BIOPROSPECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS COM POTENCIAL ANTICÂNCER EM PLANTAS DO SEMI-ÁRIDO NORDESTINO.

(1)

BIOPROSPECÇÃO DE

SUBSTÂNCIAS COM POTENCIAL

ANTICÂNCER EM PLANTAS DO

SEMI-ÁRIDO NORDESTINO.

Profa. Leticia Veras Costa-Lotufo

lvcosta@secrel.com.br

Laboratório de Oncologia Experimental – LOE

Departamento de Fisiologia e Farmacologia

(2)

(3)

Mitoses freqüentes

Células anormais e

heterogêneas

Neovascularização

9 Proliferação descontrolada

9 Síntese anormal de DNA

9 Síntese de proteínas alteradas

9 Perda de inibição por contato

9 Desdiferenciação e perda da

função

9 Comprometimento do mecanismo

intrínseco de apoptose

9 Neovascularização

9 Poder de invasão e metástase

Núcleo

aumentado

CÂNCER

(4)

(5)

ESTRATÉGIAS PARA O

TRATAMENTO DO CÂNCER

¾

Cirurgia

¾

Radioterapia

¾

Quimioterapia

¾

Imunoterapia (Vacinas)

¾

Hormonoterapia

¾

Bioterapia

¾

Inibidores da Angiogênese

¾

Anticorpos Monoclonais

(6)

Carcinogênese e quimioterapia

antineoplásica:

Invasão dos Vasos

Célula

Transformada

Células

neoplásicas

Tumor

Neovascularização

E-caderinas

Embolização

Adesão ao

Endotélio

Extravasament

Carcinógeno

1

1. Quimioprotetores

2. Antitumorais

3. Antiangiogênicos

4. Indutores de Rediferenciação

5. Antimetastáticos

6. Inibidores Mol. Adesão

2

3

4

5

6

(7)

S

í

ntese

Prospec

ç

ão

Modelagem Molecular

(8)

POR QUE ESTUDAR PLANTAS COMO

(9)

(10)

PRODUTOS NATURAIS

• Diversidade estrutural

• Presença de oxigênio

• Centros quirais

C H₃ C H₃ OH CH₃ O OR₂ O CH3 O H AcO O O O O OH NH O O O O H O H O O O O O O H₃CO OCH₃ OH H C H₃

Taxol

Etoposido

(11)

POR QUE PESQUISAR DE NOVAS

DROGAS ANTICÂNCER?

¾

Segunda causa de morte:

_{Segunda causa de morte:}

em 2006 teremos mais de

470.000

470.000 novos casos e

novos casos e

200.000

200.000 ó

ó

bitos.

¾

Cura

_Cura

em apenas

30%

dos tumores diagnosticados.

¾

Resistência

_Resistência

das c

é

lulas tumorais aos quimioter

á

picos

anticâncer.

¾

Elevada

_Elevada

toxicidade

das drogas atualmente usadas na

terapêutica.

¾

Inespecificidade

pelas c

é

lulas tumorais.

¾

(12)

HITS

(Munro et al., 1999)

Probabilidade de encontrar um espécie ativa:

(13)

Amazon rain forest Atlantic forest Araucaria forest Cerrado (Scrub) Caatinga (Semi-arid) Fields Pantanal (Swamp) Dunes and Mangrove

(14)

(15)

(16)

Caatinga:

• “Floresta branca” ou “floresta

aberta”

• 900.000km

2 _{- 70% da região}

nordeste

• Região biogeográfica com alto

grau de endemismo

• Por exemplo: Auxemma

(Boraginaceae), Apterokarpos

(Anacardiaceae), Neoglaziovia

(Bromeliaceae), e Fraunhofera

(Celastraceae)

(17)

Centro de Pesquisa e

Desenvolvimento de

Medicamentos da

UFC

UNESP

USP-SC

UFAL

INPA

_UFBA

UF

PA

U

F

M

S

UF

RJ

U

F

PE

U

F

R

G

S

U

SP

-R

P

U

E

L

Q-U

FC

UV

_A

NC

I

IC

M

Novas

colaborações

(18)

