Analises clinica, histopatologica e imunohistoquimica de rabdomiossarcomas da região de cabeça e pescoço

(1)

CLEVERTON ROBERTO DE ANDRADE

ANÁLISES CLÍNICA, HISTOPATOLÓGICA E

,

IMUNOHISTOQ~ÍMICA

DE RABDOMIOSSARCOMAS

lfÂ

.

REGIAO DE CABEÇA E PESCOÇO

I

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia

de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas para obtenção de grau de Doutor em

Estomatopatologia, área de concentração em

Estomatologia.

PIRACICABA

2004

(2)

CLEVERTON ROBERTO DE ANDRADE

ANÁLISES CLÍNICA, HISTOPATOLÓGICA E

IMUNOHISTOQUÍMICA DE RABDOMIOSSARCOMAS DA

REGIÃO DE CABEÇA E PESCOÇO

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia

de Piracicaba da Universidade Estadual de

Campinas para obtenção de grau de Doutor em

Estomatopatologia.

Orientador: Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes

Banca Examinadora: Prof. Dr. Clóvis Antônio Lopes Pinto

Prof. Dr. Jacks Jorge Júnior

Prof. Dr. Luis Carlos Spolidorio

Prof. Dr. Luiz Paulo Kowalski

Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes

PIRACICABA

(3)

N11 _CPD

An24a

Ficha Catalográfica

Andrade, Cleverton Roberto de.

Análise clínica, histopatológica e imunohistoquímica de rabdomiossarcomas da região de cabeça e pescoço. I

Cleverton Roberto de Andrade.-- Pimcicaba, SP: [s.n.], 2004. xvi, 154p. : il.

Orientador : Prof. Dr. Márcio Ajudarte Lopes.

/ Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Jaculdade de Odontologia de Piracicaba.

1. Prognóstico. 2. Epidemiologia. I. Lopes,

Márcio Ajudarte.

11. Universidade Estadual de

Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba.

111. Título.

Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marilene Girello CRB/8-6159, da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.

(4)

