelaçamento. O entrelaçamento reduz

Capitulo U - Revisão Bibliográfica

também a mobilidade e o número de estado comformacional das cadeias poliméricas, sendo assim entropicamente desfavoráveL

O fato de que vários tipos de lípossomas poderem serem preparados

~~~~~~~~~Jl"'9~r4i~es méf9dgs ÍIDJllíca ~e existem dín:rsos mecanísmos~operando na sua fonnação, especialmente quando comparamos métodos como do filme seco, dispersão de lipídios em água, da solução de lipídios em fase orgânica e emulsão de lipídios. Mesmo dentro de um mesmo método, existem mecanismos operando diferentemente, como por exemplo na preparação de VML e VUP através do filme seco de lipídios, e na preparação de VUG por sonicação, extmsão, remoção de detergente e evaporação da fase reversa.

Os mecanismos que atuam no processo de formação de lipossomas partindo da bícamada preformada são: brotamento e fragmentação da bicamada. Estes mecanismos estão presentes no métodos da preparação de lipossomas por hidratação do filme seco de lipídios seguido de extrusão ou sonicação. O mecanismo do brotamento está ilustrado na figura 2.3.

O

lrradiacão ultrassõníca ou extrusão a alta pressão.

extrusão a baixa e médla ~

----pressão através de poros/' ~

oo

t.m<mho " ' " " " ' / / ' -

o

o

Figura 2.3- Formação de vesículas de acordo com a "teoria do brotamento" [Figura adaptada de Moraes, 1994].

~C~axp~ittd~o~II~·--~R~e~~~s=ão~B~ib=l~io~~~a='fi=Ic=a~ ___________________________ ll

Por outro lado, técnicas que iniciam a preparação das vesículas a partir

de uma emulsão água/óleo podem serem entendidas pelos mecanismos da coalescência de micelas reversas (caso de emulsão simples) ou coalescêncía

2,4- PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS

Atualmente existem vários métodos de preparação de lipossomas, Deve-se escolher o método a ser utilizado de acordo com o objetivo da aplicação e da investigação a ser feita com os lipossomas produzidos. Muitas vezes a composição lipídica e a sensibilidade do material a ser encapsulado detenninam o método de preparação dos lipossomas. Os lipossomas preparados por diferentes métodos possuem propriedades deferentes tais como: eficiência de encapsulamento, penneabilidade e estabilidade da bicamada.

Um dos métodos mais utilizados é o da hidratação do fihne seco, onde a mistura de lipídios é iniciahnente solubilizada em uma solução orgãnica, e depositada nas paredes de um balão redondo pela evaporação do solvente, formando um filme seco de lipídios. Posteriormente é feita a hidratação do filme com solução tan1pão, e os lipossomas formados são do tipo multilamelares ( ML V).

Outro método utilizado é o da injeção, onde os lipídios são solubilizados em etano! ou éter e injetados por meio de uma seringa no meio aquoso onde se deseja formar os lipossomas. A ~ande vantagem desse método é a sua simplicidade e as grandes desvantagens são a baixa solubilidade dos lipídios no etano! e a dificuldade de remoção do etano! do mew.

Capitulo II - Revisão Bibliográfica 12

~~~---~~~~~---Uni terceiro método é o da demulsificação, no qual existem duas maneiras de preparação: o da fase reversa e o da dupla emulsão. O método baseia-se na solubilização dos lipídios em um solvente orgàníco volátil, que . posteriormente é místurndo com uma solução aquosa em. menor proporção. A

aplicação de uma agitação vigorosa da solução aquosa produz micro bolhas no interior do meio orgànico, e os fosfolipídios presentes formam mícelas em sua volta, de maneira que as cabeças polares encontram-se orientadas no sentido das bolhas. Com a remoção do solvente orgãnico as micelas se tomam invertidas e coalescem formando lipossomas.

2.5- PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS PELO MÉTODO DA HIDRATAÇÃO DO FILME SECO DE LIPÍDIOS

Quando o filme seco de lipídios é exposto ao aquoso, as suas camadas externas da superfície do filme hídratam-se mais do que as camadas internas e bolhas convexas são formadas na superfície do filme, devido ao aumento da área das cabeças polares com a hidratação, e da permeação de água através das bolhas e entre as camadas do filme. As bolhas da superfície crescem na forma tubular e alguns cristais ou defeitos de empacotamento na superfície fazem com que ocorra torque nestas estrutmas, originando uma configuração helicoidal. Depois de um certo tempo ocorre a estabilização da estrutura devido ao equilíbrio entre as forças repulsivas ( eletrostática, hidratação e estéricas) e as forças atrativas de Vau der Waals. Sob agitação estes tubos se destacam e imediatamente fecham seus cantos expostos, formando os lipossomas. A figura 2.4 apresenta o esquema desse processo.

Capitulo -Revisão Bibliográfica 14

--~---~~---O primeiro método usado foi a souicação [ Papahadhopoulos et al, 1967

l

Com o desenvolvimento de filtros de policarbonato resistentes e com tamanho de poros definidos foi possível utilizar-se a extrusão, e

francesa [ Olson et al, 1979.]

Dos métodos de tratamento mecânico destaca-se a extrusão, por produzir lipossomas de tamanho defiuido e uma estreita faixa de distribuição de tamanhos, comparado com a sonicação, microfluidização e prensa francesa.

