UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
NOME DO(A) ALUNO(A): Arthur Zanetti Nunes Fernandes
ÁREA: Bioquímica
NÍVEL: Doutorado
TÍTULO DO TRABALHO: Estudos sobre a resposta estringente de bactérias gram-positivas:
Busca de mecanismos de regulação e inibição da enzima RelA em Bacillus subtilis
Introdução
A resposta estringente
A resposta estringente foi identificada pela primeira vez em E. coli submetida à carência de aminoácidos1. A resposta estringente consiste em adaptações fisiológicas em resposta à produção de (p)ppGpp, um segundo-mensageiro nucleotídico universal em bactérias. As adaptações fisiológicas causadas (p)ppGpp permitem uma rápida resposta frente aos estresses sendo uma importante ferramenta para a sobrevivência da bactéria2.
O (p)ppGpp é a denominação dada a dois segundos-mensageiros: a guanosina tetra fosfato e a guanosina penta fosfato (Figura 1), sendo nucleotídeos derivados de GDP e GTP respectivamente. O (p)ppGpp também é conhecido como alarmônio: são classificados como alarmônios ribonucleotídeos (e seus derivados) cuja síntese ocorre em um momento de estresse e que por sua vez são capazes de ativar ou inibir outros processos celulares durante esta condição de estresse3,4.
Figura 1. Representação da síntese e hidrólise de (p)ppGpp. Os fosfatos estão representados por pequenos círculos, enquanto A corresponde a adenosina ribonucleosídeo e G por guanosina ribonucleosídeo. Na etapa de
síntese de (p)ppGpp temos a transferência de um grupo pirofosfato do ATP para o carbono 3` da ribose da guanosina, enquanto na reação de hidrólise temos a remoção deste mesmo pirofosfato5. (Fonte: Jain et al., 2006)
Dentre as adaptações fisiológicas induzidas pelo (p)ppGpp destacam-se as que levam à diminuição do crescimento: diminuição da síntese proteica, diminuição da transcrição de rRNA, diminuição da replicação do DNA cromossomal6,7.
Atualmente sabe-se que a resposta estringente é ativada não só em carência de aminoácidos8, mas também em carência de carbono9, nitrogênio inorgânico10, ácidos graxos11,12, ferro13, fosfato14, falta de luz (para bactérias fotossintetizantes)15, além de estresses físicos como osmolaridade16, aumento de temperatura16,17, estresse oxidativo18, danos por UV19 entre outros.
Além do envolvimento do (p)ppGpp na adaptação frente à estresses nutricionais e físicos sabe-se que ele está envolvido na regulação de outros processos como virulência20, persistência21–
25, formação de biofilme26–30, quorum sensing31,32, simbiose bactéria-vegetal33,34, produção de
antibiótico35–40, evasão da resposta imune41–44 e resistência a antibiótico45.
Embora a resposta estringente e sua regulação sejam parcialmente compreendidas em E. coli, a regulação da resposta em outras bactérias, especialmente as gram-positivas, ainda permanece obscura, especialmente para outras carência nutricionais além da falta de aminoácidos.
Proteínas da super família RSH
A síntese e degradação de (p)ppGpp é feita pela enzimas da super família RSH –
RelA/SpoT homologues – nome em referências as enzimas RelA e SpoT de E. coli, primeiro
organismo a ter a resposta estringente estudada.
A super família RSH é composta por 3 classes de proteínas: RSH longas, SAS (Small Alarmone Syntetase) e SAH (Small Alarmone Hydrolase).
As enzimas RSH longas (Figura 2A) apresentam dois domínios catalíticos em sua porção N-terminal: o domínio HD, responsável pela atividade hidrolítica de (p)ppGpp e o domínio SYNTH responsável pela síntese de (p)ppGpp. Sua porção C-terminal é composta por 4 domínios adicionais que regulam a função da RSH. Os domínios adicionais são: TGS (ThrRS, GTPase e
SpoT), α (alfa hélice), ZFD/CC (Zinc Finger Domain/Cysteine Conserved) e ACT/RRM
(Aspartate kinase, Chorismate mutase e TyrA/RNA recognition motif).
As enzimas SAS (figura 2B) por sua vez apresentam apenas um domínio de síntese, e nenhum domínio regulatório, enquanto as enzimas SAH apresentam apenas um domínio de hidrólise.