UNICAMP

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de DOUTORADO, em

sessão pública realizada em 05 de Março de 2004, considerou o

candidato CLEVERTON ROBERTO DE ANDRADE aprovado.

~~~Li~

1. Prof. Dr. MARCIO AJUDARTE LO

r

(5)

Dedico esse trabalho aos meus pais

Sebastião Aristides de Andrade e Ester

Minotti de Andrt!-de,

pelo amor e

dedicação que muito me auxiliaram por

toda a vida.

(6)

Dedico também a minha esposa

Flávia Regina Metzner de Andrade

(7)

Ao

Prof. Dr. Márcio Ajudarte

Lopes,

por sua intensa colaboração e

participação na realização dessa obra, e

pelos momentos de reflexão e auxílio nas

(8)

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor, Prof. Dr. Thales Rocha de Mattos Filho;

Ao Prof. Dr. Lourenço Correr Sobrinho coordenador do Programa de Pós-Graduação da

Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP;

Ao Prof. Dr. Pablo Agustin Vargas, coordenador do Programa de Pós-Graduação em

Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP;

Aos Profs. Drs. Oslei Paes de Almeida, Jacks Jorge Júnior, Edgard Graner, Ricardo

Della Coletta e Oswaldo Di Hipólito Júnior, professores das áreas de Patologia e

Semiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP, por seus ensinamentos;

Ao Prof. Dr. Luiz Paulo Kowalski, chefe do Departamento de Cirurgia de Cabeça e

Pescoço e Otorrinolaringologia do Hospital do Câncer A.C. Camargo - São Paulo;

Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Soares e ao Prof. Dr. Clóvis Antonio Lopes Pinto do

(9)

À Sra. Ana Cristina do Amaral Godoy, pelo auxílio nas reações de imuno-histoquímica e aos demais funcionários e estagiários dos áreas de Patologia e Semiologia: Adriano Luis

Martins, Cristiane Rizzo do Amaral, Eli Cristina ~omes Alves, João Carlos Gomes da

Silva Júnior e Rosa Maria Fornasiari, Rogério de Andrade Elias, Rosa Maria F. C. Scalco e Débora Cristina Gazola;

À Sra. Hirde ·cortezine, responsável pelo Serviço de Arquivo Médico e Estatístico

(SAME) do Hospital do Câncer A.C. Camargo por sua colaboração e auxílio na obtenção das informações durante o levantamento das fichas clínicas;

À funcionária do centro de estudos do Hospital do Câncer Sra. Inês N. Nishimoto pela realização das análises estatísticas;

Aos amigos e companheiros do curso de Pós-Graduação Paulo Rogério Ferreti Ronan, Fábio Augusto Ito, Fábio Ramoa Pires, Fábio de Abreu Alves, Ana Lúcia Rangel, Paola Cotrim, Danyel Elias da Cruz Perez, Fábio Ornelas, Michelle Agostini, Cláudio

Maranhão, Hercílio Martelli Júnior pelos conhecimentos compartilhados e momentos de

descontração;

À Capes pelo auxílio a pesquisa na forma de bolsa, fornecida no primeiro ano do

doutorado;

(10)

"A experiência mostra que,

prevendo com bastante

antecedência os passos a

serem dados,

é

possível agir

rapidamente na hora de

executá-los"

(11)

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS, GRÁFICOS E FIGURAS... 1

LISTA DE ABREVIATURAS... 5 RESUMO ... ." ... •·· ... ... ... 7

ABSTRACT... 9

1. INTRODUÇAO.. •••... ... . • •. . . ...••.•. •• ..••••... ..•.•. .. . . ..•.•. ... ... •.. 11

2. REVISAO DA LITERATURA... 13

2.1 Considerações Gerais...

13

2.2 Histopatológico dos Rabdomiossarcomas... .• . . . • . . . • . ... 15

2.2.1 Tipos Histopatológicos de Rabdomiossarcoma... •. . . •.... ..•... ... .. . •. 18

Rabdomiossarcoma Embrionário...

18

Rabdomiossarcoma Embrionário de células fusiformes... 20

Rabdomiossarcoma Embrionário botrióide... 21

Rabdomiossarcoma Alveolar...

21

Rabdomiossarcoma Pleomorfo... ....

24 2.2.2 Análise Imunohistoquímica... ... 27 2.3 Estadiamento Clínico... 35 2.4 Tratamento... 3 7 3. PROPOSIÇAO... •. . . .. . .• .• . . . .••....•... •..•... .. .. . ... . .. ... . .. .. .... 45 , 4. MATERIAL E METO DOS ....•...••...•....••••...••...•.•..

47

4.1 Casuística ...•...

47

4.2 Análise histopatológica ...•...

47

4.3 Análise imunohistoquímica ... . 48

4.4 Análise estatística ...•... 51

4 4 1 C _{• .} _orreI - d açao e requenc1a •.••••...••••••.••.•.••••...••.•... ti "" • 51 4.4.2 Sobrevida global ...•.•.•....•••••••...••••••••••••...••••••.•..••.•.•....•...•.. 51

(12)

5. RESULTADOS... 53

5.1 Características clínicas e demográficas... 53

5.2 Características histopatológicas e imunohistoquímicas... 62

5.3 Tratamento... 83

5.4 Correlacão entre as variáveis... 86

5.5 Análise da sobrevida global dos pacientes... 92

5.6 Análise da sobrevida livre de doença dos pacientes... I 05 6. DISCUSSAO... .. . . .. . .. . . .. . . . .. . . .... 119

7. CONCLUSOES... 139

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 141

9. ANEXOS E APÊNDICES... 151

9.1 Ficha para obtenção dos dados dos pacientes... 151

(13)

Tabela I Tabela 11 Tabela III Tabela IV Tabela V Tabela VI Tabela VII Tabela VIII Tabela IX Tabela X Tabela XI Tabela XII Tabela XIII Tabela XIV Tabela XV Tabela XVI Tabela XVII Tabela XVIII Gráfico 1 Gráfico 2 Gráfico 3 Gráfico 4 Gráfico 5 Gráfico 6 Gráfico 7 Gráfico 8 Gráfico 9 Gráfico 10 Gráfico 11 Gráfico 12 Gráfico 13 Gráfico 14 Gráfico 15

LISTA DE TABELAS, GRÁFICOS E FIGURAS

Classificação convencional para RMSs... .. 16

Sociedade Internacional de Oncologia Pediátrica (SIOP)... ... .. . .. . .. ... 17

Instituto Nacional do Câncer (INC) ... .-... 17

Classificação Internacional de RMS - CIR... 28

Grupo clínico... 36

Estadiamento TNM RMS ... 37

Variáveis clínicas e demográficas... 53

Variáveis histopatológicas e imunohistoquímicas... ... 65

Sequência de tratamentos realizados ... 83

Tratamentos realizados nos pacientes que apresentaram recidiva... 85

Correlação de frequência entre as variáveis, de acordo com os tipos histológicos... ... . . .. .. ... .. . . . .. ... .. . .. . ... . . ... ... .. . .. .. . . .. 89

Variáveis 92 imunohistoquímicas ... . Sobrevi da global em 5 e 1 O anos de acordo com as variáveis... 94

Sobrevida global em 5 e 10 anos de acordo com os marcadores imuno-histoquímicos... ... 99

Sobrevi da livre de doença em 5 e 1 O anos de acordo com as variáveis.. 1 07 Sobrevi da livre de doença 5 e 1 O anos de acordo com os marcadores de prognóstico... 113

Distribuição de pacientes de acordo com a idade ... 54

Distribuição dos pacientes de acordo com o gênero e cor de pele... 54

Distribuição dos pacientes de acordo com a localização... 57

Distribuição dos tumores de acordo com o diâmetro... 60

Distribuição dos tumores de acordo com a invasão local.. . . .. 60

Distribuição dos tumores de acordo com TNM... .. 61

Distribuição dos tumores de com o grupo clínico. . . .. . 62

Distribuição das recidivas... 85

Sobrevida global, método Kaplan-Meier... ... ... ... 95

Sobrevida global, de acordo com a localização, método de Kaplan-Meier... 95

Sobrevida global, de acordo com o tipo histológico, método de Kaplan-Meier... 96

Sobrevida global, de acordo com o Grupo clínico, método de Kaplan- 97 Meier Sobrevida global, de acordo com a marcação para p53, método Kaplan-Meier... 100

Sobrevi da global, de acordo com a marcação para F AS, método de Kaplan-Meier.. . . 1 O 1 Sobrevida global, de acordo com a marcação para C-erbB2, método de Kaplan-Meier... ... ... 102

(14)

Gráfico 16 Gráfico 17 Gráfico 18 Gráfico 19 Gráfico 20 Gráfico 21 Gráfico 22 Gráfico 23 Gráfico 24 Gráfico 25 Gráfico 26 Gráfico 27 Figura 1-Figura 2-Figura 3- Figura4-Figura 5-Figura 6-Figura 7-Figura 8-Figura 9-Figura 10Figura 11

-Sobrevida global, de acordo com a marcação para CDK4 nuclear,

método de Kaplan-Meier ... 103 Sobrevida global, de acordo com a marcação para CDK4

citoplasmático, método de Kaplan-Meier... ... 104 Sobrevida global, de acordo com a marcação para Ki67, método de

Kaplan-Meier... ... ... 105 Sobrevida livre de doença, método de Kaplan-Meier... 108 Sobrevida livre de doença, de acordo com o localização, método de

Kaplan-Meier... 109 Sobrevida livre de doença, de acordo com o tipo histológico, método

de Kaplan-Meier. . . 11 O Sobrevida livre de doença, de acordo com o Grupo clínico, método de Kaplan-Meier... .. . . 111 Sobrevida livre de doença, marcação por C-erbB2, método de Kaplan-Meier... ... ... 114 Sobrevida livre de doença, de acordo com a marcação para CDK4

nuclear, método de Kaplan-Meier... ... 115 Sobrevida livre de doença, de acordo com a marcação para CDK4

citoplasmático, método de Kaplan-Meier... 116 Sobrevi da livre de doença, de acordo com a marcação para F AS,

método de Kaplan-Meier... .. . . 117 Sobrevida livre de doença de acordo com a marcação para Ki67,

