Cardiolipin IgG
ELISA
Ensaios imunoenzimáticos para a determinação qualitativa e quantitativa
de anticorpos IgG contra cardiolipina em soro humanos.
RE75011
12x8
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected] D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1.
0BAPLICAÇÕES
Ensaios imunoenzimáticos para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG contra cardiolipina em soro humanos.
2.
1BSUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
Anticorpos contra cardiolipin são considerados critérios de diagnóstico da síndrome antifosfolípide (SAF). Esta é caracterizada por trombose venosa e arterial, trombocitopenia, infarto do miocárdio, aborto espontâneo recorrente e complicações neurológicas. Pode ocorrer isoladamente ou como uma APS primário com outras doenças auto-imunes, em particular lúpus eritematoso sistémico (LES), podem ser associados (SAF secundária). A cardiolipina é um fosfolípido carregado negativamente e importante componente de membranas biológicas.
Associado a APS auto-anticorpos são dirigidos não só contra CL e fosfolipídios semelhantes, mas também contra os complexos de fosfolipídios e proteínas. beta2-glicoproteína 1 (beta2 GP1; apolipoproteína H) foi identificado como um co-antigénio tal natural e essencial para auto-anticorpos anticardiolipina.
3.
2BPRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente utilizando uma curva de calibração.
4.
3BAVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.
9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos
ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN3 pode reagir com o chumbo e o cobre da
canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com grande volume de água para evitar a formação dos compostos.
10. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
4BARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 °C, em embalagem de alumínio com dessecante.
6.
5BRECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento: 2-8 °C -20 °C Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente Estabilidade: 3 dias > 3 dias
7.
6BMATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Microplaca Tiras separáveis. Revestida com cardiolipina y ß2-GP1.
1 x 14 mL ENZCONJ IgG
Conjugado Enzimático IgG
Pronto a usar. Colorido en vermelho. Contêm: anti humano IgG, conjugado com peroxidase, tampão contendo proteína, estabilizantes.
1 x 6 x 2 mL CAL A–F
Padrão A–F
0; 3.0; 8.0; 18; 45; 100 GPL-U/mL. Pronto a usar, gradualmente colorido azul. Contêm: anticorpos IgG contra cardiolipina, STT o conservantes.
1 x 2 mL CONTROL +
Control Positivo
Pronto a usar, colorido vermelho.
Contêm: anticorpos IgG contra cardiolipina, STT o conservantes.
1 x 2 mL CONTROL -
Control Negativo Pronto a usar, colorido verde. Contêm: STT o conservantes.
1 x 100 mL SAMPLEDIL Diluente de Amostra Pronto a usar, colorido laranja. Contêm: STT o conservantes. 1 x 14 mL TMB SUBS Solução de Substrato TMB Pronto a usar, incolor. Contêm: TMB, H
2O2.
1 x 100 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem, Concentrado (10x) Colorido azul. Contêm: STT o conservantes. 1 x 14 mL STOP Solução de Paragem TMB Pronto a usar. 0.2 M H
2SO4.
8.
7BMATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 5; 50; 100; 500 µL 2. cilindro graduado
3. Tubos (1 mL) para diluição de amostras.
4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm
(comprimento de onda de referência 600-650 nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada
8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
9.
8BNOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
5. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das soluções nos poços.
6. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
7. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
9BINSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. 19BPreparación de Componentes
Diluir / dissolver Componente Diluente Relação Armazenamento Estabilidade 100 mL WASHBUF CONC ad 1000 mL agua bidest 1:10 2-8°C 4 semanas 10.2. 20BDiluição de Amostras
Amostra diluir com Relação Observações
Soro geralmente SAMPLEDIL 1:101 p.ex. 5 µL + 500 µL
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente diluídas.
11.
10BPROCEDIMENTO DO ENSAIO
1. Lavar a fase sólida, uma vez imediatamente antes da utilização: encher os poços com 300 µL
Tampão de Lavagem diluido, deixe de molho por cerca de 10 segundos nos poços e remover.
2. Pipetar 100 µL de cada Padrão, Controlo e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca. A fiabilidade da análise pode ser melhorada através de determinações duplas. 3. Incubar 30 min à temperatura ambiente (18-25 °C).
4. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
5. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço. 6. Incubar 30 min à temperatura ambiente (18-25 °C).
7. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
8. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
9. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço.
10. Incubar 30 min à temperatura ambiente (18-25 °C) no escuro (sem película aderente).
11. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço. Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para amarelo.
12. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência: 600-650 nm) nos 30 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12.
11BCONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e métodos de lavagem.
É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
13.
12BCÁLCULO DE RESULTADOS
Os dados obtidos são avaliadas quantitativamente usando uma curva padrão, utilizando um programa de avaliação de ELISA convencional, como mostrado no exemplo abaixo. Um bom ajuste com uma função de 4 parâmetros ou spline aproximação é obtida. Além disso, em alternativa, pode ser manualmente desenhar a curva padrão em um papel milimetrado semilogarítmica.