FLUXOGRAMA DE DESENVOLVIMENTO

Coleta e identificação de

material

Coleta e identificação de

material

Citotoxicidade

em 4 linhagens

tumorais (MTT)

Citotoxicidade

em 4 linhagens

tumorais (MTT)

Estudo do mecanismo

de atividade citotóxica

Estudo do mecanismo

de atividade citotóxica

Inibição do

desenvolvimento de

ovos do ouriço do mar

Inibição do

desenvolvimento de

ovos do ouriço do mar

Fracionamento

biomonitorado das

amostras (MTT)

Fracionamento

biomonitorado das

amostras (MTT)

Toxicidade em

Artemia salina

Toxicidade em

Artemia salina

Identificação dos

compostos ativos

Identificação dos

compostos ativos

Atividade

hemolítica

Atividade

hemolítica

Proliferacão celular

(MTT)

Proliferacão celular

(MTT)

_{Indução de apoptose}

(anexina-V e BE/AO)

Indução de apoptose

(anexina-V e BE/AO)

Análise morfológica

(coloração por H/E)

Análise morfológica

(coloração por H/E)

Duplicação celular

(incorporação de BrdU)

Duplicação celular

(incorporação de BrdU)

Viabilidade celular

(exclusão por azul de tripan)

Viabilidade celular

(exclusão por azul de tripan)

Cinética celular

(curva de crescimento)

Cinética celular

(curva de crescimento)

Estudos in vivo

Sarcoma 180

Estudos in vivo

Sarcoma 180

(19)

ALGUNS

(20)

Auxemma oncocalyx

• Nome popular: Pau-branco

• Uso Popular: anti-séptico e

cicatrizante

• Alantoína

• Estudos químicos:

terpenóides quinonas e

hidroquinonas com

esqueleto C

₁₆

(21)

SUBSTÂNCIAS ESTUDADAS

O

OH

CH

₃

O

OH

1 4 5 8 8a 4a 9 10 11 12 10a 9a 2 3 6 7

O

CH

3

O

CH

3

O

CH

₃

O

OH

Cl

OH

O

CH

₃

O

OAc

CH

2

OAc

O

CH

₃

O

OH

CH

₂

OAc

Oncocalixona A

_{Oncocalixona C}

8,11-O-diacetiloncocalixona A

6-cloro-oncocalixona A

_{11-O-acetiloncocalixona A}

(22)

(23)

A. Oncocalyx - Atividade citotóxica

Pessoa et al. 2000, Leyva et al., 2000, Pessoa et al., 2004.

Tabela 1. Atividade citot—xica da oncocalixona A e seus derivados.

Compostos

CI

50 * ( g/mL)

CEM

SW1573

Oncocalixona A (1) 1.4

+ 0.5

4.9 + 1.5

6-Cloro-oncocalixona A (2) 3.3

+ 0.7 **

4.7 + 0.1

8-O-Acetil-oncocalixona A (3) 2.0

+ 0.2

3.3 + 0.4

8,11-O-Diacetil-oncocalixona A (4) 3.5

+ 1.3 **

5.2 + 0.2

(24)

(25)

Amburana cearensis

COOH OH OH 1 O O OH O H OH OH 2 O O OH O H OCH3 OH 3 O O H O H O O O H OH H H H H OH O H OH 4

1 - Ácido protecatecuico 2 - Kampferol

3 - Isokampferídeo 4 - Amburosídeo

(26)

(27)

Platymiscium floribundum

PTEROCARPANOS

O

R

1

R

₂

O

R

3

R

4

OCH

3

H

R

1

R

2

R

3

R

4

1 H H H

OH

2 H

CH

3

H H

3 H

CH

3

OCH

3

H

4 OH H H H

5 H H H H

Militão et al., 2005. Planta Med. 71: 683-685.

Falcão et al., 2005. J. Nat. Prod. 68: 423-426.