O método da extrusão baseia-se na passagem de ML V' s por filtros de poros de tamanhos bem defiuidos sob pressão normalmente de nitrogênio, da ordem de 100 a 1500 atm [Olson, 1979]. O volume das extrusoras varia de 1 ml a diversos litros, e são equipadas com jaquetas de aquecimento para controle da temperatura . Os filtros de poli carbonato possuem diâmetro de lO

a 142 mm e poros de diversos 1-ffil a 30 nm. A extrusão normalmente é feita em uma seqüencia de várias passagens da dispersão de lipossomas de concentração igual ou superior a de até 150mM, através do filtro. Recomenda-se um mínimo de I O passagens para se obter uma boa uniformidade da distribuição de tamanhos das vesículas, [ Mayer et al, 1986].

Na operação prensa francesa os lipossomas são colocados em um cilindro e forçados através de nm orifício por pistão, com uma pressão de até 2500 Psi [Barenhols et al, 1979]. As grandes desvantagens é a utilização de uma concentração máxima de lípossomas de 20 mM, a produção de uma larga faixa de distribuição de tamanhos e difícil operação a alta temperatura.

No método da micro:fluidização os lipossomas são pressurizados através de um filtro de poros definidos e posteriormente a solução e dividida em duas correntes que se colidem. As grandes vantagens deste método é que se pode operar com altas concentrações de lipossomas e elevadas

Capitulo H- Revisão Bibliográfica 15

~~---~~~---temperaturas, porém os liposomas produzidos possuem uma ampla faixa de distribuição de tamanhos.

O método de sonicação baseia-se em submeter os lípossomas a uma

~~-.~ate@llli. t~ ultraso:ooica pr9dniliiàa p9i um ~99i Gil! llastã9 imwsG aa SQ~fi)àer·~~. ·~-~

A posição do agitador e a mtensidade de vibração são parâmetros importantes a serem controlados neste processo. Uma das grandes vantagens em se usar a sonicação em relação aos outros métodos é poder trabalhar abaixo da temperatma de transição ( Te). As desvantagens deste método é a produção de uma larga faixa de distribuição de tamanhos de partículas e possibilidade de contaminação com o metal do agitador (geralmente de titãnio ).

2.7- MÉTODOS DE CAR..A..CTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS

Os lipossomas preparados como descritos nos itens anteriores possuem grandes variações em suas propriedades físicas e químicas, tais como tamanho, distribuição de tamanhos, lamelarídade, permeabilidade, estabilidade, eficiência de encapsulamento e possivelmente grau de degradação.

A maioria dos métodos usados na caracterização dos lipossomas, podem serem agrupados nas seguintes categorias microscopia, espectroscopia, difração e espalhamento de luz, termodmâmica, hidrodinàmica, mecânica e química. Outros, métodos de natureza biológica consistem em testes "ín

vivo" e em "in vitro" para determinar a reatividade, a interabilidade, toxicidade e resposta biológica.

A microscopia baseia-se na observação direta dos lipossomas, que tanto pode ser em microscópio óptico ou eletrônico, permitindo determinar o tamanho, homogeneidade e lameridade das vesículas. Em alguns casos é

Capitulo H- Revisão Bibliográfica 16

~~~----~----~~~---possível observar a adsorção de lipossomas nas células usando microscopia eletrônica.

Os métodos espectroscópicos permitem uma estimativa qualitativa e

qnavtitatiVI! do tamanho e concentração de li:PQ~~onMil> a~:<Íls da Qn'bidez das~~~~~···

soluções.

Os métodos de difração e espalhamento de luz são bastantes utilizados para obter informações sobre a estruQn'a dos lipossomas. A técnica de espalhamento de luz é largamente utilizada para determiuar o rruo hidrodinâmico e a distribuição de trunanbos dos lipossomas.

Métodos calorimétricos como ca!orimetria, dilatometria e eletroquímicos são mais usados para o estudo energético de transição de fases.

2.8 -ESTABILIDADE DOS LIPOSSOMAS EM FLUIDOS BIOLÓGICOS

A constituição do plasma sanguineo possm grande influência na estabilidade dos lipossomas devido à presença de lipoproteínas de alta densidade, fosfolipases, tensoativos e opsoninas, que adsorvidas na superficie dos lipossomas desestabilizrun a sua estrutura. No caso particular das opsoninas, a sua adsorção ativa o sistema reticulo-endotelial fazendo com que os lipossomas sejrun rapidrunente eliminados da corrente sanguínea. Além destes fatores o pH, a força iônica e a presença de íons Ca+2 interferem na estabilidade da bícrunada lipídica.

A composição química e as condições de preparação dos lipossomas trunbém influencirun fortemente na estabilidade dos lipossomas em fluidos biológicos.

Capitulo II - Revisão Bibliográfica 17

