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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

RESISTOTIPAGEM E TRANSFERÊNCIA GENÉTICA DE

PLASMÍDIOS DE RESISTÊNCIA ENTRE COLIFORMES E

VIBRIOS POTENCIALMENTE PATOGÊNICOS PARA O HOMEM

ISOLADOS DE CAMARÃO (Litopenaeus vannamei)

COMERCIALIZADO EM NATAL-RIO GRANDE DO NORTE

LIGIA MARIA RODRIGUES DE MELO

NATAL/RN

2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

RESISTOTIPAGEM E TRANSFERÊNCIA GENÉTICA DE PLASMÍDIOS DE RESISTÊNCIA ENTRE COLIFORMES E VIBRIOS POTENCIALMENTE PATOGÊNICOS PARA O HOMEM ISOLADOS DE CAMARÃO (Litopenaeus

vannamei) COMERCIALIZADO EM NATAL-RIO GRANDE DO NORTE

TESE APRESENTADA AO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE, COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

DOUTOR.

Ligia Maria Rodrigues de Melo

Orientadora: Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira Co-Orientadora: Profa. Dra Dulce Almeida

NATAL/RN 2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

RESISTOTIPAGEM E TRANSFERÊNCIA GENÉTICA DE PLASMÍDIOS DE RESISTÊNCIA ENTRE COLIFORMES E VIBRIOS POTENCIALMENTE PATOGÊNICOS PARA O HOMEM ISOLADOS DE CAMARÃO (Litopenaeus

vannamei) COMERCIALIZADO EM NATAL-RIO GRANDE DO NORTE

Coordenadora do Curso de Pós-Graduação Profa. Dra. Ivonete Batista de Araújo

NATAL/RN 2012

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RESISTOTIPAGEM E TRANSFERÊNCIA GENÉTICA DE PLASMÍDIOS DE RESISTÊNCIA ENTRE COLIFORMES E VIBRIOS POTENCIALMENTE PATOGÊNICOS PARA O HOMEM ISOLADOS DE CAMARÃO (Litopenaeus

vannamei) COMERCIALIZADO EM NATAL-RIO GRANDE DO NORTE

Presidente da Banca: Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________ Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira

(PPgCSA/CS/UFRN – Orientadora)

____________________________________________ Profa Dra Eveline Pipolo Milan

PPgCSA/CS/UFRN

____________________________________________ Profa. Dra. Ângela Maria Soares Cardonha

Departamento de Nutrição/UFRN-Examinadora Externa ao Programa

____________________________________________ Prof. Dr. Cícero Romão Gadê Neto

Escola da Saúde (UnP)-Examinador Externo à Instituição

____________________________________________ Prof. Dr. Ernesto Hofer

FioCruz – RJ – Examinador Externo à Instituição

NATAL – RN 2012

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Manoel Rodrigues de Melo “in memoriam” e Laurita Rodrigues de Melo “in memoriam” pelos exemplos de retidão, honestidade, apoio, perseverança e incentivo, durante todas as etapas de minha vida. A eles a minha eterna gratidão e saudades.

À minha filha Laurita de Melo Galvão de Souza e ao meu neto Rodrigo Galvão Pires, os bens mais preciosos da minha vida concedidos pelo Criador.

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vi

AGRADECIMENTOS

A Deus por me guiar e iluminar sempre, permitindo que as minhas dificuldades fossem todas superadas para que eu conseguisse atingir mais um objetivo em minha vida.

À minha orientadora, Profa. Dra. Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira, pela paciência, apoio, competência e orientação desse trabalho.

À minha co-orientadora, Profa. Dra. Dulce Almeida, pela amizade, orientação e apoio, sempre disponível e me encorajando nas horas mais difíceis.

Ao Professor Dr. Ernesto Hofer pelo apoio, amizade e colaboração com sua vasta experiência me abrindo todas as portas, tornando possível a realização desse trabalho.

A Universidade Potiguar, pela valiosa colaboração permitindo a realização da parte experimental desse trabalho no Laboratório de Microbiologia dos Alimentos.

À Raissa Maria Chaves Dantas Barretto Godeiro, amiga de todas as horas, pela colaboração na parte prática desse trabalho.

À Profa. Dra. Nilma Cintra Leal, pesquisadora do Centro Ageu Magalhães – UFPE e ao Biólogo Claudio Eduardo Cavalcanti de Araújo, pela atenção e apoio no treinamento da técnica de isolamento de plasmídios.

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vii

Ao Instituto Osvaldo Cruz pela inestimável colaboração na identificação fenotípica e molecular das cepas bacterianas isoladas.

Ao Laboratório de Ciências do Mar (Labomar), em especial a doutoranda Edirsana Maria Ribeiro de Carvalho e a Profa. Dra. Oscarina Viana de Souza, pelo treinamento da técnica de cura de plasmídios e colaboração na realização da conjugação bacteriana.

Ao Marcelo Barreto, sempre atencioso e prestativo, pela colaboração na formatação desse trabalho.

À Coordenação e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCSA) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, que nos propiciaram a concretização desse sonho.

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viii SUMÁRIO

Dedicatória ... v

Agradecimentos ... vi

Lista de siglas ... xi

Lista de abreviaturas ... xiii

Lista de Figuras e Tabelas... xiv

Resumo ... xv 1 INTRODUÇÃO ... 1 2 OBJETIVOS ... 4 2.1 GERAIS ... 4 2.2 ESPECÍFICOS ... 4 3 JUSTIFICATIVA ... 6 4 REVISÃO DE LITERATURA ... 9 4.1 Carcinicultura mundial ... 9 4.2 Carcinicultura brasileira ... 10

4.3 Carcinicultura no Rio Grande do Norte ... 11

4.4 O Viveiro, nicho de bactérias patogênicas ... 12

4.4.1 Os coliformes ... 12

4.4.2 O gênero Vibrio ... 13

4.4.3 O gênero Aeromonas ... 15

4.5 O Viveiro e a resistência bacteriana aos antimicrobianos ... 16

(10)

ix

5.1 Amostragem ... 19

5.2 Coleta das amostras ... 20

5.2.1 Camarões frescos ... 20

5.3 Processamento laboratorial ... 20

5.3.1 Isolamento e caracterização fenotípica dos coliformes ... 20

5.3.2 Isolamento e caracterização feno e genotípica dos vibrios ... 21

5.3.2.1 Teste de Kanagawa (Vibrio parahaemolyticus) ... 22

5.3.2.2 Detecção das Hemolisinas ... 22

5.3.3 Isolamento e caracterização fenotípica das aeromonas ... 24

5.3.4 Resistotipagem ... 25

5.3.4.1 Susceptibilidade Antimicrobiana ... 25

a) Cálculo do Índice de multiresistência a antimicrobianos (MAR) ... 25

5.3.5 Cura dos Plasmídios ... 26

5.3.6 Processo de recombinação genética ... 26

a) Experimentos de conjugação ... 26

6 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS ... 28

6.1 ARTIGO 1: Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from pond-reared shrimps Litopenaeus vannamei marketed in Natal, Brazil. ... 28

6.2 ARTIGO 2: Multiresistance in strains of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) marketed in Natal, Northeastern Brazil. ... 38

7 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES ... 59

8 APÊNDICE ... 63

(11)

x

Tabela 1 - Incidência de coliformes isolados de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte

(RN). ... 63 8.2 APÊNDICE B ... 63 Tabela 2 - Perfil de resistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN). ... 63 Tabela 3 - Perfil de multirresistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – RN... 64

8.3 APÊNDICE C ... 66 Tabela 4 - Perfil de resistência a antimicrobianos da Escherichia coli K12C600 após a conjugação bacteriana, adquirido de espécies de Vibrio isolados de camarões frescos e refrigerados, comercializados em Natal/RN .. 66 8.4 APÊNDICE D - Lista de Publicações em Eventos ... 68 8.5 APÊNDICE E - Artigo e convites - A cólera no Estado do Rio Grande do Norte – Brasil – perfil sorológico e de sensibilidade do Vibrio cholerae a diferentes antibióticos ... 72 9 REFERÊNCIAS ... 78