Militão et al., 2006. Life Sciences 78: 2409-2417.

(28)

Pterocarpanos

Relação estrutura-atividade citotóxica

A

B

C

D

Substances 1

st

cleavage

log (M)

3

rd

cleavage

log (M)

Blastulae

log (M)

n

1 -5.01

± 0.07

d

-5.14

± 0.09

e

-5.12

± 0.05

d

6

2 -6.34

± 0.06

c

-6.83

±0.06

c

-6.85

± 0.02

b

3

3 -8.10

± 0.02

a

-7.91

± 0.01

a

-7.97

± 0.02

a

4

4 -4.74

± 0.09

d

-5.09

± 0.02

e

-5.28

± 0.22

d

6

5 -6.95

±0.03

b

-7.24

± 0.04

b

-6.92

± 0.02

b

4 Doxorubicin

-4.95 ± 0.04

d

-6.17

± 0.71

d

-6.12

± 0.11

c

4 Etoposide

-4,94 ± 0.11

d

-

6.28 ± 0.14

d

-6.01

± 0.13

c

4

(29)

Esses

dados ressaltam

a importância

da

metoxila no carbono 2 dos pterocarpanos para a

atividade antimitótica

(30)

Atividade antiproliferativa em células

tumorais e células normais in vitro

CI

₅₀

-

μg/mL (μM)

CI 95% -

μg/mL

Composto

HL-60

HCT-8

MDA-MB-435

MCF-7

MX-1

SF295

PC-3

L929

2,3,9trimetoxipterocarpano

0,09 (0,3)

0,07-0,12

0,7 (2,3)

0,3-1,6

0,2 (0,6)

0,08 – 0,7

0,7 (2,3)

0,4-1,4

1,3 (4,1)

0,7-2,3

0,5 (1,6)

0,2-1,4

1,3(4,1)

0,7-2,3

> 25

Doxorrubicina

0,02 (0,03)

0,01-0,02

0,04 (0,07)

0,03 - 0,05

0,47 (0,81)

0,34 - 0,65

0,20 (0,34)

0,17 - 0,24

0,076(0,13)

0,054-0,10

0,16(0,27)

0,13-0,23

0,45 (0,77)

0,38-0,68

n.d.

(31)

Importância da metoxila em C-2

O

H

₃

CO

H

₃

CO

OCH

₃

O

OCH

₃

H

₃

CO

H

₃

CO

O

OCH

₃

H

₃

CO

OCH

₃

CI

₅₀

= 0,09 -1,30 µg/mL

CI

₅₀

> 25 µg/mL

CI

50 > 25 µg/mL

(32)

Avaliação da atividade antiproliferativa

em células mononucleadas do sangue

periférico

Atividade do composto 2,3,9-trimetoxipterocarpano e da doxorrubicina em células

mononucleadas do sangue periférico

0

25

50

75 Controle

Doxorrubicina 10μg/mL

Pterocarpano 10μg/mL

24 h

48 h

72 h

*

N

ú

m

e

ro

d

e

cé

lu

las

(1

0

4 cel

/m

L

)

(33)

CICLO CELULAR:

M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2

Controle

DMSO

2,3,9-trimetoxipterocarpano

5μg/mL

2,3,9-trimetoxipterocarpano

2,5μg/mL

Militão et al., 2006. Life Sciences 78:

2409-2417.

(34)

Estudo do mecanismo de

ação

2, trimetoxipterocarpano e

3,9-dimetoxipterocarpano

3,4-dihidroxi-9-metoxipterocarpano

e

3-hidroxi-9-metoxipterocarpano

Necrose

Parada no ciclo celular em G2/M e morte por apoptose

HL-60

(35)

Imunofluorescência para citoesqueleto

24h

Adição

das drogas

24h

PBS

Fixadas e

Permeabilizadas

α-tubulina 24h

Ac-Cy5 3h

Faloidina-FICT

RNAse

PI

Zeiss LSM 510

(36)