~~~--~~~~~~~---Outros fatores tais como a presença de impnrezas, sufatantes de cadeia simples, defeitos de estrutura e alto raio de curvatura nas vesículas, defeitos decorrentes da preparação no empacotamento da bicamada lipídica que podem

~~~"c~mm~~"~ c~,c~mÍnÍmizadqs pela adíçãodecolesteroJJI uma u;mcentração eutre3Q<i50%ccc e pela manufatura a uma temperatura acima de transição de fase ( Te ) também influenciam a estabilidade do lipossomas

f

Lasic, 1993].

2.9- LIPOSSOMAS ESTERICAMENTE ESTABILIZADOS

O tempo de vida dos lipossomas no corpo humano é muito baixo devido a interação com as células e com os componentes do plasma, fazendo com que ocorra uma liberação prematura da droga encapsulada no sangue. O tempo de vida dos lipossomas é da ordem de um a dezenas de minutos, e isto limita a utilização dos lipossomas na administração de medicamentos por via intravenosa [ Senior, 1987].

Lipossomas compostos de lipídios não carregados e de alta temperatura de transição de fase ( Te ) misturados com 30 - 50% de colesterol apresentam um tempo de meia vida ( Tv2 tempo necessário para destruir a metade dos

lipossomas iniciais) da de diversas horas, para partículas com diâmetros maiores lOOum [ Hwang et al 1980; Senior et ai, 1985]. Estudos posteriores demonstraram que lipossomas composto de glangliosídios ( GM1) e fosfatidilnusitol hidrogenado ( HPPl) apresentaram tempos de meia vida em tomo de lO horas [ Sell, 1987; Gabizon et al, 1988].

W oodle et al em 1990 introduziram na formulação dos lipossomas lipídios diacíl com as cabeças polares associadas a polímeros, e observaram aumentos significativos do tempo de meia vida dos lipossomas no sangue. Um dos polímeros mais utilizados atualmente é o polietileno-glicol ( ) de

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 18

--~---~~---peso molecular 1900 ligado covalentemente a cabeça polar da fosfadiletolanamina em concentrações de 5-l 0% em relação à concentração total de lipídios. Diversos trabalhos usando este polímero demonstraram um ~····~···~····~·~~:ande anmemo &J.a estabihd.alie d>!s hpossalil.aS f.Woodie e basto,

l991]room-um tempo de circulação no sangue de macacos da ordem de l991]room-um dia e em humanos maior que 40 horas.

Embora vários trabalhos tenham demonstrado a maior estabilidade de lipossomas contendo PEG, o mecanismo deste processo é pouco conhecido. Um dos modelos qualitativos que tenta explicar este processo é que a estabilização resulta de uma concentração superficial de grupos altamente hidratados, que inibem esteticamente a aproximação de uma grande variedade de componente do sangue na superfície dos lipossornas [ Klibanov et ai, I 990 e Lasic et al, 1991]. A figura 2.5 mostra um esquema do efeito das cadeias de PEG em lipossornas na interação com os componentes do plasma, comparado com lipossomas convencionais.

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( 1 ) ₍₂₎

Figura 2.5 - Apresentação esquemática das interações dos lipossomas convencionais e lipossornas esteticamente estabilizados com liproteínas e opsoninas. As iípoproteinas ( ), adsorvidas na superfície dos lipossomas convencionais ( 1 ) desestabilizam a estrutura através da troca lipídios, As opsoninas ( B ), adsorvidas na superfície dos lipossomas atuam corno bandeiras, identificando os lipossornas como

Capítulo - Revisão Bibliográfica 19

~~~~~~~~~~~~---partículas estranhas ativando os macrófagos do sistema imunológico. Lipossomas ( 2 ) estericamente estabilizados possuem longas cadeias de polietileno glicol que previnem a esteticamente a adsorção de lipopmteínas e op?m>inas na !luperfície dg lípg~~Qma. {1i'~a adaptada"···." .•

de Lasic, 1993].

2.10 - ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS EM PRESENÇA DE TENSOATIVOS.

Os tensoativos penetram nos lipossomas alterando o empacotamento da sua bicamada lipídica, e dependendo da sua concentração podem desestabilizar totalmente as vesículas. Tensoativos tais como o Triton X-100, são utilizados na solubilização da membrana celular para estudo de proteínas e outros constituintes.

Tensoativos não-iônicos foram utilizados em vários estudos sobre a estabilidade de hpossomas. Para um mesmo tempo de exposição, a concentração do tensoativo influencia o estado de agregação das vesículas, originando perfis típicos de solubílízação tal como apresentado na figura 2.6.

Capitulo li -Revisão Bibliográfica 20 O,:'IJ , - - - - , - - - , - - - , - - - , - - - , o,;;s

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Figura 2.6. - Pefil característico da solubilização dos lipossomas em presença de tensoativos

O perfil de solubilização dos hpossomas pode ser dividido em três regiões características: A primeira, na qual há somente um entumecimento com aumento insignificante do tamanho das vesículas, a qual é seguida por uma segunda fase, na qual concentrações elevadas de tensoativos produzem o crescimento e a agregação das vesículas, e finalmente, à

concentrações de tensoativos da ordem de 80% há a desestruturação da bicaroada com a formação de micelas. Essas regiões são identificadas através de medidas de turbidez das soluções, ou do diâmetro médio das vesículas por espalhamento quase elástico de [Edwards e Alrngreen, 1990.]

Os perfis de solubilização lipossomas em presença de tensoativos não iônicos, são muito úteis para a determinação dos mecanismos de interação de lipossornas com tensoativos, bem corno para estimar a integridade da bícaroada lípidíca das vesículas nas várias condições, determioando assim

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 22

--L---~~---2.12- APLICAÇÕES DE UPOSSOMAS COMO VEÍCULO DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE MEDICAMENTOS.