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xi

LISTA DE SIGLAS

ABCC Associação Brasileira de Criadores de Camarão

AMK Amicacina

AMP Ampicilina

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APA Água Peptonada Alcalina

ATCC American Type Culture Collection

CECON Centro de controle e produtos para diagnósticos LTDA

CHL Cloranfenicol

CIP Ciprofloxacina

dNTP Deoxynucleotide triphosphate dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate

EMB Eosine Methyl-Blue

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

GEN Gentamicina

IMNV Vírus da Mionecrose Infecciosa

KIA Kligler Iron Agar

LABORCLIN Laboratório de Análises Clínicas

LB Luria Bertani

LIA Lysine Iron Agar

MAR Múltipla Resistência aos Antimicrobianos MIC Concentração Inibitória Mínima

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NaCl Cloreto de sódio

NAL Ácido nalidíxico

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NIT Nitrofurantoína

OMS Organização Mundial de Saúde

PCR Reação em Cadeia Polimerase

pH Potencial Hidrogeniônico

RDC Reunião da Diretoria Colegiada

RN Rio Grande do Norte

SXT Sulfametoxazol-Trimetoprim

SIRVETA Sistema de Vigilância Epidemiológica de Enfermidades Transmitidas por Alimentos.

TCBS SacaroseTiossulfato Citrato Sais Biliares TCP Toxin -coregulated pilus

TDH Thermostable direct hemolysin

TL Thermolabile hemolysin

TRH Thermostable direct hemolysin-related

TSA Tripticase Soy Agar

TCY Tetraciclina

UnP Universidade Potiguar

USA Estados Unidos das Américas

US$ Dólar

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xiii LISTA DE ABREVIATURAS A. Aeromonas C Celsius CT Toxina colérica Et al E Colaboradores g Grama h Hora Há Hectare Kg Kilograma mg Miligrama mL Mililitro n Número t Tonelada V. Vibrio µg Micrograma µl Microlitro µM Micromol

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xiv

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Perfil da Produção Mundial de Camarão Marinho: Cultivado e Capturado de 1978 a 2008 (ABCC, 2011).

Figura 2 Municípios do Rio Grande do Norte - procedência das amostras de camarão Litopenaeus vannamei

Tabela 1 Incidência de coliformes isolados de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN).

Tabela 2 Perfil de resistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN).

Tabela 3 Perfil de multirresistência do grupo coliforme isolado de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) comercializado na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN).

Tabela 4 Perfil de resistência a antimicrobianos da Escherichia coli K12C600 após a conjugação bacteriana, adquirido de Vibrio e Aeromonas isolados de camarões frescos e refrigerados, comercializados em Natal - RN

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xv RESUMO

Cinquenta amostras de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei) foram coletadas em diferentes pontos de comercialização na cidade de Natal – RN. As amostras foram maceradas em um gral estéril e 25 gramas semeadas em 225mL de APA contendo 1% de NaCl e 25g em 225mL de CL incubadas a 35ºC - 24 horas. O crescimento em APA foi semeado em placas de Ágar TCBS, incubadas a 35ºC-24h para isolamento de Vibrio e Aeromonas. O crescimento do CL foi semeado em Agar EAM, para isolamento de coliformes. Dos 102 isolados, 91 (89,2%) pertenciam ao gênero Vibrio e 11 (10,8%) ao gênero Aeromonas, com predominância de V. cholerae não O1/não O139, V.

alginolyticus, V. carchariae e V. parahaemolyticus K- e A. veronii biogrupo sobria , A. jandaei, A. schubertii, A. veronii biogrupo veronii e A. hydrophila. A

menor eficiência entre os antimicrobianos foi da AMP (57,8% de resistência) seguida da AMK (29,4%) e TCY (21,6%). As 39 cepas de Vibrio e Aeromonas multirresistentes se distribuíram em 10 perfis distintos, sendo que um revelou cinco marcos (AMP, CHL, NIT, SXT e TCY) em um isolado de V. carchariae de camarão, adquirido em supermercados. O índice MAR, nas 39 cepas variou de 0,28 a 0,42, sugerindo que são de risco na transferência e difusão da resistência na cadeia alimentar. Após a cura plasmidial pelo tratamento com AO de 24 cepas multirresistentes e com resistência intermediária de víbrio e aeromonas escolhidas aleatoriamente, 13 perderam totalmente a resistência e 7 perderam parcialmente, sendo que o maior percentual de perda da resistência ocorreu nas cepas de V. cholerae não O1 e não O139 (6 cepas), se concentrando nos marcos de resistência a AMP (13), AMK (11), TCY(8) e CIP(3). Os resultados da conjugação realizada entre amostras de Vibrio

(17)

xvi

curadas e a E. coli K12C600 demonstraram que 78,5% das culturas de Vibrio testadas revelaram capacidade de transferência para o gene que confere resistência a AMP e 28,5% para a TCY. Dos coliformes, E. coli foi a mais frequente, seguida de Citrobacter spp, isoladas em 40,3% e 27,5% das amostras respectivamente. AMP foi o antimicrobiano menos eficaz, seguido de TCY. As 11 cepas multirresistentes se distribuíram em 9 perfis distintos, um deles constituído de cinco marcos (AMP, NIT, TCY, CHL, SXT), albergados em uma cepa de Klebsiella spp, oriunda de camarão adquirido em supermercado, similar ao resultado obtido em V. carchariae. Conclui-se que, os camarões marinhos frescos e refrigerados, comercializados em Natal-RN evidenciaram contaminação com coliformes, víbrios e aeromonas multirresistentes a antimicrobianos comumente utilizados na terapia médica e veterinária, e que, possivelmente, a transferência de genes de resistência entre bactérias se constitui um sério problema de saúde pública.

Palavras Chave: Litopenaeus vannamei, multirresistência, coliformes, Vibrio, Aeromonas.

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1 1 INTRODUÇÃO

O cultivo de camarão marinho em cativeiro, vem se desenvolvendo no mundo desde a década de 70, do século passado, com produções progressivas no agronegócio internacional, envolvendo mais de 50 países.

No Brasil a atividade ganhou destaque em meados dos anos 80, particularmente no Nordeste Brasileiro, que reúne as condições propícias para o cultivo, pela extensa área costeira banhada por águas com temperatura acima de 22ºC durante todo o ano (Barbieri Junior; Ostresnky Neto, 2002).

A carcinicultura em parte do litoral nordestino, se projetou através do desenvolvimento de pesquisas, da criação de fazendas para a reprodução e o cultivo experimental de camarão particularmente, no Estado do Rio Grande do Norte. Em 1995, uma nova etapa na carcinicultura brasileira teve início, motivada pela participação e consolidação do cultivo em caráter industrial do camarão branco (Litopenaeus vannamei), oriundo do Oceano Pacífico (Barbieri Junior; Ostresnky Neto, 2002).

No entanto, o Brasil, tal como outros países produtores de camarão marinho em cativeiro, tem enfrentado, vários problemas com forte impacto econômico, resultante principalmente de enfermidades infecciosas, que contribuíram para a queda dos índices de desenvolvimento da carcinicultura (Alves; Mello, 2007).

Para minimizar os prejuízos, os carcinicultores lançaram mão como uma alternativa empírica, o processo de antibiótico profilaxia em larga escala nos sistemas de cultivo, prática que se generalizou e sem os subsídios técnico- científicos previamente analisados. Como consequências, ocorreram alterações no meio ambiente, pelo acúmulo desses fármacos nos sedimentos e

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2 obviamente, resultando como impacto sobre a microbiota a seleção de bactérias resistentes às drogas (Decamp; Moriarty, 2005).

