CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS DA RAIVA
(Lyssavirus – Rhabdoviridae) ISOLADOS DE ESPÉCIMES CLÍNICOS
DE MORCEGOS HEMATÓFAGOS Desmodus rotundus NO NORTE E
NOROESTE FLUMINENSE
LUIZ FERNANDO PEREIRA VIEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2007
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS DA RAIVA
(Lyssavirus – Rhabdoviridae) ISOLADOS DE ESPÉCIMES CLÍNICOS
DE MORCEGOS HEMATÓFAGOS Desmodus rotundus NO NORTE E
NOROESTE FLUMINENSE
LUIZ FERNANDO PEREIRA VIEIRA
Tese apresentada ao Centro de Ciências
e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientadora: Profª. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2007
DE MORCEGOS HEMATÓFAGOS Desmodus rotundus NO NORTE E
NOROESTE FLUMINENSE
LUIZ FERNANDO PEREIRA VIEIRA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 26 de fevereiro de 2007
Comissão Examinadora:
__________________________________________________________________ Drª. Juliana Galera Castilho (Doutora, Microbiologia) - Instituto Pasteur
___________________________________________________________________ Prof. Fernando Portela Câmara (Doutor, Biofísica) - UFRJ
___________________________________________________________________ Prof. Márcio Manhães Folly (Doutor, Medicina Veterinária) - UENF
__________________________________________________________________ Profª. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira (Doutora, Microbiologia) - UENF
ii Aos meus pais,
Emílio Augusto Vieira Filho e
Sônia Pereira Vieira
iii
Luiz Fernando Pereira Vieira, filho de Emílio Augusto Vieira Filho e Sônia Pereira Vieira, nasceu no dia 4 de janeiro de 1980, na cidade de Cachoeiro de Itapemirim – ES, onde cursou o ensino fundamental no Colégio Jesus Cristo Rei.
Em 1995, quando completou quinze anos, foi estudar em regime de internato na Escola Agrotécnica Federal de Alegre, concluindo o Curso Técnico em 1997.
Em março de 1999, ingressou na Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, onde cursou Medicina Veterinária. Ainda nesse ano, foi selecionado para a Iniciação Científica, pelo Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC), no Laboratório de Sanidade Animal (LSA) do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) da UENF. No LSA, como bolsista do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), trabalhou com Bacteriologia e Virologia.
Em fevereiro de 2004, defendeu a Monografia intitulada “Avaliação da sensibilidade da impressão de tecido encefálico em lâmina, corado pela rotina da hematoxilina e eosina, como método para o diagnóstico da raiva”, e concluiu o Curso de Graduação em Medicina Veterinária.
Ainda em 2004, ingressou no Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Sanidade Animal, do CCTA – UENF. Submeteu-se à defesa de Tese para conclusão do referido Curso em fevereiro de 2007 e foi selecionado para o nível de Doutorado no mesmo Curso de Pós-Graduação da UENF.
iv
Primeiramente, agradeço à Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) por me permitir realizar este trabalho e poder concluir meu Curso de Mestrado em Produção Animal.
À minha, não somente Orientadora, mas muito mais do que isso, uma grande amiga e conselheira, Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira, que há muitos anos vem me conduzindo nesse árduo e, ao mesmo tempo, maravilhoso caminho da Pesquisa Científica.
Ao Instituto Pasteur de São Paulo, onde realizei as técnicas de diagnóstico do vírus. Agradeço a Drª. Ivanete Kotait, Drª. Neide Yumie Takaoka, Drª. Maria Luiza Carrieri, Samira Maria Achar, Drª. Juliana Galera Castilho, Drª. Zélia., Pedro Carnieli Junior, Rafael de Novaes Oliveira, Echaterine e Wilian.
Ao Prof. Paulo Eduardo Brandão, que tive a grande satisfação de tê-lo como meu Co-Orientador, um pesquisador extremamente inteligente, mas dotado de simplicidade, o que permitiu o trabalho ser prazeroso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de Mestrado concedida.
Ao Centro de Controle de Zoonoses e Vigilância Ambiental Dr. Arnaldo Rosa Vianna - Campos dos Goytacazes/RJ (CCZ - Campos / RJ), em especial à equipe
responsável pelo controle da raiva no município de Campos dos Goytacazes e ao diretor dessa entidade, Luiz José de Souza.
v
de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo apoio financeiro ao trabalho.
Aos amigos que saíram a campo em busca de morcegos: Mônica do Nascimento Brito, Andrea Cecília Sicotti Maas, Sérgio Fernandes Bonadiman e Carla Nascimento Chicarino.
Aos Médicos Veterinários: Antônio Márcio e Phyllis Romijn, do Núcleo de Defesa Sanitária de Miracema, e Antônio Carlos, do Núcleo de Defesa Sanitária de Bom Jesus do Itabapoana.
Ao Marlon Vicente da Silva, do Instituto Municipal de Medicina Veterinária Jorge Vaitsman – Rio de Janeiro/RJ (IJV/RJ).
Ao colega Rafael dos Santos Costa que nos abriu as portas do Matadouro
Frigorífico Guarus Ltda., para que pudéssemos alimentar os morcegos com o sangue bovino ali colhido.
Aos colegas e amigos que, direta ou indiretamente, acompanharam as dificuldades e conquistas do meu trabalho: Roberto Machado Carneiro, Bethânia Vieira Lopes, Letícia Cazes, Ive Santos Luzitano, Rachel Siqueira Simões de Queirós Marins e Prof. Márcio Manhães Folly.
Agradeço ao meu amigo Weber Feitosa e seus colegas de república que me acolheram em sua casa na cidade de São Paulo durante mais de dois meses.
Aos meus pais e irmãos, que sempre foram a minha sustentação emocional. Ao meu pai, pela construção de uma gaiola onde foram alojados os morcegos. Ao meu irmão Emílio e minha cunhada Sabina, pelas conversas de alto nível científico e filosófico sempre acompanhadas de um bom café.
Agradeço especialmente aos dois bolsistas de Iniciação Científica, alunos de Graduação em Medicina Veterinária, que me ajudaram muito neste trabalho, sem os quais seria impraticável a manutenção dos morcegos no Morcegário, Aline Carvalho Galante e Leonardo de Barros Peres Souza.