~--~~~-~-~~---~----Existe <W!alm~ um gtllDde illtell::iSC ...

ew

!JSíl! Iú;!q§si@as como·---~. . .~ veículos transportadores de medican1entos, não somente devido ao

encapsulamento de uma grande variedade de substâncias biologicamente ativas, mas também por poderem ser administrados em humanos e outros animais sem efeitos adversos.

Experimentalmente foi comprovado que drogas encapsuladas em lipossomas foram 700 vezes mais efetivas do que na sua forma não encapsulada, no tratamento de doenças como leishmaniose, hepatite e doenças de macrófagos do baço[Alving, 1983; Alving, 1978; New et al, 1978]. A eficácia dos lipossomas foi tan1bém comprovada como veículos de transporte de anfotericina B no tramento de doenças fungais associadas com macrófagos [ Taylor et al, 1982; Graybill et al, 1982], e doxorrubicina no tratamento de câncer.

Em particular, o sistema reticulo-endotelial é o alvo passivo ou natural dos lipossomas, o que é demonstrado pela sua grande potencialidade no tratamento de doenças que envolvem os macrófagos, [ Alving, 1983].

2.13 -APLICAÇÕES IMUNOLÓGICAS DOS LIPOSSOMAS

A vacinação é nm dos métodos mais utilizados para a prevenção de doenças. Vacinas convencionais são constituídas de microrganismos mortos ou enfraquecidos e devido à sua complexidade podem provocar fortes reações imunológicas, ou infecções fracas. A recente introdução de vacinas sintéticas tem eliminado as reações adversas provocadas por contanlÍllantes existentes

Capitulo II - Revisão Bibliográfica

nas vacinas convencionais. No entanto, por serem constituídas geralmente de peptidios sintetizados como mna cópia curta da sequencia de proteínas microbianas, as vacínas síntéticas apresentan1 respostas imunológícas fracas.

--···~···.-... . ... Um resposta imune forte requer que o agenteímlmogêníco PoSSWLWit alto peso molecular. Antígenos de pesos moleculares menores do que 1000 Da não são imunogênicos, enquanto que aqueles com pesos moleculares por volta de 6000 Da e acima apresentam fraca e boa imunogenicidade respectivaniente. Antígenos de baixo peso molecular podem ter sua capacidade imunogênica amnentada quando combinados com adjuvantes. Os adjuvantes mais utilizados são: hidróxido de alunúnio e o adjuvante de Freood's. Em 1974 foi demonstrado que hpossomas potencialízaram a resposta imooe ao encapsular toxinas da difteria de baixa capacidade imooe, e em anos seguintes outros trabalhos demonstraram que bactérias, vírus, protozoários e outros antígenos exibiram excelente imimogenicidade quando

encapsulados ou acoplados na superficie de lipossomas, [ Lasic, 1993].

Lipossomas encapsulando vacinas reduzem os efeitos de toxicidade e até reações anaflláticas. Por esses motivos os lipossomas são considerados como mn tipo de adjuvante muito versátil devido às suas caracteristicas físico químicas, por serem compostos de produtos naturais, biodegradáveis, e por não apresentarem imimogenicidade quando vazios e serem menos tóxicos e irritantes do que os imimoadjuvantes convencionais.

Wagner et al (1984) demonstraram que a incorporação de compostos alergênicos em lipossomas reduziu sensivelmente as reações anafiláticas e amnentou a produção de anticorpos protetivos. Diversos autores mostraram que a resposta lgG amnentou com o encapsulamento de alergenos em lipossomas [ Genín et al, 1994]. Geralmente a resposta imime de antígenos associados a lipossomas amnenta com a adição de outros adjuvantes, como o complexo de Freimd's, hidróxido almnínío, fosfolipídíos, etc. Um exemplo

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 24

~~---~---desse efeito é mostrado nas figuras 2.8 e 2.9, com dados referentes ao encapsulrunento em lipossomas de peptidios circunsporozoite (CS), antígeno retirado do Plasmodium tálciparum, causador da malária, e com lípossomas

·~~ ·~··· • • m em:apsnlando

proteínas do

vims da Herpes ( E:mstein Bar)

l Ostro,

J987L. ···~·

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O, O

5 10 15 20

Semanas após a primeira imunização

Figura 2.8 - Representação da resposta imune contra peptidios do circunsporozoite.

As curvas representam a atividade no plasma (dilnição 1: 1000) de mn coelho imunizado com peptidios de J 6 aminoácidos sintéticos conjugados à

albumina do soro bovino. O peptidio foi derivado da proteína CS do

Plasmodium falciparum. O antígeno foi injetado livre, e em lipossomas, ou

em lipossomas contendo lipídios A. A albumina conjugada ao peptidio foi encapsulada nos lipossomas e atividade resposta foi medida espectrofotometricamente [Figura adaptada de Ostro, 1993].

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Figura 2.9. -Representação da resposta imune das glicoproteinas de 340 KDa gp 340 marcadas com iodo 125 ligadas ao plasma de camundongo imunizado com proteínas do virns da herpes, (a) gp 340 com adjuvante de Freund's; (b) injeção IV de gp 340 encapsulada em liposscmas, (c) injeção de gp 340 com lipossomas junto com células de Bordel/a

pertussis ; (d) injeção IP de gp 340 com lipossomas incorporando

lipídio A; (e) injeção IV de gp 340 com lipossomas incorporando lipídio A; (í:) Como em (d) mas com uma dosagem de antígeno menor, [Figura adaptada de Ostro, 1993].