método de Kaplan-Meier... . . 118 RMS embrionário composto, em sua maioria, por células primitivas com diferenciação rabdomioblástica (H&E, 200x) ... 66 RMS embrionário, rabdomioblastos demonstrando estriações cruzadas em halo ao redor do núcleo (H&E, 400x) ... 66 RMS embrionário botrióide, aspecto mixóide e hipercelularidade (H&E, 1 OOx) . . . .. 67 RMS embrionário botrióide em maior aumento (H&E, 200x)... 67 RMS embrionário fusiforme, células fusiformes relativamente uniformes (H&E,100x) ... 68 RMS embrionário fusiforme, maior detalhe demonstrando as células tumorais fusiformes dispostas em fascículos irregulares (H&E, 200x).. 68 RMS alveolar clássico, padrão "alveolar" característico, com células tumorais aderidas aos septos fibrosos e soltas no interior das cavidades. (H&E, 1 OOx)... ... 69 RMS alveolar clássico, detalhe demonstrando as células tumorais em camada única aderidas aos septos fibrosos (H&E, 200x)... 69 RMS alveolar sólido, septos fibrosos com células tumorais em seu interior, hipercelularidade no interior das cavidades (H&E, 100x)... 70 RMS alveolar sólido, septos fibrosos com células tumorais aderidas, células pequenas com citoplasma escasso (H&E, 200x)... 70 RMS pleomorfo composto predominantemente por células fusiformes pleomorfas (H&E, 100x) ... 71

(15)

Figura 12-Figura 13-Figura 14Figura 15 -Figura 16-Figura 17-Figura 18-Figura 19-Figura 20- Figura21-Figura 22-Figura 23-Figura 24-Figura 25-Figura 26-Figura 27-Figura 28-Figura 29-Figura 30-Figura 31-Figura 32-Figura 33-Figura

34-RMS pleomorfo, grandes células tumorais com núcleo hipercromático e citoplasma eosinófilo (H&E, 200x)... 71 RMS pleomorfo demonstrando positividade para vimentina (Imunoperoxidade, 200x) . . . .. 72 RMS alveolar evidenciando células tumorais com positividade citoplasmática característica para desmina (Imunoperoxidase, 200x)... 72 RMS embrionário, células tumorais demonstrando positividade nuclear para miogenina (lmunoperoxidade, 200x) ... 73 RMS alveolar, células tumorais evidenciando positividade nuclear para miogenina (Imunoperoxidase, 200x) ... 73 RMS embrionário, demonstrando positividade nuclear para MyoD 1 (Imunoperoxidase, 200x)... .. . . 74 RMS embrionário, células tumorais demonstrando marcação nuclear para MyoD1 (Imunoperoxidase, 200x)... ... 74 RMS alveolar, área focal demonstrando positividade nas células tumorais para AE1/AE3 (Imunoperoxidade, 200x)... 75 RMS pleomorfo, células tumorais esparsas demonstrando positividade para AE1/AE3 (Imunoperoxidade, 200x) ... 75 RMS embrionário, demonstrando área com células positivas para p53 (lmunoperoxidase, 200x)... 76 RMS pleomorfo, evidenciando células positivas para p53 (lmunoperoxidade, 200x)... 76 RMS embrionário, demonstrando grande número de células tumorais positivas para CDK4 nuclear (lmunoperoxidase, 200x)... 77 RMS alveolar, células tumorais demonstrando positividade nuclear e citoplasmática para CDK4 (Imunoperoxidase, 200x) ... 77 RMS embrionário, células tumorais apresentando marcação positiva para CDK4 citoplasmático (lmunoperoxidase, 200x)... 78 RMS alveolar, várias células demonstrando positividade para CDK4 citoplasmático (lmunoperoxidase, 200x)... ... 78 RMS alveolar, grande número de células demonstrando positividade para o receptor de superficie C-erbB2 (Imunoperoxidase, 200x)... 79 RMS pleomorfo, demonstrando alta positividade para o receptor de superficie C-erbB2 (lmunoperoxidase, 200x) ... 79 RMS embrionário, células tumorais positivas para F AS (Imunoperoxidase, 200x)... 80 RMS alveolar, células tumorais evidenciando positividade para F AS (Imunoperoxidase, 200x)... 80

RMS alveolar, células tumorais positivas para PCNA

(Imunoperoxidase, 200x)... ... ... 81 RMS pleomorfo, células tumorais positivas para PCNA (Imunoperoxidase, 200x)... 81 RMS embrionário, células tumorais positivas para Ki67 (Imunoperoxidase, 200x)... 82 RMS alveolar, células tumorais positivas para Ki67 (Imunoperoxidase, 200x)... 82

(16)

LISTA DE ABREVIATURAS

A - Actinomicina D

AFIP- Armed Forces Institute ofPathology (Instituto de Patologia das Forças Armadas) BSA- Bovine Serum Albumin (Soro Albumina Bovina)

C - Ciclofosfamida

CDK- Cyclin-Dependent Kinase (Ciclinas Dependentes de Quinases) C-erb - Receptores de superficie para fatores de crescimento

CIR - Classificação Internacional dos RMSs

CKI- Cyclin-dependent Kinase Inhibitors (inibidores de CDKs)

CWS- Cooperative Soft Tissue Sarcoma Study Group (Grupo Alemão Colaborativo de Sarcoma de Tecido Mole)

DNA- Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxidorribonucleico) Dox - Doxorubicina

E - Etoposide

FAS- Animal Fatty Acid Synthase (Complexo enzimático ácido graxo sintase) GF AP - Glial Fibrillary Acidic Protein (Proteína Fibrilar Ácida Glial)

Gy- Unidade de medida para dose de radiação (Gray) H&E - Hematoxilina e Eosina

HFRT- Hyperfractionated Radiotherapy (Radioterapia Hiperfracionada) I - Ifosfamida

ICG - Italian Cooperative Group (Grupo Italiano Cooperativo de Sarcoma de Tecido Mole)

(17)

lER- Intergroup Rhabdomyosarcoma Study (Intergrupo de Estudo de RMSs) INC (NCI)- National Cancer Institute (Instituto Nacional do Câncer)

MFH- Malignant Fibrous Histiocytoma (Fibro Histiocitoma M<l;ligno) MRF - Myogenic Regulatory Factor (Fator Regulatório Miogênico) MyoD- Família de fatores miogênicos

PBS- Phosphate Buffered Saline (Solução Salina Tamponada com Fosfatos)

PCNA- Proliferating Cell Nuclear Antigen (Antígeno Nuclear de Proliferação Celular) PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de polimerase)

QT- Quimioterapia Rb - Retinoblastoma

RHD - Regime de Higiene e Dieta RMS - Rabdomiossarcoma RXT - Radioterapia

SIOP - International Society of Pediatric Oncology (Sociedade Internacional para Oncologia Pediátrica)

TNM - Sistema Internacional para Estadiamento Clinico V- Vincristina

(18)

Análises Clínica. Histopatológíca e lmunohistoouímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeca e Pescoco

RESUMO

Cleverton Roberto de Andrade

RESUMO

Rabdomiossarcoma (RMS) são tumores malignos de músculo estriado e acometem preferencialmente crianças e adolescentes, sendo raros em pessoas com mais de 45 anos de idade. Muitos estudos clínicos com RMSs têm proporcionado melhoras no prognóstico. Entretanto, a importância da expressão imunohistoquímica de algumas proteínas ainda precisa ser esclarecida. O objetivo desse estudo foi avaliar as características clínicas, histopatológicas e imunohistoquímicas de RMSs de cabeça e pescoço correlacionando com o prognóstico dos pacientes. Foram analisados 29 pacientes com RMS da região de cabeça e pescoço tratados no Departamento de Cabeça e Pescoço e Otorrinolaringologia, Hospital do Câncer A.C Camargo, São Paulo, Brasil entre 1954 e 2002. Os dados clínicos foram obtidos dos prontuários médicos e as lâminas histológicas foram revisadas e os tumores

classificados de acordo com Enzinger & Weiss (2001). A imunohistoquímica foi realizada

pela técnica de imunoperoxidase usando anticorpos contra vimentina, desmina, miogenina, MyoD1 e AE1/AE3 para diagnóstico e contra p53, PCNA, Ki67, C-erbB2, FAS e CDK4 para análise do prognóstico. Os tumores foram mais frequentes nas duas primeiras décadas de vida (média de idade 14,3 anos) com uma discreta predominância no gênero masculino (58,6%). A região extra-oral foi o local mais comum (62,1%) com maior frequência no nariz. A região intra-oral foi acometida por 37,9% dos casos, havendo predomínio de tumores em mucosa jugal. O estádio clínico predominante foi o T2b (9 casos, 31% ). A

maioria dos pacientes não apresentava metástase à distância no momento do diagnóstico,

entretanto 1 O pacientes apresentaram metástase regional e 2 metástase à distância.

Microscopicamente, 18 casos ( 62,1%) foram classificados como RMS embrionário, 10 (34,5%) como RMS alveolar e 1 caso (3,4%) como RMS pleomorfo. Na avaliação

(19)

Análises Clinica. Histopatológica e lmunohistoquímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoço

RESUMO

imunohistoquímica para diagnóstico, 27 casos foram positivos para desmina (93,1 %), 28 para vimentina (96,5%), 27 casos para miogenina (93,1 %) e em 10 casos para MyoD1 (34,5% ). Considerando marcadores de prognóstico, positividade para p53 foi encontrada em 4 casos (13,8%), para PCNA em 28 casos (96,5%), para Ki67 em 16 casos (55,2%), para C-erbB2 em 19 casos (70,4% ), para F AS em 9 casos (31%) e para CDK4 em 10 casos (34,5%). A análise da correlação de frequência demonstrou que a expressão de Ki67 e CDK4 foi mais comum em RMSs embrionários. O tratamento predominante foi a quimioterapia com radioterapia (17 casos, 58,6%) havendo recorrência em 15 casos (41,4%). A sobrevida global foi de 28,7% em cinco e dez anos. Somente a variável p53 foi associada ao prognóstico na sobrevida global, com os casos positivos relacionados com o pior prognóstico (p = 0,06). Nossos resultados demonstraram que nenhum dos marcadores imunohistoquímicos estudados apresentaram significância prognóstica.