Considerando todas as particularidades mencionadas e que o camarão consumido em Natal-RN é cultivado em viveiros, pareceu oportuno encetar uma investigação sobre vibrios e enterobactérias, potencialmente enteropatógenos para o homem, que são capazes de se colonizar nesse crustáceo e a tentativa de verificar se esses isolados são portadores de fatores de resistência antimicrobiana, tendo em vista a discreta literatura que abordou o problema, tanto nos âmbitos internacional como nacional.

Convém salientar que, o intuito de aprofundar os estudos sobre o nível de resistência antimicrobiana transmitida pelas bactérias, sua propagação através do meio ambiente até ao homem pelo consumo deste produto alimentar inadequadamente preparado, veio a se constituir em um tema investigativo. Desta forma foi apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde – PPGCSA, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, como ante-projeto para o curso de Doutorado, com o seguinte título – “Resistotipagem e transferência genética de plasmídios de resistência entre coliformes e vibrios potencialmente patogênicos para o homem isolados de camarão (Litopenaeus vannamei) comercializado em Natal-Rio Grande do Norte”. Ressalta-se que na dependência dos resultados que serão obtidos será possível ou não, avaliar a hipótese da permanência e/ou estabilidade de marcos de resistência nos isolados bacterianos, mesmo após a proibição do uso desses agentes em tais ecossistemas.

Admite-se a relevância do projeto, desde as etapas das caracterizações fenotípica e genotípica de bactérias potencialmente patogênicas para o homem

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3 pertencentes às familias Vibrionaceae e Enterobacteriaceae a partir de camarões (Litopenaeus vannamei) comercializados na cidade de Natal – Rio Grande do Norte (RN), assim como, detendo-se e aprofundando a pesquisa de plasmídios-R, fatores de resistência à antimicrobianos, nos isolados. Tal conjectura possibilitará avaliar a disseminação dos genes de resistência, que obviamente implicaria na diminuição da eficácia dos antimicrobianos no tratamento de infecções bacterianas, nas diversas fontes de infecção.

Os principais resultados obtidos estão apresentados nos documentos anexados nesta tese. “Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from pond-reared Litopenaeus vannamei marketed in Natal, Brazil” enviado para publicação em 2010 e aceito em 2011, na revista Brazilian Journal of Microbiology e “Multiresistance in strains of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) marketed in Natal, northeastern Brazil”, artigo que será submetido para publicação, em 2012, em revista especializada no tema.

(21)

4 2 OBJETIVOS

2.1 GERAIS

2.1.1 Determinar o perfil de resistência a antimicrobianos dos isolados bacterianos de amostras de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus

vannamei) comercializado na cidade de Natal/RN;

2.1.2 Verificar a transferência de material genético entre bactérias da família Enterobacteriaceae e Vibrionaceae isoladas do camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado na cidade de Natal/RN.

2.2 ESPECÍFICOS

2.2.1 Isolar e identificar fenotipicamente os coliformes do camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado na cidade de Natal/RN; 2.2.2 Caracterizar feno e genotipicamente as espécies de Vibrio potencialmente patogênicas para o homem, isoladas das coletas de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado na cidade de Natal/RN;

2.2.3 Caracterizar fenotipicamente as espécies de Aeromonas potencialmente patogênicas para o homem, isoladas das coletas de camarão fresco e refrigerado (Litopenaeus vannamei), comercializado na cidade de Natal/RN;

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5 2.2.4 Determinar o perfil de resistência dos isolados de coliformes, vibrios e aeromonas, frente aos antimicrobianos utilizados na prevenção de vibrioses no camarão (Litopenaeus vannamei);

2.2.5 Verificar o nível da resistência plasmidial aos antimicrobianos após a cura ou eliminação de plasmídios pela Acridina Orange;

2.2.6 Ensaiar através da conjugação a transferência de plasmídio de resistência nos isolados de víbrios para a Escherichia coli K12.

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6 3 JUSTIFICATIVA

Os viveiros de camarão, na maioria das vezes resultante de atividade antropogênica, constituem um ecossistema cuja biocenose com os fatores bióticos, abióticos e edáficos apresentam uma tendência, em que a manutenção do equilíbrio ambiental é relativamente instável. Todo o problema reside nas águas de cultivo, com uma microbiota constituída de uma grande variedade de micro-organismos, em particular, as bactérias que podem ser caracterizadas como autóctonas (residente normal) e alóctonas (não residente ou transiente). Aliás, até o momento, raros foram os estudos que se detiveram na análise e classificação das bactérias constituintes de cada grupo neste ecossistema. A maioria das investigações se concentrou em analisar a ocorrência de membros das famílias Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Aeromonadaceae e Pseudomonadaceae, potencialmente patogênicas para o homem e que são capazes de colonizar e infectar o camarão de viveiro. Tal hospedeiro suscetível ao fenômeno da colonização por bactérias que vivem no ambiente aquático pode se constituir em veículo de transmissão ao homem contribuindo para a emergência da infecção e/ou doença para o consumidor. Por outro lado, as mudanças ecológicas impostas pelo homem, no caso advindas para o desenvolvimento econômico pleno da carcinicultura, exemplificando-se o uso arraigado da quimioprofilaxia por antibióticos, representou ou ainda representa um fator preponderante na seleção da microbiota, tanto autóctona como alóctona, resultando na presença de microrganismos resistentes aos antimicrobianos e passíveis de propagar essa propriedade através de plasmídios contendo tais fatores de resistência.

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7 A Organização Mundial de Saúde (OMS) salienta para o problema, inclusive sugerindo a adoção de medidas de ordem tecnológica e ecológica para amenizar a questão da resistência às drogas. Como meta de natureza ecológica destaca-se as ações que devem ser instituídas para a redução do uso indiscriminado de antimicrobianos e o lançamento de tais produtos para o meio ambiente (Souza, 1998).

Diante da exposição e respaldo na afirmação de vários autores, que a maioria das espécies de Vibrio, presente neste ecossistema aquático e, consequentemente no camarão, é dotada de fatores de virulência com ação patogênica para o homem, resultando em sérios problemas, com repercussão clínica para os consumidores do crustáceo. Nesse caso, exemplificam-se:

Vibrio cholerae O1 e não O1, Vibrio alginolyticus, V. vulnificus, V.

parahaemolyticus, V. mimicus, V. metschnikovii, V. damsela (Photobacterium damsela) e V. fluvialis (Gopal et al., 2005; Costa et al., 2009).

Além disso, outros autores analisaram a susceptibilidade dos víbrios isolados do ambiente aquático a diferentes antibióticos, constatando a presença de cepas multirresistentes (Devi et al., 2009; Lagana et al., 2011).

Neste contexto, pareceu oportuno, numa primeira etapa da investigação avaliar o nível e a especificação dos víbrios isolados do camarão cultivado e comercializado no Estado do Rio Grande do Norte. Como consequência, nos isolados, as atenções se voltaram para a determinação de fatores de resistência antimicrobiana, visando fornecer os subsídios para a implementação de medidas pelos profissionais da área da saúde e saneamento básico (envolvendo os carcinicultores) do estado do Rio Grande do Norte, com intuito primordial de monitorar e minimizar a resistência microbiana.

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8 Aprofundando os estudos sobre a suscetibilidade antimicrobiana, naquelas cepas de Vibrio, que por ventura, evidenciaram níveis de resistência, as análises se concentraram na pesquisa de plasmídios portadores de fatores de resistência, a sua possível transmissibilidade para célula bacteriana receptora, assim como, a aplicação do processo de cura plasmidial.

Em síntese, a abordagem do problema procurou demonstrar a influência antropogênica exercida na carcinicultura e vários problemas correlatos, inclusive no campo da Saúde Pública.

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9 4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 Carcinicultura mundial

O segmento mais bem sucedido da aquacultura, do ponto de vista econômico, é o cultivo de camarões marinhos, apresentando nos últimos 30 anos, um expressivo aumento, no tocante à produção de cultivo. Corroborando essa observação a FAO em 2010 reportou esse expressivo aumento no período de 1978 a 2008 (Quadro 1 – ABCC, 2011).