2.14- EFEITO DA LOCALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

ENCAPSULADAS E DA CARGA DOS UPOSSOMAS NA RESPOSTA IMUNE.

As proteínas podem localizar-se tanto no interior das vesícnlas como também na superficie e na bicamada lipídica, dependendo do grau de hidrofobicidade. Proteínas hidrofílícas tendem a se localizarem no interior dos lipossomas pelo encapsulamento e podem também serem adsorvidas na superfície devido à interação com as cabeças polares. Proteinas hldrofóbicas localizam-se no interior da bicamada lipídica. A Figura 2.1 O mostra os tipos de interação das proteinas com os iipossomas.

Figura 2. lO - Localização topográfica das proteínas nos hpossomas. As proteínas podem ser igualmente ser adsorvidas na snperficie da bícamada lipídica, situarem no interior da bícamada ou encapsulada no interior dos lipossomas. [Figma adaptada do Ostro, 1987]

O aparecimento da resposta imune está associada à localização das proteínas nos lipossomas. Vários estudos demonstram que proteínas localizadas na superficie das vesículas mostraram-se imuuogênicas [Beat!y et

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 27

~~~----~~~~~~---al, 1984; van Rooijen e van Níeuwmegem,l982a; Alving et al, 1980; Alving, 1982; van Rooijen e van Níeuwmegem, 1980; 1980b; Shek e Sabíston, 1982; Shek e Sabiston, 1983; Yung et al, 1985; Snyder e Vanníer, 1984]. van

~~

...

~···~~~···~·Rooijem e yan Níenwmegem, ( 1980 e 1282) . tilzendo testes &oro lipossomas ... ~~····

contendo albumina de soro bovino, BSA, observaram que as proteínas encapsuladas não apresentavam imunogenicidade e que a resposta imune era proveniente somente das proteínas adsorvidas na superficie dos lipossomas. Outros estudos incluindo antígenos exibiram resultados contrários, e as proteínas encapsuladas apresentaram maior resposta imune do que as proteínas adsorvidas na superficie [ Shek e Sabiston, 1982; Six et al, 1980].

A carga associada às proteínas e aos lipossomas é um outro fator que influencia o aparecimento e a intensidade da resposta imune. Utilizando a lisozima, rnn antígeno catiônico, observou-se que o encapsulamento em hpossomas com fosfohpídios carregados positivamente conduziu a rnna resposta imune maior do que quando a mesma proteína foi encapsulada em lipossomas com fosfolípídios carregados negativamente. Lipossomas carregados positivamente provocaram alergia, o mesmo não ocorrendo com lípossomas neutros ou carregados negativamente [Latif e Bachhawat, 1984] . Outros estudos demonstraram que BSA encapsulado em vesículas unilamelares grandes LUV's a uma resposta imune mais intensa que quando encapsulada em vesículas multilamelares, MLV's [ Ostro, 1987].

15- PROTEÍNAS COMO ~1\JTÍGENOS NO TRATAMENTO DE ALERGIA.

As doenças alégicas podem ser consideradas como problemas de saúde pública mundial. Dentre as sua manifestações destacamos a Asma Brônquica

Capitulo H - Revisão Bibliográfica 28

e a Rinite ~Alérgica. Nos Estados Unidos da América estima-se que 35 milhões de pessoas possuem algum tipo de problema alérgico. No Brasil estas estatísticas não são diferentes.

~~··~~··~··~·D.entte os

fllw.n:s

causais, oslÍí<a!l!S lls;liJ,!Qntam como um dosyfÍllcipais.~ •. ~ ... ~. ~· agentes desencadeadores do processo alérgico. Kem (1921) e Cooke (1992)

foram os primeiros a sugerir que aracuideos microscópicos domésticos, os ácaros, eram importantes no desencadeamento de "crises alérgicas" de Asma. Contudo, somente a partir dos trabalhos publicados por Voorhost ( 1964 e 1967 ) é que ficou comprovada tal associação, com a demonstração da presença de Dematophagoides sp em amostras de poeira domícilíar de pacientes asmáticos que apresentavam reatividade a testes epicutâneos ao "extrato bruto" desse ácaro, sugerindo a presença de IgE específica a seus antígenos.

2.16- ANTIGENICIDADE DOS ÁCAROS DO PÓ DOMÉSTICO

Os fatores componentes dos ácaros que determinam seu comportamento antigênico estão localizados em proteínas constituíntes do "corpo" ou aqueles que fazem pa1te das "bolotas fecais" ( Tovey et ai., 1981; Lindetal, 1988;Schou&Lind, 1991).'

Estudos íruunoterápicos envolvendo sua purificação, caracterização quimica através do sequenciamento de aminoácidos e avaliações clinicas têm sido desenvolvidos na Unicamp nos laboratórios de Imunologia Clínica e Qillmica de Proteínas. ZoHner et al (1994), caracterizou as proteínas dos ácaros do gênero Blomia Tropicalis, através de seu fracionamento em coluna de gel, obtendo três frações com pesos moleculares de 63 KDa, faixa de 8-30 KDa e 3.4 KDa Os resultados são mostrados na figura 2.1 L Em testes com

Capitulo II - Revisão Bibliográfica 29

--~---~~---pacientes atópicos os mesmos autores verificaram que as proteínas de peso moleculares na faixa de 8-30 KDa são as mais alergênicas e as de 63 KDa as menos alergênicas.

63KDa 8-30KDa 3.4 Kda

Figura 1 I - Perfil de eluição do complexo proteico dos ácaros do gênero Blomia Tropicalis em gel de Sephadex G-1 00 [ Figura adaptada de Zollner et ai., 1994].

2.17 - LIPOSSOMAS COMO VEÍCULOS DE ALERGENOS NO TRATAMENTO DA ALERGLL\..

Um dos problemas enfrentados no procedimento da imunoterapia refere-se à qualidade do material ou alergeno empregado. É de consenso que o alergeno deve ser purificado e sua potência biológica determinada através de testes populacionais. Além da estabilidade, a sua forma de apresentação poderá levar a resultados discrepantes. A regularidade de exposição alergênica ao sistema imunológico com os imunoterápicos até então disponíveis no

~C~a~p~itu~lo~ll_-__ R_e_~~·s~ã~o~B_ib~l_io~gr~áfi~I~ca~---30

mercado, é pouco definida, e os esquemas de administração aos pacientes são os mais variados possíveis.

O desenvolvimento de terapias alternativas que possibilitem o controle

~,,,, ,~·-~-$,çresentação dos jmJmoterãpü,;os ao sistlaJJit Íllllm!llógjco é de . extr~.ml! ... ,., ... . importância para o entendimento dos mecanismos de ação dos imnnoterápicos

no tratamento de doenças alérgicas.

Dentro deste contexto, os lipossomas são muito promissores como veículos para a administração controlada de alergenos purificados, possibilitando uma defmição dinâmica de liberação dos alergenos ao sistema imunológico do paciente a ser tratado, trazendo subsídios para o entendimento dos mecanismos de ação dos imnnoterápícos.

Tanto é do nosso conhecimento, nenhum outro trabalho foi realizado o encapsulamento em lipossomas de misturas de proteínas de vários pesos moleculares, e provenientes dos ácaros do genero Blomia Tropicalis.

Capitulo III Material e Métodos 31

~~---3.0- MATERIAL E MÉTODOS

equipamentos utilizados no desenvolvimento deste trabalho.

3.1- MATERIAL

Os lipídios: distearoilfosfatidilcolina ( DSPC) ( Cl8:0 ), L-a-dimiristoilfosfatidiletolanarnina ( DMPE ) e colesterol ( COL ) 5a,6a-epóxido foram adquiridos da Sigma Chemical CO.

Os compostos alergênicos foram obtidos inicialmente por extração de uma mistura bruta de ácaros do gênero Blomia Tropica!is fornecida pelo Laboratório de Imunologia Clínica e Alergia da UNICAMP e posteriormente comprados do Laboratório de Extratos Alergênicos Ltda, Rio Janeiro, na forma de solução protéica concentrada ( 12 mg/ml ).

Os reagentes utilizados no ensaio de proteínas foram: 4',4'dicarboxil-2,2'biquinolina, adquirido da Sigma Chemical CO., carbonato de cálcio, bicarbonato de sódio e sulfato de cobre pentahidratado, adquiridos da Merk Chemical CO., tartarato de sódio e hidróxido de sódio, produzidos pela Líbisynth Produtos para Laboratórios Ltda, e Quimibras Industria Química S/ A, respectivamente.

Ácido sulfúrico e mobilidato de amõnio usados no ensaio fosfato foram adquiridos da Cetus Indústria e Comércio de produtos Químicos Ltda. O ácido ascórbico foi adquirido Merk Chemical CO ..

Os reagentes usados na extração das proteínas dos ácaros: bicarbonato de amõnio e tartarato de sódio foram produzido pela Libisynth Produtos para

Capitulo Hl Material e Métodos 32

--~---Laboratórios Ltda. O e-ácido amino capróico (EPSON) e o fenil metil sulfonil :fluoretro (EPMSF) foram adquiridos da Sigma Chemical CO.

Para a síntese do PEG-DMPE, o lipídio