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico).
A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão GPL-U/mL DOMédia
A 0 0.053 B 3.0 0.154 C 8.0 0.330 D 18 0.689 E 45 1.372 F 100 2.207
Além disso, o teste pode ser avaliada de forma qualitativa. Isto requer apenas a medição do controlo positivo. No entanto, recomenda-se para medir e analisar o controle negativo (ver: controle de qualidade). Na avaliação teste qualitativo, a absorvância (DO) das amostras é comparado com o limite de DO (= cut-off). O prazo SD é determinada pela seguinte fórmula:
DOlimite = DOcontrol positivo x fator
l fator depende do lote do kit e é indicado no certificado de controle de qualidade específico do lote que está incluído em cada kit de teste. exemplo:
DOcontrol positivo = 1.250 fator = 0.35 DOlimite = 1.250 x 0.35 = 0.438 0 500 1000 1500 2000 2500 1 10 100 GPL-U / mL m O D 450 n m
Para se ter uma idéia do grau de reatividade de uma amostra, é possível calcular a quociente, de acordo com a seguinte fórmula:
quociente = DOamostra / DOlimite Exemplo:
DOlimite = 0.438
DOamostra = 1.480
quociente = 1.480 / 0.438 = 3.4
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13BINTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Interpretação Avaliação quantitativa GPL-U/mL Avaliação qualitativa quociente Negativo < 10 < 0.86 Cut-off 12.0 1.00 Indeterminado 10 – 14.4 0.86 - 1.16 Positivo > 14.4 > 1.16
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
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14BVALORES ESPERADOS
Em uma amostra de 160 soros de doadores de sangue, distribuídos igualmente por sexo e idade, a seguinte distribuição do analito foi determinada:
Média: 5.3 GPL-U/mL
Média + 2 DS: 11.0 GPL-U/mL
Mediana: 4.7 GPL-U/mL
Percentil 95 %: 9.5 GPL-U/mL
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15BLIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
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16BDESEMPENHO
Normalização Calibrado para um set comercialmente disponível, gradualmente soros positivos ("Harris suero"; Louisville APL Diagnostics Inc., Louisville, KY, USA).
Sensibilidade Analítica Limite de Detecção (3 x DS de Tampão da Amostra) < 0.5 GPL-U/mL (n = 24) Especificidade Analítica Específicos para IgG humano contra cardiolipina
Precisão
Variabilidade Intra-Ensaio (n = 24) Variabilidade Inter-Ensaio (n = 72) Média (GPL-U/mL) % CV Média (GPL-U/mL) % CV
10 3.2 10 4.6
19 3.2 19 3.4
65 2.8 65 2.9
Variabilidade entre operador (n = 12) Variabilidade entre 2 lote (n = 6) Média (GPL-U/mL) % CV Média (GPL-U/mL) % CV
10 9.6 11 4.6
20 5.5 21 2.5
65 4.2 73 3.1
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17BAUTOMATIZAÇÃO
Versão manual versus Dynex DS2
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 GPL-U/mL manually G P L-U /m L D y nex y = 1,03 * x r = 0,998
Variabilidade: Usando o mesmo lote de amostra, a variabilidade dos resultados do teste foram comparados entre o sistema de ELISA manual e automática Dynex DS2.
Versão manual Dynex DS2
Variabilidade Intra-ensaio (n = 16) CV Média 1.8 % CV Média 2.6 %
Variabilidade Inter-ensaio (n = 48) CV Média 3.5 % CV Média 3.2 %
19.
18BREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
1. Gromnica-Ihle, E., and Schössler, W.: Antiphospholipid Syndrome. Int Arch Allergy Immunol 123 (2000), 67 - 76
2. Harris, E. N., et al.: Anticardiolipin antibodies: Detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet Nov 26 (1983), 1211 - 1214
3. Petri, M.: Epidemiology of the Antiphospholipid Antibody Syndrome. J Autoimm 15 (2000), 145 - 151 4. Galli, M., et al.: Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma cofactor.
Lancet 335 (1990), 1544 - 1547
5. Matsuura, E., et al.: Anticardiolipin antibodies recognise ß2-Glycoprotein 1 structure altered by interacting with an oxygen modified solid phase surface. J Exp Med 179 (1994), 457 - 462
6. Shoenfeld, Y., et al.: Induction and treatment of the antiphospholipid syndrome - lessons from animal models. Eur J Clin Invest 31 (2001), 736 - 740
7. Pierangeli, S. S., et al.: Complement activation: a novel pathogenic mechanism in the antiphospholipid syndrome. Ann NY Acad Sci 1051 (2005), 413 - 420
8. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), 86 - 92
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons.
WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement.
LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER’S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS.
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