Figura 1 - Perfil da Produção Mundial de Camarão Marinho Cultivado e Capturado de 1978 a 2008 (ABCC, 2011)

De acordo com o Quadro 1, quando se analisa a origem da produção desse setor no ano de 2008, verifica-se que o Continente Asiático, continua tendo uma representação hegemônica, especialmente no segmento da carcinicultura, com uma participação de 85,53%, comparado com 14,08% do Continente Americano e 0,39% de Outros Continentes. No continente asiático

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10 destaca-se a China, com uma produção de camarões de 1.268.074t, a Tailândia, com 507.500t e Indonésia, com 408.346t e, no continente americano, encontramos o Equador, com 150.000t, o México, com 130.201t e Brasil, com 65.000t (ABCC, 2011).

4.2 Carcinicultura brasileira

No Brasil, a carcinicultura comercial deu seus primeiros passos na década de 1970, baseando-se inicialmente em modelos importados do Equador, do Panamá e dos Estados Unidos, cujas validações e intenso aprimoramento interno, resultaram na definição de uma tecnologia adequada a realidade nacional. Assim, o país se tornou líder mundial no quesito produtividade, no ano de 2003, quando a produção atingiu a marca de 90.190t, com exportações de 58.455t e 226 milhões de dólares (ABCC, 2011). .

Entretanto, de 2004 a 2009, a carcinicultura brasileira enfrentou desafios que afetaram o seu crescimento global, havendo uma queda significativa na produção (de 90.190t para 65.000t (-22,4%), na produtividade (de 6.083kg/há/ano para 3.514kg/há/ano e nas exportações que foram reduzidas de 58.455t para 5.728t (-90,2%). Isto, naturalmente, decorreu pela falta de apoio e de incentivos compensatórios para que a atividade pudesse superar seus problemas e competir em pé de igualdade com seus concorrentes internacionais (ABCC, 2011).

Por outro lado, o problema recrudesceu ainda mais pela incidência do Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) associado a perda de competitividade das exportações, resultado da forte desvalorização do dólar (US$). A recuperação setorial teve como base o mercado interno, o qual absorveu 98%

(28)

11 da produção nacional de camarão cultivado em 2010, cujo volume produzido foi de 80.000t do crustáceo (ABCC, 2011).

Hoje, o camarão de cultivo responde por cerca de dois terços da produção total de camarões no Brasil, com destaque para os estados do Rio Grande do Norte e Ceará (ABCC, 2011).

4.3 Carcinicultura no Rio Grande do Norte

O Rio Grande do Norte é o estado brasileiro com maior potencial para o desenvolvimento da carcinicultura, isto devido ao clima, posição geográfica e estuários de portes significativos. Aqui, a prática da carcinicultura teve início em 1970, quando foi criado o Projeto Camarão, visando comprovar a viabilidade técnica e econômica do cultivo de camarões marinhos no estado, objetivando minimizar o problema do desemprego nas salinas, incentivando assim, o pequeno e médio produtor (ABCC, 2011).

Até bem pouco tempo, o Rio Grande do Norte se revezava com a Bahia na liderança da produção nacional de camarões (Wainberg, 2001). Atualmente, o Rio Grande do Norte se mantém na liderança da exportação de pescado e é o segundo maior produtor de camarão do Brasil (Diário de Natal, 2010).

Ao longo da história da carcinicultura várias espécies de camarão têm sido testadas no intuito de encontrar uma espécie ideal, para o desenvolvimento desta atividade, a qual apresente uma boa taxa de crescimento, normalidade morfológica e resistência à doenças.

Entre as espécies mais cultivadas no mundo estão o Penaeus monodon e Litopenaeus vannamei (Pillay, 1997).

(29)

12 No Rio Grande do Norte, inicialmente, as pesquisas foram feitas com espécies nativas Penaeus brasiliensis e Penaeus schmitti, como também com espécies exóticas, tais como, Penaeus monodon, Penaeus japonicus,

Litopenaeus vannamei e Penaeus stylirostris, oriundas da Ásia, Oriente e

América Central. A espécie que apresentou as melhores performances de produção foi o Litopenaeus vannamei, tendo sido adotada pela maioria dos produtores brasileiros(Molina; Lima, 2001).

4.4 O viveiro, nicho de bactérias patogênicas 4.4.1 Os coliformes

Os coliformes são bastonetes Gram-negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae e têm uma característica em comum, a fermentação da lactose com produção de ácido e gás. Pertencem a esse grupo, os gêneros

Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. São utilizados como

indicadores biológicos da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos, assim como, os diferentes componentes da carcinicultura, como a água e camarão (Bhaskar et al., 1998).

Alguns autores, verificaram que a qualidade da água utilizada na aquacultura é refletida na microbiota dos organismos cultivados (Sivakami et al., 1996). Parente et al. (2011), pesquisando a presença de bactérias entéricas em amostras de água e camarão marinho Litopenaeus vannamei oriundos de fazendas de cultivo no Ceará, verificaram que a composição bacteriológica da água foi semelhante a do camarão, com predominância da espécie Escherichia

(30)

13 É interessante salientar que os coliformes, principalmente a E. coli podem ser portadores de plasmídios de resistência aos antimicrobianos, transferíveis para outros membros da família Enterobacteriaceae, assim como, para espécies dos gêneros Vibrio e Aeromonas, que podem colonizar o camarão de viveiro.

4.4.2 O gênero Vibrio

Nos últimos trinta anos, a carcinicultura no mundo tem sido acometida de diversas doenças infecciosas, principalmente as vibrioses, uma das maiores ameaças para essa atividade. Os víbrios são microrganismos oportunistas que fazem parte da microbiota normal dos peneídeos, provocando doenças quando condições da biocenose são desfavoráveis e assim, favorecem a propagação da bactéria nos sistemas de cultivo. Se veiculados através do produto destinado ao consumo, podem provocar gastroenterites e quadros de septicemia em humanos (Aguirre-Guzmán et al., 2004).

Dentre as várias espécies pertencentes ao gênero Vibrio, autóctones de ambientes marinhos e estuarinos, V. vulnificus, V. parahaemolyticus e

V.cholerae são os principais causadores de gastroenterite e em alguns casos,

septicemia (Panicker et al., 2004) .

A espécie mais importante é V. cholerae, sorogrupo O1, responsável pela cólera, uma doença endêmica em extensas áreas do globo terrestre. V.

cholerae O1 é capaz de produzir vários fatores de virulência que contribuem

para sua patogenicidade, os quais podem ser divididos em dois grandes grupos: toxinas e fatores de colonização, embora a capacidade de causar o quadro clínico (cólera) dependa, primariamente, da expressão da Cholera

(31)

14 Toxin (CT) e do pilus Toxin Coregulated Pilus (TCP) (Campos, 2008). Salienta-se que algumas estirpes de V. cholerae não O1/não O139 albergam vários fatores de virulência, idênticos ao sorogrupo O1 (Cariri et al., 2010).

Outra espécie que deve ser destacada é V. parahaemolyticus, cujo papel na etiologia das toxinfecções alimentares vem sendo reconhecido de maneira crescente, nos últimos anos. De acordo com Hayat et al. (2006), o consumo de alimentos de origem marinha pode representar risco para saúde pública, uma vez que cepas de V. parahemolyticus toxigênicas (O3:K6) têm sido isoladas dessa fonte, inclusive no Brasil (Leal et al., 2008) e que apresentam características pandêmicas.

Por outro lado, investigações clínicas e epidemiológicas têm demonstrado que V. vulnificus quando atinge a corrente sanguínea pode causar septicemia e morte, tendo como veículos de transmissão a ingestão de alimentos marinhos contaminados ou através da contaminação de cortes na superfície cutânea após contato direto com água e/ou pescados marinhos (Almeida Filho, 2004).