Imunofluorescência para citoesqueleto

A

B

C

D

E

F

3-hidroxi-9-metoxipteroc

3,4-dihidroxi-9-metoxiptero

3,10-dihidroxi-9-metoxiptero

(37)

Imunofluorescência para citoesqueleto

MCF-7

T47 D

_HS58T

_BRL3A

Controle

actina,

tub

u

lina e n

ú

cleo

Tratad

o

actina,

tub

u

lina e n

ú

cleo

Tratad

o

(mito

se) tu

bulina

(38)

Imunofluorescência para citoesqueleto

Imagens da rede de microtúbulos (tubulina)

MCF-7

T47D

_HS58T

_BRL3A

Co

n

tr

o

le

tu

bu

li

n

a

Tr

atad

o

tu

b

u

lin

a

MCF-7

T47D

_HS58T

_BRL3A

Co

n

tr

o

le

tu

bu

li

n

a

Tr

atad

o

tu

b

u

lin

a

(39)

(40)

2,3,9-trimetoxipterocarpano:

• Parada do ciclo em prófase ou prometáfase

• Confirmado pelo índice mitótico e pela análise do DNA

por citometria de fluxo

• Aparentemente não possui atividade sobre os

microtúbulos

• Figuras semelhantes aos bloqueadores de EG5

(Monastrol) –

Mecanismo interessante!!!

(41)

AMIDAS DE Piper sp.

O O N O N O H₃CO H₃CO OCH₃ O

A

B

C

D

E

F

G

H

I

PIPERINA

PIPLARTINA

(42)

Relações estrutura-atividade de compostos

isolados de Piper spp.

O

N

O

Piperine

N

O

H

₃

CO

H

₃

CO

OCH

₃

O

Piplartine

Piplartina possui atividade antitumoral in

vitro e in vivo

Piperina apresentou atividade apenas em

modelos in vivo

D.P. Bezerra et al., Z. Naturforsch, 60, 539 (2005); D.P. Bezerra et al., Braz. J. Med. Biol.

Res, 39, 801 (2006)

(43)

CITOTOXICIDADE DA PIPLARTINA

• CI

₅₀

= 0.7 a 1.7 μg/mL em células tumorais

• Baixa seletividade- CI

₅₀

= 14.34 μg/mL em células

mononucleares de sangue humano

• Ensaios de genotixicdade sugerem que a piplartina inibe a

Topoisomerase do tipo-II

(44)

Requisitos estruturas para atividade

citotóxica

N

O

OCH

₃

CH

₃

O

CH

₃

O

Piplartine N-3’,4’,5’-trimethoxydihidrocinnamoil-dihidropyridin-2-one (1)

OH

O

OCH

₃

CH

3

O

CH

3

O

3’,4’,5’-trimethoxycinnamic acid (2)

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

OH

O-3,4,5-trimethoxycinamoil-1,2-ethanodiol (3)

2 carbonilas

α,ß-insaturadas

N O H₃CO H₃CO OCH₃ O

Piplartina

Não citotóxico

(45)

S-3,4,5-trimethoxycinamoil-benzene (4)

S

O

OCH

₃

CH

₃

O

CH

3

O

H

N

O

OCH

3

CH

3

O

CH

3

O

NH

2 N-3,4,5-trimethoxycinamoil-1,2-aminoethane (5)

2 carbonilas

α,ß-insaturadas

N O H₃CO H₃CO OCH₃ O

Piplartina

Não citotóxico

Requisitos estruturas para atividade

citotóxica

(46)

Atividade antitumoral

in vivo

Dia 0

inoculação do tumor

2 x 10

6

_cels/animal

Região da axila

Dia 1 - 7

Tratamento

Droga 10 e 25 mg/m

2

i.p.

Dia 10

Sacrfício dos animais

Parâmetros observados:

Peso do tumor

Fígado

Baço

Rins

O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:

IT (%) = [(A-B)/A] x 100

onde A = média dos pesos do tumor no grupo controle e B = peso do tumor nos animais

tratados.