Em E. coli e em outras γ-proteobactérias costumeiramente são encontradas duas enzimas RSH longas (RelA e SpoT), enquanto em Bacillus subtilis e outras bactérias gram positivas são encontradas uma RSH longa (Rel) e uma ou mais SAS (no caso de B. subtilis RelP e RelQ). A presença SAH é rara e poucos procariotos apresentam enzimas dessa classe46.
Ativação de resposta estringente
Nosso grupo tem estudado como Bacillus subtilis responde a carência de ácidos graxos: recentemente verificou-se que esta carência produz severa perda de viabilidade em uma mutante onde houve a deleção de rel, indicando o importante papel de ppGpp na sobrevivência a este estresse47. Porém até o momento não foi identificada a forma de ativação de Rel em bactérias gram-positivas durante esta carência nutricional. Sabe-se que em E. coli e outras proteobactérias que apresentam duas RSH longas (SpoT/RelA), durante a carência de ácidos graxos, ocorre a ativação de SpoT pela sua interação com a proteína carregadora de acila (ACP)48.
Durante a carência de aminoácidos, a produção de (p)ppGpp por Rel é ativada pela formação de um complexo ternário Rel • tRNA • Ribossomo49. Devido a esta diversidade de mecanismos de ativação da resposta estringente a diferentes estímulos acredita-se que exista uma via específica para ativação de Rel durante a falta de ácido graxos em B. subtilis.
Inibidores da resposta estringente e a crise de antibióticos
O uso indiscriminado de antimicrobianos nos trouxe a uma crise de cepas multidroga-resistentes que levaram à morte 700 mil pessoas em 2014, podendo chegar a 10 milhões de mortes anuais em 2050, com perdas financeiras totais de 100 trilhões de dólares50. Dessa forma, se mostra essencial a descoberta de novos antimicrobianos.
Os níveis de (p)ppGpp estão associados à resistência a diversos antibióticos. Observou-se que a indução da resposta estringente causou resistência a antibióticos, enquanto a deleção das enzimas de síntese de (p)ppGpp levaram à sensibilização das cepas45. Esse efeito foi verificado
em diversos organismos como E. coli, V. cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, S. aureus e Mycobacterium tuberculosis frente aos mais diversos antibióticos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, tetraciclina, eritromicina, entre outros)45.
A relação entre (p)ppGpp e resistência a antibióticos não é um fato verificado apenas em laboratório: em isolados clínicos multidroga resistentes foi verificada uma produção mais elevada
de (p)ppGpp, causada por mutações em Rel51,52, mostrando que a elevação de (p)ppGpp vai além de uma forma de sobreviver a carência nutricional, sendo também uma forma de escape às terapias antimicrobianas.
Até o momento foram identificados poucos compostos capazes de inibir a resposta estringente: o GSK-X9 identificado em uma recente triagem de mais de 2 milhões de compostos42,
a relacina e os compostos AB e AC são resultado de um desenho racional de inibidores, enquanto a vitamina C foi testada especificamente devido ao seu efeito de potencializar agentes anti-tuberculose, além de afetar a resposta a estresse e dormência em micobactérias. Os valores de IC50 dos compostos são elevados (40uM a 1mM), com exceção do composto GSK-X9, com um IC50 de 2uM42,53–55. Compostos com IC50 elevados não são bons candidatos a uso clínico, com apenas um composto com um IC50 possível de utilização, mostrando assim a necessidade da descoberta de inibidores mais efetivos da resposta estringente.
Ademais, até o momento nenhum inibidor para as enzimas SAS foi descoberto. A inibição de RelP é um interessante alvo devido ao fato de RelP ser fortemente expressa durante inibição da síntese da parede celular, sendo seu promotor inclusive usado em sistema repórter para busca de novos inibidores da síntese da parede celular56. Em S. aureus um tratamento de 24h com 10x a MIC de ampicilina mostrou que a deleção de RelP e RelQ aumentou a letalidade em cerca de 30 vezes. Dessa forma a descoberta de inibidores da resposta estringente permitiria a potencialização de antibióticos já conhecidos.