(20)

Análises Clínica. Histopatoi6Qica e lmunohistoauímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoco

ABSTRACT

ABSTRACT

Rhabdomyosarcoma is the most common soft tissue malignant tumor arising in children and young adults and it is rare in people older than 45 years. Many studies o f this tumor have been providing improvement of the prognosis. However, importance of the immunohistochemical expression of some proteins needs to be clarified. Therefore, the objectives o f this study were to analyze the clinicopathological and immunohistochemical features o f head and neck rhabdomyosarcomas and its relationship with the prognosis o f the patients. From 1954 to 2002, twenty-nine patients with head and neck rhabdomyosarcoma treated in the Department of Head and Neck Surgery and Otorhinolaryngology, Cancer Hospital AC Camargo, Sao Paulo, Brazil, were selected for this study. Clinicai data were obtained from the medicai records, and the histological slides were reviewed and the tumors were classified according to Enzinger and Weiss (2001). Immunohistochemical analysis was performed using primary antibodies anti vimentin, desmin, myogenin, MyoD1 and AE1/AE3 for diagnostic and p53, PCNA, Ki67, C-erbB2, FAS and CDK4 for prognostic significance by immunoperoxidase technique. The tumors were more frequent in the first two decades of life (mean age of 14.3 years) with a discreet male predilection (58.6%). The extraoral region was the most common location (62.1%) with prevalence on the nose. Intraoral involvement was observed in 37.9% of the cases, being the buccal mucosa the most frequent site. The predominant clinicai stage was T2b (9 cases, 31 %). Most patients did not show metastasis at the moment o f the diagnosis, however 1 O patients presented regional metastasis and two displayed distant metastasis. Microscopically, 18 cases (62.1%) were classified as embryonal, 10 (34.5%) as alveolar and 1 (3.4%) as pleomorphic. Immunohistochemical analysis for diagnosis showed positivity for desmin in

(21)

Análises Clínica. Histopatológica e lmunohistoguímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeca e Pescoço

ABSTRACT

27 cases (93.1 %), for vimentin in 28 (96.5%), for myogenin in 27 (93.1 %) and for MyoDl in 10 (34.5%). Regarding prognostic factors, positivity for p53 was found in 4 cases (13.8%), PCNA in 28 (96.5%), Ki67 in 16 (55.2%), C-erbB2 in 19 (70.4%), FAS in 9 (31 %) for CDK4 in 10 cases (34.5%). The correlation analysis showed that expression of Ki67 and CDK4 were more common in embryonal rhabdomyosarcoma. The predominant treatment was chemotherapy with radiotherapy (17 cases, 58.6%) being recurrence noted in 15 cases (41.4%). The overall survival was 28.7% in 5 and 10 years. The unique variant associated to prognosis was p53, with tumors positive for p53 having a worst prognosis (p= 0.06). Our results showed that ali prognostic factors analyzed did not modified the survival o f the patients.

(22)

Análises Clinica. Histopatológica e lmunohistoauimica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeca e Pescoço

INTRODUÇAO

1. INTRODUÇÃO

Rabdomiossarcoma (RMS) é um tumor maligno de músculo estriado que acomete preferencialmente crianças e adolescentes com discreto predomínio no gênero masculino. Apresenta-se clinicamente como massa indolor de crescimento rápido e progressivo, firme

à palpação e geralmente não ulcerado, podendo apresentar multilobulações. A região de

cabeça e pescoço é a de maior prevalência, seguida de trato genito-urinário, retroperitônio e extremidades.

Histologicamente são classificados principalmente em três tipos: embrionário, alveolar e pleomorfo. No entanto, o tipo embrionário poder ser subdividido nos tipos botrióide e fusiforme e o tipo alveolar em clássico e sólido. Para o tratamento são utilizadas três modalidades combinadas: cirurgia, radioterapia e quimioterapia, as quais dependem principalmente do tipo do tumor, tamanho e localização. Embora o aspecto histopatológico nas lâminas coradas em hematoxilina e eosina possa caracterizar a grande maioria das lesões, a imunohistoquímica vem demonstrando o seu valor tanto como auxiliar no diagnóstico quanto para identificação de prognóstico.

O presente estudo teve como objetivo analisar as características clínicas, histopatológicas e imunohistoquímicas de pacientes com RMSs de cabeça e pescoço diagnosticados e tratados no Hospital do Câncer A. C. Camargo e correlacionar com o prognóstico.

(23)

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Considerações Gerais

Vários tumores podem desenvolver-se a partir de tecido mole constituindo um grupo altamente heterogêneo, os quais são classificados de acordo com o tecido maduro que se assemelham. Dentro das várias categorias histogênicas, os tumores de tecido mole são divididos em benignos e malignos. Os tumores benignos apresentam maior semelhança com o tecido normal, capacidade limitada de crescimento, pequena tendência para invadir

localmente e apresentam baixo índice de recorrência local (Enzinger & Weiss, 2001).

Os tumores mesenquimais malignos de tecido mole são chamados de sarcomas de tecido mole, sendo relativamente raros quando comparados com carcinomas e outras neoplasias. Revisão realizada entre 1972 e 1997 identificou um total de 11.250 cânceres de cabeça e pescoço, sendo 139 sarcomas (1,24%), desses somente 16 casos (0,15%) de

tecidos intra-orais (Gorsky & Epstein, 1998)

O sarcoma que se assemelha com os tecidos embrionários de músculo estriado foi primeiramente descrito em 1946 (Stout, 1946) sendo denominado rabdomiossarcoma (RMS). Tumores esporádicos foram descritos ao longo dos anos e o conceito do que se constitui o RMS sofreu consideráveis mudanças nesse período. Gradualmente, tomou-se evidente que muitos sarcomas infantis diagnosticados meramente como sarcomas de células redondas ou sarcomas de células fusiformes na verdade eram RMSs, geralmente do tipo embrionário ou alveolar. Desta forma, foram incluídas na categoria dos RMSs, lesões neoplásicas malignas que apresentam evidência morfológica, imunohistoquímica, ultraestrutural ou genética de diferenciação muscular esquelética primária, usualmente na

(24)

Análises Clínica. Histopatológica e lmunohistoauímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoco

REVISAO DE LITERATURA

Rabdomiossarcoma (RMS) acomete preferencialmente crianças e adolescentes com discreta predominância no gênero masculino (Maurer et al., 1988). Bras et al. (1987), estudando grupo de pacientes com R!vfS verificaram que a idade do diagnóstico variou de três a trinta anos, com uma mediana de 9,5 anos e média de 11,8 anos, e o tempo entre os primeiros sintomas e o diagnóstico variou de O a 26 semanas, com uma mediana de sete semanas. Por outro lado, Maurer et al. (1988), estudando RMSs e sarcomas indiferenciados verificaram uma mediana de sete anos no momento do diagnóstico. Estes autores também observaram que 63 dos 686 pacientes (9%) estudados tinham 1 O anos de idade ou menos e 27 (4%) foram diagnosticados com menos de um ano de idade, com predomínio no gênero masculino (59%).

As principais características clínicas dos RMSs são aumento de volume ou massa indolor de crescimento rápido e progressivo, firme, não ulcerado, com bordas bem definidas ou l)ão, apresentando-se algumas vezes multilobular ou exofitico. Envolvimento dos linfonodos metastáticos foram descritos em 11 a 36% dos casos (Weingrad &

Rosenberg, 1978; Fong et al., 1993; Skinner & Eilber, 1996).

O local mais comum para o surgimento de RMSs é a região de cabeça e pescoço (incluindo órbita e meninges), seguido da região genito-urinária, membros e finalmente tronco (Pappo et al., 1995). A AFIP (Armed Forces Institute of Pathology) revisou 558 casos de RMS e identificou 246 casos (44%) na região de cabeça e pescoço. Pappo et al. (1995) estudaram 2747 tumores e de maneira semelhante identificaram 970 casos (35%) de RMSs na região de cabeça e pescoço. Todavia, Maurer et al. (1988) obtiveram números descritos diferentemente mas com índices semelhantes para essa prevalência, onde a região do trato geniturinário apresentava-se com 21%, extremidades 20%, região crânio