~~~~"lfimiristoiifõsfm-idiletela~ \ D!l.rfPE)wi adquúido da Sigma CllemicaL ... " .... " CO. e o polietileno glícol metil éter (P.M. 2000), foi adquirido da Aldrich

Cheruical Company, INC O solvente benzeno foi fabricado pela Merk Chemical CO. e o catalisador trietilamina pela Analar.

Etanol e iodo usados na cromatografia de camada delgada foram adquiridos da Merk Chemical CO, e as placas de fase reversa, foram abtidas da Whatmam Laboratory Division.

Toda a água utilizada foi destilada e microfiltrada no sistema MILLI-Q a 18.2 MOeM da Millipore Indústria e Comércio Ltda. Os sufatantes

Triton-XlOO e C12Es (Polioxietileno 5 Lanril Eter ) foram obtidos da Sigma

Chemical CO. O octanol usado nos testes de partição foi adquirido da Merk Chemical CO. Nos processos de separação dos lipossomas das proteínas não encapsuladas, foram usados os géis Sephadex-G 100 e Sepharose-CL6B adquiridos da Sigma Chemical CO. Na separação por ultrafiltração, foi usado um sistema de 50 ml da Amícon, equipado com filtros de diâmetro de corte de 100 A homogeneização dos lipossomas foi em extrusora de ml fabricada pela Lípex Biomenbranes lNC, equipada com filtros de policarbonato da Nuclepore de diâmetro igual a lOOmn. O gás utilizado tanto na ultrafiltração como também na extrusão foi o nitrogênio, com 99% de pureza, fornecido pela White Martins.