Objetivos
Este projeto apresenta três frentes distintas: um buscando uma melhor compreensão da fisiologia bacteriana (I), um com objetivo de encontrar inibidores da resposta estringente (II) e um de cunho metodológico (III):
I. Mecanismo da ativação de Rel durante a resposta estringente por carência de ácidos graxos.
Até o momento não há informações de qual sinal é responsável pela ativação de Rel na carência de lipídios. Dessa forma almejamos a descoberta de possíveis proteínas parceiras de Rel associadas a este estímulo.
Como citado na introdução, a inibição da resposta estringente é um alvo terapêutico interessante dessa forma buscamos a identificação de compostos capazes de reduzir a síntese de (p)ppGpp por Rel e RelP.
III. Desenvolvimento de um método de quantificação de (p)ppGpp intracelular.
Atualmente o monitoramento do (p)ppGpp intracelular é possível apenas em E. coli onde um sistema repórter baseado na modulação do complexo RNAP-DksA por (p)ppGpp foi construído25,57. Infelizmente esse sistema é funcional apenas em E. coli, dessa forma a
quantificação do (p)ppGpp em Bacillus subtilis deve ser realizada por meios convencionais que requerem a extração do (p)ppGpp impossibilitando o monitoramento dos níveis de (p)ppGpp em células individuais intactas. Dessa forma buscamos a construção de um sistema repórter in vivo para B. subtilis.
Resultados
I. Mecanismo da ativação de Rel durante a resposta estringente por carência de ácidos graxos.
Para a descoberta de mecanismos de regulação da proteína Rel durante a carência de ácidos graxos utilizaremos a técnica de pull-down, para captura e identificação de parceiros físicos de Rel. Para induzir carência de ácido graxos utilizaremos do antibiótico cerulenina, um inibidor de FabF, uma proteína componente da sintetase de ácidos graxos bacteriana58.
Utilizando a proteína Rel recombinante contendo uma cauda de polihistidinas, imobilizaremos a proteína em uma coluna NiNTA e aplicaremos o lisado total de Bacillus subtilis submetido a carência lipídica induzida por cerulenina12, e paralelamente utilizaremos como controle um lisado de uma cultura sem indução da carência lipídica.
A obtenção de um protocolo de purificação de Rel foi concluído, e no momento estamos validando a técnica de pull-down para captura de parceiros de Rel utilizando como controle a já conhecida resposta estringente induzida por carência de aminoácidos. Essa resposta é facilmente induzida pela adição do antibiótico mupirocina, levando a conhecida interação de Rel com tRNA não aminoacilado e ribossomo. Concluída essa etapa de validação do método, daremos prosseguimento a identificação de parceiros de Rel responsáveis pela ativação da proteína em resposta à falta de àcidos graxos.
II. Busca de inibidores da resposta estringente.
A ativação da resposta estringente, quer por Rel ou por SAS, levam à produção de (p)ppGpp e, consequentemente, a uma redução do crescimento. Logo, inibidores dessas enzimas devem ser capazes de promover uma aceleração no crescimento da bactéria por haver uma menor produção de (p)ppGpp
Em um primeiro momento visamos a triagem de inibidores da proteína Rel, porém para triagem de inibidores da síntese de (p)ppGpp por Rel é necessário que ela seja de alguma forma ativada, quer pela adição de algum composto que mimetize o processo de carência nutricional, quer pela utilização de mutantes onde a função sintetase está desregulada e predomine frente à função hidrolítica.
Visando a obtenção de uma Rel com função de síntese de (p)ppGpp ativada construímos mutantes baseado em informações da literatura ou pela análise da estrutura de Rel. Foram obtidos os mutantes pontuais H77A59, F128Y51 e K159Q, além de um mutante com a deleção do domínio C-terminal ACT49,60. Enquanto o mutante H77A mostrou um fenótipo severo demais para ser utilizado, os mutantes K159Q e ΔACT foram fracos demais. O mutante F128Y apresentou um fenótipo ideal para utilização na triagem de compostos. Esta está sendo realizada por André Ferreira, aluno de mestrado em nosso grupo.
Em paralelo à obtenção da cepa mutante ideal de Rel, iniciamos a busca de inibidores de RelP. A busca de inibidores de RelP se justifica por alguns motivos: até o momento não há dados na literatura de nenhum inibidor de RelP, dessa forma haverá um maior ineditismo, além disso a enzima RelP também tem papel importante na resposta à antibióticos, em especial aqueles que tem como alvo a parede celular.
