MANUAL ILUSTRADO: NORMAS GERAIS DE USO DE
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NA
PRÁTICA ANALÍTICA MICROBIOLÓGICA
NORMAS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
INTRODUÇÃO: Os cursos de Técnico em química, Tecnologia em Alimentos e Licenciatura em Química possuem o laboratório de microbiologia em sua infra-estrutura com o objetivo geral de promover estudos práticos, pesquisas cientificas e estudos livres aos alunos da Coordenação de Química. Têm como principal função a aquisição do conhecimento prático de microbiologia, complementando a teoria, integrando as disciplinas afins, promovendo a formação básica do aluno e fazendo com que pesquisas científicas realizadas avancem no conhecimento científico em geral.
OBJETIVOS DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
Acadêmico: possibilitar ao aluno a realização de atividades práticas das áreas básicas, proporcionando com isso uma base de conhecimento para o futuro profissional da microbiologia.
Pesquisa/extensão: apoiar o desenvolvimento de estudos e pesquisas, tanto básicas quanto aplicadas, no sentido de propiciar o avanço no conhecimento e descobertas inovadoras sobre a pesquisa em questão.
APLICAÇÃO DA NORMA: Estas normas se aplicam a todas as pessoas que utilizarem o
laboratório de microbiologia da Coordenação de Química, incluindo técnicos, alunos monitores, alunos de iniciação científica, alunos estágio ou alunos de projetos de extensão, alunos em aulas práticas e professores.
OBJETIVO DA NORMA: Garantir a segurança de todos que utilizam o laboratório, através
da adesão rígida às normas, práticas e técnicas microbiológicas padrões. As pessoas que trabalham com agentes infecciosos ou com materiais potencialmente contaminados devem se conscientizar sobre os riscos potenciais, e devem ser treinadas e estarem aptas a exercerem as técnicas e práticas necessárias para o manuseio seguro destes materiais.
RESPONSABILIDADES: Cabe aos técnicos dos laboratórios, a responsabilidade pelo
treinamento adequado quanto às normas de segurança e de técnicas microbiológicas para os alunos monitores. Cabe aos professores das aulas de microbiologia, a responsabilidade pelo treinamento adequado quanto às normas de segurança e de técnicas microbiológicas para todos os alunos em aulas práticas. Cabe aos professores pesquisadores ou orientadores que fizerem uso do laboratório de microbiologia a responsabilidade de treinamento adequados quanto às normas de segurança e de técnicas microbiológicas aos alunos de iniciação científica, alunos em estágio ou alunos de projetos de extensão.
INSTALAÇÕES: O laboratório de microbiologia é compartimentado em áreas:
1. área de preparo de meios de cultura; 2. área de descarte e lavagem de materiais; 3. área de inoculação;
4. área de incubação;
5. duas bancadas para observações microscópicas 6. duas bancadas para aulas práticas
O laboratório tem capacidade para realização de práticas de microbiologia com no máximo 16 alunos. Portanto, as turmas com mais alunos devem ser divididas para que sua capacidade não seja excedida, e coloque em risco a segurança dos próprios alunos. Recomenda-se que as turmas que excedam a capacidade do laboratório sejam fator 2, ou seja, devem ser divididas e os seus horários devem alocados em dias diferentes para não sobrecarregar o funcionamento do laboratório.
FUNCIONAMENTO: Os horários das aulas práticas constam da grade horária específica de
cada curso, elaborada pela coordenação e aprovada pela direção de ensino no inicio de cada semestre/ano letivo. O laboratório deve ser aberto com 5 minutos de antecedência das aulas pelos técnicos ou monitores. Tais horários deverão ser respeitados e os alunos deverão permanecer dentro do laboratório durante as aulas. O uso do laboratório para atividade de pesquisa e extensão devem ser previamente agendados com os técnicos do laboratório. Quando o laboratório não estiver sendo utilizado o mesmo deve ser mantido trancado. Apenas as geladeiras e estufas incubadoras poderão ficar ligadas à noite e fins de semana, quando da realização de análises microbiológicas que se fizerem necessária.