vi LISTA DE TABELAS ... IX LISTA DE FIGURAS ... XI RESUMO ... XIII ABSTRACT ... XV 1. INTRODUÇÃO ...1 2. REVISÃO DE LITERATURA ...4 2.1. Histórico...4 2.2. Taxonomia viral ...6
2.3. Estrutura e propriedades do vírus da raiva...7
2.4. Genoma viral ...9
2.5. Ciclo de replicação viral...11
2.5.1. Adsorção ...11
2.5.2. Penetração e desnudamento ...11
2.5.3. Transcrição e tradução...12
2.5.4. Replicação do genoma viral ...12
2.5.5. Montagem e brotamento ...13
2.6. Patogenia ...13
2.7. Patologia...14
2.8. Resposta imune e vacinas...16
2.9. Sinais clínicos...18
vii
2.13. Tratamento e profilaxia ...24
2.13.1. Atuação em focos de raiva...25
2.13.2. Ações permanentes em áreas epidêmicas ...26
2.13.3. Ações permanentes em áreas endêmicas ...27
2.13.4. Atendimento a focos em áreas esporádicas ...27
2.14. Biologia do Desmodus rotundus (Morcego Vampiro Comum)...27
3. MATERIAL E MÉTODOS ...30
3.1. Animais...30
3.1.1. Morcegos hematófagos...30
3.1.2. Camundongos ...30
3.2. Célula ...31
3.3. Captura de morcegos e sua manutenção em cativeiro...31
3.4. Colheita e processamento das amostras...35
3.5. Imunofluorescência direta...35
3.6. Isolamento viral ...37
3.6.1. Inoculação em célula de neuroblastoma murino ...37
3.6.2. Inoculação em camundongo ...38
3.7. Amplificação das regiões específicas do genoma viral ...38
3.7.1. Extração de RNA total...40
3.7.2. Transcrição reversa...41
3.7.3. Reação em cadeia pela polimerase ...42
3.7.4. Hemi-nested ...42
3.7.5. Avaliação do resultado da amplificação ...43
3.8. Seqüenciamento do DNA ...43
3.8.1. Purificação do c-DNA ...43
3.8.2. Reação de seqüenciamento...44
3.9. Análise filogenética...45
4. RESULTADOS ...49
4.1. Resultados da imunofluorescência direta e isolamento viral ...51
4.2. Resultado da amplificação...53
4.3. Seqüenciamento e análise filogenética ...56
viii órgãos do D. rotundus ...63 5.3. Análise filogenética...65 6. CONCLUSÕES ...74 7. RECOMENDAÇÕES ...75 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...76
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Descrição dos abrigos do Norte e Noroeste Fluminense e Sul do Espírito
Santo onde foram realizadas as capturas de Desmodus rotundus ...33
Tabela 2. Descrição das colônias de Desmodus rotundus capturadas nas Regiões
Norte e Noroeste do Rio de Janeiro e Sul do Espírito Santo...33
Tabela 3. Oligonucleotídeos iniciadores (primers) utilizados nas reações de
transcrição reversa (RT), reação em cadeia da polimerase (PCR),
hemi-nested e seqüenciamento de parte do genoma do vírus da raiva ...39 Tabela 4. Primers utilizados em cada etapa de amplificação de regiões específicas
do genoma viral, para cada tipo de amostra, e os respectivos tamanhos de fragmento de DNA amplificado ...39
Tabela 5. Amostras obtidas no GenBank utilizadas na análise filogenética, por
identificação no mapa número de acesso, local e ano de isolamento das amostras...46
Tabela 6. Número de acesso no GenBank das amostras de vírus da raiva isoladas
de Desmodus rotundus capturados nas regiões Norte e Noroeste Fluminense ...48
Tabela 7. Número de morcegos mantidos em cativeiro, proporção entre machos
e fêmeas cativos, médias de consumo de sangue e mortalidade dos mesmos 7, 15 e 30 dias após a captura ...50
x
direta (IFD) e isolamento viral por inoculação em células de neuroblastoma murino (N2A)...53
Tabela 9. Resultado da RT-PCR dos órgãos e hemi-nested RT-PCR de saliva dos
morcegos que apresentaram cérebros positivos para a raiva na IFD e isolamento viral...55
Tabela 10. Resultado da RT-PCR de glândula salivar e hemi-nested RT-PCR de
saliva dos morcegos que apresentaram cérebros negativos para a raiva na IFD e isolamento viral ...55
Tabela 11. Matriz de identidade das amostras dos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 presentes na
árvore filogenética. As células da tabela em cinza representam a identidade das amostras dentro do grupo e o cruzamento entre linhas e colunas representa o grau de identidade entre os grupos...58
Tabela 12. Matriz de identidade das amostras dos subgrupos 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5,
e 1.6 presentes na árvore filogenética. As células da tabela em cinza representam a identidade das amostras dentro do subgrupo e o cruzamento entre linhas e colunas representa o grau de identidade entre os subgrupos ...59
xi
Figura 1. Casos de raiva humana no Brasil, transmitida pelos principais
reservatórios do vírus (cão e morcego). No eixo do X, estão representados os anos desde 1986 até 2006: e eixo do Y representa o número de casos de raiva humana (COVEV/CGDT/DEVEP/SVS/MS. *Dados parciais do ano de 2006). ...23
Figura 2. Captura e manutenção de morcegos hematófagos em cativeiro
(Morcegário do Setor de Virologia – LSA/CCTA/UENF. A) Abrigo artificial de Desmodus rotundus. B) Morcego hematófago D. rotundus preso à rede de neblina. C) Gaiola onde foram mantidos os morcegos no cativeiro. D) D.
rotundus dentro da caixinha removível pertencente à gaiola. E) D. rotundus, vista ventral e de cabeça para baixo, posicionado para se
alimentar com o sangue oferecido em pote preso à gaiola. F) Fêmea de D.
rotundus com um filhote que nasceu no cativeiro (VIEIRA, 2006)...34 Figura 3. Esquema representativo do genoma mostrando as regiões amplificadas do
vírus da raiva. Colchete 1: região amplificada utilizando-se os primers 21g e 304. Colchete 2: região amplificada utilizando-se os primers 504 e 304. A região do genoma que codifica as proteínas N, P, M. G e L estão representadas por suas respectivas letras e o número de nucleotídeos de cada uma delas está logo acima da barra (DE MATTOS et al., 2001)...40
Figura 4. Abrigos diurnos dos Desmodus rotundus (morcego-vampiro-comum) onde
foram realizadas as capturas. RJ (FUNDAÇÂO CIDE, 2006). Os abrigos foram plotados no mapa do Rio de Janeiro com o software MapSource do GPS Garmin modelo E-Trex Vista C. ...52
Figura 5. Gel de agarose mostrando segmentos de DNA amplificados (1478bp) pela
xii
9) controle positivo CVS...54
Figura 6. Gel de agarose mostrando segmentos de DNA amplificados (248bp) pela
técnica de RT-PCR, a partir das amostras isoladas de Desmodus
rotundus, utilizando os primers para o vírus da raiva 504 e 304. 1) 100bp Ladder. 2) CVS. 3) H2O. 4) Língua-24/06. 5) Glândula Salivar-24/06. 6) 25/06. 7) CVS. 8) Coração-25/06. 9) Fígado-25/06. 10) Língua-26/06. ...54
Figura 7. Árvore filogenética de distância para uma região de 1360 nucleotídeos do
gene N do vírus da raiva. As amostras isoladas nesse trabalho estão identificadas com o número em negrito, as amostras obtidas no GenBank estão identificadas pelo número de acesso, seguido da espécie de isolamento, estado e ano. Os valores de bootstrap acima de 50% são mostrados acima dos nós e a escala representa o número de substituição de nucleotídeos pelo número total no alinhamento. ...57
Figura 8. Casos de raiva no Brasil. Os números representam as cidades, onde
foram isoladas as amostras do GenBank. Os números com fundo em azul representam as amostras do grupo 1 da árvore filogenética; em laranja, representam o grupo 2; em vermelho, o grupo 3; em amarelo, o grupo 4; e em cinza, o grupo 5. O símbolo representa o abrigo onde foi encontrado Desmodus rotundus positivos para a raiva no presente trabalho. ...71
xiii
VIEIRA, Luiz Fernando Pereira, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; fevereiro de 2007; Caracterização molecular de vírus da raiva (Lyssavirus –
Rhabdoviridae) isolados de espécimes clínicos de morcegos hematófagos Desmodus rotundus no Norte e Noroeste Fluminense; Professora Orientadora: Sílvia
Regina Ferreira Gonçalves Pereira. Professores Conselheiros: Carlos Eduardo Lustosa Esbérad, Fernando Portela Câmara, Paulo Eduardo Brandão.
No presente trabalho, objetivou-se avaliar a ocorrência do vírus da raiva em
Desmodus rotundus, verificar a dispersão do vírus nos diversos órgãos dos
morcegos positivos para a raiva e realizar um estudo filogenético dos isolados de
D. rotundus no Norte e Noroeste Fluminense. Foram testadas, pela
imunofluorescência direta e isolamento viral em células N2A, 199 amostras de
D. rotundus. Sete morcegos (3,52%), de um mesmo abrigo, foram positivos para
a raiva. As amostras de cérebro, língua, coração, pulmão, fígado, rim e glândula salivar dos morcegos positivos foram submetidas à técnica de RT-PCR. Os produtos da PCR dos isolados de cérebro foram seqüenciados e a análise filogenética das amostras isoladas foi realizada por comparação com seqüências obtidas no
GenBank. Foi encontrado vírus da raiva em todos os órgãos dos morcegos, mas
com diferentes freqüências: 100% no coração, 100% na língua, 80% no rim, 40% na glândula salivar, 40% no pulmão e 20% no fígado. A árvore filogenética formou cinco grupos principais: o grupo 1, relacionado à raiva do D. rotundus; os grupos 2, 3 e 4, relacionados à raiva de morcegos insetívoros; e o grupo 5, relacionado à raiva canina. O grupo 1 ainda pôde ser dividido em seis subgrupos e um destes foi formado, exclusivamente, pelas amostras isoladas de morcego hematófago, no presente trabalho, no município de Quissamã. Seqüências de vírus isoladas de bovinos em Porciúncula e Miracema apresentaram alta identidade de nucleotídeos quando comparadas com as de Quissamã. Os resultados indicam que o vírus
xiv transmissores da raiva aos bovinos.