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parameningeana 14% e outras regiões de cabeça e pescoço (excluindo órbita) 13%. No entanto, os autores subdiviram a região de cabeça e pescoço o que reduziu sua incidência. Especificamente na boca e regiões peribucais os locais de acometimento mais freqüentes, em ordem decrescente são: palato mole, mucosa jugal, mandíbula, assoalho bucal, lábio inferior, língua, gengiva e maxila (O'Day et al., 1965; Bras et al., 1987; Sadeghi et al., 1988; Lazzaro et al., 1990; Tanigushi et al., 1995; Chen et al., 1995; Mathew & Ali, 1997; Merchant, 1997; Blatt et al., 1997; Schouwengurg et al., 1998; Kullendorf et al., 1998; Kushner et al., 1999; Skelton & Goodwin, 1999; Limwongse et al., 1999; Pandey et al., 2000; Ikuta et al., 2001; Gopez et al., 2001; Furlong et al., 2001).

2.2 Histopatológico dos Rabdomiossarcomas

A Organização Mundial da Saúde (OMS), em 1969, adotou os tipos de RMSs: embrionário, botrióide, alveolar e pleomorfo, também conhecida como "esquema convencional" (Tabela I), a qual foi inicialmente esboçada por Stout (1946) e primeiramente descrita por Hom & Enterline (1958). Essa classificação serviu de base para as classificações realizadas pelo Intergrupo de Estudo de RMS (lER) nos estudos realizados em 1983 e 1993 (IER1 e IER2) onde foram considerados os tipos e subtipos: embrionário, alveolar, pleomorfo, embrionário-botrióide, indiferenciado e outros sarcomas e na categoria dos indiferenciados foram reconhecidos dois tipos especiais de células de tecido mole, as quais exibiam características de sarcoma ósseo de Ewing (pequenas e grandes células), sendo posteriormente reclassificados como sarcoma de Ewing extra-esquelético (Maurer et al., 1988; Maurer et ai., 1993).

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Análises Clínica. Histopatológica e lmunohistoguimica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoço

REVISÃO DE LITERATURA

Tabela I - Classificação convencional para RMSs. Embrionário

Botrióide Alveolar Pleomorfo

Sarcoma, não classificado

Sarcoma de pequenas células redodondas, tipo intermediário Sarcoma de Ewing extra-ósseo

Paralelamente o IER em estudo comparativo realizado de 1987 a 1991 produziu um sistema de classificação considerando a significância e reprodutibilidade dos diferentes sistemas de classificação existentes na época. Para isso baseou-se nas classificações da Sociedade Internacional para· Oncologia Pediátrica, 1989 (SIOP, Tabela II), do Instituto Nacional do Câncer, modificação do esquema convencional, 1992 (NCI, Tabela III), e do Sistema de Classificação citohistológico. Essa última é a única que não teve como base o esquema convencional, usando metodologia previamente aplicada para o tumor de Wilms, e possui os tipos: indiferenciado, RMS misto, anáplasico e células redondas monomórficas, sendo que os tipos anáplasico e de células redondas monomórficas apresentam o pior

prognóstico (Beckwith & Palmer, 1978; Newton et al., 1995). Adicionalmente, foi avaliada

a taxa de sobrevida de todos os tipos (Maurer et al., 1993). A nova classificação foi então

denominada como Classificação Internacional dos RMSs (CIR) do Intergrupo de Estudo do

RMSs (lER), relacionando os achados histológicos com o prognóstico e taxa de sobrevida (Tabela IV).

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Análises Clínica. Histopatolóqica e lmunohistoquímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeca e Pescoco

Kodet et al. (1997) estudando RMSs de órbita usaram o protocolo do lER, e incluíram RMS indiferenciados de pequenas células, e sarcomas cujo material não possibilitou uma precisa subclassificação devido à quantidade ou preservação inadequada do tecido. Essa classificação foi realizada devido aos achados anteriores que demonstraram que na maioria dos casos de RMSs embrionários de órbita havia uma menor diferenciação, sendo portanto específica para os tumores desta localização.

Tabela II- Sociedade Internacional de Oncologia Pediátrica (SIOP). Sarcoma Embrionário RMS Embrionário Frouxo Denso Botrióide Não-botrióide Bem diferenciado Pobremente diferenciado RMS Alveolar RMS do Adulto (pleomorfo)

Outros sarcomas específicos de tecido mole Sarcoma, sem outra especificação

Tabela III- Instituto Nacional do Câncer (NCI) RMS Embrionário- Favorável

Convencional Pleomorfo Leiomiomatoso

Características histológicas agressivas RMS Alveolar- Desfavorável

Convencional Alveolar Sólido RMS Pleomorfo

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Tabela IV- Classificação Internacional de RMS - CIR Prognóstico superior RMS Botrióide RMS de células fusiformes Prognóstico intermediário RMS Embrionário Prognóstico pobre RMS Alveolar Sarcoma indiferenciado

Subtipos cujos prognósticos não se apresentam avaliáveis RMS com achados rabdóides

Os RMSs pleomorfos foram excluídos da classificação da (CIR) por serem extremamente raros em crianças, faixa de análise nos grupos de estudo do lER (Newton et al., 1995).

2.2.1 Tipos Histopatológicos de Rabdomiossarcomas Rabdomiossarcoma Embrionário

O RMS embrionário representa cerca de 50% a 60% de todos os RMSs (Oliveira &

Nascimento, 2001). Surgem mais comumente em crianças na primeira década de vida com idade média de 11 anos (mediana, 5 anos), mas também afetam adolescentes e adultos jovens, havendo também um predomínio deste tipo na segunda e terceira décadas de vida (Hashimoto, 1995). De maneira geral, o local mais comum para ocorrência de RMS embrionário é a região cabeça e pescoço (Foschini & Eusebi, 1994), e especificamente nas regiões peri-bucais é o tipo mais freqüente (Kushner et al., 1999; Skelton & Goodwin, 1999; Limwongse et al., 1999; Pandey et al., 2000; Ikuta et al., 2001; Gopez et al., 2001; Furlong et al., 2001).

Histologicamente, RMSs embrionários assemelham-se aos vários estágios da embriogênese do músculo estriado normal, apresentando desde tumores pobremente diferenciados até tumores bem diferenciados que se assemelham ao músculo fetal. Os

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Análises Clínica, Histopatológica e lmunohistoguímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoço

REVISÃO DE LJTERA TURA

achados mms comuns são: (1) variáveis graus de celularidade apresentando áreas

hipercelulares até áreas mixóides com textura frouxa; (2) mistura de células redondas, pequenas, indiferenciadas, pobremente orientadas e com núcleo hipercromático ou células fusiformes e um variado número de células diferenciadas com citoplasma eosinofílico característico de rabdomioblastos; e (3) uma matriz contendo pouco colágeno e quantidades variáveis de material mixóide (Enzinger & Weiss, 2001 ).

RMSs embrionários com evidente grau de pleomorfismo celular são raros e, em alguns casos, são difíceis de distinguir do RMS pleomorfo, usualmente do adulto, exceto pela maior freqüência de estriações cruzadas em tumores da infância e a identificação de áreas típicas de RMS embrionário (Enzinger & Weiss, 2001 ).

Existem também RMS embrionários extremamente diferenciados que consistem quase inteiramente de rabdomioblastos redondos, fusiformes ou poligonais com abundante citoplasma eosinofílico e freqüentes estriações cruzadas. Kodet et al. (1997) consideraram que estes tumores com acentuada diferenciação consistituem-se praticamente na totalidade de rabdomioblastos, sugerindo rabdomioma. No entanto, existem grupos de células indiferenciadas e áreas focais com marcada anaplasia e núcleos multilobulados os quais caracterizam esses tumores como RMSs.

Ocasionalmente, os RMSs embrionários também apresentam focos de cartilagem e/ou tecido(s) ósseo(s) imaturo(s). As células tumorais podem apresentar acúmulos de glicogênio no citoplasma, produzindo células claras, as quais podem ser confundidas com tumores de células claras (Bégin et al., 1994).

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Rabdomiossarcoma Embrionário de células fusiformes

Cavazzana et ai. ( 1992) reportaram 21 ( 4,4%) RMSs embrionários com

características diferentes em 417 RMS reavaliados pela cooperação Germano-italiana, apresentando células tumorais fusiformes em mais de 80% do tumor, lembrando células musculares estriadas em estágio final de formação embrionária. Os autores denominaram

esta entidade como RMS embrionário de células fusiformes, tendo sido considerada rara e

distinguiram essa entidade do tradicional RMS embrionário devido ao seu melhor prognóstico. Através da imunohistoquímica e da microscopia eletrônica, os autores verificaram um alto grau de diferenciação muscular.

Em outro estudo, dezesseis patologistas de oito grupos, representando seis países e vários grupos cooperativos, classificaram histopatologicamente 800 RMSs e identificaram

