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ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Curcuma
zerumbet
Rodrigo Queiroz de LIMA
1Carlos Cleomir de Souza PINHEIRO
2Márcia Seixas de CASTRO
31Bolsista PIBIC/CNPQ; 2 Orientadores INPA/COTI; 3 Co-orientador INPA/COTI
INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais na prevenção e cura de doenças está condicionada a um processo de experimentação que vem se desenvolvendo desde as civilizações antigas, constituindo assim a base da fitoterapia, a qual vem sendo retomada pela medicina ocidental, que procura aproveitar suas práticas, dando-lhes respaldo científico e integrando-as num conjunto de princípios visando, mais do que curar algumas doenças, restituir o homem à vida natural (Buchillet 1991).
Entre as plantas medicinais temos a C. zerumbet conhecida popularmente como gajitsu ou zedoária. É uma planta herbácea, perene, pertencente à família vegetal Zingiberaceae de ocorrência espontânea na Ásia (Schulz et al. 2002). A zedoária apresenta folhas verdes, membranáceas, lanceoladas, nervuras bem visíveis e com uma nuvem roxa no meio (Leong-škorničková et al. 2008). Porém, essa porção da planta não é muito empregada com relação à propriedade terapêutica, apesar de existir trabalhos com uso de extratos e óleos essenciais desta planta (Kato e Fischer 1996; Teske e Trentini 1997).
Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos em vários órgãos das plantas, e contém grande número de funções orgânicas em sua composição química, eles são isolados por diferentes métodos como arraste a vapor de água, hidrodestilação e pela extração com solventes (Ciolfi 2010). Atualmente, os óleos essenciais têm sido objeto de muitas pesquisas devido seus constituintes para a produção de fármacos (Naghetini et al. 2006; Cansian et al. 2010; Ciolfi 2010). Neste sentido o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade farmacológica do óleo essencial das folhas da C. zerumbet para futuras aplicações biotecnológicas.
MATERIAL E MÉTODOS
O material botânico da C. zerumbet foi coletado no Instituto Nacional Pesquisas da Amazônia (INPA). A identificação foi feita pela taxonomista, Dr. Jana Leon-Škorničková e depositada no herbário do INPA n° 003. As folhas da C. zerumbet coletadas foram lavadas, secas em temperatura ambiente, trituradas em liquidificador semi-industrial e pesadas em balança semi-analítica para posterior hidrodestilação.
A extração do óleo essencial das folhas de C. zerumbet foi realizada pelo método de hidrodestilação utilizando aparelho de Clevenger modificado, os volumes dos óleos essenciais obtidos foram medidos em tubo de ensaio graduado e pesado em balança analítica para cálculo de seu rendimento expresso em porcentagem (%) v/p (volume de óleo por massa de material) e p/p (massa do óleo por massa de material). Após este procedimento, foram armazenados em frasco âmbar sob refrigeração até sua utilização (Pinheiro 2005).
Métodos fitoquímicos foram realizados no Laboratório de Farmacologia e Produtos Naturais do INPA, as análises dos compostos orgânicos presentes na Curcuma zerumbet pela Cromatografia de Camada Delgada (Matos 1980; Chaves 1997) e Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM).
Cromatografia de Camada Delgada: O perfil cromatográfico do óleo essencial foi avaliado através de Cromatografia de Camada Delgada (CCD) utilizando placas de sílica gel GF254 (ALUGRAM®). Para eluição foram preparadas 10 mL das seguintes fases móveis: Hexano/acetona (4:1), Acetato de etila /diclorometano (4:1), Clorofórmio/Etanol 96° GL (4:1 e 1:4). A amostra foi diluída em hexano e aplicada sobre as placas com auxílio de um capilar. Após a aplicação da amostra a placa entrou em contato com fase móvel contida numa cuba cromatográfica. Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta foi retirada da cuba e seca (Matos 1980; Chaves 1997). Verificou-se a coloração das manchas (bandas) no espectro visível, sob luz ultravioleta (UV) de 254 e 365 nm, e revelada com Iodo. As bandas visualizadas e reveladas foram medidas para calcular os fatores de retenção (Rf).
Cromatografia Gasosa - Espectrometria de Massas (CG-EM): Amostras dos óleos essenciais da Curcuma zerumbet foram enviadas para o Centro de Biotecnologia da Amazônia (CBA).