Palavras-chave: raiva, morcego hematófago, Desmodus rotundus, filogenética de
xv
VIEIRA, Luiz Fernando Pereira, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February of 2007; Molecular characterization of rabies virus (Lyssavirus –
Rhabdoviridae) isolated of clinical specimens of vampire bats Desmodus rotundus
from North and Northwest of Rio de Janeiro State. Advisor: Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira. Counselors: Carlos Eduardo Lustosa Esbérad, Fernando Portela Câmara, Paulo Eduardo Brandão.
In the present study, objectified evaluate the occurrence of rabies virus in vampire bats; assess the dispersion of virus in several positive bats organs; and perform a phylogenetic study of rabies virus isolated of Desmodus rotundus from North and Northwest regions of Rio de Janeiro State. It was tried, by direct immunofluorescence and virus isolation in cell N2A, 199 samples of D. rotundus. Seven bats (3,52%) from the same shelters were positive to rabies virus. The samples of brain, tongue, hearth, lung, liver, kidney and salivary gland from positive bats were submitted to RT-PCR. The PCR product isolated of brain was sequenced and the phylogenetic analyze was performed contrasting the samples isolated with sequences obtained in GeneBank. It was encountered rabies virus in all organs of bats, but the frequency it was different among the organs: 100% in hearth, 100% in tongue, 80% in kidney, 40% in salivary gland, 40% in lung, and 20% in liver. The phylogenetic tree formed five main clusters, the cluster 1 was related to
D. rotundus rabies, the clusters 2, 3 and 4 were related to insectivorous bat rabies
and the cluster 5 was related to dog rabies. The cluster 1 was divided in six subclusters, one of these was exclusively formed by isolated samples of vampire bat
xvi
were compared with Quissamã samples. The results showed that the rabies virus of
D. rotundus from North and Northwest of Rio de Janeiro State presented
geographical clustering characteristics, and the vampire bats are the transmitter of rabies to cattle.
Key words: rabies, vampire bat, Desmodus rotundus, Lyssavirus phylogenetic, Rio de Janeiro.
1. INTRODUÇÃO
A raiva é uma doença conhecida há milhares de anos, havendo relatos de doença com mesma sintomatologia há 2.300 a.C. no Antigo Egito e é citada em código de lei da Mesopotâmia. Contudo, ainda hoje, esta é uma enfermidade que mata animais e humanos em todo o mundo.
É uma doença infecciosa de caráter antropozoonótico e cosmopolita. Seu agente etiológico é um vírus RNA (ácido ribonucléico) de fita simples e sentido negativo. Possui nucleocapsídeo helicoidal envolto por envelope lipoprotéico. O vírus é classificado na ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae e gênero
Lyssavirus.
O gênero Lyssavirus é dividido em sete espécies, de acordo com suas características imunovirológicas: Rabies virus (RABV), Lagos bat virus (LBV),
Mokola virus (MOKV), Duvenhage virus (DUVV), European bat lyssavirus tipo 1
(EBLV-1), European bat lyssavirus tipo 2 (EBLV-2) e Australian bat lyssavirus (ABLV). O primeiro vírus citado (RABV) é o vírus clássico da raiva, enquanto os demais são denominados vírus relacionados à raiva (“rabies-related viruses” ou “rabies-like viruses”).
O vírus clássico da raiva pode ser distinguido em variantes virais, as quais estão relacionadas com a espécie animal transmissora e a região de isolamento da mesma. No Brasil, as principais variantes são a variante 3, da qual o Desmodus
rotundus é o principal transmissor; e a variante 2, da qual o cão é o principal
Clinicamente, a raiva apresenta-se com distúrbios neuromusculares, expressos por mudança no comportamento e dificuldade locomotora. Há duas formas básicas de apresentação da virose: a forma excitativa ou “raiva furiosa”, transmitida principalmente pelo cão, quando o animal acometido passa por um período de intensa agitação e agressividade, seguido por um estágio de paralisia; e a forma paralítica ou “raiva muda”, transmitida principalmente pelo morcego hematófago aos bovinos e eqüinos, cuja fase de agitação pode ser breve ou mesmo ausente e logo advém o estágio de paralisia e apatia.
O vírus da raiva é transmitido, principalmente, por meio da saliva de um animal infectado, quando este agride outro, sadio. Tipicamente, dois ciclos epidemiológicos mantêm o agente infeccioso na natureza: o ciclo da raiva urbana e o ciclo da raiva silvestre. No ciclo da raiva urbana, o cão é o principal transmissor; enquanto no ciclo da raiva silvestre, diversos animais como a raposa, o macaco e o morcego podem estar envolvidos na manutenção do vírus.
O principal transmissor da raiva aos herbívoros é o morcego hematófago
Desmodus rotundus, também conhecido como “morcego-vampiro-comum”. Esta
espécie de morcego habita a América Latina desde o México até a região central da Argentina. Sabe-se que mudanças no ambiente dos morcegos e a introdução de animais domésticos, principalmente bovinos e eqüinos, após a colonização européia, proporcionaram o aumento populacional desses quirópteros.
A pecuária da América Latina é fortemente afetada pela raiva, os prejuízos estimados são de 30 milhões de dólares anualmente. Só no Brasil, os prejuízos diretos são estimados na ordem de 15 milhões de dólares, com a morte de cerca de 40 mil cabeças bovinas, e os prejuízos indiretos giram em torno de 22,5 milhões de dólares por ano.
Nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, bovinos e eqüinos são constantemente agredidos por D. rotundus e conseqüentemente, todo
o ano ocorrem casos de raiva em herbívoros domésticos nessas regiões.
No Brasil, a variante viral que circula em morcegos pode ser diferenciada do vírus que circula no ciclo epidemiológico de cães. Inicialmente foram utilizados anticorpos monoclonais para determinar as diferenças antigênicas; depois, vieram as técnicas moleculares que trouxeram maior precisão às análises filogenéticas. Nessas análises, a principal região seqüenciada do genoma corresponde ao gene da nucleoproteína do vírus. Estudos das variantes virais, sob uma perspectiva
epidemiológica, concluíram que as amostras de vírus da raiva estão relacionadas à espécie reservatório e à região geográfica de isolamento da cepa.
São poucos os trabalhos dedicados à filogenia do vírus da raiva em bovinos nas regiões do Norte e Noroeste do Estado Rio de Janeiro, menores ainda são os estudos da raiva em D. rotundus na região.
Portanto, o objetivo desse estudo foi: 1) verificar a freqüência de ocorrência do vírus da raiva em populações de morcegos hematófagos nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, mediante técnicas de imunofluorescência direta e isolamento viral; 2) realizar a caracterização molecular das amostras de vírus da raiva detectadas com base no seqüenciamento parcial do gene da nucleoproteína viral; e 3) verificar a dispersão do vírus da raiva entre os diversos órgãos dos morcegos Desmodus rotundus através da RT-PCR (transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Histórico
A raiva é a mais antiga doença reconhecidamente infecciosa. Embora graves doenças tenham aparecido como a varíola, a influenza e, mais recentemente, a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a preocupação com a raiva ainda persiste, por causa de sua progressão quase sempre fatal e pelos grandes prejuízos que traz à pecuária (DE MATTOS et al., 2001).
Na Mesopotâmia, há cerca de 2.300 a.C, determinava-se o seguinte: “Se um cão é louco e as autoridades tomam conhecimento do fato e de seu dono; se ele não o prende e o cão morde um homem e causa a sua morte, seu dono deve pagar 2/3 de uma mina (40 shekels) de prata. Se o cão morde um escravo e causa a sua morte, o dono do cão deve pagar 15 shekels de prata” (DE MATTOS et al., 2001).