Outras espécies de víbrios, incluindo V. fluvialis, V. hollisae, V.

alginolyticus, V. furnissii e V. metschnikovii, têm sido isolados de ambientes

estuarinos e associados a casos de gastroenterites. As espécies V.

cincinnatiensis, V. damsela (Photobacterium damsela) e V. carchariae apesar

de não serem consideradas agentes etiológicos de gastroenterites, em casos raros representam risco à saúde humana (Elliot et al., 1998).

Pereira et al. (2007), pesquisando víbrios patogênicos em ostras, verificaram que V. parahaemolyticus, V. carchariae, V. alginolyticus e V.

(32)

15 Costa et al.(2009) analisaram amostras de água de viveiros de cultivo do camarão marinho Litopenaeus vannamei no Estado do Ceará, Brasil e identificaram a partir de 55 isolados de Vibrio, 7 espécies, com predominância de V. cholerae nãoO1/nãoO139, V. harveyi, V. parahaemolyticus e V.

anguillarum.

4.4.3 O gênero Aeromonas

Aeromonas spp. tem uma distribuição cosmopolita e são isoladas de

ambientes aquáticos dulcícolas ou salinos, em áreas de poluição ou não. Esse ambiente constitui o habitat do micro-organismo e representa um importante veículo de transmissão para o homem seja sob a forma direta (balneabilidade) ou indireta através da ingestão de alimentos e água contaminados.

As diversas espécies do gênero Aeromonas foram consideradas oportunistas durante muito tempo, porém estudos realizados na área da Microbiologia de Alimentos permitiram descobrir a relação desses microrganismos com infecções humanas após consumo de alimentos de origem aquática, sob a forma in natura ou insuficientemente cozidos (Martins et al., 2002; Vivekanandhan et al., 2002).

As espécies mais frequentemente citadas em associação a patologia humana são: A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biotipo sobria. Algumas são consideradas patógenos em circunstâncias raras, como: A. jandaei e A.

schubertii. Outras, ocasionalmente, são isoladas de material clínico: A. sobria, A. media, A. trota e A. salmonicida. As duas últimas são adaptadas ao pescado

(33)

16 No Brasil, existem diversos relatos de isolamento de diferentes espécies de Aeromonas spp. de amostras clínicas de casos de diarréia infantil, infecção hospitalar, ou gastrenterites causadas por ingestão de alimentos como ostras, mexilhões, pescado e vegetais (Martins et al., 2002; Vivekanandhan et al., 2002; Evangelista-Barreto et al., 2006; Pereira et al., 2008). Evangelista-Barreto et al. (2010) isolaram do estuário do rio Cocó, Ceará, Brasil, 38 cepas de Aeromonas, pertencentes a sete espécies: A. caviae, A. veronii biotipo

sobria, A. veronii biotipo veronii, A. trota, A. media, A. sobria, A. hydrophila e Aeromonas spp.

De acordo com a literatura, uma das causas mais destacadas na propagação destes agentes etiológicos está relacionada com atividades antropogênicas, exemplificando-se o emprego de antibióticos, a introdução de espécies exóticas de camarão e o manejo inadequado do meio ambiente (Lightner; Redman, 1998).

4.5 O viveiro e a resistência bacteriana aos antimicrobianos

Para controlar as doenças infecciosas na aquacultura, algumas estratégias foram postas em prática, como por exemplo, o uso de drogas antimicrobianas. O uso de antimicrobianos provocou o surgimento de reservatórios de bactérias resistentes no ambiente aquático (Akinbowale, 2006).

O aparecimento dessa resistência pode resultar por mutações espontâneas e recombinações de genes, criando uma variabilidade genética sobre a qual atua a seleção natural. Para lidar com a pressão seletiva exercida, por exemplo, pelos antimicrobianos, a aquisição de elementos

(34)

17 extracromossômicos de resistência (plasmidios R) tem sido a arma mais eficaz dos micro-organismos (Molina-Aja et al., 2002).

Lagana et al. (2011), determinando a susceptibilidade antibiótica de cepas de víbrios isoladas da aquacultura italiana, verificaram um baixo valor para flumequina no teste da Concentração Inibitória Mínima (CIM – 0,97 μg mL-1), indicando assim seu forte efeito antimicrobiano. Um aspecto que merece ser considerado é que a resistência às quinolonas pode ser transmitida apenas por seleção de mutantes e não por outros mecanismos genéticos, razão pela qual deve haver um maior controle e acima de tudo, responsabilidade no uso de agentes antibacterianos na aquacultura.

Em geral, as bactérias aquáticas são capazes de transferir genes de resistência antimicrobiana para outras bactérias (Akinbowale et al., 2007). A aparente interrelação entre vários ambientes ecológicos, incluindo a aquacultura e o ambiente humano, significa que as bactérias e os genes da resistência às drogas que elas contêm podem ser trocados entre estes ambientes, implicando num risco de que genes de resistência podem ser transferidos para os seres humanos a partir do reservatório de bactérias aquáticas.

Muitos agentes antimicrobianos utilizados na aquacultura, são classificados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como importantes e rotineiros na terapêutica médica e veterinária (WHO, 2007). Assim, a utilização constante desses agentes antimicrobianos nas águas de cultivo de camarões culminou no desenvolvimento de cepas multirresistentes (MAR), existindo a possibilidade de ser propagado para bactérias potencialmente patogênicas para o homem, e com isso reduzindo a eficácia da terapêutica antibiótica nas

(35)

18 doenças humanas e animais (Decamp; Moriarty, 2005). Resistência bacteriana à eritromicina, estreptomicina, penicilina, ampicilina, amoxicilina, canamicina, tetraciclina, oxitetraciclina e cloranfenicol tem sido observada em espécies de

Vibrio isoladas do cultivo de camarão (Bhattacharya et al., 2000).

Vários autores analisaram a susceptibilidade dos víbrios do ambiente aquático a diferentes antibióticos, constatando a presença de cepas multirresistentes portadoras de fatores passíveis de se transferir aos coliformes e outras enterobactérias presentes no ambiente aquático (Srinivasan; Ramasamy, 2009; Rebouças et al., 2011).

No Brasil não existem antibióticos registrados para uso na aquacultura, portanto, os usados atualmente não são específicos para tal finalidade, pois não apresentam respaldo técnico-científicos e as indicações essenciais de posologia (dose), período de carência, informações ambientais, modo de administração, etc, para o uso eficaz e responsável do produto (Decamp; Moriarty, 2005).

(36)

19 5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Amostragem

As amostras de camarão Litopenaeus vannamei, (n=50), foram obtidas em vários pontos de comercialização: supermercados (n=21 amostras) e vendedores ambulantes (n=29 amostras), no período de agosto de 2005 a setembro de 2007, na cidade de Natal-Rio Grande do Norte - Brasil.

A procedência das amostras foi de fazendas de cultivo de camarão marinho, situadas no interior do Estado do Rio Grande do Norte, nos municípios de Macau, Canguaretama, Grossos, Nísia Floresta, São Gonçalo do Amarante e Arês.

Figura 2 - Municípios do Rio Grande do Norte - procedência das amostras de camarão Litopenaeus vannamei

(37)

20 5.2 Coleta das amostras

5.2.1 Camarões frescos

O camarão fresco e refrigerado (200g) para exame bacteriológico foi identificado e acondicionado em recipiente de isolamento térmico, e transportado a uma temperatura em torno de 10ºC ao Laboratório de Microbiologia dos Alimentos da Universidade Potiguar – UnP, onde as análises bacteriológicas foram realizadas, respeitando o prazo máximo de duas horas após a coleta.

5.3 Processamento laboratorial

5.3.1 Isolamento e caracterização fenotípica dos coliformes

Amostras de 200g de camarão fresco e refrigerado foram maceradas em um gral estéril e frações de 25g foram adicionadas em 225mL de caldo lactosado. A incubação foi feita a 35°C por 24 horas.

Após a incubação, foi semeada uma alçada de crescimento do caldo lactosado, para placas contendo Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB- Difco) e incubadas a 35°C por 24 horas.