Atividades farmacológicas foram realizadas em camundongos (Mus musculus) e ratos (Rattus novergicus) albinos do biotério central do INPA, avaliados previa e posteriormente ao tratamento com óleo essencial das folhas de Curcuma
zerumbet por via intraperitoneal e por via oral, após a aprovação do uso dos animais neste Projeto. Para isso o trabalho
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Testes Gerais de Atividades: os efeitos gerais de toxicidade dos óleos essenciais foram realizados utilizando-se camundongos machos e fêmeas com peso de 20-30g. Seis grupos, contendo seis animais cada, receberam por via
intraperitoneal (i.p.) e via oral (v.o.) doses de 10, 100 e 500 mg.kg-1 do óleo essencial, sendo que um animal serviu de
controle e recebe veículo (salina 0,9% + Tween 20 a 5%) pelas mesmas vias citadas anteriormente (Lapa et al. 2005). Após uma hora da injeção dos óleos essenciais, os animais foram levados ao campo-aberto, confeccionado em acrílico, usado para avaliar a atividade exploratória dos animais: sua movimentação espontânea (número de cruzamentos, com as quatro patas, entre as divisões do campo), o número de comportamentos de auto-limpeza (“grooming”), de levantar, assim como o tempo em que permaneceram parados e a sua defecação, como índice de emocionalidade, o qual foi registrado durante 05 minutos. Assim, foi possível uma avaliação da atividade estimulante ou depressora do composto em teste (Lapa et al. 2005). Os camundongos, após a análise da atividade estimulante, passaram pelo “teste do bastão” para verificação da sua capacidade normal de preensão.
Os animais então foram deixados em observação 1, 2, 7 e 14 dias. Os parâmetros observados foram anotados em tabelas adaptadas e descritos por Rocha e Silva (1968). Todos os efeitos foram comparados imediatamente com os animais controle.
Edema de pata induzido por carragenina: A injeção subcutânea de carragenina na pata de ratos induz aumento agudo e progressivo do volume desta, e proporcional à intensidade da resposta inflamatória (Lapa et al. 2005). Neste modelo o efeito antiedematogênico óleo essencial da Curcuma zerumbet, foi estudado em quatro grupos de ratos adultos, com seis animais cada. Em todos os grupos, foi realizada a medida do volume basal das patas. Dois grupos de animais foram
tratados por via intraperitoneal (i.p.) dose de 50 e 150 mg.kg-1 enquanto, os outros dois grupos foram tratados por via
oral (v.o.) nas mesmas doses citadas intraperitoneal. Um animal de cada grupo serviu de controle negativo e recebeu o
veículo (solução salina 0,9% + Tween 20 a 5%) enquanto outro animal, controle positivo, recebeu 25 mg.kg-1 de
Indometacina (Winter et al. 1962). Uma hora após o tratamento, o edema foi induzido nas patas traseiras dos animais, injetando 30 μL/pata de uma solução de carragenina a 1%, a pata contralateral injetada com o mesmo volume de solução fisiológica (Lapa et al. 2005). O tamanho das patas foi medido com paquímetro digital. A variação das patas direita (D) e esquerda (E) foram medidas imediatamente após a injeção, e as leituras repetidas até a 90 minutos após o estímulo. O valor do edema foi obtido pela subtração do tamanho da pata injetada com carragenina com o tamanho basal da pata (Lapa et al. 2005).
Contorções Abdominais produzidas pelo Acido Acético 1%: as contorções abdominais em camundongos são caracterizadas por contração do abdômen, seguida por extensão de uma ou ambas as patas traseiras. Esta resposta motora decorre da aplicação de um estímulo nociceptivo por via i.p., que neste método foi o ácido acético (Lapa et al. 2005).Utilizou-se um frasco de ácido acético glacial P.A. e as diluições foram feitas com solução salina 0,9%, devendo ser utilizadas num período máximo de duas horas. O volume de ácido acético diluído injetado mantido constante 10
mL.kg-1 (Lapa et al. 2005). Aos animais foram divididos em 4 grupos com 6 animais cada, optou-se por deixar dois
animais controles em cada grupo. Aos animais controle negativo foi administrado o veículo (solução salina 0,9% +
Tween 20 a 5%) e o controle positivo receberam 50 mg.kg-1 de indometacina. Os outros animais foram tratados com
óleo essencial por via intraperitoneal (i.p.) e por via oral (v.o.) nas doses de 50 e 100 mg.kg-1 do óleo essencial. Após 60
minutos do tratamento foi realizada a injeção intraperitonial de ácido acético 1%. Em seguida, os animais foram colocados em uma caixa de vidro para ser realizada uma contagem cumulativa do número de contorções que ocorreram durante um período de 40 min após a aplicação do ácido acético.