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 2: Os perigos primários em relação às pessoas que
trabalham com esses agentes estão relacionados com acidentes percutâneos de as exposições da membrana mucosa ou com a ingestão de materiais infecciosos. Deve-se tomar um extremo cuidado com agulhas contaminadas ou com instrumentos cortantes. Embora os organismos rotineiramente manipulados em um Nível de Biossegurança II, (Salmonella) não sejam transmitidos através de aerossóis, os procedimentos envolvendo um alto potencial para a produção de salpicos ou aerossóis que possam aumentar o risco de exposição destes funcionários devem ser conduzidos com um equipamento de contenção primária ou com dispositivos como a cabine de segurança biológica (CSB), ou os copos de segurança da centrífuga. Outras barreiras primárias, máscaras, aventais e luvas devem ser utilizados de maneira adequada. As barreiras secundárias como pias para higienização das mãos devem ser utilizadas antes e após realização de análises microbiológicas.
CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICAS (CSB): são geralmente usadas como contenção
primária no trabalho com agentes de risco biológico (microrganismos), minimizando a exposição do operador, do produto e do ambiente. Muitos agentes de risco biológicos requerem o uso de substâncias químicas em suas análises. Não devem ser utilizadas substâncias químicas tóxicas voláteis no interior desta CSB pode causar problemas devido ao balanço de ar entre a cabine e resultando no retorno de vapores químicos para o ambiente laboratorial.
Procedimento para uso da cabine de segurança biológica
Nas áreas laboratoriais de contenção NB2 devem ser utilizados cabines de segurança biológica (Classe I ou II) e outro(s) equipamento(s) de proteção adequado(s) ou dispositivo(s) de contenção física sempre que:
- Sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criação de aerossóis, como centrifugação, trituração, homogeneização, agitação vigorosa, ruptura por sonicação, abertura de recipientes contendo material onde a pressão interna possa ser maior que a pressão ambiental e em cultura de tecidos infectados ou de ovos embrionados;
- Altas concentrações ou grandes volumes de materiais biológicos patogênicos. Tais materiais só poderão ser centrifugados fora de cabines de segurança se forem utilizadas centrífugas de segurança e frascos lacrados. Estes devem ser abertos no interior da cabine de segurança biológica.
Procedimentos corretos para uso da cabine de segurança biológica: - Fechar as portas do laboratório.
- Evitar circulação de pessoas no laboratório durante o uso da cabine.
- Descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida em álcool etílico ou isopropílico a 70%.
- Lavar as mãos e antebraços com água e sabão e secar com toalha ou papel toalha descartável.
- Passar álcool etílico ou isopropílico a 70% nas mãos e antebraços.
- Usar os equipamentos de proteção individual adequados, tais como: jaleco de manga longa, luvas, máscara e gorro (estes dois , quando necessário).
- Colocar os equipamentos, meios, vidraria, etc., no plano de atividade da área de trabalho.
- Limpar todos os objetos antes de introduzi-los na cabine.
- Organizar os materiais de modo que os itens limpos e contaminados não se misturem.
- Minimizar os movimentos dentro da cabine.
- Colocar os recipientes para descarte de material no fundo da área de trabalho ou lateralmente (câmaras laterais também são usadas).
- Usar incinerador elétrico ou microqueimador automático (o uso de chama do bico de Bunsen pode acarretar danos ao filtro HEPA e interromper o fluxo laminar de ar, causando turbulência).
- Usar pipetador automático.
- Conduzir as manipulações no centro da área de trabalho.
- Interromper as atividades dentro da cabine enquanto centrífugas, misturadores ou outros equipamentos estiverem sendo operados .
- Limpar a cabine, ao término do trabalho, com gaze estéril embebida em álcool etílico ou isopropílico à 70%.
- Descontaminar a cabine (a descontaminação poderá ser feita com formalina fervente), aquecimento de paraformaldeído (10,5g/m3) ou mistura de formalina ou paraformaldeído e água com permanganato de potássio (35 ml de formalina e 7,5 g de permanganato de potássio ou 4g de paraformaldeído e 8g de permanganato).
- Deixar a cabine ligada 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.
NORMAS GERAIS:
1. Deve procurar familiarizar-se com a localização de extintores de incêndio e chuveiros de emergência. Qualquer acidente deverá ser comunicado imediatamente ao responsável. 2. A permanência no laboratório exige postura de estudos e pesquisa, observando-se o silêncio necessário a estas atividades.