Muitas civilizações antigas foram bastante familiares da raiva. Na Ilíada (700 a.C.), Hector foi comparado a um cão raivoso. Escolas chinesas advertiam sobre o perigo de cães raivosos em 500 a.C. Aristóteles (400 a.C.) associou a doença aos animais, mas erroneamente excetuou os humanos de contraírem a raiva de cães. Celsus inventou o termo hidrofobia e descreveu um caso clínico de raiva humana (KOPROWSKI, 1996a). Em Roma, Cordamus supôs que o veneno (i.e. o vírus) estava presente na saliva (DE MATTOS et al., 2001).
Muita superstição havia acerca da raiva e sua possível cura, até se iniciarem os estudos e experimentações sobre a doença no final da idade média e início da renascença (DE MATTOS et al., 2001). Girolamo Fracastoro, em 1546, escreveu um
tratado “A Ferida Incurável”, onde detalhou a doença, inclusive com relato de caso clínico humano desde a mordida até o óbito do paciente. Fracastoro acompanhou diversos casos de raiva e pôde concluir que a doença não tem cura após terem aparecidos os sinais clínicos (KOPROWSKI, 1996a).
No Velho Mundo, a raiva é conhecida há milhares de anos, mas, nas Américas, é difícil precisar se havia o vírus antes da chegada dos europeus. É possível que já houvesse a enfermidade antes da chegada de Colombo, pois, logo após a colonização, o bispo Petrus Martyr-Anglerius escreveu sobre morcegos que, com suas mordidas venenosas, levavam à morte os homens atacados por esses. Contudo, somente 200 anos após a invasão espanhola, casos de raiva foram relatados nas Américas. No México, em 1709, houve relatos de casos e, na América do Norte, em 1753, a raiva foi descrita em cães e mais tarde em raposas (DE MATTOS et al., 2001).
Por muitos anos, a mordida de um animal raivoso foi considerada a possível fonte de infecção da raiva, mas somente em 1804 Zinke usou a saliva de um cão raivoso para a transmissão da doença (DE MATTOS et al., 2001).
O estudo mais metódico da raiva iniciou-se com Louis Pasteur que em colaboração com Thuillier, Roux e Chamberland concluíram, em 1881, que a sede do vírus da raiva era o sistema nervoso central e que a inoculação intracerebral era a melhor forma para a transmissão da doença. Em 1885, Pasteur descobriu como atenuar o vírus, o que permitiu a tentativa de vacinação. A atenuação foi realizada através de passagens, seriadas em cérebros de coelhos. Após várias passagens o vírus perde o tropismo pelo sistema nervoso central (FERREIRA, 1976).
O dia 6 de julho de 1885 é um marco para a história da raiva: Um menino de nove anos de idade, agredido por um cão raivoso em várias regiões do corpo, recebeu a primeira profilaxia pós-exposição com a vacina de Pasteur, constituída de material dissecado da medula espinhal de coelhos, previamente, inoculados com vírus “fixo” (DE MATTOS et al., 2001).
Contudo, a técnica de vacinação não foi aceita por toda a comunidade médica e Louis Pasteur encontrou um problema quando um menino vacinado contra a raiva morreu da doença. O médico da família, George Clemenceau, aconselhou os pais a processar Pasteur, afirmando que a morte da criança fora causada pelo vírus utilizado na vacina. Hoje se sabe que a vacina de Pasteur realmente não é totalmente segura e pode levar o paciente a óbito (KOPROWSKI, 1996).
Negri, em 1903, detectou inclusões intracitoplasmática em neurônios de animais raivosos. Em 1913, estas inclusões tiveram reconhecido valor diagnóstico (FERREIRA, 1976; LIEBERMANN, 1988; DE MATTOS et al., 2001). A composição química dos corpúsculos de Negri só foi desvendada após a invenção do microscópio eletrônico (DE MATTOS et al., 2001).
A transmissibilidade da raiva por meio de morcegos hematófagos foi sugerida, em 1935, por Sílvio Torres, e confirmada em 1936 por Pawan, com a relevância de também ser transmitida aos humanos (MAIR e GUERREIRO, 1972). Segundo Malaga Alba em 1965, citado por MAIR e GUERREIRO (1972), já se conhecia mais de 60 espécies de morcegos não hematófagos com importância na disseminação da virose.
No Brasil, em 1973, instituía-se o Programa Nacional de Profilaxia da Raiva (PNPR), com o objetivo de promover atividades sistemáticas de combate à raiva humana, mediante o controle da antropozoonose nos animais domésticos e o tratamento específico das pessoas agredidas. Em uma análise realizada entre 1980 e 2003, pôde-se observar que o número de casos diminuiu desde a implantação do PNPR, porém percebeu-se que, a partir de 1996, houve uma queda brusca no número de casos nos países americanos, enquanto no Brasil o número de casos manteve-se no mesmo patamar (WADA et al., 2004).
Em dezembro 2004, realizou-se o Encontro Nacional do Programa de Controle da Raiva dos Herbívoros, cujo principal objetivo foi harmonizar e padronizar as ações dos diversos atores do processo de combate à raiva dos herbívoros. Assim, caracterizaram-se as competências nas ações sanitárias frente ao Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros (PNCRH). Este programa funcionava, até então, orientado pela Portaria Ministerial Nº. 126, de 18 de março de 1976, revogada por estar defasada e ainda abranger aspectos ligados ao combate da raiva canina / felina, hoje, a cargo do Ministério da Saúde (CRMV-RJ, 2005).
2.2. Taxonomia viral
A família Rhabdoviridae é composta pelos vírus RNA de sentido negativo, da grande ordem Mononegavirales. A organização genética dos vírus da família
Rhabdoviridae é similar a dos vírus das famílias Paramyxoviridae, Filoviridae e Bornaviridae classificadas na mesma ordem. São vírus envelopados que se replicam
no citoplasma das células, com exceção de alguns rhabdovírus de plantas que se replicam no núcleo (ICTV, 2006; ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
Os rhabdovírus são amplamente distribuídos na natureza, onde infectam vertebrados, invertebrados e muitas espécies de plantas. Os rhabdovírus que causam a raiva e outros que causam doenças em peixes parecem ter seu ciclo confinado exclusivamente aos vertebrados. Os demais rhabdovírus são transmitidos aos vertebrados e plantas por um vetor artrópode (ROSE e WHITT, 2001).
Mais de 70 rhabdovírus de vertebrados foram identificados e classificados. Os vírus que infectam mamíferos são separados em três gêneros: Vesiculovirus,
Ephemerovirus e Lyssavirus (ICTV, 2006).
O gênero Lyssavirus, cujo nome deriva do Grego lyssa: “agir com violência, fúria, loucura canina”, contém o vírus clássico da raiva: Rabies virus (RABV) e os vírus relacionados à raiva (rabies-like virus ou rabies-related virus): Lagos bat virus (LBV), Mokola virus (MOKV) e Duvenhage virus (DUVV), originários da África;
European bat lyssavirus tipo 1 (EBLV-1) e European bat lyssavirus tipo 2 (EBLV-2),
originários da Europa; e Australian bat lyssavirus (ABLV), originário da Austrália (ICTV, 2006; ROSE e WHITT, 2001; MURPHY et al., 1999).
2.3. Estrutura e propriedades do vírus da raiva
O vírus da raiva possui capsídeo com simetria helicoidal (LIEBERMANN, 1988), tem a forma de “bala de revólver” e apresenta variação no tamanho das partículas, com 60 a 80nm de diâmetro por 120 a 300nm de comprimento (FERREIRA, 1976).
Os rhabdovírus são compostos por uma membrana externa (envelope viral) derivada da célula infectada, e por um cerne de ribonucleoproteína (RNP). A partir do envelope para o exterior, projetam-se espículas de glicoproteína (G), arranjadas em trímeros, e moléculas de proteína da matriz (M), dentro do envelope viral, entre a membrana externa e o nucleocapsídeo (ROSE e WHITT, 2001).
O nucleocapsídeo é composto pelo genoma viral e pelas proteínas N (nucleoproteína), L (large) e P (fosfoproteína). O RNA possui entre 11 e 12Kb de tamanho e é altamente compactado, com o auxílio da proteína N, formando uma estrutura helicoidal com aproximadamente 35 voltas. Associadas à nucleoproteína estão as proteínas L e P, que juntas formam a RNA-polimerase RNA-dependente do
vírus. As proteínas L e P estão em número aproximado de 50 e 500 por vírion, respectivamente (ROSE e WHITT, 2001).