cerca de 3% de RMSs embrionários de células fusiformes (Newton et ai., 1995). Hicks &

Flaitz (2002) estudando 137 RMSs da região de cabeça e pescoço, encontraram cerca de ,,

2% da variante embrionária fusiforme.

Assim como em outras formas de RMSs embrionários, a variante de células fusiformes tende a surgir em pacientes jovens (média de idade de aproximadamente sete

anos), sendo raramente descrito em adultos (Rubin et al., 1998).

Histologicamente, o tumor é composto quase exclusivamente por células fusiformes alongadas com núcleo evidente em forma de "charuto" e nucléolos evidentes. As células tumorais apresentam citoplasma fibrilar eosinofílico com bordas celulares distintas, lembrando os últimos estágios de desenvolvimento dos mioblastos fetais. Estriações citoplasmáticas também podem ser observadas. O colágeno é abundante, caracterizando-se por células fusiformes separadas por grande quantidade de fibras colágenas arranjadas em

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REVISA O DE LITERATURA

"ninhos" ou "espiralado". A forma pobre em colágeno é mais celularizada arranjando-se

em feixes ou em fascículos, lembrando o leiomiossarcoma (Cavazzana et al., 1992).

Rabdomiossarcoma Embrionário botrióide

O RMS embrionário botrióide representa cerca de 6% de todos os RMSs (Newton et

al., 1995) e, especificamente na região de cabeça e pescoço, totalizam cerca de 4% (Hicks

& Flaitz, 2002). A palavra botrióide deriva do grego e significa uva ou parreira. Essa

variante é caracterizada por crescimento polipóide, apresentando-se microscopicamente com células esparsas e abundante estroma mucóide, freqüentemente resultando um aspecto

semelhante ao mixoma (Newton et al., 1995). RMSs embrionários botrióides são

encontrados em mucosa, sendo os locais mais freqüentes cavidade nasal, nasofaringe, dueto

biliar, bexiga e vagina (Enzinger & Weiss, 2001).

A configuração tradicional em cachos de uva é um achado importante da variante botrióide, mas o diagnóstico desta variável pode ser realizado sem essa característica

(Newton et al., 1995), no qual "anéis de crescimento de árvore" caracterizados por

condensação subepitelial de células tumorais separadas por estroma frouxo e uma superfície intacta de células epiteliais são encontradas.

Rabdomiossarcoma Alveolar

RMS alveolar é o segundo tipo mais comum de RMS representando

aproximadamente 25-30% do total dos RMS (Oliveira & Nascimento, 2001), geralmente

sugerindo em músculos esqueléticos e fáscia muscular nas nádegas, extremidades inferiores, abdômen e tórax. Casos isolados de RMS alveolar foram descritos em mama, pulmão, retroperitôneo, estômago, trato genital feminino, veia pulmonar, glândula pituitária

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Análises Clínica. Histopatológica e lmunohistoquímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeça e Pescoço

e ossos sacrais (Foschini & Eusebi, 1994). Apresenta índices semelhantes na região de cabeça e pescoço (28%) na sorna das variantes sólida e clássica (Hicks & Flaitz, 2002).

O tumor tende a surgir em idade ligeiramente maior que os RMSs embrionários, com um pico de incidência entre 10 e 30 anos (Heffner, 2003). Harms (1995a) descreve que dos seus 215 RMSs alveolares, 21,4% desenvolveram-se nos primeiros cinco anos de vida, 27% até os dez anos, 26% até os quinze anos e 25,6% em pacientes com mais de quinze anos, em contraste com os RMS embrionários, dos quais 75% ocorreram até os dez anos. Na fase adulta os RMSs alveolares são considerados mais prevalentes que os RMSs embrionários (Hashirnoto, 1995).

Histologicarnente, o RMS alveolar é composto por agregados mal definidos de células turnorais arredondadas ou ovais pobremente diferenciadas que, freqüentemente, demonstram em sua região central perda da coesão celular e formação de espaços alveolares irregulares (Enzinger & Shiraki, 1969). Os agregados celulares individuais são separados e rodeados por urna estrutura densa com septos fibro-hialiizados que, freqüentemente, rodeiam canais vasculares dilatados (Enzinger & Shiraki, 1969). Caracteristicamente, as células da periferia dos espaços alveolares são bem preservadas e aderem em camada simples ao septo fibroso. As células dos espaços centrais do tumor tendem a se arranjar de maneira mais frouxa ou livremente soltas, freqüentemente demonstrando evidências de degeneração e necrose. Em alguns casos, células viáveis são virtualmente ausentes, e o tumor consiste meramente de finas trabéculas fibrosas rodeadas por células pequenas, grupos de células degeneradas com núcleo picnótico e debris de células necróticas (Harrns, 1995a).

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Existe também a forma sólida do tumor, que apresenta poucas regiões de padrão alveolar, sendo composta, na sua maioria, por densos grupos ou lençóis de células semelhantes às células redondas do RMS embrionário, mas com celularidade mais uniforme e com pequeno ou nenhum componente fibroso, da qual deve-se fazer a

diferenciação da forma indiferenciada que apresenta pior prognóstico (Tsokos et al., 1992).

A distinção pode ser difícil, mas na maioria dos casos, a forma sólida do RMS alveolar demonstra padrões celulares uniformes, lembrando formas incipientes de alvéolos. Mesmo nas áreas sólidas há um arranjo regular de septos fibrosos rodeando as células

arredondadas primitivas (Tsokos et al., 1992). Também é importante enfatizar que cerca de

1 0% das lesões apresentam-se focalmente com ninhos de tumor alveolar em RMS embrionário ou indiferenciado e que tradicionalmente estes tumores seriam chamados de RMS misto embrionário/alveolar, ou embrionário se o padrão alveolar fosse minoritário. No entanto, a nova classificação de RMS propôs que qualquer achado alveolar seria

suficiente para o diagnóstico de RMS alveolar (Newton et al., 1995). Do mesmo modo,

muitas lesões podem apresentar arranjos micro-alveolares semelhantes a glândulas e a presença de miogênese com citoplasma eosinofílico é importante, mas não é essencial. Porém, há de se distinguir células miogênicas de material proteináceo coagulado ocasionalmente localizado ao redor do núcleo das verdadeiras células com diferenciação

rabdomioblástica (Newton et al., 1995).

Em contraste com o RMS embrionário, células multinucleadas são proeminentes e um achado importante para o diagnóstico do RMS alveolar. Usualmente as células gigantes têm múltiplos núcleos periféricos com coloração pálida e citoplasma fracamente eosinofílico, não sendo possível verificar as estriações cruzadas nestas células. A formação

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Análises Clfnica. Histopatoi6Qica e lmunohistoguímica de Rabdomiossarcomas da Região de Cabeca e Pescoco

de colágeno é usualmente confinada as regiões dos septos, mas ocasionalmente grandes porções do tumor são recobertas por extensas áreas de fibrose (Enzinger & Weiss, 2001).

Rabdomiossarcoma Pleomorfo

RMS pleomorfo é considerado uma variante rara de RMS, acometendo quase exclusivamente adultos, com média de idade de 54 anos para homens e 51 anos para mulheres (Furlong et al., 2001). A mais recente classificação proposta pelo lER (Newton et

al., 1995) não incluiu o tipo pleomorfo para RMSs, devido ao enfoque principal da entidade, que visa classificar e tratar tumores pediátricos, sendo considerado extremamente raro nessa faixa etária. Harms (1995b) estudou um total de 1987 tumores malignos de tecido mole em crianças e adolescentes, dos quais 766 (45,4%) foram RMS: 541 do subtipo embrionário, 215 alveolar e somente um p1eomorfo. No início de sua classificação, Hom &

Enterline (1958) consideraram que 13 dos 39 tumores por eles classificados eram RMSs pleomorfos, dos quais, .a. maioria originava-se de tecidos moles profundos das extremidades de indivíduos adultos. Essa alta prevalência do tipo pleomorfo em adultos foi confirmada em vários estudos publicados na década de 60, sugerindo uma incidência de 9% a 14% de todos os sarcomas. No entanto, essa informação foi reformulada em 1978, quando Weiss & Enzinger (1978) introduziram o conceito de Fibro Histiocitoma Maligno (MFH), que apresentava a variante estoriforme, o que acabou reclassificando vários RMS pleomorfos nessa nova entidade, tomando esse tipo de RMS raro (Harms, 1995b) ou inexistente (Sei dai & Kindblom, 1989).

Posteriormente, com o advento da imunohistoquímica e o refinamento do reconhecimento dos tumores com diferenciação muscular estriado, foi confirmada a existência do RMS pleomorfo e delineado o critério para distinção de outros sarcomas