Os tampões usados foram o Tris-HCl a uma concentração de 0,5 Me pH 7,4, e Hepes mM e pH 7,4.

Capitulo IU Material e Métodos 33

~~~~--~~~~~~---3.2- MÉTODOS EXPERIMENTAIS E EQUIPAMENTOS

3.2.1- EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS DOS ÁCAROS

A extração das proteínas do corpo dos ácaros foi realizada de acordo o procedimento usado por Zollner et al, (1994).

Misturou-se inicialmente 19,6 ml de tampão de carbonato ácido de amônio com 200f.ll de EPSON e 180f.ll de tampão Tris - HCL Á solução obtida foram adicionados lg de ácaro e 20 f.ll de EPMSF dissolvido em álcool isopropílico puro. Nessa etapa, por dificuldades de solubilização do EPMSF em solução de álcool isopropílico com tampão Tris-HCI ( 0,5 M, pH 7,4) na proporção l/9 VN, como proposto por Zollner, usou-se o álcool ísopropílico puro. A solução resultante foi colocada em um frasco ãmbar e deixada em repouso por 24 horas à 4 °C, agitando-se em intervalos de trinta minutos, durante as primeiras 6 horas.

A solução foi em seguida macerada em um equipamento GLAS-COL de potência 1/40 HP e torque 26/5,4 lb/in munido de um variador de velocidade GKH-GT. No processo de maceração foram usados volumes de 10 ml de solução, e rotação de 1 O RPM por 1 O minutos.

A amostra macerada foi deixada em repouso por 4 dias, e posteriormente centrifugada por 30 minutos a 15000 RPM em uma centrifuga SORV ALL RC2-B, equipada com o rotor SM-24 (aprox. 28000 G). O sobrenadante foi distribuído em vários frascos de I ml e em seguida liofilizado e estocado à temperatura ambiente.

Capitulo IH Material e Métodos 34

~~~~--~--~~~---3.2.2 - ELUIÇÃO DAS PROTEÍNAS EXTRAÍDAS DOS ÁCAROS POR CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL DE SEPHADEX G 100

Com o objetivo de determinar o perfil de eluição e a distribuição de tamanhos das proteínas dos ácaros, uma das amostras liofilizadas foi solubilizada em tampão Tris-HCI e eluida em coluna empacotada com gel Sephadex GlOO de 42 em de altura e 2,5 em de diâmetro. Um volume de 500 111 de amostra de concentração de concentração 3,2 mg/ml, foi aplicado no topo da coluna e frações de 2 ml foram recolhidas automaticamente em coletor de frações, modelo 2128 fabricado pela Bio Rad.

3 .2.3 - CARACTERIZAÇÃO DOS PESOS MOLECULARES DAS

PROTEÍNAS POR ELETROFORESE

A eletroforese é uma das técnicas mais usadas para a determinação de pesos moleculares de proteinas. Os ensaios de eletroforese realizados com o extrato protéico de ácaros foram feitos em equipamento PhastStsystem da Pharmacia. As proteínas foram iniciahnente desnaturadas com tensoativo SDS, e eluídas em gel do tipo PhastGel IEF, de gradiente médio 8-25, produzido pela Phannacia Biotech. Os marcadores padrões utilizados estão apresentados na tabela 3.1. A revelação das proteinas no gel, foi feita por fixação em solução de glutaraldeído, seguida de reação com nitrato de prata e

revelação com ácido acético.

A eletroforese foi realizada com amostras das proteinas extraídas dos ácaros fornecidos pelo Laboratório de Imunologia Clínica e Alergia, e com

Capitulo IV - Resultados e Discussão 54

~==~~~~~~~~~---4.2.3- CONCENTRAÇÃO PROTEÍNA TOTAL

Os resultados obtidos das análises de proteínas através dos três

---~--- ---mét~meneitmades -~-~~4;--~·afJFes;mtaàes aa-t~e-la-

4.1-4:--Wel:a-se que os métodos de Lowry e BCA produziram resultados 4.1-4:--Wel:a-semelhantes, além de uma maior sensibilidade comparada ao método de Bradford, cujo valor foi bem inferior. O método do BCA foi o que produziu também melhores resultados quanto à reprodutibilidade nas análises do extrato protéico.

A partir desses resultados e das informações da literatura quanto à

interferência mínima de tampões e tensoativos na quantificação de proteínas através do ácido bicíncrôníco, adotou-se o método do BCA nos ensaios subsequentes deste trabalho.

Tabela 4.1 -Dosagem da proteína total extraída dos ácaros

MÉTODO PROTEÍNAS TOTAL (rng/ml)

Bradford 0,4

Lowry 6,4

BCA 5,3

4.2.4- COEFICIENTE DE PARTIÇÃO NO SISTEMA

OCTANOL-ÁGUA

Os resultados obtidos da exposição das proteínas ao sistema octanol-água nas condições descritas no item 3.2.5, mostraram que as proteínas extraídas dos ácaros são altamente hidrofilicas. A concentração determinada na fase aquosa foi de 0,998 rng/rnl. O cálculo do coeficiente de partição

~C~a~p~itu~lo~II~I-~~a~te~n~·a~l~e~~~e~·t~o~do~s~---35

amostras do extrato concentrado proveniente do Laboratório de Extratos Alergênicos.