3. Exige-se conduta pautada pela seriedade e responsabilidade no trato com os materiais e equipamentos utilizados durante as aulas práticas.
4. Logo ao entrar no laboratório, o aluno deverá guardar seus pertences num local desocupado, levando para a bancada de trabalho apenas o material referente à aula, como apostila, caderno e materiais para apontamento. É conveniente desligar aparelhos telefônicos celulares.
5. O uso do avental é obrigatório. O aluno deve vesti-lo logo ao chegar ao seu local de trabalho.
6. É proibido fazer experimentos não autorizados pelo professor ou técnico.
7. O acesso dos alunos dos cursos da área da saúde ao laboratório para as aulas teórico- práticas, bem como para horários de estudo livre, somente será permitido, quando estiverem
trajando jaleco branco.
8. Não é permitido o consumo de alimentos e bebidas nas dependências do laboratório. 9. É expressamente proibido fumar dentro do laboratório.
10. Não é permitida a presença de alunos, ou de qualquer pessoa sem vínculo com a Instituição, nas dependências do laboratório, sem a presença de um professor responsável ou do técnico.
11. As aulas práticas regulares têm precedência sobre quaisquer outras atividades.
12. A não observância das exigências com relação às normas de funcionamento implica a proibição de acesso ou o convite para retirada do aluno das dependências do laboratório. 13. Nas disciplinas que tiverem normas específicas, serão passadas detalhadamente e por escrito, no primeiro dia letivo, e deverão ser cumpridas.
14. Os aluno devem lavar as mãos com sabão e desinfetar com álcool iodado 70%
disponível no laboratório. Ao final da aula é obrigatória a lavagem das mãos e desinfecção, por motivos de segurança.
15. Após colocar o avental, as pessoas que tenham cabelos compridos, deverão prendê-los por motivo de segurança (uso de fogo).
16. Sobre a bancada de trabalho haverá um pulverizador com álcool iodado 70%. A área de trabalho deverá ser pulverizada com álcool e limpa com o papel toalha fornecido, sempre ao início e também ao final de cada sessão de trabalho. Ou seja, SEMPRE, no trabalho em biologia e microbiologia, a PRIMEIRA e a ÚLTIMA coisa a ser feita é a descontaminação da área de trabalho.
17. O aluno encontrará um conjunto de objetos de uso comum para as disciplinas de Microbiologia de Alimentos. Esses objetos serão usados em diversas ocasiões durante o ano, conforme a necessidade. É dever do aluno verificar a integridade do material recebido e comunicar ao Professor qualquer irregularidade encontrada. De acordo com orientação do Professor, o aluno utilizará os materiais necessários à aula para uso. Ao final da aula, os materiais removidos serão devolvidos para uso do próximo grupo. Os demais materiais necessários à aula serão colocados sobre a bancada pelo Laboratorista.
18. Cada aluno deverá possuir uma caneta capaz de escrever em vidro (caneta de retroprojetor ou específica para vidraria de laboratório).
19. Todo o material utilizado, tanto em aula, como em horário de estudo livre, será listado e terá um aluno ou (grupo de alunos) responsável pelo seu uso. Todo o material será verificado no final da aula.
NORMAS ESPECÍFICAS:
1. Dedique atenção especial às condições de trabalho.
2. Antes de iniciar verifique se todos os equipamentos e suas temperaturas estão funcionando de forma correta
3. No início das análises siga exatamente o roteiro de aula prática considerando o tempo necessário para efetuá-las e ter seus resultados. Colocar próximo ao local de trabalho todo o material a ser utilizado para aquelas análises
4. Limpar e desinfetar a superfície de bancadas, balcões, e piso antes e depois da prática.
5. Manipular todo o material de incubação (Culturas em tubos , placas de Petri, Pipetas, etc.) dentro da zona de segurança (cabine de segurança biológica - CSB).
6. Todo o material a ser descartado, principalmente os que contenham meios de cultura e microrganismos devem ser colocados tapados dentro de recipientes no local próprio para esta finalidade, para posterior esterilização.