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pleomorfos (Furlong et al., 2001). Atualmente, RMS na idade adulta representa cerca de 5,4% dos casos de sarcomas de tecido mole e encontra-se em sexto lugar em freqüência. Dentre os tipos e subtipos de RMSs da idade adulta, o pleomorfo corresponde a cerca de 9,7% dos casos (Furlong et al., 2001).

A região de maior incidência para os RMS pleomorfos é controversa, com autores demonstrando que embora haja um aumento na incidência desse tumor nas extremidades, o local mais comum seria a região de cabeça e pescoço, principalmente em regiões não orbitais (Hoon Lee et al., 1996). Outros autores demonstraram uma maior incidência nas extremidades inferiores, abdomên/retroperitôneo, parede do tórax/abdominal, cordão espermático/testículos (Furlong et al., 2001 ).

Histologicamente o RMS pleomorfo pode ser distinguido do RMS embrionário e RMS alveolar pela associação de arranjo impreciso, orientação ao acaso, células redondas ou pleomorfas com núcleo hipercromático e citoplasma eosinofílico (Enzinger & Weiss, 2001). Apresenta rabdomioblastos pleomorfos, atipicamente grandes e policlonais. Estas células variam das formas de "tira" ou "fusiforme" a forma de "raquete" ou multinuclear com núcleo vesicular, nucléolo evidente e abundante citoplasma. Estriações cruzadas são raramente identificadas. O estroma varia de lençóis de células poligonais epitelióides médios ou grandes a até lençóis atípicos de células fusiformes e pleomorfas com um padrão de crescimento estoriforme. A contagem de mitoses por campo apresenta-se alta e áreas de necrose estão muitas vezes presentes (Furlong et al., 2001).

O RMS pleomorfo precisa ser primeiramente distinguido de outros tipos e subtipos de RMSs, já que todos podem apresentar áreas focais de células pleomorfas. Amostras adequadas do tumor usualmente revelam mais áreas típicas de RMS embrionário ou

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alveolar. RMS pleomorfo pode se arranjar em padrão de crescimento fascicular lembrando leiomiossarcoma pleomorfo. Todavia, a maioria dos casos de leiomiossarcoma pleomorfo apresenta um padrão fascicular bem definido composto por células musculares lisas típicas. Ambos os tumores são positivos para actina e desmina, mas a imunohistoquímica para mioglobina, mio sina estável, MyoD 1 e miogenina são úteis para reconhecer o RMS pleomorfo (Dias et al., 2000)

Ultraestruturalmente os RMSs pleomorfos são· similares aos outros tipos de RMSs. As células tumorais apresentam-se fusiformes, indiferenciadas e com pouco retículo endoplasmático ou demonstrando achados oncocíticos, além de células alternando filamentos em banda-Z finos e espessos (Hollowood & Fletcher, 1994). A identificação de complexos ribossomo-miosina e disposição hexagonal de filamentos finos e espessos, ajuda a identificar um tumor como RMS pleomorfo (Furlong et al., 2001).

O diagnóstico diferencial dos RMSs pleomorfos e MFH (fibro-histiocitoma maligno) baseia-se na presença de grandes células gigantes eosinófilas, freqüentemente com citoplasma finam ente vacuolizado (diferente da vacuolização grosseira em "teia de aranha" presente no RMS) nos MFH e associados com ocasionais células xantomatosas e um proeminente componente inflamatório (Enzinger & Weiss, 2001). Além disso, a

distinção dos RMSs pleomorfos requer identificação da diferenciação sarcomérica, mesmo que só focalmente. Devido a possível falta de especificidade da desmina e actina em vários sarcomas pleomorfos, esta distinção é melhor realizada usando anticorpos específicos, tais como MyoD1 ou miogenina ou através da microscopia eletrônica (Furlong et al., 2001).

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2.2.2 Análise Imunohistoquímica

O conceito de que a imuno-fenotipagem pode denotar a linhagem celular dos tumores, tanto pelo padrão de expressão do antígeno quanto pela expressão de sua linhagem específica é bem aceito. A imuno-histoquímica tem demonstrado ser um adjuvante efetivo para o diagnóstico na maioria dos tumores nos quais as características histopatológicas estabelecidas não são suficientes para o diagnóstico definitivo, ou nos quais essas . características sejam semelhantes em diferentes tumores de diferentes linhagens (Leong & Wannakrairot, 1992; Jordan et al., 2002). É particularmente importante nos RMSs pleomorfos, já que o aspecto morfológico característico que evidencia a diferenciação sarcomérica, na forma de estriações cruzadas, é muito rara nesses tumores (Kumar et al., 2000).

Jordan et al. (2002) descreveram cinco subtipos de tumores de cabeça e pescoço que apresentam dificuldade no diagnóstico e incluíram os RMSs em três desses subtipos:

tumores de pequenas células redondas, tumores de células grandes redondas e tumores de células fusiformes. Os anticorpos mais comumente usados no diagnóstico de RMS são: desmina, mioglobina, actina, miogenina e actina músculo específica, embora seja possível a expressão de marcadores inespecíficos como pancitoqueratina ou antígeno leucocitário (Hicks & Flaitz, 2002; Jordan et al., 2002).

Filamentos intermediários constituem um dos três maiores sistemas do citoesqueleto celular. Esses filamentos são compostos por diversas famílias de proteínas que expressam padrões que usualmente são específicos para o tipo celular (Fuchs & Weber, 1994). Grupos distintos de filamentos intermediários são descritos baseados em suas propriedades, estrutura do gene e seqüências homólogas e como exemplos são relatadas as queratinas, os

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neurofilamentos, as lamininas, e as proteínas relacionadas com a vimentina, sendo que estes últimos incluem a própria vimentina, desmina, proteínas ácidas gliais (GF AP) e periferrina. Vimentina se expressa predominantemente em células de origem mesenquimal (Franke et al., 1982) e em células adaptadas à cultura (Franke et al., 1979). Desmina é uma proteína

filamentosa classificada como intermediária (8 a 1 O nm) com peso molecular de aproximadamente 53.000, encontrada em células musculares e miofibroblastos (Bergamini

et al., 1989). Essa proteína é necessária na miofibrinogênese normal e resistência ao dano

contrátil em células musculares (Li et al., 1994). As funções da proteínas ácidas gliais e da

vimentina não estão totalmente claras. A remoção da capacidade de produção de proteínas ácidas gliais (Pekny et al., 1995) ou de vimentina em animais é compatível com a vida,

sugerindo compensação através de outras proteínas do citoesqueleto (Colucci-Guyon et al.,

1994).

Mioglobina é uma hemoproteína monomérica citoplasmática que é restrita a cardiomiócitos e miofibras esqueléticas oxidadas metabolicamente (Witternberg & Witternberg, 1989). A inibição química aguda da formação de oximioglobina demonstrou que a mioglobina é uma proteína essencial na liberação de oxigênio dos eritrócitos para as mitocôndrias durante os períodos de alta demanda metabólica (Witternberg & Witternberg, 1989). Entretanto, a completa ausência de mioglobina é possível e mantêm a função esquelética e cardíaca sob hipóxia (Garry et al., 1998). A imunoreatividade para desmina e

mioglobina é útil como auxiliar no diagnóstico de tumores de origem muscular, especialmente RMS.

Actina é um filamento citoplasmático pequeno de aproximadamente 5 nm de diâmetro com propriedades contráteis. Muitos organismos apresentam múltiplos genes que

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codificam actina. Os humanos tem seis genes, sendo descritas três isoformas diferentes

chamadas de a, ~ e y, as quais diferem levemente em suas sequências de aminoácidos

(Alberts et a/., 2002). A actina a expressa-se somente em células musculares, enquanto~ e

y são encontradas juntas na maioria das células não musculares. A actina músculo

específica (clone HHF35) geralmente propicia uma boa sensibilidade para detecção dos

leiomiossarcomas (Gown et ai., 1985), embora apresente pouca especificidade,

expressando-se também em células mioepiteliais de glândulas salivares (Regezi et

a/.,

1991), ou mesmo em tumores de músculo estriado. A diferenciação muscular em uma neoplasia pode ser estabelecida pela demonstração da expressão das proteínas desmina, actina ou mioglobina.

O processo de miogênese de músculos esqueléticos envolve a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas em células musculares esqueléticas e é regulado por

genes da família de fatores miogênicos (MyoD) (Puri et ai., 1997). Esses fatores