O empacotamento do genoma, feito pela proteína N, produz um cerne resistente a RNase. Cada proteína N participa do empacotamento de aproximadamente nove nucleotídeos, totalizando cerca de 1.200 proteínas N no vírion. O complexo N–RNA interage com o complexo polimerase P–L durante a transcrição e a replicação; e com a proteína M na condensação do nucleocapsídeo, na união do cerne com a membrana, e no brotamento (ROSE e WHITT, 2001).
A proteína P possui diferentes locais com domínios para a fosforilação, os quais têm a função de regular a transcrição e a replicação. A proteína P forma trímeros após a fosforilação e dessa forma, torna-se apta a unir-se à proteína L e ao complexo N–RNA. Portanto, o complexo polimerase completo é o seguinte: N-L-P3-RNA. A fosforilação em pontos diferentes da proteína P pode estar relacionada à formação de dois complexos polimerase distintos: um que funciona como transcriptase e outro que funciona como replicase. A proteína P não possui nenhuma atividade enzimática conhecida, mas funciona como co-fator que pode modificar o funcionamento da proteína L (ROSE e WHITT, 2001).
A proteína L, além de formar junto com a proteína P o complexo polimerase que faz a transcrição do genoma viral em mRNA e a replicação do genoma no sentido positivo (antigenoma) e negativo (genoma), promove a adição da estrutura quepe (cap) no mRNA, a metilação das estruturas cap e poliadenilação. O grande tamanho da proteína L (a maior proteína dos rhabdovírus) é justificado pela complexidade das reações que catalisa e a multifuncionalidade que ela apresenta (ROSE e WHITT, 2001).
A menor e mais abundante proteína do vírion é a proteína da matriz (M), que participa de numerosas funções, tais como a condensação do nucleocapsídeo durante a montagem, a união do envelope ao nucleocapsídeo, a degradação do citoesqueleto, e a inibição de funções na célula hospedeira. A proteína M expressa sozinha em células é capaz de causar brotamento de vesículas, o que permite supor que esta proteína seja importante no processo de brotamento viral (ROSE e WHITT, 2001).
No envelope viral estão as proteínas G, que possuem glicosilações na sua estrutura de 505 aminoácidos. Possuem três domínios: o C-terminal citoplasmático, com 44 resíduos de aminoácidos; o domínio transmembrana hidrofóbico com
22 aminoácidos; e o domínio externo antigênico que se estende do domínio transmembrana ao resíduo N-terminal. A proteína G é responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira, auxilia o desnudamento viral, catalisa a fusão da membrana endocítica e é o principal antígeno dos rhabdovírus. Portanto, quase todas as vacinas, humanas e veterinárias, são produzidas com base nas reações imunológicas contra essa proteína (DE MATTOS et al., 2001).
O vírus da raiva é sensível aos ácidos, aos solventes orgânicos, à temperatura de 80ºC por dois min, aos raios ultravioletas e ao formaldeído (LIEBERMANN, 1988). Pode manter-se ativo por semanas à temperatura de 4°C, por meses quando acondicionados abaixo de 0°C ou em tecidos infectados quando colocados em glicerina neutra a 4°C, e podem perman ecer ativos por anos quando liofilizados (MAIR e GUERREIRO, 1972).
2.4. Genoma viral
Os rhabdovírus possuem como genoma uma única fita (não segmentada) de RNA com sentido negativo (sentido complementar ao do mRNA) e que contém no mínimo cinco genes na ordem 3’ N–P–M–G–L 5’ (as letras fazem correspondência às proteínas codificadas pelo RNA genômico) (ROSE e WHITT, 2001).
Para alguns autores, os Lyssavirus possuem um pseudogene entre os genes G e L. (WAGNER e ROSE, 1996). Tordo et al. (1986) descreveram uma longa região intergênica entre os genes G e L. Dentro dessa região foram observadas duas seqüências interessantes. A primeira, parecida com a seqüência consenso de início de transcrição, localizada 10 nucleotídeos à jusante (downstream) do sinal de parada do mRNA da proteína G. A outra seqüência, parecida com o sinal de poliadenilação (sinal de parada da transcrição), encontrada no final de cada gene, foi localizada 25 nucleotídeos a montante (upstream) do gene L. Nenhum mRNA que correspondesse à região do genoma viral entre os sinais de início e parada de transcrição foi encontrado, portando a região intergênica pode ser um pseudogene.
Nos Vesiculovirus, a região entre os genes G e L, é de apenas dois nucleotídeos, já, em alguns Rhabdovirus de peixe, é encontrado um gene adicional entre as regiões que codificam as proteínas G e L. Portanto, os sinais de início e parada de transcrição encontrados nessa região dos Lyssavirus podem ser resquícios de um gene perdido no processo evolutivo do vírus (TORDO et al., 1986).
É possível que a região intergênica G–L se apresente de três formas diferentes em cepas virais distintas: presença de pseudogene na região intergênica, proposto por TORDO et al. (1986); ou incorporação da região intergênica à proteína G, proposto por RAVAKOV, SMITH e NICHOL (1995); ou ausência de pseudogêne e não incorporação da região intergênica G–L à proteína G, proposto por MORIMOTO, OHKUBO e KAWAI (1989).
A região intergênica G–L não é essencial para a replicação viral, como se pôde perceber em um trabalho onde se substituiu o intergene G–L do Lyssavirus pelos genes das cadeias leve e pesada da imunoglobulina G (IgG) (MORIMOTO et al., 2001).
Os rhabdovírus possuem um genoma bastante simples e compacto, com pouco desperdício de espaço. Há somente dois nucleotídeos separando as regiões intergênicas de todos os genes dos Vesiculovirus (ROSE e WHITT, 2001), enquanto, entre os Lyssavirus, as regiões intergênicas não são iguais para todos os genes. Entre o gene N–P, há dois nucleotídeos; entre os genes P–M e M–G, há cinco nucleotídeos; e entre os genes G–L, há 423 nucleotídeos, quando se considera a região intergênica G–L como não-codificante (TORDO et al., 1986).
Tordo et al. (1986) analisaram o DNA complementar ao genoma do vírus da raiva e observaram que a seqüência de nucleotídeos consenso do iniciador da transcrição é composta por nove nucleotídeos localizados entre 12 e 30 nucleotídeos à montante do códon de início de transcrição. Os quatro primeiros (AACA) e dois últimos (CT) nucleotídeos da seqüência consenso são invariáveis. Nas posições cinco e seis, há dois resíduos de pirimidina, mas a citosina é mais freqüente que a timina; e finalmente, a sétima posição que é variável. Esta organização é relatada para o vírus Sendai (Sendai virus – SeV, família
Paramyxoviridae, gênero Respirovirus) e no vírus da estomatite vesicular (Vesicular stomatitis virus – VSV), onde há um ou dois nucleotídeos variáveis, respectivamente,
separados por duas regiões conservadas. A seqüência de iniciação do vírus da raiva e do VSV compartilham cinco posições de nucleotídeos invariáveis, o que demonstra a proximidade genética entre os dois.
Analisando o DNA complementar do genoma do vírus da raiva, pôde-se observar uma seqüência consenso após o códon de parada de transcrição de todos os genes. A seqüência consenso é uma região contendo sete adeninas (com
exceção do gene G que possui oito adeninas), cuja região no genoma promove a poliadenilação da molécula de mRNA (TORDO et al., 1986).