Teste da placa quente: Este teste caracteriza-se pela colocação do animal sobre uma superfície aquecida a mais de 50 °C que determinará uma resposta característica, na qual o animal troca rapidamente o apoio dos pés, levanta ou lambe as patas. O aparecimento destas respostas pode ser indicativo da intensidade da resposta nociceptiva a um estímulo térmico (Lapa et al. 2005). Os animais foram divididos em quatro grupos com cerca de seis camundongos cada, onde foram colocados individualmente na placa quente com temperatura constante de 52 a 54 °C e dois valores basais foram obtidos com intervalos de 30 minutos. O tempo máximo de contato do animal com a placa foi de 15 segundos para evitar lesões. Em seguida, os grupos escolhidos para tratamento com o óleo essencial da planta receberam por via
intraperitonial (i.p.) e via oral (v.o) as doses de 100 e 500 mg.kg-1 do óleo essencial. O grupo controle negativo foi
tratado através da v.o. e i.p. com o veículo (solução salina 0,9% + Tween 20 a 5%) e o controle positivo receberá fentanest 25μg/Kg.
Análise estatística, os resultados obtidos foram apresentados em tabelas e gráficos comparativos expressos como médias e desvio padrão. As respostas obtidas através dos ensaios farmacológicas foram analisadas através do programa estatístico GraphPad Prism 6.04 considerando estatisticamente significativos em nível de 5% (p < 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os óleos essenciais extraídos apresentaram rendimento de 1,51% v/p e 0,95% p/p com odor típico e coloração verde escura. Os rendimentos foram diferentes dos encontrados no Pibic anterior, tendo menor volume (2% v/p), mas maior percentual em peso (0,7% p/p), essa mudança deve-se a coleta e ao cultivo, pois, neste trabalho os vegetais foram
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proveniente do INPA e no anterior o material avaliado proveniente do Careiro da Várzea, aspectos relacionados ao solo, umidade, clima, temperatura e pH interferem nos compostos qualitativa e quantitativamente (Ribeiro e Diniz 2008). No método fitoquímico de CCD as placas cromatográficas eluida com Hexano/Acetona (4:1) apresentaram várias bandas (manchas). Duas manchas foram fluorescentes no UV 365 uma azul-claro (Rf= 0,6) e outra verde-claro (Rf= 0,32) que somente apareceu na placa de maior concentração (Placa B), além disso, essas manchas não apareciam no UV 254 nm e nem com o uso do revelador Iodo. Várias manchas foram visualizadas no UV254 nm, no entanto apenas duas manchas de coloração verde-escuro foram reveladas com iodo e apresentaram o Rf= 0,6.
Na análise com (CG/EM) dos óleos, vários picos estão presentes no cromatograma com 79 picos que correspondem a diferentes compostos. Os compostos voláteis majoritários dos óleos foram os 1,8 cineole (16,93%), 4,4a,5,6,7,8-Hexahydronaphthalen-2(3H)-one (9,93 %) e curzerenone (8,13). Na extração realizada ano passado o óleo da folha teve a presença dos mesmos compostos porem em diferentes porcentagens com menor quantidade de curzerenone (17,9%) e 4,4a,5,6,7,8-Hexahydronaphthalen-2(3H)-one (12,5%) enquanto houve aumento de 1,8 cineole (9,5%). Os compostos apresentam ação farmacológica, pois o 1,8 cineole apresenta ação antimicrobiana e antioxidante (Rodrigues et al. 2009; Aguiar et al. 2003) enquanto o curzerenone tem efeito anti-inflamatório (Lobo et al. 2009).
Atividades farmacológicas, durante a realização dos testes gerais de atividade foi possível observar na primeira hora do tratamento: diminuição da motilidade, defecação e da atividade exploratória; quietação, dificuldade respiratória, tônus da costa, piloereção e sonolência. Esses resultados mostram sinais depressores ao nível do Sistema Nervoso Central (SNC), indicativo de uma possível atividade analgésica. O acompanhamento realizado durante 1, 2, 7 e 14 dias não foi observado tais sinais depressores do SNC e nenhum dos animais tratados com o óleo essencial faleceu durante esse
acompanhamento nas doses de 10, 100 e 500 mg.kg-1, assim torna-se necessário utilização de doses maiores para
efetuar cálculo da dose letal média (DL50).
Durante o teste de Placa quente (figura 1) foi possível verificar um aumento significativo do tempo de latência em
segundos (s), em todas as doses principalmente com óleo essência da C. zerumbet 500 mg.kg-1 pela via oral e a via
intraperitonial. A dose de 100 mg.kg-1 do óleo essencial propiciou um efeito anti-nociceptivo, pelo aumento do tempo
de reação em placa quente.