7. Lembre-se que todo material no laboratório de microbiologia deve ser esterilizado previamente, exigindo cuidados especiais no seu manuseio para evitar a contaminação. 8. As colheres, pinças, alças, espátulas, facas, aquecer até incandescência antes e após o uso. Pode-se também mergulhar todo o material em álcool e flambar, resfriando sempre na zona de segurança da chama.
9. Faça sempre assepsia do frasco de amostra, antes de iniciar a análise, com algodão embebido em álcool 70%.
10. Faça a assepsia das mãos, antes e depois das análises.
11. Mantenha sempre algodão embebido em álcool 70% durante a repicagem de microrganismo para sua segurança.
12. O banho-maria deve permanecer com água destilada (limpa) e no nível para não queimar a resistência.
13. É proibido a permanência de pessoas de outras áreas no laboratório de microbiologia, principalmente na sala de inoculação.
LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS
Esta norma fixa as condições exigíveis para Iavar, preparar e esterilizar os vários tlpos de vidrarias e materiais usados para ensaios microbiológicos.
Condições gerais: para o preparo de materiais a serem utilizados em ensaios microbiológicos, visando completa assepsia e esterilização é necessária a utilização dos seguintes acessórios e reagentes.
Equipamentos e Acessórios do laboratório de microbiologia:
a. Alça de Drigalsky - obtida a partir de um bastão de vidro fino, pipeta plástico,
dobrada em ângulo reto e depois em 45°C na chama. É utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólido.
a. Algodão hidrófobo: É elaborado com fibras 100% algodão cru e repele a água, usado para fazer tampões em tubos de ensaios e erlenmeyers para evitas a contaminação de meios de cultura.
b. Autoclave: equipamento usado na esterilização com vapor úmido de meios de
cultura e materiais usados nas análises microbiológicas numa pressão de 15 lb/pol2, ou 1atm, ou 1 kgf/cm2, correspondendo a uma temperatura de
irá depender do volume de líquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 litros, podem ser esterilizados durante 20 a 30 minutos.
c. Balança semi-analítica: Balança com precisão de 0,001g (três casas depois
da virgula).
c. Banho-maria: utilizado para incubação de culturas, de microrganismos, em meios líquidos na temperatura ideal para seu crescimento.
d. Barbantes e fita crepe: usados para fixar embalagem de papel Kraft feita em
utensílios para esterilização.
d. Bico de bunsen, tela de amianto e tripé: são usados para manter área ao
redor da chama em condições estéreis, flambagem de alças, pinças, tesouras, etc., durante a realização de análises microbiológicas fora da cabine de segurança biológica, além de serem usados também durante o preparo de meios de cultura que são aquecidos para facilitar a sua dissolução.
e. Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas (círculo,
ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de colônias de microrganismos.
f. Centrifuga: utilizada para sedimentar partículas (células de microrganismos) sólidas de meio líquido.
g. Cestas de arame e Aço inox: para acondicionamento de tubos de ensaios para esterilização;
h. Contador de colônias: utilizada para contar a colônias de microrganismos que crescem em meios sólidos contidos em placas de Petri.
i. Erlenmeyer - utilizado para propagação celular de microrganismos em meio
líquido sob agitação em mesa agitadora.
j. Espectrofotômetro: instrumento usado para determinar curvas de crescimento
k. Incinerador de alça de platina elétrico: esterilização de alças de platina.
l. Estufas bacteriológica (incubação): incubação de culturas de microrganismos em temperaturas diferentes, como: 4, 25, 42 e 45ºC favorecendo o crescimento de microrganismos pela incubação na temperatura adequada.
m. Estufas de esterilização e secagem: equipamento usado na esterilização com
calor seco de materiais usados nas análises microbiológicas numa temperatura de 170°C por 1 a 2 horas.
n. Folhas de papel alumínio e papel Kraft: utilizados para embalar materiais que
o. Gaze: usado para envolver o algodão hidrófobo e tampar tubos e frascos com
culturas estéreis.
p. Geladeiras: utilizado na conservação de culturas de microrganismos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de geração.
q. Indicadores de esterilização (fita, tinta ou ampola com suspensão de
Bacillus stearothermophillus): usados para verificação da eficiência da
esterilização.