2.5. Ciclo de replicação viral
A replicação do vírus da raiva ocorre no citoplasma da célula infectada. Apesar de várias etapas do processo de replicação ocorrerem ao mesmo tempo, é interessante estudá-las sob uma perspectiva linear. Desta forma, pode-se dividir o ciclo em oito etapas: adsorção, penetração, desnudamento, transcrição, tradução, replicação completa do genoma, montagem e brotamento (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
2.5.1. Adsorção
A adsorção é o processo pelo qual o vírus se liga à membrana da célula hospedeira. A glicoproteína G promove a união entre o vírus e o receptor da membrana celular. Os receptores nicotínicos de acetilcolina permitem a adsorção do vírus da raiva. Há também outros receptores que podem estar envolvidos na adsorção (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
2.5.2. Penetração e desnudamento
A penetração ocorre por endocitose mediada por receptores, através de vesículas revestidas com clatrina (ROSE e WHITT, 2001). Uma subseqüente redução do pH no compartimento endocítico conduz a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma. Essa fusão é catalisada pela proteína G, e resulta na liberação do cerne de ribonucleoproteína (RNP) no citoplasma da célula (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996). Concomitante ou logo após a fusão, a proteína M se dissocia da RNP. Os processos de liberação do nucleocapsídeo e a dissociação da proteína M constituem o desnudamento ou descapsidação viral (ROSE e WHITT, 2001).
2.5.3. Transcrição e tradução
Logo após a entrada do vírus no citoplasma celular, o genoma viral não é capaz de codificar proteínas, para isso deve ser transcrito em sentido positivo na forma de mRNA. Este processo de transcrição primária pode ocorrer na ausência da síntese de proteínas, pois o vírion carrega consigo, para dentro da célula, sua própria RNA-polimerase. A transcrição se inicia, obrigatoriamente, na terminação 3’ do genoma produzindo um RNA líder com 48 nucleotídeos, seguida, em ordem, pela transcrição dos mRNAs individuais que codificam as proteínas N, P, M, G e L (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
A cada junção gênica, a transcriptase faz uma pausa e a transcrição é atenuada cerca de 20 a 30%, o que resulta num gradiente de mRNA e, conseqüentemente, num gradiente de proteína decrescente em relação à ordem gênica: N>P>M>G>L (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
Nos mRNAs individuais, são adicionadas uma estrutura “quepe” (cap) na extremidade 5’, e uma cauda poli A na extremidade 3’. Essa ultima adição, aparentemente, ocorre pela cópia repetitiva da seqüência U7, presente no final de cada gene (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
A tradução dos mRNAs ocorre nos ribossomas. Todas as proteínas são codificadas pelos ribossomas livres no citoplasma, exceto a proteína G que é codificada pelos ribossomas do retículo endoplasmático rugoso (RER) (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
2.5.4. Replicação do genoma viral
Diferente da transcrição, a replicação depende da síntese ativa de proteínas vírus-codificadas, principalmente N e P. A replicação do genoma viral ocorre em duas etapas. A primeira utiliza o genoma infeccioso como molde para produzir fitas de RNA de sentido positivo. Na segunda etapa, a polimerase produz uma fita de RNA de sentido negativo, que serão as fitas da progênie viral. Para tal procedimento, a polimerase utiliza como molde a fita de RNA de sentido positivo, produzida na primeira etapa do processo (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
Ainda não está bem explicado como funciona a chave que determina ao complexo polimerase quando realizar a transcrição ou a replicação do genoma. Um modelo aceito é que o RNA líder funcione como sinal para que se realize a
transcrição em mRNA, porém esse sinal não é mais reconhecido quando o RNA líder se une ao complexo das proteínas N–P e então a polimerase realiza a replicação completa do genoma viral. Esse modelo é aceito porque, logo após a entrada do vírus na célula, não ocorre síntese de proteínas virais, o que permite a transcrição. Mas à medida que a concentração das proteínas N–P aumenta o sinal do RNA líder, este é subjugado, o que permite a replicação completa do genoma (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
2.5.5. Montagem e brotamento
A montagem dos rhabdovírus inicia-se quando o RNA da progênie se une às proteínas N, P e L, para formar o cerne de RNP ou nucleocapsídeo. Em seguida, o nucleocapsídeo se liga à membrana plasmática e, posteriormente, é compactado pela proteína M. No processo de brotamento, ocorre a união entre o nucleocapsídeo e a membrana da célula, o que culmina com a liberação da partícula viral que leva consigo parte da membrana onde se ancora a proteína G (ROSE e WHITT, 2001; WAGNER e ROSE, 1996).
2.6. Patogenia
A forma mais comum de infecção pelo vírus da raiva é por meio da mordida de um animal infectado. O vírus replica-se no tecido muscular no local da mordida e depois infecta os nervos periféricos, ou pode infectar diretamente os nervos periféricos (MURPHY et al., 1999; DE MATTOS et al., 2001).
A infecção se direciona ao sistema nervoso central (SNC), em uma movimentação chamada centrípeta, que ocorre através de infecção neuronal ativa e por movimentação passiva do genoma viral dentro dos axônios, principalmente os da medula espinhal e através do líquido cefalorraquidiano (MURPHY et al., 1999; DE MATTOS et al., 2001). Em seguida, ocorre uma seqüência ascendente de infecção e disfunção neuronal. O vírus chega ao sistema límbico do cérebro, onde há intensa replicação, o que explica os acessos de fúria vistos clinicamente. A replicação em outras partes do cérebro continua e, quando o vírus atinge o neocórtex, ocorre a fase paralítica ou “muda” da doença. Segue-se um quadro de depressão, coma e morte por parada respiratória (MURPHY et al., 1999).
A partir do SNC, a infecção atinge outros órgãos, através dos nervos periféricos, em uma movimentação chamada centrífuga. Os órgãos afetados podem ser o córtex adrenal, pâncreas, terminações nervosas sensoriais das cavidades nasal e oral, papila gustativa, rim, músculo cardíaco, gordura, folículo piloso, retina, córnea e glândula salivar (DE MATTOS et al., 2001). É interessante observar que, na replicação do vírus da raiva em células nervosas, o brotamento ocorre nas membranas intracitoplasmáticas, enquanto, na glândula salivar, o vírus é formado na membrana plasmática da superfície apical (lumenal) das células da mucosa, e, portanto, liberados em grande quantidade na saliva de animais infectados (MURPHY et al., 1999).
Em infecções com “vírus de rua”, é comum encontrar o vírion na saliva antes que os primeiros sintomas apareçam, em média três dias para os cães e um dia para gatos. Em cães, o vírus já foi encontrado até 14 dias antes que aparecessem os primeiros sintomas. O sangue e a urina raramente são fontes de infecção. Todos os órgãos internos, incluindo os nódulos linfáticos, podem apresentar infecciosidade. No cérebro, a substância cinzenta é mais infecciosa que a branca (FERREIRA, 1976).
Além do tecido muscular e nervos periféricos, as vias aerógena, digestiva e a pele lesionada em contato com saliva podem servir de porta de entrada para o agente etiológico da raiva. A gravidade da infecção está relacionada a vários fatores como a virulência, a extensão e profundidade da ferida, a riqueza da inervação e vasos linfáticos no local da lesão, a proximidade da lesão em relação ao sistema nervoso central (FERREIRA, 1976) e a espécie animal envolvida tanto a agressora quanto a agredida (MURPHY et al., 1999).
2.7. Patologia
Apesar de ser uma doença grave e fatal, as lesões macroscópicas e microscópicas, na raiva, são pouco aparentes (MURPHY et al., 1999; DE MATTOS et al., 2001). Os achados histopatológicos são de natureza e intensidade variáveis, distribuindo-se principalmente no tronco encefálico, cerebelo e medula espinhal. Em bovinos, observa-se nas meninges e no parênquima nervoso do encéfalo e da medula espinhal, manguitos perivasculares e infiltrados celular intramural, consistindo primariamente de linfócitos e, em menor grau, de macrófagos
e plasmócitos. Os manguitos são mais proeminentes (até nove camadas de células) e os pequenos vasos são mais freqüentemente afetados na substância cinzenta e nos núcleos do tronco encefálico. No telencéfalo, é mais comum encontrar os manguitos na substância branca subcortical.
Hemorragias restritas ao espaço perivascular são observadas na medula espinhal, pedúnculos cerebelares, colículos e tálamo. Observa-se também necrose das células neuronais, incluindo células de Purkinje do cerebelo, células piramidais do hipocampo e núcleos do tronco encefálico e da substância cinzenta da medula espinhal. (LANGOHR et al., 2003). A gravidade da lesão inflamatória pode estar relacionada à cepa viral, e a supressão imunológica reduz as lesões inflamatórias, mas aumenta a replicação viral (DE MATTOS et al., 2001).