0 1 5 3 0 4 5 6 0 0 5 1 0 1 5 C o n tr o le In d o m e ta c in a 2 5 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 1 0 0 m g .k g- 1 Ó le o E s s e n c ia l 5 0 0 m g .k g- 1 T e m p o (m in ) te m p o d e l a tê n c ia (s ) 0 1 5 3 0 4 5 6 0 0 5 1 0 1 5 C o n tr o le In d o m e ta c in a 2 5 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 1 0 0 m g .k g- 1 Ó le o E s s e n c ia l 5 0 0 m g .k g- 1 T e m p o ( m in ) te m p o d e l a tê n c ia (s )
Figura 1. Teste Placa quente em camundongos previamente tratados via oral (A, n=12) e via intraperitoneal (B, n12) com controle negativo (salina e Tween), Indometacina 25 mg.kg-1 e Óleos essenciais da C. zerumbet a 100 e 500 mg.kg-1. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão do número de animais.
No teste Antiedematogênico por via intraperitoneal (figura 2), os dados mostraram que após 45 minutos da aplicação da carragenina houve um aumento do edema nos ratos enquanto os demais grupos tratados pela via i.p. apresentaram uma redução significativa no edema após a administração do Óleo essencial da C. zerumbet. Observa-se que a os gráficos representam as patas direita (figura 2 A) e esquerda (figura 2 B) as doses propiciaram uma pequena inibição do edema em comparação ao grupo controle, enquanto as outras doses de 1000 e 1500 mg/kg reduziram de maneira significativa, sendo esta redução observada a partir dos 60 minutos após tratamento oral.
0 1 5 3 0 4 5 6 0 7 5 9 0 0 .0 0 .3 0 .6 0 .9 1 .2 1 .5 1 .8 C o n tr o le In d o m e ta c in a 2 5 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 5 0 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 1 5 0 m g .k g- 1 T e m p o ( m in ) ta m a n h o d o e d e m a ( c m )
Figura 2. Edema da pata de ratos induzido por carragenina (1%) previamente tratados por via intraperitoneal (n=12) com controle negativo (salina e Tween), Indometacina 25 mg.kg-1 e Óleos essenciais da C. zerumbet a 100 e 500 mg.kg-1. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão do número de animais.
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O teste de contorções abdominais (Figura 4), no qual verificamos que as doses testadas propiciaram uma total eliminação das contorções pela via i.p. e uma diminuição bastante significativa por v.o., se comparado com o grupo
controle. Numero de contorção por via oral em média foram na dose de 50 mg.kg-1 (24,38 % ± 0,79), 100 mg.kg-1
(16,13% ±3,94), indometacina 25 mg.kg-1 (3,5% ± 1,0) e com controle negativo (30,0 % ± 0,1). Numero de contorção por
intraperitoneal em média foram na dose de 50 mg.kg-1 (20,0 % ± 0,49), 100 mg.kg-1 (32,25% ±2,31), indometacina 25
mg.kg-1 (5,0% ± 1,0) e com controle negativo (30,75 % ± 0,5). No estudo de Lobo et al. (2009), atividade antinoceptiva
por i.p. do extrato diclorometano da C. zedoaria a 10 mg/kg (91.1 e 93.4%), curcumenol (64,0 %) e dihydrocurdione (46.0%). 1 5 3 0 0 2 5 5 0 7 5 C o n tr o le Ó le o e s s e n c ia l 5 0 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 1 0 0 m g .k g- 1 T e m p o ( m in ) % c o n to r ç õ e s a b d o m in a is In d o m e ta c in a 2 5 m g .k g- 1 1 5 3 0 0 2 5 5 0 7 5 C o n tr o le Ó le o e s s e n c ia l 5 0 m g .k g- 1 Ó le o e s s e n c ia l 1 0 0 m g .k g- 1 T e m p o ( m in ) % c o n to r ç õ e s a b d o m in a is In d o m e ta c in a 2 5 m g .k g- 1
Figura 3. Contorções Abdominais por ácido acético (1%) em camundongos tratados por via oral (A, n=12) e intraperitoneal (B, n= 12) com controle negativo (salina e Tween), Indometacina 25 mg.kg-1 e Óleos essenciais da C. zerumbet a 50 e 100 mg.kg-1. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão do número de animais.
CONCLUSÃO
O presente trabalho com os óleos essenciais da Curcuma zerumbet apresentaram rendimento de extração e foram caracterizados vários compostos naturais com aplicação na área farmacêutica. Quanto aos ensaios farmacológicos permitem sugerir que a Curcuma zerumbet possui propriedades antiinflamatórias e analgésicas, tendo uma potente ação no nível de SNC, mas há necessidade da realização de estudos com doses diferentes para estabelecer a DL50 e outras ações farmacológicas ou toxicológicas.
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