EDILSON NOBUYOSHI KANESHIMA
EFEITO GENOTÓXICO DO BENZONIDAZOL EM CÉLULAS
DIPLÓIDES DE Aspergillus nidulans E TRIPANOCIDA SOBRE AS
FORMAS EPIMASTIGOTAS DE Trypanosoma cruzi.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular, da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas.
Maringá – PR
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO BIOLOGIA CELULAR
EFEITO GENOTÓXICO DO BENZONIDAZOL EM CÉLULAS
DIPLÓIDES DE Aspergillus nidulans E TRIPANOCIDA SOBRE AS
FORMAS EPIMASTIGOTAS DE Trypanosoma cruzi.
Aluno: Edilson Nobuyoshi Kaneshima Orientadora: Dra. Marialba Avezum Alves de
Castro-Prado
Maringá – PR
À DEUS por Vosso imenso AMOR e
misericórdia.
À memória de meu pai Luiz
Kaneshima
Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver amor, sou como o bronze que soa, ou como o címbalo que retine. Mesmo que eu tivesse o dom da profecia e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência; mesmo que tivesse toda a fé, a ponto de transportar montanhas, se não tiver amor, não sou nada.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Marialba Avezum Alves de Castro-Prado pela orientação, pela paciência, pela amizade, pela oportunidade, pela confiança e pelo exemplo de seriedade no desenvolvimento deste trabalho científico.
À Profa. Dra. Mônica Lúcia Gomes pela amizade, pelas sugestões e pelas diversas colaborações durante a realização deste trabalho.
Aos Doutores Silvana Marques de Araújo e Max Jean de Ornelas Toledo pela amizade, pelas críticas e sugestões construtivas..
À Profa. Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos pelo apoio e pelos equipamentos utilizados na realização deste trabalho.
Às professoras Ana Maria Sell, Márcia Machado de Oliveira, Sueli de Oliveira Lautenschlager e Tânia Cristina Alexandrino Becker pelo apoio e pelas aulas ministradas durante este período.
À Luzia A. S. Regasse, Sonia A. de Carvalho, Maria Betania Padua, Sandra Vieira da Silva e Maristela Gabriel pelo apoio técnico e pela preparação dos materiais de laboratório.
Aos colegas do Laboratório de Genética de Microrganismos, Carmem, Cleverson, Josy, Saulo, Simone e Tânia pela amizade e incentivo.
Ao Sr. Francisco Gualter da empresa Roche do Brasil, pela doação do medicamento Rochagan (benzonidazol) para a realização deste trabalho.
Aos amigos Benício e Cláudio pelo apoio e incentivo durante a realização deste trabalho.
À Carmelita e ao grupo de oração Irmãos em Cristo pela amizade e pelas orações.
A todos os professores e amigos do Departamento de Análises Clínicas e do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – área de concentração Biologia Celular que me ofereceram apoio e incentivo.
Em especial, à Alice e ao Luis Filipe pelo amor, carinho e compreensão e também por tudo que convivemos e o que deixamos de conviver durante este período. E à minha mãe Yolanda e meus irmãos Eliana e Edson pelo apoio e carinho.
APRESENTAÇÃO
Esta tese é constituída por dois artigos científicos resultantes do estudo da genotoxicidade e do efeito tripanocida do benzonidazol, medicamento utilizado para o tratamento da doença de Chagas.
Os artigos foram redigidos de acordo com as normas estabelecidas pelas revistas às quais foram submetidos. São eles:
Artigo I. Kaneshima, E.N. & Castro-Prado, M.A.A. Benznidazole-induced genotoxicity in diploid cells of Aspergillus nidulans. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 100(3): 325-330, 2005.
Artigo II. Kaneshima, E.N., Castro-Prado, M.A.A., Toledo, M.J.O., Araújo, S.M.; Gomes, M.L. Trypanocidal activity of genotoxic concentrations of benznidazole on forms epimastigote of Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo (submetido).