(47)

(48)

Requisitos para atividade

antitumoral in vivo

Presença do grupamento

Metilenedioxifenil

O

N

O

Piperina

D.P. Bezerra et al., Braz. J. Med. Biol. Res, 39, 801 (2006);

D.P. Bezerra et al., J. Appl. Toxicol (in press)

O

NH

CH3

O

CH3

Piperlonguminina

(49)

Resultados promissores

D.P. Bezerra et al., J. Appl. Toxicol (in press)

Differential count of leukocytes (%) Drug Dose (mg kg-1) Hemoglobin

(g dL-1)

Platelet (107cells L-1)

Total leukocytes (103cells L-1)

Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte Saline - 14.15 ± 0.41 8.91 ± 0.47 5.66 ± 0.52 0.98 77.52 16.2 5,3 10% DMSO - 13.25 ± 0.53 7.42 ± 0.59 4.25 ± 0.43 0.8 69.62 23.0 7.0 5-FU 10 12.49 ± 0.53 8.02 ± 0.39 3.04 ± 0.23 a 1.3 55.4 a 40.0 a 3.3 Piplartine 50 14.34 ± 0.83 6.98 ± 0.45 6.69 ± 0.44 1.3 78.5 12.9 7.3 5-FU + Piplartine 50 + 10 13.59 ± 0.21 7.42 ± 0.59 5.73 ± 0.77 c 0.79 65.9 26.9 6.4 Piperine 50 11.98 ± 0.73 8.62 ± 0.29 5.69 ± 0.66 1.6 70.4 18.7 9.3 5-FU + Piperine 50 + 10 12.69 ± 0.47 6.35 ± 0.49 4.98 ± 0.38 c 1.7 67.4 25.6 5.3 Saline - 13.02 ± 0.32 7.1 ± 0.65 8.18 ± 0.53 a 1.0 56.8 a 39.5 a 2.7 10% DMSO - 12.04 ± 0.53 8.6 ± 0.53 7.95 ± 0.78 a 1.0 53.9 a 42.3 a 2.8 5-FU 10 12.42 ± 0.49 9.2 ± 0.62 3.32 ± 0.42 a,b 1.6 52.3 a 42.9 a 3.2 Piplartine 50 14.58 ± 0.72 9.5 ± 1.20 9.65 ± 1.05 a 0.9 69.2 26.4 3.5 5-FU + Piplartine 50 + 10 12.45 ± 0.69 9.4 ± 0.78 6.19 ± 0.98 d,c 1.9 72.6 b 21.0 b 4.5 Piperine 50 13.48 ± 0.52 9.3 ± 1.43 6.74 ± 0.79 a 0.9 65.9 27.2 6.0 5-FU + Piperine 50 + 10 12.35 ± 0.49 8.4 ± 1.02 5.79 ± 0.43 b,c 1.1 69.0 b 24.5 b 5.4

(50)

Piplartina pode ser considerada um protótipo

interessante para o desenvolvimento de novas

(51)

Capraria biflora L.

A

B

(52)

O

Biflorina

Isolada pelo doutorando Aluísio Marques da Fonseca

sob orientação da prof. Dra. Telma Leda Gomes de

Lemos do departamento de Química Orgânica e

Inorgânica da Universidade Federal do Ceará

CI

_50:

Células tumorais - 0,43 a 10,11

μg/mL

(53)

Mecanismo de ação:

• Outras quinonas (Lapachol & Cia) – induzem dano

oxidativo e inibem Topoisomerase tipo II

• Biflorina –

– Atividade antioxidante in vitro e in vivo

– Não interfere com Topoisomerase

– Atividade imunoadjuvante

– Interação direta com DNA

– Induz apoptose

(54)

Resultados in vivo

Carcinoma de Erlich e Sarcoma 180

Sarcoma 180

Droga Dose (mg/kg/dia) Fígado (g/100g peso corpóreo) Baço (g/100g peso corpóreo) Rins (g/100g peso corpóreo) Tumor (g) Inibição (%) n