Três a cinco colônias sugestivas de bactérias fermentadoras da lactose no Agar EAM foram semeadas em Ágar Soja Triptona (TSA– Difco) inclinado pela técnica de estrias sinuosas e incubadas a 35°C por 24h. Em sequência, foi feito o teste de citocromo oxidase de cada cultura e aquelas oxidase negativas foram identificadas fenotipicamente de acordo com Koneman et al. (2008) e cujos resultados foram lançados na Tabela 1 (Apêndice A). As provas bioquímicas utilizadas foram: produção de indol, vermelho de metila e Voges-Proskauer, citrato de Simmons, sulfeto de hidrogênio (TSI), hidrólise da uréia,

(38)

21 fenilalaninadesaminase, lisina descarboxilase, arginina dehidrolase, ornitina descarboxilase, motilidade, fermentação da lactose, sacarose, d-manitol, dulcitol, salicina, maltose, produção de gás a partir da fermentação da glicose e redução do nitrato a nitrito.

5.3.2 Isolamento e caracterização feno e genotípica dos vibrios Para o enriquecimento primário, amostras de 200g de camarão foram maceradas em um gral estéril e frações de 25g foram adicionadas em frascos erlenmeyer com 225mL de água peptonada alcalina (APA) estéril, com 1,0% de NaCl, pH 8.6 e incubados a 35ºC por 24 horas . Após esse enriquecimento primário, foi retirada uma alçada e semeada em Agar Sacarose Tiossulfato Citrato Sais Biliares (TCBS - Difco), pela técnica das estrias múltiplas e as placas incubadas a 35°C por 24 horas. Três a cinco colônias sacarose positivas (amarelas) e negativas (verde-azuladas) crescidas no meio de TCBS foram transferidas para meios de triagem Agar Ferro Kligler (AFK) e Agar Ferro Lisina (AFL) e posteriormente, para TSA inclinado, contendo 1,0% de NaCl, todos incubados a 35°C por 24 horas. Em seguida, foi realizado o teste de citocromo-oxidase para seleção das cepas positivas e, posteriormente, identificadas pelo perfil fenotípico segundo esquema proposto por Kaysner e DePaola (2004) , utilizando as seguintes provas bioquímicas: lisina e ornitina descarboxilase, arginina dehidrolase, crescimento em NaCl nas concentrações de 0%, 3%, 6%, 8% e 10%, crescimento a 42ºC, produção de ácidos a partir de sacarose, D-celobiose, lactose, arabinose, D-manose, D-manitol, ONPG e Voges Proskauer, sensibilidade aos vibriocidas O/129-10µg, O/129-150 µg, gelatinase e urease.

(39)

22 5.3.2.1 Teste de Kanagawa (Vibrio parahaemolyticus)

Os crescimentos de 24h a 35ºC em água peptonada alcalina das colônias puras de V. parahaemolyticus foram semeados de forma circular (± 1cm de diâmetro) no Ágar Wagatsuma contendo hemácias humanas na concentração de 2%. Após a incubação a 35ºC por 24h, verificou-se a presença ou ausência de um halo de hemólise total, indicativo da atuação de uma Hemolisina Termoestável Direta (HTD). Como controle positivo foi usada uma cepa de V. parahaemolyticus Kanagawa positiva (K+) isolada de um surto de gastroenterite em Cascável, Ceará (Hofer, 1983).

5.3.2.2 Detecção das Hemolisinas

A detecção dos genes tdh e trh, responsáveis pela ação hemolítica e envolvidos na ação patogênica, e complementadas com a verificação do gene da hemolisina termolábil (tl), específico para V. parahaemolyticus foi realizada através da técnica de PCR-Multiplex. Foram executadas as seguintes etapas: a) Extração do DNA;

b) Iniciadores;

c) Amplificação PCR-Multiplex. a) Extração do DNA

Para a extração do DNA genômico foi empregado um Kit comercial de extração (DNeasy Blood & Tissue Kit – Qiagen) seguindo as recomendações preconizadas pelo fabricante.

(40)

23 b) Iniciadores

As sequências nucleotídicas e o tamanho dos amplicons dos iniciadores específicos para os genes tl,tdh e trh estão dispostos na Tabela 1 (Anexação de artigos, p. 44, Table 1).

c) Amplificação por PCR-Multiplex

A reação de amplificação para uso simultâneo dos três iniciadores foi preparada em microtubos de 200µl para um volume final da reação de 25µl, contendo:

 2,5µl do tampão da reação (KCl – 50mM, MgCl2 – 1,5mM, Tris-HCl - 10mM, pH-9,0 – Amersham Pharmacia Biotech USA);

 2,0µl da mistura de dNTPs (200µM de cada desoxinucleotídeo trifosfato – dATP, dCTP, dGTP, dTTP - Amersham Pharmacia Biotech USA);

 0,5µl de cada iniciador (10 pmol);

 0,25µl da enzima Taq DNA polimerase (1U – Amersham Pharmacia Biotech USA);

 16,75µl de água deionizada esterilizada;

 0,5µl do DNA genômico.

A amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada em termociclador (Px2 – Thermo Electron Corporation) programado para efetuar 30 ciclos, começando com a desnaturação do molde de DNA por 1 minuto a 94ºC, o anelamento dos iniciadores na região alvo do molde por1 minuto a 58ºC e o alongamento da fita por 1 minuto a 72ºC. Uma etapa inicial de aquecimento da reação a 94ºC por 3 minutos e uma final de 72ºC durante 5 minutos,

(41)

24 asseguraram a completa desnaturação do molde e a extensão final da nova fita, respectivamente.

Ao final das amplificações, o produto obtido foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TBE 0,5X, durante aproximadamente 1 hora. Um padrão de peso molecular (Amersham Pharmacia Biotech, USA) foi incluído em cada gel.

Após a migração, os produtos foram corados por imersão do gel em solução de brometo de etídio (10mg/mL) e analisados, sob luz ultravioleta, em equipamento analisador de imagens (Image Quant 300 – GE).

5.3.3 Isolamento e caracterização fenotípica das aeromonas

Para o enriquecimento primário, amostras de 200g de camarão foram maceradas em um gral estéril e frações de 25g foram adicionadas em frascos erlenmeyer com 225mL de água peptonada alcalina (APA) estéril, com 1,0% de NaCl, pH 8.6 e incubados a 35ºC por 24 horas . Após esse enriquecimento primário, foi retirada uma alçada e semeada em Agar Sacarose Tiossulfato Citrato Sais Biliares (TCBS - Difco), pela técnica das estrias múltiplas e as placas incubadas a 35°C por 24 horas). Três a cinco colônias sacarose positivas (amarelas) crescidas no meio de TCBS foram transferidas para meios de triagem Agar Ferro Kligler (AFK) e Agar Ferro Lisina (AFL) e posteriormente, para TSA inclinado, contendo 1,0% de NaCl, todos incubados a 35°C por 24 horas. Em seguida, foi realizada a caracterização bioquímica, com base nos testes de citocromo-oxidase, resistência ao agente vibriostático O129 (2,4 diamino, 6,7 diisopropilpteridine), produção de orto-nitrofenil-beta-D galactosidase (ONPG), produção de acetoína (VP) em meio Clark-Lubs,

(42)

25 fermentação da glicose, sacarose, arabinose e manose e utilização de aminoácidos (lisina e ornitina descarboxilase e arginina dehidrolase) a fim de obter a identificação conclusiva das cepas isoladas (Hofer, 1975).