Utilizamos uma cepa em que a expressão de RelP é induzível por xilose. Dessa forma, a adição de xilose leva a um acúmulo de (p)ppGpp, e consequentemente a uma redução de crescimento. Após diversas etapas de padronização envolvendo condições como densidade inicial de células, tempo de cultivo, concentração de xilose, chegamos a uma condição ótima de triagem, onde fomos capazes de obter um fator Z` superior a 0.5, considerado assim um ensaio em ótimas condições para descoberta de inibidores61.
Até o momento triamos 2320 compostos da Spectrum Collection (MicroSource), esta biblioteca apresenta como diferencial a presença de diversos compostos com alguma ação biológica conhecida (cerca de 80%), permitindo uma mais rápida validação de ensaios contra novos alvos. Os hits encontrados nesta biblioteca estão em processo de validação, sendo retestados em triplicata para confirmar seu efeito. Em seguida os compostos serão testados em uma cepa sem produção de (p)ppGpp para avaliar se o aumento do crescimento é dependente da
inibição de RelP. Confirmada sua especificidade, será feita uma curva dose vs. resposta, para avaliação de sua potência. Ensaios adicionais poderão ser realizados como inibição in vitro da proteína recombinante, potencial sinérgico com outros antibióticos, quantificação do (p)ppGpp na cepa controle e tratada.
Paralelamente seguiremos com a triagem de uma nova biblioteca - DIVERset (ChemBridge) - agora com 10 mil compostos. Esta biblioteca, além de apresentar um maior universo químico de possíveis farmacóforos, foi construída selecionando compostos com características de drogas (drug likeness), ou seja, os compostos foram selecionados seguindo parâmetros físico químicos (como baixo peso molecular, liposolubilidade, superfície de área polar, entre outros) que permitem uma melhor biodisponibilidade quando usado por administração oral.
III. Desenvolvimento de um método de quantificação de (p)ppGpp intracelular.
Recentemente foi descoberta uma nova classe de riboswitches responsivos à (p)ppGpp. Este riboswitch é do tipo terminador da transcrição, ou seja sem o metabólito modulador o riboswitch assume uma conformação que leva à parada da transcrição. Quando o (p)ppGpp se liga ao riboswitch sua estrutura sofre mudanças que permitem o avanço da RNAP e a consequente expressão gênica.62
Construímos uma sistema repórter baseado no recém descoberto riboswitch de (p)ppGpp onde o gene transcrito seria o da proteína fluorescente mNeonGreen. Dessa forma, monitorar a elevação dos níveis de (p)ppGpp in vivo seria possível através do monitoramento dos níveis de fluorescência. Optamos por utilizar o riboswitch de Bacilllus megaterium, espécie mais próxima de nosso organismo modelo Bacillus subtilis que possui o riboswitch. Essa construção infelizmente não se mostrou funcional, não sendo observada fluorescência nas bactérias cuja resposta estringente foi induzida. Duas hipótese foram levantadas que explicariam a não funcionalidade do sistema repórter:
I – Identificação in silico da literatura estar incorreta: Os riboswitches de (p)ppGpp foram identificados primeiramente in silico, e foram descritos experimentalmente apenas os riboswitches de Desulfitobacterium hafniense e de Thermosediminibacter oceani 63. O riboswitch
para (p)ppGpp faz parte de uma família que reconhece moléculas diferentes de (p)ppGpp, dessa forma é possível que o riboswitch de Bacillus megaterium tenha sido identificado erroneamente, já que até os riboswitches de um mesmo subtipo apresentam diferenças significativas em suas sequencias.
II – Baixa afinidade do riboswitch de Bacillus megaterium por (p)ppGpp: a caracterização in vitro dos riboswitches de D. hafniense e T. oceani mostrou uma diferença da afinidade, in vitro,
do riboswitch por ppGpp de quase 1000 vezes, tendo um Kd de 10nM para T. oceani e de 6uM para D. hafniense62. Assim o riboswitch de Bacillus megaterium, embora possa ser realmente um riboswitch para ppGpp, ele pode apresentar uma afinidade muito baixa por (p)ppGpp.