São encontrados, nas células do sistema nervoso central, os corpúsculos de Babés, as lesões de Van Gehuchten e Nélis e os corpúsculos de Negri. Os corpúsculos de Negri são inclusões intracitoplasmática arredondadas ou irregularmente trianguladas, medindo de 1 a 27 µm. Coram-se de vermelho vivo pelo método de Mann, e rosado-forte pelo método de Giemsa. São constituídos de proteína principalmente, mas há também RNA viral (LIEBERMANN, 1988). Durante muitos anos, os corpúsculos de Negri foram a principal ferramenta de diagnóstico da raiva, porém sua importância tem sido diminuída com o advento das técnicas de imunofluorescência direta e imunoistoquímica (DE MATTOS et al., 2001).
As lesões de caráter macroscópico são: paralisia dos esfíncteres da vesícula urinária e anal (principalmente na raiva paralítica, transmitida por morcegos aos bovinos). A bexiga dos bovinos necropsiados mostra-se cheia de urina, e a ampola retal repleta de fezes (SANTOS, 1975).
As características das infecções por vírus “fixo” e “de rua” são diferentes. Geralmente as infecções com vírus “fixo” deixam intactos os neurônios e, nessas infecções, quase não aparecem os corpúsculos de Negri. Já em infecções com vírus “de rua”, os corpúsculos de Negri apresentam-se grandes e numerosos. Diferentemente do vírus “de rua”, o vírus “fixo” não apresenta neurotropismo (DE MATTOS et al., 2001).
Apesar da limitada mudança anatômica, as funções neurológicas são gravemente afetadas. O vírus da raiva causa mudanças na atividade elétrica dos neurônios que induzem alterações no sono e na expressão dos genes. A apoptose
pode ser um resposta eficaz do hospedeiro, mas pode piorar o quadro clínico quando as células afetadas são os neurônios (DE MATTOS et al., 2001).
2.8. Resposta imune e vacinas
O vírus da raiva induz resposta imune humoral e celular. Os anticorpos neutralizantes são direcionados principalmente a dois grupos de proteínas antigênicas: a proteína N, específica para o grupo viral, e a glicoproteína G, específica para o tipo viral (WAGNER e ROSE, 1996).
A glicoproteína é a principal responsável pela indução da produção de anticorpos neutralizantes de vírus (VNA). A habilidade em induzir a produção de anticorpos depende da conformação estrutural secundária e terciária da proteína. A proteína G associada ao vírion confere maior produção de anticorpos que a proteína solúvel. Os anticorpos neutralizantes exercem seu efeito de proteção pela neutralização do vírus extracelular, pela lise de células infectadas mediada pelo sistema complemento e por citotoxicidade anticorpo dependente. Os VNAs são capazes de mediar a eliminação viral, sem nenhum outro mecanismo imunológico (DE MATTOS et al., 2001).
A ribonucleoproteína (RNP) é o principal complexo antigênico que induz a resposta de anticorpos vírus-específicos. Os anticorpos contra este complexo podem auxiliar na proteção contra a infecção, embora ainda não esteja completamente elucidado o mecanismo pelo qual os anticorpos anti-RNP atuam na inibição da replicação viral (DE MATTOS et al., 2001). O gene que codifica a proteína N é muito pouco variável entre as cepas virais, por este motivo essa proteína poderia ser um ótimo adjuvante na produção de vacinas recombinantes. Contudo, as pesquisas realizadas, nesse sentido, até agora, mostraram-se controversas quanto ao potencial adjuvante da proteína N (DRINGS et al., 1999).
A infecção pelo vírus da raiva resulta em uma geração de células T CD4+ e CD8+ vírus-específicas. A proteína G é um dos antígenos que induzem a resposta de Linfócitos T citotóxicos (CTL). Alguns camundongos também desenvolvem CTL contra a proteína P. O papel das células T CD8+ na imunidade do hospedeiro ainda não está claro. Alguns pesquisadores reportaram a eliminação do vírus da raiva após a transferência de células T específicas contra o vírus e a proteção contra a raiva por clone de CTL. Ao passo que outros pesquisadores mostraram que as CTLs
são insuficientes para a proteção contra o desafio do vírus e a depleção in vivo das células T CD8+ não apresenta diferença na resistência à infecção viral. Por outro lado, as CTLs podem estar envolvidas na imunopatologia da raiva e têm sido implicadas em paralisia neuronal. Já as células T CD4+ participam ativamente na defesa imunológica contra o vírus da raiva. A eliminação das células T CD4+ anula a produção de IgG na resposta à infecção. A RNP contém os principais epitopos que induzem a resposta das células T CD4+, e a maioria dessas células T faz reação cruzada com outros Lyssavirus (DE MATTOS et al., 2001).
Apesar de as proteínas do vírus da raiva serem altamente imunogênicas, nenhuma resposta humoral ou celular pode ser observada durante o estágio de movimentação viral do local de entrada até o SNC, provavelmente porque muito pouco antígeno é liberado para o sistema imune, a maioria fica seqüestrada nas células musculares ou nos axônios. Apesar de o organismo, naturalmente, não produzir anticorpos neste estágio inicial da infecção, os vírus são sensíveis a anticorpos exógenos ou aos previamente produzidos por vacinação pré-exposição, ou até mesmo, por pós-exposição. A vacinação e a administração de soro anti-rábico, após a exposição do indivíduo ao vírus, são eficazes porque o período de incubação do vírus é longo, havendo uma demora entre a replicação inicial nas células musculares e a chegada do vírus ao sistema nervoso (MURPHY et al., 1999).
Desde a primeira vacinação feita por Pasteur, as formas de produção das vacinas modificaram e tornaram-nas mais eficazes e seguras. As vacinas mais comuns são obtidas de tecido cerebral infectado com vírus provenientes de replicação em pintos jovens, embriões de galinha e culturas celulares de diversas origens (LIEBERMANN, 1988). As vacinas obtidas de tecido cerebral apresentam algumas reações adversas como a desmielinização, acidentes neuroparalíticos e choque anafilático. As vacinas provenientes de cultivo celular são mais seguras, pois são produzidas em culturas de células diplóides humanas ou de células renais de macaco verde africano (VERO), e não de tecido nervoso de camundongo (FUNASA, 2001).
A atenuação do vírus da raiva e a técnica de recombinância de vírus permitiram a produção de vacinas de administração oral, utilizadas na Europa e EUA para o controle da raiva em raposas e raccoons. Os vírus vetores utilizados nessas vacinas recombinantes são os poxvírus: vacínia ou canarypoxvirus
(MURPHY et al., 1999). Pesquisas na área de vacinas de DNA obtiveram bons resultados na imunização de cães (PERRIN, 2000) e cavalos (FISHER, 2003).
2.9. Sinais clínicos
Os sinais clínicos da raiva são variados e inespecíficos (LANGOHR et al, 2003). O lapso entre a inoculação viral em camundongos e a sua morte pode variar quanto à cepa viral utilizada e à idade do animal. Animais mais jovens são mais susceptíveis ao vírus (GERMANO et al., 1988)
O período de incubação (PI) nos cães varia entre 15 e 90 dias, com extremos de oito dias e 13 meses. Nos eqüinos, o PI varia entre 21 e 90 dias, podendo prolongar-se até quatro meses. Nos ovinos, caprinos e suínos, o PI varia entre 21 e 60 dias. Nos bovinos, o PI varia entre 20 e 80 dias. Nos felinos, o PI varia entre 14 e 60 dias (FERREIRA, 1976).
Há três formas de apresentação da raiva, a excitativa ou “furiosa”, a paralítica ou “muda” e a atípica (FERREIRA, 1976).
Na “raiva furiosa”, o curso total da doença é de aproximadamente quatro a sete dias em cães, dois a seis dias em gatos, seis dias em eqüinos e; em ruminantes e suínos, cinco a nove dias. Nessa apresentação clínica da raiva, são observados três períodos básicos: o melancólico, o de excitação e o de depressão. No primeiro, com duração de um a três dias, o animal mostra-se triste, exaltado, com hipersensibilidade à luz e ao som, isola-se em lugares tranqüilos e semi-obscuros, e responde ao chamado do dono com menor vivacidade que o habitual (FERREIRA, 1976).