SUMÁRIO
Resumo ... 1
Abstract ... 3
Artigo I. Benznidazole-induced genotoxicity in diploid cells of Aspergillus
nidulans. ……….. 5
Artigo II. Trypanocidal activity of genotoxic concentrations of benznidazole on
forms epimastigote of Trypanosoma cruzi. ……… 11
EFEITO GENOTÓXICO DO BENZONIDAZOL EM CÉLULAS DIPLÓIDES DE
Aspergillus nidulans E TRIPANOCIDA SOBRE AS FORMAS EPIMASTIGOTAS
DE Trypanosoma cruzi Edilson Nobuyoshi Kaneshima
Dra. Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
RESUMO
A Tripanosomíase Americana ou doença de Chagas tem como agente etiológico o Trypanosoma cruzi, cujas linhagens T. cruzi I e T. cruzi II, previamente caracterizadas, apresentam origens genéticas distintas. A infecção humana pelo T. cruzi ocorre em vários países da América Latina, com a prevalência de uma das linhagens genéticas, conforme a região demográfica.
No Brasil existem cerca de quatro milhões de pessoas infectadas pelo T. cruzi e o benzonidazol é o único medicamento disponível para o tratamento etiológico da doença de Chagas, com potencial para eliminar o parasita presente no sangue e nos tecidos, durante a fase aguda da doença. Este medicamento, entretanto, não é completamente eficaz na fase crônica da doença.
Durante o tratamento etiológico da doença, reações adversas, tais como alterações digestivas, dermatite, neurite e diminuição de glóbulos brancos, têm sido relatadas como as principais causas da interrupção do tratamento. Além destas reações, há suspeitas de que o benzonidazol possa induzir a formação de linfomas em animais de laboratório e outros tipos de neoplasias malignas em indivíduos imunosuprimidos.
O efeito genotóxico do benzonidazol foi avaliado no presente estudo, pela capacidade deste medicamento induzir a homozigose de genes recessivos em células diplóides de Aspergillus nidulans. Este estudo também avaliou o efeito inibitório das doses genotóxica e não genotóxica do benzonidazol sobre as formas epimastigotas do T.
cruzi I e II.
As concentrações de 50, 75 e 100 µM foram utilizadas para avaliar os efeitos citotóxicos e genotóxicos do benzonidazol nas linhagens diplóides UT448//A757 e B211//A837 de A. nidulans. O medicamento, nas concentrações utilizadas, não alterou a morfologia das colônias, tampouco o crescimento micelial das linhagens analisadas.
Com relação ao efeito genotóxico, entretanto, o tratamento do diplóide B211//A837 com 100 µM de benzonidazol, permitiu o isolamento de um segregante haplóide, com fenótipo recombinante para o intervalo Acr-w do cromossomo II. O tratamento do diplóide UT448//A757 com benzonidazol nas concentrações de 50, 75 e 100 µM, por outro lado, permitiu o isolamento de nove segregantes diplóides prototróficos (D1-D9), os quais foram submetidos à haploidização espontânea em Meio Completo. Os segregantes mitóticos haplóides então obtidos, foram utilizados para o cálculo do Índice de Homozigotização (HI). Este índice permite avaliar a indução de homozigose de genes recessivos, previamente presentes em heterozigose, através do crossing-over mitótico (ou somático).
Os valores de HI dos diplóides obtidos com 50 µM de benzonidazol foram menores do que 2.0, indicando a ausência de crossing over para os genes analisados. Os valores de HI obtidos com o benzonidazol nas concentrações de 75 e 100 µM (D2, D4, D5, D6), por outro lado, foram maiores do que 2.0 e estatisticamente diferentes do controle. Estes resultados demonstraram o efeito recombinagênico do benzonidazol, através do aumento das taxas de crossing over mitótico induzido, processo este que
resulta na homozigose dos genes distais ao ponto de permuta. A indução de homozigose, por sua vez, pode ter efeitos carcinogênicos, devido à perda da heterozigose constitucional de genes supressores de tumores, mediada pelo crossing-over somático. Os resultados apresentados demonstram o efeito recombinagênico dose-dependente do benzonidazol, nas concentrações de 75 e 100 µM.
O efeito inibitório das concentrações genotóxica (75 µM) e não genotóxica (50 µM) do benzonidazol foi avaliado sobre o crescimento das formas epimastigota das cepas G2, A2.1A, CL, Y e 2052. Os parasitos foram cultivados em meio LIT, durante 192 horas, à 28oC, tanto em presença de benzonidazol (50 e 75 µM), quanto em sua ausência (controle negativo), e observou-se o efeito inibitório destas concentrações em todas as cepas analisadas, independentemente do grupo genético a que pertenciam. Na concentração de 75 µM, houve redução significativa do número de parasitos inoculados no tempo zero (T0), após 96 horas de incubação.