r. Jarros de anaerobiose: jarros que permitem o desenvolvimento e cultivo de microrganismos anaeróbios em atmosfera de CO2 ou H2, sem o auxílio de vácuo, manômetros ou válvulas de pressão.
s. Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópios.
t. Lâmina Escavada - possui uma ou duas depressões possibilitando observar a
mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de líquido (Ensaio em gota pendente).
v. Lavador automático de pipetas: recipiente cilíndrico de PVC ou inox que
acondiciona as pipetas e possui entrada e saída de água que flui lavando-as.
w. Luvas de amianto: usadas para retirar materiais quentes da estufa e autoclave.
x. Mesas agitadoras: favorece o crescimento de microrganismos aeróbios, pela dissolução do oxigênio no meio, através da agitação da mesa, em movimentos rotatórios.
y. Micropipetas com ponteiras: equipamento pipetador (substitui a pipeta) de
precisão com grande faixa de capacidade volumétrica (1!L a 5000 !L) através do uso de ponteiras.
z. Microscópico estereoscópico (lupa) : estudo da morfologia de colônias microbianas.
aa. Microscópio de campo claro: observação de preparações em lâminas
coradas ou a fresco.
bb. Pinças de Aço inox;
cc. Pipeta automática, tipo bico de papagaio, junta esmerilhada: usada para
dd. Pipeta bacteriológica graduada com bocal para algodão e esgotamento
total: São utilizadas para diluições, inoculações, distribuições de meio, etc. Em
microbiologia estas pipetas devem ser esterilizadas com uma porção de algodão hidrófobo na parte superior. Estas pipetas podem ser sopradas com auxiliar de pipeta (pêra), pois não se requer muita precisão. As pipetas para uso com substâncias químicas devem ser separadas das microbiológicas. As pipetas microbiológicas podem ser usadas com dispensadores automáticos.
ee. Pipeta Pasteur - é um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada para
transportar pequenos volumes de líquido.
ff. Placa aquecedora com agitação magnética: dissolução de meios de cultura ou soluções.
gg. Placa de Petri: é um recipiente cilíndrico (as mais usadas medem cerca de 100
mm de diâmetro por 10 mm de altura), achatado, de vidro, metal ou plástico utilizado para a cultura de microrganismos facilitando o seu isolamento devido à grande superfície de crescimento que apresenta, possibilitando o aparecimento de colônias separadas.
hh. Potenciômetro ou pHmetro : medir pH de meios de cultura e de reagentes. ii. Porta-pipetas em aço inox ou alumínio com tampa: acondicionar pipetas
para esterilização.
jj. Porta-placas de petri em aço inox ou alumínio com tampa: acondicionar
pacas de petri para esterilização.
kk. Provetas 100 mL, 500 mL e 1000mL: usadas para medir o volume de água
destilada para o preparo de meios de cultura.
mm. Tubo de ensaio de cultura: são tubos de vidro, sem borda ou com
tampa de plástico rosqueável, seu tamanho pode variar de acordo com o trabalho a ser realizado. É utilizado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de microrganismos.
nn. Tubos de Durham: São tubos de vidro pequenos e cilíndricos. Servem para
captar o gás formado em uma fermentação.
O material utilizado deve receber a seguinte sequencia de tratamento: A. • descontaminação B. • lavagem C. • secagem D. • esterilização E. • armazenamento A. Descontaminação
- Autoclave 120 °C /60 min. ! Descontaminações
Obs.: Não autoclavar tubos que contenham reativos de KOVAC'S. B. Lavagem
- Enxaguar o material em água corrente, eliminado material orgânico. - Utilizar detergente neutro.
- Preparar a solução e mergulhar todo material a ser lavado.
- Deixar de molho por no mínimo 30 minutos ou por até 24 horas dependendo do grau de sujidade.
- Caso os materiais apresentem incrustações ou resíduos gordurosos, proceder a imersão destes em solução sulfocrômica.
- Enxaguar dez vezes com água corrente, enchendo e esvaziando totalmente a vidraria.
- Utilizar, no último enxágüe, água destilada.
- Deixar drenar a água das vidrarias em cestas de aço inoxidável com fundo perfurado Solução sulfocrômica: Para o preparo da mistura sulfocrômica, dissolver 60g de dicromato de potássio em 200ml de água destilada quente e deixar a solução esfriar. Colocar o recipiente em água fria ou banho de gelo, adicionando lentamente 800ml de ácido sulfúrico, com agitação constante. Utilizar para sujidades aderidas.