No período de excitação que, em geral, dura de três a quatro dias, a inquietação inicial se transforma em acessos de fúria, que alternam com períodos de calma. Pode haver prurido intenso. O animal raivoso tenta atacar tudo o que está à sua volta e, às vezes, deglute parte de objetos dilacerados por ele. A voz torna-se rouca, devido à paralisia da faringe, o que leva a uma deficiência e dor na deglutição. Com o avançar desta fase, os acessos de fúria são cada vez mais espaçados, dando início ao período de depressão (FERREIRA, 1976).
O período de depressão vem com o aumento das fases de abatimento entre cada acesso de fúria. Com o progresso degenerativo da medula, a marcha torna-se cambaleante, segue-se a paresia, a paraplegia ou paralisia, micção e defecação
involuntárias. A cauda torna-se pendente e posicionada entre as pernas. A paralisia progride de forma ascendente e acentuada, o que torna a fonação e a deglutição cada vez mais difíceis. A língua mostra-se pendente, o maxilar descaído e a saliva escorre “em fios”. Ocorre estrabismo convergente, aprofundamento dos globos oculares nas órbitas e as córneas turvam-se. Ao final da doença, os animais caem em decúbito lateral, há hipotermia, entram em coma e morrem ao final de poucas horas (FERREIRA, 1976).
Na “raiva muda”, o período melancólico e de excitação são reduzidos ou não ocorrem, antecipando assim a fase paralítica (FERREIRA, 1976). Esta forma de apresentação clínica da raiva é a predominante em bovinos. Nesses casos, os sinais mais freqüentemente observados são a incoordenação dos membros pélvicos, seguida de paresia e paralisia flácida. Outros sinais nervosos incluem a paralisia da cauda e do esfíncter anal, hipoestesia na região pélvica, sialorréia, cegueira, bruxismo, tremores musculares na região da cabeça e opistótono. No final do curso clínico médio de 5 dias, que pode variar entre dois e 10 dias, o animal posiciona-se em decúbito esternal, seguido por decúbito lateral e morte após realizar movimentos de pedalagem. Em raros casos, pode ocorrer a “raiva furiosa” em bovinos, que então apresentam agressividade e mugidos freqüentes (LANGOHR et al, 2003).
Desmodus rotundus inoculados experimentalmente com o vírus da raiva
morrem em média 12 dias após a inoculação, com extremos de sete e 30 dias. Os sinais clínicos são anorexia, alteração do reflexo, tremor, paralisia, ansiedade (AGUILAR-SÉTIEN et al., 1998), irritabilidade à luz e a sons, prostração, conjuntivite purulenta, incontinência urinária, desidratação, perda de peso (ALMEIDA et al., 2005) e isolamento do restante da colônia (AGUILAR-SÉTIEN, 2005). O surgimento dos sinais clínicos se dá 24 a 72 horas antes da morte (AGUILAR-SÉTIEN et al., 2002). Mas alguns morcegos também morrem sem apresentar qualquer sinal clínico aparente (ALMEIDA et al., 2005).
A raiva também pode apresentar cursos atípicos, nos quais podem ocorrer prolongamento do PI, paralisia limitada a certos músculos, manifestações de gastrenterite hemorrágica, da qual o animal se cura, mas morre poucos dias depois (FERREIRA, 1976).
2.10. Colheita e envio de material clínico ao laboratório
Para a remoção do encéfalo da caixa craniana, primeiramente desarticula-se a cabeça, depois se faz um corte a partir do forame magno de forma que os ossos occipital e temporal sejam cortados dos lados direito e esquerdo. Outro corte é realizado traçando-se uma linha imaginária imediatamente após as apófises supra-orbitárias dos ossos frontais, unindo-se o extremo caudal de um olho ao outro. Em seguida, retira-se a calota craniana. Com auxílio de tesoura e pinça, cortam-se as meninges longitudinalmente, rebate-se a dura-máter lateralmente e remove-se o cérebro juntamente com o cerebelo (GUIMARÃES e LEMOS, 1999). Em bovinos, quando não é possível abrir a caixa craniana, pode-se retirar fragmentos do cerebelo através do forame magno, após a desarticulação do occipital com o atlas (SANTOS, 1976).
As regiões de eleição para a colheita são o cerebelo, o bulbo, a ponte e o corno de Ammon. Para a realização do isolamento viral e imunofluorescência, utiliza-se a amostra fresca, refrigerada ou congelada. As amostras devem utiliza-ser embaladas em saco plástico duplo, etiquetado com o número do animal, a espécie, a data da colheita, o sexo, a idade e a procedência. Para o exame histopatológico, utiliza-se a amostra fixada em formol tamponado a 10% (SANTOS, 1976).
Para animais de pequeno porte, como cães e gatos, pode-se enviar a cabeça inteira e sem conservante, desde que não ultrapasse o período de três horas a partir da morte do animal até seu destino. Se demorar mais que três horas, deve-se enviar a cabeça refrigerada. Morcegos podem deve-ser enviados inteiros e refrigerados (SANTOS, 1976; GUIMARÃES e LEMOS, 1999).
2.11. Métodos diagnósticos
O diagnóstico clínico da raiva pode ser feito se houver uma boa documentação da exposição do indivíduo ao vírus e, subseqüentemente, os sintomas e sinais compatíveis com a doença. Contudo, nem sempre é possível assegurar se houve exposição ao vírus. Nesses casos, qualquer doença neurológica aguda, que progrida para a morte, deve ser considerada como suspeita de raiva. (DE MATTOS, et al., 2001).
O diagnóstico laboratorial deve ser realizado para confirmar uma suspeita clínica de raiva (LIEBERMANN, 1988). Os métodos diagnósticos para a raiva são:
imunofluorescência direta (IFD), exame histopatológico, isolamento viral em camundongos, neutralização viral, microscopia eletrônica (LIEBERMANN, 1988; DE MATTOS et al., 2001), isolamento viral em cultivo celular, imunoistoquímica, reconhecimento de epitopos específicos com anticorpos monoclonais (MAbs) e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) (DE MATTOS et al., 2001).
O diagnóstico por IFD de impressão da córnea, o exame histopatológico da pele da região occipital da cabeça (folículo piloso) e a inoculação de amostra salivar, por via intracerebral em camundongos, podem fornecer o diagnóstico ante-morten. O isolamento viral, a partir de amostra encefálica ou salivar, pode ser tentado por inoculação intracerebral em camundongos ou pela inoculação em culturas de células de neuroblastoma. As técnicas de RT-PCR e MAbs não só fornecem diagnóstico, mas também permitem identificar a variante viral envolvida na infecção (DE MATTOS et al., 2001).
O exame histopatológico pode ser realizado através de cortes histológicos, impressões teciduais e distensão (esfregaço) de tecido macerado. As colorações utilizadas podem ser a hematoxilina & eosina, Sellers e Giemsa (SMITH, 1962). Na técnica de Faraco, é utilizada a coloração de Mann (SANTOS, 1976). Nestes métodos, a estrutura que indica resultado positivo para a raiva são os corpúsculos de Negri, porém os mesmos não estão presentes em 10 a 25% das amostras positivas. Os corpúsculos de Negri são encontrados, principalmente, no corno de Ammon (hipocampo cerebral), mas também são encontrados no córtex cerebral, no tronco encefálico, na medula oblonga e em outras partes do SNC (LIEBERMANN, 1988). Esses corpúsculos são encontrados com freqüência nas células de Purkinje (no cerebelo) e nas células piramidais (corno de Ammon) (SANTOS, 1975). Os corpúsculos de Negri podem ser encontrados, fora do SNC, nas glândulas salivares (LIEBERMANN, 1988), nas células ganglionares da retina, nos gânglios simpáticos satélites do nervo óptico e nos neurônios da retina (RAVISSE, 1981).
A IFD é hoje o método mais utilizado para realizar diagnóstico de raiva, pois é um teste rápido e tão seguro quanto o isolamento viral, e possibilita o diagnóstico mesmo nos casos em que na histopatologia não se encontra corpúsculo de Negri (LIEBERMANN, 1988). Permite a utilização de amostra fresca, congelada ou fixada