Tabela 3·.·r=-1'esos molectd~drrs"mat cadm es usados nai":lettofmese··· .. • · SUBSTÂNCIA PESO ~OLECULAR KDa

Fosfolipase 94

Albumina bovina 64

Ovabumina 43

Anidrase carbônica 30 Inibidor de tripsina de soja 20,1

a -Lactabumina 14,4

3.2.4-DETE~INAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS

A concentração total de proteínas foi determinada em relação à

proteína albumíua de soro bovino, BSA, por três métodos diferentes: método de Bradford, método Lowry e o método do ácido bicincrônico, BCA.

Na análise das proteínas pelo método de Bradford, utilizou-se o reagente Azul de Comassie, fornecido na forma concentrada pela Bio RAD. Inicialmente o reagente concentrado foi diluído com água ~ILLI-Q, na proporção de 1:4 e a solução resultante foi filtrada em filtro de vidro sinterizado da Whatman. Volumes de 5ml do reagente diluído e filtrado, forruu adicionados à lOOf.il das ruuostras de proteínas em tubos de ensaio os quais forruu agitados em vórtex, deixados em repouso por 5 míuutos, procedendo-se em seguida a leitura da absorbância das soluções a um comprimento de onda de 595 mn. O ensaio foí feito em triplicata, e a

Capitulo III Material e Métodos 36

--~---concentração total de proteínas do extrato foi determinada através de cnrva de calibração, previamente construída com BSA, na faixa de concentrações de

O, 1 à 1 mg/ml, usando o mesmo procedimento descrito.

O método de I:owry

oasem::se

·na formaçao··

de

um

comjm:xo·ffin;õõre com as ligações peptídicas das proteínas, ocorrendo a redução do Cu+2 para Cu+1, o qual reage com reagente de fenol de Folim-Ciocalteu, formando um

complexo de cor azulada, detectado espectrofotometricamente a 750 nm. Em tubos de ensaios contendo 0,3 ml das amostras, foi adicionado o mesmo volume de hidróxido de sódio O, 1 M. Os tubos foram agitados em vórtex, e deixados em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida adicionou-se 3 ml de uma solução contendo hidróxido de sódio 0,067 M, 0,3% de tartarato duplo de sódio e 1,7 % de sulfato de cobre, agitando-se novamente em vórtex, e deixando os tubos em repouso, à

temperatura ambiente, durante 1 O minutos. Após este periodo, foram adicionados 0,3 ml do reagente de Folim diluído na proporção 1:2 com tampão trís , seguido de nova agitação e repouso nas mesmas condições, durante 30 minutos. A absorbância das soluções foi lida em espectrofotômetro

à 750 nm. Uma cnrva de calibração da proteína BSA foi também feita previamente nas mesmas condições experimentais.

O método do BCA baseia-se também na redução dos íons cobre em decorrência da complexação com as proteínas a pH 11,25. O íon Cu+1 reage posteriormente com o BCA formando um complexo de cor púrpura, cuja absorbância é lida em espectrofotômetro à 562 nm [Smith et al, 1985]. Nesse ensaio, preparou-se inicialmente uma solução A de 50 ml com 0,5 g de BCA, 1 g de carbonato de sódio, 0,08 g de tartarato de sódio, 0,2 g de hidróxido de sódio e 0,475 g de bicarbonato de sódio e ajustou-se o pH para 11,25. Preparou-se também uma segunda solução B de sulfato de cobre penta hidratado de concentração 0,004 mg/ml. Misturou-se 2 ml de B com 100 ml

Capitulo III Material e Métodos 37

--~---de A, e volumes --~---de 1 ml da solução resultante foram colocados em tubos ensaios, aos quais adicionou-se 20111 das amostras e dos padrões de BSA. A solução foi aquecida a 60 ºC durante 30 minutos e posteriormente resfriada à

~mm~ ~ ~ ~ ~~~c~ ~lemperatu:ra: c CC

amBiente

c ~ ~ abSotbâllclámmaa:s~msolíiÇões~ 1oC~Ilãá~~mem

espectrofotômetro à 560 mn.

Uma das grandes vantagens da utilização do método BCA é baixa interferência de tampões e sufactantes em relação aos outros métodos de

quantificação de proteínas [Smith et al, 1985].

3.2.5- DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO DA PROTEÍNA TOTAL

A determinação do coeficiente de partição do complexo protéico é de fundamental importância para predizer a localização das proteínas na estrutura dos lipossomas. Dependendo do grau de hidrofilicidade as proteínas podem localizar-se na superfície, no núcleo ou na bicamada lipídica. A metodologia utilizada neste trabalho foram baseadas no procedimento descrito por Moraes (1996). Misturou-se em um tubo de ensaio 1 ml da solução aquosa de proteínas de concentração 1 mg!ml, com l mi de octanol puro. A mistura foí agitada vígorosomente por 5 minutos, deixada em repouso por 1 hora e posteriormente centrifugada por 1 O minutos a 5000 rpm em centrífuga Eppendorf, com objetivo de melhor separação das fases hidrofilica e hidrofóbica. As proteínas presentes na fase hidrofilica foram quantificadas pelo método do BCA. O coeficiente de partição foi determinado pela equação

3.1.

Cia-Cfa