Os resultados demonstram que tanto a dose genotóxica quanto a não genotóxica do benzonidazol inibem o crescimento de formas epimastigotas de T. cruzi I e II, porém somente a dose de 75 µM apresenta efeito tripanocida. Estudos complementares do benzonidazol in vitro ou in vivo mostram-se necessários para a obtenção de informações adicionais, visando melhorar o tratamento etiológico dos pacientes com doença de Chagas crônica.
GENOTOXIC EFFECT OF BENZNIDAZOLE IN DIPLOID CELLS OF
Aspergillus nidulans AND TRIPANOCIDE EFFECTS ON EPIMASTIGOTE
FORMS OF Trypanosoma cruzi Edilson Nobuyoshi Kaneshima
Dra. Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi is the etiological factor of American Tripanosomiasis or
Chagas’ Disease featuring already characterized strains T. cruzi I and T. cruzi II with distinct genetic origins. Human infection by T. cruzi occurs in several Latin American countries and the prevalence of a specific strain depends on the demographic region.
Although approximately four million people are infected by T. cruzi in Brazil, benznidazole is the only treatment for the disease’s etiological treatment. In fact, it eliminates the parasite from the bloodstream and tissues during the acute phase of Chagas´disease. However, benznidazole is not efficient in the chronic phase of disease.
Further, side effects during the disease’ etiological treatment, such as digestion changes, dermatitis, neuritis and decrease in white blood corpuscles, have been reported with consequent interruption of treatment. Besides the above reactions, benznidazole has been suspected to cause the formation of lymphomas in lab animals and other types of malign cancer in immunosuppressed individuals.
Current research investigates the genotoxic effect of benznidazole through its ability to induce homozygosis of recessive genes in diploid cells of Aspergillus
nidulans. Research also evaluates the inhibitory effect of genotoxic and non-genotoxic
doses of benznidazole on epimastigote forms of T. cruzi I and T. cruzi II.
Concentrations of 50, 75 and 100 µM were used to evaluate the cytotoxic and genotoxic effects of benznidazole in diploid strains UT448//A757 and B211//A837 of A.
nidulans. Benznidazole in the above concentrations failed to modify the morphology of
colonies and the mycelial growth of the strains under analysis.
In the case of genotoxic effect, treatment of diploid B211//A837 with 100 µM of benznidazole caused the isolation of a haploid segregant with a recombining phenotype for interval Acr-w of chromosome II. On the other hand, treatment of diploid UT448//A757 with benznidazole in 50, 75 and 100 µM concentrations isolated nine prototrophic diploid segregants (D1 – D 9) which underwent spontaneous haploidization in complete medium. Mitotic haploid segregants obtained were then used to calculate Homozygotization Index (HI) which evaluates induction of homozygosis of recessive genes, previously present in heterozygosis, by mitotic (or somatic) crossing-over.
Since HI rates of diploids obtained with 50 µM of benznidazole were lower than 2.0, the absence of crossing-over for genes is thus shown. On the other hand, HI rates obtained with 75 and 100 µM concentrations of benznidazole (D2, D4, D5, D6) were higher than 2.0 and statistically different from control. Results showed benznidazole’s recombinogenic effect by an increase in induced mitotic crossing-over rates. This process is the result of distal homozygosis of genes at exchange site. Further, homozygous induction may have carcinogenic effects owing to the loss of constitutional heterozygosis of tumor-suppressing genes which is mediated by somatic crossing-over. Results also show benznidazole’s dose-dependent recombinogenic effect in 75 and 100 µM concentrations.
The inhibitory effect of genotoxic (75 µM) and non-genotoxic (50µM) concentrations of benznidazole has been assessed by the growth of epimastigote forms of lines G2, A22.1A, CL, Y and 2052. Parasites were cultivated in LIT medium during 192 h, at 28ºC, with (50 and 75 µM) and without (negative control) benznidazole. The inhibitory effect of these concentrations in all strains has been reported, regardless of the genetic group to which they belong. A significant decrease in the number of parasites inoculated at T0 after 96h of incubation has been registered.
Results show that although genotoxic and non-genotoxic benznidazole doses inhibit the growth of epimastigote forms of T. cruzi I and II, only 75 µM dose has tripanocide effects. Complementary in vivo and in vitro studies with benznidazole are deemed necessary for further information on the theme and for an improvement in the etiological treatment of patients with chronic Chagas’ disease.