C. Secagem
A secagem vai variar com o tipo de material. Esta secagem pode ser feita a temperatura ambiente ou em estufa a 100°C.
D. Preparo dos materiais antes da esterilização
Após a secagem cada material deve ser preparado de acordo com o tipo de tratamento que vai receber. Os materiais que recebem tratamento por calor seco podem ser embrulhados em papel Kraft (pardo) ou acondicionados em cilindros apropriados. Todos os materiais devem ser devidamente identificados.
No caso de tratamento por vapor (autoclave) os materiais devem ser acondicionados dentro de vidros com gaze e algodão no fundo (ponteiras e bastões), deixando a tampa do vidro semi aberta durante o tratamento.
As pipetas devem ser preparadas colocando-se algodão no bocal e depois embrulhado
individualmente em papel Kraft e identificar capacidade e divisão, ou acondicionado em cilindros apropriados.
As placas de petri devem ser preparadas juntas a tampa e fundo e acondicionar para esterilização em porta-placas ou embrulhar individualmente, ou em grupos de dez, em papel Kraft.
As Provetas, Balões, Frascos de Erlenmeyer, Béqueres e Funis colocar tampão de algodão hidrófobo e gaze no bocal dos balões e frascos de Erlenmeyer. Cobrir com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, cordonê ou fita adesiva tipo crepe. Cobrir os bocais e as hastes dos funis e os bocais das provetas e dos béqueres com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, cordonê ou fita adesiva tipo crepe.
Os tubos de ensaio deve-se colocar as tampas de algodão hidrófobo e gaze no bocal de cada tubo e acondicionar em cestas de arame e cobrir com papel Kraft.
Os frascos com tampa de rosca deve-se deixar a tampa de rosca frouxa para autoclavar evitando que o frasco estoure, após retirar da autoclave rosquear a tampa e fechar bem.
As tesouras, pinças, espátulas devem ser embrulhadas com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, cordonê ou fita adesiva tipo crepe e identificadas.
E. Esterilização de material
ITENS TIPO DE
TRATAMENTO TEMPERATURA / TEMPO
Pipetas embaladas
individuais ou em cilindros CALOR SECO ESTUFA 170 °C / 1 h.
Placas de Petri, tubos de ensaios, colheres, conchas, frascos, tesouras, etc...
CALOR SECO ESTUFA 180 °C / 2 h
Potes para coletas, filtros, ponteiras, bastões
(deixar os frascos com as tampas semi abertas)
CALOR ÚMIDO (VAPOR)
AUTOCLAVE 121 °C / 30 min.
Meios de cultura (maioria) CALOR ÚMIDO
(VAPOR) AUTOCLAVE 120 °C / 15 min.
• Todos os tubos e frascos de vidro com tampas de rosca, devem ter suas tampas afrouxadas antes da autoclavagem. Após a retirada da autoclave, estes devem ter as suas tampas fechadas imediatamente.
PROCEDIMENTO OPERACIONAL DA AUTOCLAVE
1. Verificar o nível da água, que deve cobrir totalmente a resistência ou apoio do cesto; 2. Trocar a água da autoclave a cada mês ou quando for necessário abrindo a válvula do dreno, e esvaziar com ajuda de um balde;
3. Adicionar água destilada até cobrir a resistência ou apoio do cesto; 4. Baixar a tampa da autoclave e fechar as manoplas;
5. Ligar a tomada da autoclave e o botão de ajuste de temperatura (máximo);
6. Deixar a válvula de segurança aberta, e deixar sair vapor até começar a gotejar água, então fechá-la;
7. Aguardar que a temperatura alcance 121 ºC e a pressão de 1,1 Kgf./cm2;
8. Ajustar o controle de temperatura para médio, e inicial a marcação do tempo de autoclavagem;
9. Após o tempo de esterilização, ajustar o botão de temperatura (desligar) e desligar a a tomada;
10. Não abrir a tampa da autoclave até que a pressão atinja 0 Kgf./cm2 e a válvula de segurança seja aberta, liberando o vapor contido na autoclave;