5.3.4 Resistotipagem

5.3.4.1 Susceptibilidade Antimicrobiana

Foi efetuada através da técnica dos discos impregnados de antimicrobianos e depositados na superfície de Ágar Mueller-Hinton (Bauer et al., 1966), adotando a orientação descrita pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003) . A incubação foi feita a 35ºC por 24h e após esse tempo os halos de inibição foram medidos com paquímetro.Como controle foi utilizada uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922. Os discos de antibióticos empregados (LABORCLIN) foram: ácido nalidíxico (NAL-30µg), amicacina (AMK-30µg), ampicilina (AMP-10µg), gentamicina (GEN-10µg), ciprofloxacina (CIP-5µg), cloranfenicol (CHO-30µg), nitrofurantoína (NIT-300µg), tetraciclina (TCY-30µg), sulfazotrim (SFT- 25µg).

a) Cálculo do Índice de multiresistência a antimicrobianos (MAR) O cálculo do MAR foi determinado através da relação a/b, em que “a” é o número de antimicrobianos aos quais o isolado foi resistente e “b” o número de antimicrobianos aos quais o isolado foi exposto. O índice MAR acima de 0,2 caracteriza multirresistência (Krumperman, 1983).

(43)

26 5.3.5 Cura dos Plasmídios

As cepas de Vibrio e Aeromonas que apresentaram multirresistência e/ou resistência intermediária foram semeadas em tubos de TSA inclinado, suplementado com 1,0% de NaCl e incubados a 35ºC por 24h. Após a incubação, inóculo de cada crescimento foi semeado em tubos de hemólise com 1mL de Caldo Luria Bertani (LB) acrescido de 1,0% de NaCl e 50mg/mL de Acridine Orange (Sigma, nº A-6014). A incubação foi feita a 35ºC por 24h (Molina-Aja et al., 2002).

Após o tratamento cada cepa foi semeada em TSA inclinado acrescido de 1,0% de NaCl e incubado a 35ºC por 24h, para, posteriormente, ser repetido o teste de susceptibilidade antimicrobiana, com o intuito de verificar aquelas que mantiveram ou perderam os marcos de resistência.

5.3.6 Processo de recombinação genética

a) Experimentos de conjugação (Dias; Hofer, 1985)

Foram utilizadas, como possíveis doadoras de marco de resistência nos experimentos de conjugação, cepas de Vibrio submetidas ao processo de cura e que apresentaram monoresistência, multirresistência ou resistência intermediária, à ampicilina (AMP), amicacina (AMK), tetraciclina (TCY), ciprofloxacina (CIP) e nitrofurantoína (NIT), conforme resultados determinados através do método da difusão em disco.

Foi utilizada como receptora, a linhagem padrão de Escherichia coli K-12C600 (F-/lac+/NALr), cedida gentilmente pelo Prof. Dr. Ernesto Hofer (FIOCRUZ), que apresenta um marco cromossômico de resistência ao ácido nalidíxico.

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27 A partir de um crescimento exponencial, isto é, com uma concentração de 108 células, procedeu-se à mistura das culturas-testes com a receptora na proporção de 1:10, incubando-se em banho-maria a 35ºC durante 3 e 24h. Após as incubações, 0,1mL das misturas foi transferida para placas contendo uma modificação do meio de Mueller-Hinton com 2g% de lactose e 0,008g% de azul de bromotimol. Para contra-selecionar o crescimento da amostra doadora, acrescentou-se NAL, em concentração de 30µg/mL de acordo com a natureza da cultura padrão. Nesta etapa procurou-se analisar, além do perfil de resistência, a fermentação de lactose como outro marcador para detecção de transconjugantes.

Após 24-48h a 35ºC, foram selecionadas cinco a dez colônias transconjugantes para confirmação da resistência através do método da difusão em disco.

(45)

28 6 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS

6.1 ARTIGO 1

Manuscrito aceito pela revista Brazilian Journal of Microbiology (ISSN:1517-8382), sob o nº BJM 1640, de acordo com o documento em anexo.

 Qualis CAPES B2 em Medicina II.

 Fator de Impacto: .0,1644

Título do Manuscrito: Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from pond-reared shrimps Litopenaeus vannamei marketed in Natal, Brazil.

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29 ATT01016.pdf (202.4 Kb) attached

--- Original Message ---

From: "BJM" bjm@sbmicrobiologia.org.br

To: "'Regine HSF Vieira'" reginevieira@terra.com.br Cc: ernesto.hofer@yahoo.com.br

Sent: Ter 13/12/11 09:47

Subject: Fwd: ENC: ENC: sobre a publicação do trabalho código 1640 ATT01016.pdf (202.4 Kb) attached

Pedimos a gentileza de confirmar o recebimento. Prezado (a) Dr (a). Regine HSF Vieira,

Segue abaixo o parecer da Dra. Bernadette.

Aproveito a oportunidade para solicitar o arquivo aprovado em WORD para que possamos agilizar o processo de publicação.

Section Editor 2011-12-04 06:14 PM

Subject: [BJM] Editor Decision Regine HSF Vieira:

We have reached a decision regarding your submission to

Brazilian Journal of Microbiology, "Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from pond-reared Litopenaeus vannamei marketed in Natal, Brazil".

Our decision is to: accept the paper adn publish it the next issue of BJM.

Prof. Dr. Bernadette D.G.M. Franco Associate editor

Brazilian Journal of Microbiology Atenciosamente,

Tífani Luri

Secretária do BJM

BJM - Brazilian Journal of Microbiology ICB III - SBM - Dep. de Microbiologia Av. Prof. Lineu Prestes, 2415

(47)

30 05508-900 São Paulo, SP - Brasil

Tel: (+5511) 3813-9647/3037-7095 Ramal USP 7979

E-mail: bjm@sbmicrobiologia.org.br

Site: http://submission.scielo.br/index.php/index/login

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38 6.2 Artigo 2

 Manuscrito que será submetido à publicação em revista especializada no assunto.

Título do Manuscrito: Multiresistance in strains of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) marketed in Natal, Northeastern Brazil.

(56)

39 Multiresistance in strains of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) marketed in Natal, Northeastern Brazil

L. M. R. Melo1, D. Almeida2, E. Hofer3, O. V. Sousa4, R. M. C. D. B. Godeiro1, E. M. R. Carvalho4 and R. H. S. F. Vieira4

1 - Universidade Potiguar (UnP), Natal, RN, Brazil.

2 - Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil. 3 - Fundação Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) , Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 4 - Universidade Federal do Ceará – Instituto de Ciências do Mar, Fortaleza, CE, Brazil.

Corresponding author:

Ligia Maria Rodrigues de Melo, Av. Afonso Pena 632, Tirol, Natal, RN, Brazil. CEP 59020-100.

E-mail: melolg@digi.com.br

Abstract

Aims: To evaluate the microbial susceptibility of vibrios and aeromonas isolated from shrimp (Litopenaeus vannamei) marketed in Natal (Northeastern Brazil). Methods and results: The shrimp samples yielded 91 Vibrio strains and 11 Aeromonas strains. Susceptibility was tested for 9 drugs: 57.8% of the strains

were resistant to ampicillin, 29.4% to amikacin and 21.6% to tetracycline. Multiresistance was observed for 38.2% of the isolates. The MAR index ranged between 0.28 and 0.42, indicating these strains pose a risk of transference and diffusion of resistance factors along the food chain. When submitted to plasmid curing with acridine orange, 20 of 24 randomly selected resistant or intermediately resistant strains lost resistance completely (n=13; >50%) or partially (n=7).

(57)

40 Conclusion: Farmed marine shrimp marketed in Natal were contaminated with species of vibrios and aeromonas resistant to multiple antibiotics of common use in humans and livestock. Significance and impact of the study: The transference through the food chain of bacteria resistant to antibiotics employed in human therapy is a serious concern to public health. The study evidences the risk of transference of bacterial resistance markers to humans through the consumption of aquaculture products.

(58)

41 Introduction

The Brazilian shrimp farming industry has grown dramatically over the past 25 years, making Brazil one of the largest producers and exporters in the world, mainly due to the favorable ecological conditions found in the Northeastern part of the country (ABCC, 2004).

However, the rapid expansion of the sector has raised concerns about the introduction and propagation of exogenous viral, bacterial and/or fungal diseases (Alves and Mello 2007). Many farmers therefore regularly submit their livestock to chemoprophylaxis with antibacterial agents of different spectra of activity (Roque et al., 2001).