Como alternativa ao sistema baseado em riboswitch escolhemos o gene yvyD (hpf), que codifica o fator de promoção de hibernação do ribossomo, responsável pela dimerização de dois ribossomos 70S em um dímero 100S64. A expressão de yvyD se correlaciona com os níveis de ppGpp, sofrendo um aumento de 15,4 vezes quando a resposta estringente é promovida pela adição de dl-norvalina. Dessa forma o promotor de yvyD será utilizado para construção de um sistema repórter com a proteína fluorescente mNeonGreen, a qual permitirá o monitoramento dos níveis de (p)ppGpp in vivo em B. subtilis.
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- Sistema Administrativo da Pós-Graduação
Universidade de São Paulo Instituto de Química
FICHA DO ALUNO
46131 - 10741207/1 - Arthur Zanetti Nunes Fernandes
Email: arthurznf@usp.br
Data de Nascimento: 14/07/1991
Cédula de Identidade: RG - 35.378.454-0 - SP Local de Nascimento: Estado de São Paulo Nacionalidade: Brasileira
Graduação: Farmacêutico-Bioquímico - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - São Paulo - Brasil - 2014
Mestrado: Mestre em Ciências Área: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde (1) -Universidade Estadual de Campinas - São Paulo - Brasil - 2017
Curso: Doutorado
Programa: Ciências Biológicas (Bioquímica)
Área: Bioquímica
Data de Matrícula: 23/02/2018 Início da Contagem de Prazo: 23/02/2018 Data Limite para o Depósito: 23/02/2023
Orientador: Prof(a). Dr(a). Frederico José Gueiros Filho - 23/02/2018 até o presente. Email: fgueiros@iq.usp.br
Proficiência em Línguas: Inglês, Aprovado em 21/03/2019 Prazo Máximo para Inscrição no
Exame de Qualificação: 25/02/2021 Data de Aprovação no Exame de
Qualificação:
Data do Depósito do Trabalho: Título do Trabalho:
Data Máxima para Aprovação da Banca:
Data de Aprovação da Banca: Data Máxima para Defesa: Data da Defesa:
Resultado da Defesa:
Histórico de Ocorrências: Primeira Matrícula em 23/02/2018
Aluno matriculado no Regimento da Pós-Graduação USP (Resolução nº 6542 em vigor de 20/04/2013 até 28/03/2018). Última ocorrência: Matrícula Regular em 27/07/2020
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FICHA DO ALUNO
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Sigla Nome da Disciplina Início Término Carga
HoráriaCred. Freq. Conc. Exc. Situação
QFL5930-5/1
Noções de Segurança em Laboratórios de Química e Bioquímica, Ética e Responsabilidade em
Pesquisa 07/03/2018 13/03/2018 30 2 100 A N Concluída
QBQ5759-9/3 Tópicos Avançados de Bioquímica e BiologiaMolecular I 15/03/2018 27/06/2018 30 2 100 A N Concluída
QBQ5751-14/1 Bioquímica Avançada 04/04/2018 26/06/2018 180 12 100 B N Concluída
QBQ5710-12/1 Biologia Molecular do Gene 15/08/2018 06/11/2018 180 12 100 A N Concluída
QBQ5764-12/1 Tópicos Avançados de Bioquímica e BiologiaMolecular II 16/08/2018 28/11/2018 30 2 100 A N Concluída
BMM5787-7/2
Compostos Bioativos e Estratégias de
Desenvolvimento de Drogas (Instituto de Ciências
Biomédicas - Universidade de São Paulo) 17/09/2018 11/11/2018 120 8 100 A N Concluída
SFI5840-7/1 Cristalografia de Macromoléculas (Instituto deFísica de São Carlos - Universidade de São Paulo) 21/08/2020 13/11/2020 180 0 - - N canceladaMatrícula
Créditos mínimos exigidos Créditos obtidos
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Disciplinas: 30 40 38
Estágios:
Total: 30 40 38
Créditos Atribuídos à Tese: 180
Observações:
1) Curso com validade nacional, de acordo com o disposto na Portaria nº 1.325, de 21.09.2011. Conceito a partir de 02/01/1997:
A Excelente, com direito a crédito; B Bom, com direito a crédito; C Regular, com direito a crédito; R Reprovado; T -Transferência.
Um(1) crédito equivale a 15 horas de atividade programada. Última ocorrência: Matrícula Regular em 27/07/2020 Impresso em: 18/02/2021 02:15:59