musculares regulatórios (MRFs) são fosfoproteínas nucleares que ativam a transcrição músculo-específica através da ligação a uma seqüência conhecida como E.box, presente em numerosos promotores de genes musculares (Emerson, 1993). Essa família inclui os genes MyoDl/myf-3, miogenina/myf4, myf5, e MRF-4 que transcrevem proteínas que se ligam ao DNA e atuam como fatores de transcrição em regiões amplificadoras de genes de

músculos específicos, induzindo sua expressão (Clark et a/., 1991; Bouche et a/., 1993; Jin

et ai., 1993; Dias et ai., 1994; Parham, 1994).

A miogênese normal é caracterizada pela ativação em cascata de precursores miogênicos de fatores regulatórios miogênicos, sendo seguida pela diferenciação fenotípica para mioblastos, alcançada com a expressão de proteínas contráteis (isoformas de miosina e

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actina) e posteriormente por mudanças morfológicas como a formação de feixes musculares (Arnold & Winter, 1998). Células de RMS são bloqueadas em sua diferenciação terminal para músculo, particularmente no programa de segmento miogênico. Este segmento falha no caminho de transformação miogênica revelado pela ampla expressão de fatores de transcrição músculo-específicos e proteínas estruturais em quase todos os RMSs, e pelo fracasso em completar os últimos estágios da miogênese, como definida pela expressão escassa e heterogênea de marcadores finais da diferenciação, como miosina de cadeia pesada (Wijnaendts et ai., 1994a).

Nabeshima et al. (1993) consideraram a miogenina crucial no desenvolvimento muscular em útero e demonstraram outros membros da mesma família impossibilitados de compensar uma possível falha na expressão dessa proteína. Miogenina é o primeiro candidato para diferenciação de RMSs por ser o gene mais diferencialmente expresso e porque é um fator de transcrição miogênica que orienta mioblastos para a diferenciação muscular terminal (Astolft 2001). Kumar et ai. (2000) estudaram RMSs e outros tumores de células redondas pobremente diferenciados e concluíram que a miogenina (myf-4) é extremamente sensível e específica na definição de linhagens rabdomioblásticas e útil como auxiliar imunohistoquímico no painel de tumores de células redondas. Esses resultados foram revalidados em outro estudo, usando tumores de células fusiformes que incluíram 32 RMSs, sendo considerada miogenina altamente sensível e específica como marcador para RMSs (Cessna et al., 2001), fato confirmado recentemente por Hicks & Flaitz (2002) com cerca de 96% de positividade em RMSs.

Queratinas são um grupo de proteínas insolúveis em água que formam monofilamentos, sendo classificadas como filamentos intermediários. Fazem parte do

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citoesqueleto celular em epidermes e outros tecido epiteliais. São identificadas mais de 20 proteínas, dividas em tipo I (relativamente ácido, K9-K20) e tipo II (relativamente básica, kl-K8) (Fuchs & Weber, 1994). O anticorpo anti-AE1/AE3 reconhece proteínas do tipo I e do tipo II, sendo considerado como específico para identificação de diferenciação celular epitelial, sendo, desse modo, útil para a diferenciação de sarcomas e tumores malígnos de origem epitelial (Katenkamp & Kosmehl, 1995). Em RMSs a marcação para AE1/AE3 foi descrita variando entre O e 14,9% (Coindre et al., 1988; Folpe et ai., 2002; Hicks & Flaitz, 2002).

O processo de carcinogênese envolve o ganho da atividade oncogênica e a perda da função do gene supressor de tumor. O principal gene supressor de tumor freqüentemente afetado é o p53, que pode induzir temporariamente a interrupção do crescimento e o reparo celular, parar o crescimento de maneira irreversível, diferenciação terminal ou apoptose em resposta a estresse celular potencialmente oncogênico, tal como dano ao DNA (Ko & Prives, 1996; Levine, 1997). A proteína p53 pode mediar essas funções de diferentes maneiras, entretanto, essa indução envolve a ativação direta ou indireta de múltiplos genes associados com apoptose, interrupção do crescimento, do citoesqueleto, fatores reguladores de crescimento e genes de adesão e inibição do metabolismo celular (Zhao et al., 2000).

Sendo assim, apenas algumas mutações missense da região codificadora de p53 no DNA e na região amplificadora proporcionam acúmulo da proteína mutante p53.

O gene supressor de tumor p53 está mutado em cerca de 50% dos cânceres humanos e 74% dessas mutações são missense, que resultam em proteínas alteradas. Essa fração de mutações missense é maior no gene p53 que em outros genes supressores de tumores (Hussain & Harris, 1998) e conferem a proteína p53 mutante algumas vantagens seletivas

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na carcinogênese. Um importante achado da atividade da oncoproteína p53 é a sua habilidade de interferir na apoptose dependente de p53 por um mecanismo dominante negativo e também com apoptose independente de p53. Devido à evasão de células programadas para morrer oferecer uma forte vantagem seletiva para as células cancerosas em metástases e durante a quimioterapia, a função anti-apoptótica do p53 mutante pode ser especialmente devastadora. A marcação para p53 em RMSs varia entre 5 e 19% quando se utiliza a identificação imunohistoquímica (Ayan et al., 1996; Taylor et al., 2000; Hicks & Flaitz, 2002) e foi descrita como sendo de 44% em análise molecular (Y oo e t al., 1997).

A atividade proliferativa de uma célula depende da regulação de seu ciclo celular, seja regulando o próprio ciclo ou mesmo permitindo que uma célula lábil entre no ciclo celular. Sherr (1996) e Morgan (1997) elucidaram o mecanismo de regulação do ciclo celular, no qual, o grupo principal de proteínas reguladoras do ciclo celular são as proteínas da família retinoblastoma (Rb ). A proliferação ocorre quando estas proteínas são fosforiladas pela família de proteínas chamadas de ciclinas dependentes de quinase (CDK). Já foram identificadas nove CDKs, sendo essas quinases ativadas por ciclinas do tipo D (DI, D2 e D3) e ciclinas E e, inativadas por por duas famílias de inibidores de CDKs (CKI), família INK composta pelas proteínas p 16ink4_a,_{p 15ink}_4b,_{p 19ink}4_c_{e p 19ink}_4d_{e família}

CIP/KIP composta pelas proteínas p21 Cipi, p27Kipi e p57Kip2•

O Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) é uma proteína nuclear de 36kDa que funciona como uma proteína auxiliar para a DNA polimerase õ e é absolutamente necessário na síntese de DNA (Schipper et al., 1998; Tsurimoto, 1998). É uma proteína nuclear reguladora do ciclo celular que é expressa diferentemente durante o ciclo, sendo sua taxa de síntese relacionada diretamente com as taxas de proliferação

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celular. Os níveis de PCNA aumentam ao final da fase G~, imediatamente antes do início da síntese de DNA, se tornam máximos durante a fase S e declinam durante a fase G2,

alcançando níveis basais na fase M e em células quiescentes. Um grande número de anticorpos monoclonais para PCNA está disponível atualmente no mercado, incluindo PC10, 19A2 e a9F4 (Schipper et ai., 1998). O PCNA é um marcador imunohistoquímico útil para identificar células em proliferação devido a sua expressão e distribuição, correlacionadas com as taxas de síntese de DNA (Jaskulski et ai., 1988).

Ki67, é uma fosfoproteína nuclear altamente expressa e fortemente relacionada com o ciclo celular (Maccallum & Hall, 1999). Não é detectável em células em G0 (Scott et ai.,

1991) e aumenta seu nível de expressão durante G1 como conseqüência da regulação da

transcrição do gene p53 (Gerdes et ai., 1991) localizado no cromossomo 10q25-ter (F onatsch et ai., 1991 ). A associação absoluta de Ki67 com o ciclo celular e sua ausência em células em GO e células sob reparo do DNA tem tornado a proteína Ki67 uma ferramenta útil na caracterização da atividade proliferativa em tecidos normais e patológicos (Hall & Levison, 1990). De qualquer forma, a função de Ki67 ainda não foi estabelecida. Experimentos utilizando antisense de Ki67 sugerem que a proteína é essencial na replicação do DNA (Schluter et ai., 1993). Similarmente, a micro-injeção de anticorpos anti-Ki67 também perturba o ciclo celular, proporcionando uma redução da progressão do ciclo celular (Starborg et ai., 1996). O anticorpo para o clone MIB-1 da proteína Ki67 é relacionado na literatura como um bom marcador para Ki67 (Kawauchi et ai., 2000).

A família de receptores de superfície conhecida como erbB apresenta papel importante na determinação de linhagens celulares de uma grande variedade de tecidos, inclusive na indução mesênquima-epitélio em órgãos epiteliados. Os receptores erbB já