Nevertheless, in Brazil prophylaxis with antibiotics is prohibited in aquaculture (ABCC, 2004) due to the risk of development of resistant microorganisms in the environment. The propagation of pathogens to the environment favors the transference of resistance markers to bacteria potentially pathogenic to man and other animals (Decamp; Moriarty, 2005).

In this study, samples of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) farmed and marketed in Rio Grande do Norte (Northeastern Brazil) were evaluated for the presence of Vibrio and Aeromonas strains. The isolated strains were subsequently submitted to antibiogram testing.

Materials and methods Samples

Between August 2005 and September 2007, 50 samples of L. vannamei were obtained from supermarkets (n=21) and street peddlers (n=29) in Natal,

(59)

42 capital of the state of Rio Grande do Norte (Northeastern Brazil). The shrimp was produced on farms outside Natal and in the hinterland.

Sample collection

Fresh cooled shrimp samples (200g) were purchased and accommodated in labeled isothermal boxes at 10ºC, then transported to the Food Microbiology Laboratory at Universidade Potiguar for microbiological analysis within two hours of sampling.

Isolation and phenotypical characterization of vibrio strains

After grinding the samples (200g) in a sterilized mortar, 25g aliquots were added to 225 mL sterile alkaline peptone water containing 1.0% NaCl (pH 8.6) and incubated at 35ºC for 24 hours. After the initial enrichment, a loopful of inoculum was streaked on TCBS agar and incubated at 35°C for 24 hours (Kaysner; DePaola, 2004).

Three to five sucrose-positive and negative colonies were transferred to the differential media Kligler iron agar (KIA) and Lysine Iron Agar (LIA), then to inclined tubes with Trypticase Soy Agar (TSA) containing 1.0% NaCl, followed by incubation at 35°C for 24 hours. Finally, positive strains were selected with the cytochrome-oxidase test, followed by phenotyping (Kaysner; DePaola, 2004).

Antimicrobial susceptibility

The strains were submitted to antibiogram testing using soaked disks on Muller-Hinton agar (Bauer et al., 1966), as recommended by the Clinical and

(60)

43 Laboratory Standards Institute (CLSI, 2003). After 24 hours of incubation at 35ºC, the inhibition halos were measured with a caliper. A strain of Escherichia

coli ATCC 25922 was used as control. The disks (Laborclin) were soaked with

nalidixic acid (NAL/30µg), amikacin (AMK/30µg), ampicillin (AMP/10µg), gentamicin (GEN/10µg), ciprofloxacin (CIP/5µg), chloramphenicol (CHL/30µg), nitrofurantoin (NIT/300µg), tetracycline (TCY/30µg) and sulfametoxazol-trimetoprim (SFT/25µg).

Multiple antibiotic resistance (MAR) index

The MAR index was calculated as the ratio between the number of antibiotics to which the strain was resistant and the number of antibiotics to which the strain was exposed. A MAR index above 0.2 indicates multiresistance (Krumperman, 1983).

Plasmid curing

Multiresistant strains were seeded in inclined tubes with TSA supplemented with 1.0% NaCl and incubated at 35ºC for 24 hours. Subsequently, a loopful of each inoculum was seeded in test tubes with 1 mL Luria-Bertani broth containing 1.0% NaCl and 50 mg/mL acridine orange dye (Sigma #A-6014) and incubated for 24 hours at 35ºC (Molina-Aja et al., 2002).

Next, each strain was seeded in inclined TSA containing 1.0% NaCl and incubated at 35ºC for 24 hours. The antibiogram test was then repeated to quantify the loss of resistance markers.

(61)

44 Results

The 50 shrimp samples analyzed yielded 102 strains, of which 91 (89.2%) were vibrios and 11 (10.8%) were aeromonas. Vibrio cholerae (24.52%) was predominant among the former (although no strain of V. cholerae O1 or O/139 was identified) followed by V. alginolyticus (18.63%), V. carcharie (15.69%) and Kanagawa-negative V. parahaemolyticus (9.80%). The isolated

Aeromonas strains belonged to five species: A. veronii biogroup sobria, A. jandaei, A. schubertii, A. veronii biogroup veronii and A. hydrophila (Table 1).

Table 1- Species of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) farmed and marketed in Rio Grande do Norte, Brazil.

Strains Strains (n) Percentage%

Vibrio cholerae não O1/não O139 25 24.52

Vibrio alginolyticus 19 18.63 Vibrio carcharie 16 15.69 Vibrio parahaemolyticus 10 9.80 Vibrio spp 10 9.80 Aeromonas spp 4 3.92 Vibrio mimicus 4 3.92 Aeromonas jandaei 2 1.96

Aeromonas veronii biogrupo sóbria 2 1.96

Vibrio fischeri 2 1.96

Vibrio harveyi 2 1.96

Aeromonas hydrophila 1 0.98

Aeromonas schubertii 1 0.98

Aeromonas veronii biogrupo veronii 1 0.98

Vibrio cincinnatiensis 1 0.98

Vibrio damsela (Photobacterium

damsela) 1 0.98

Vibrio vulnificus 1 0.98

(62)

45 Three of the ten Vibrio species identified are potentially pathogenic to man and important to public health: V. cholerae non-O1/non-O139, V.

parahaemolyticus and V. vulnificus. Likewise, three of the Aeromonas species

have been implicated in food-borne illnesses: A. veronii biogroup sobria, A.

veronii biogroup veronii and A. hydrophila.

The antibiogram revealed that 11/102 strains (V. cholerae non-O1/non-O139 n=9; Aeromonas jandaei n=2) were sensitive to all the antibiotics tested and that 99% of the isolates were sensitive to NAL and GEN (Figure 1). Monoresistant strains are shown in Table 2 and Figure 1. Only two strains were monoresistant to TCY and one was monoresistant to SFT. The least effective antibiotic was AMP (57.8% resistance), followed by AMK (29.4%) and TCY (21.6%) (Figure 1). The greatest frequency of intermediate resistance was observed for AMK (41.2%), followed by CIP (25.5%) and AMP (20.6%).

(63)

46 Figure 1- Susceptibility to antibiotics (susceptible, intermediately resistant and resistant) of strains of Vibrio and Aeromonas isolated from marine shrimp (Litopenaeus vannamei) farmed and marketed in Rio Grande do Norte, Brazil.

AMK – amikacin; AMP - ampicillin; CHL - chloramphenicol; CIP - ciprofloxacin; GEN - gentamicin; NIT - nitrofurantoin; SXT – sulfametoxazol-trimetoprim; TCY - tetracycline; NAL – nalidixic acid.

(64)

47 Table 2- Frequency of monoresistance in species of Vibrio and Aeromonas isolated from shrimp (Litopenaeus vannamei) farmed and marketed in Rio Grande do Norte, Brazil.

Antibiotic Species Resistant

strains (n)

AMK

Vibrio cholerae não O1/não O139(2) 6 Vibrio parahaemolyticus(1) Vibrio fisheri(2) Aeromonas schubertii (1) AMP

Vibrio cholerae não O1/não O139(1) 24 Vibrio carcharie (9) Vibrio alginolyticus (8) Vibrio parahaemolyticus (4) Vibrio harveyi (1) Vibrio spp (1)

SXT Vibrio cholerae não O1/não

O139(1) 1

TCY Aeromonas spp(2) 2

* (33) Number isolates.

Multiresistance was observed for 39 strains distributed over 10 different profiles (Table 3). One strain of V. carcharie (isolated from shrimp purchased at a supermarket) was resistant to five antibiotics (AMP, CHL, NIT, SFT and TCY). The resistance profiles “AMK/AMP”, “AMP/TCY” and “AMK/AMP/TCY” were observed for 28 isolates belonging to the species V. alginolyticus, V. carcharie,

V. cholerae non-O1/non-O139, V. parahaemolyticus, Vibrio spp., V. harveyi, V. cincinnatiensis, A. veronii biogroup sobria, A. veronii biogroup veronii, A. hidrophyla and Aeromonas spp. (Table 3).

Referências

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