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Reações Click para Obtenção de Compostos Com Potencial
Ação no Tratamento de Esquizofrenia
Aluno: João Gonçalves Neto
Orientadora: Camilla Djenne Buarque
1. INTRODUÇÃO
1.1. A Esquizofrenia
A esquizofrenia é uma doença cerebral crônica que afeta 1% da população mundial. Segundo a Sociedade Brasileira de Psiquiatria, a quantidade de pessoas que são afetadas pela doença no Brasil é em torno de 2,5 milhões. A doença caracteriza-se por múltiplas disfunções psicológicas e cognitivas que comprometem gravemente a saúde e a qualidade de vida dos pacientes (Singer, 2015). Uma pesquisa feita pela Revista Brasileira de Psiquiatria indica que cinco a cada dez pessoas com esquizofrenia já tentara suicídio e uma a cada dez se suicidam de fato.
Por muito tempo o tratamento da Esquizofrenia foi dominado por terapias que envolvem o uso de antagonistas de receptores dopaminérgicos, ou seja, o uso de antipsicóticos (Poter, 2014). Embora esses medicamentos (bloqueadores de receptores de dopamina D2) supram eficazmente os sintomas psicóticos ou positivos da esquizofrenia, não existe uma medicação satisfatória para os sintomas negativos e cognitivos desta doença (Singer, 2015), o que resulta em pacientes que muitas vezes se negam a fazer uso desses medicamentos.
Recentemente teorias não-dopaminérgicas, como a que envolve o sistema glutamatérgico, vêm se destacando com o objetivo de solucionar as deficiências das terapias atuais. Uma das abordagens mais estudadas, consiste em aumentar as concentrações sinápticas de glicina, co-agonista do receptor de NMDA (N-metil D-aspartato) através da inibição do transportador de glicina (GlyT-1) (Poter, 2014).
Estudos clínicos demonstraram que a sarcosina (N-metil glicina) um inibidor do transportador GlyT-1 apresenta atividade antipsicótica em pacientes com esquizofrenia, dessa forma a combinação de glicina com antipsicóticos convencionais está reduzindo os sintomas negativos em pacientes esquizofrênicos, algo que não ocorre com o uso dos antipsicóticos de forma isolada (Hashimoto, 2010; Singer, 2015).
2 Com base nos recentes estudos, a indústria farmacêutica tem demostrado um grande interesse no desenvolvimento de novos medicamentos que atuem como inibidores seletivos do transportador de GlyT-1 para o tratamento da esquizofrenia.
O composto (I) (Figura 1) é uma análogo da sarcosina que foi relatado como um inibidor seletivo de GlyT1 em estudos pré-clínicos in vivo em roedores, demonstrando eficácia similar a outros antipsicóticos (Lipina, 2005). Mais recentemente, outros compostos não análogos da sarcosina vêm atraindo atenção da comunidade científica, dentre eles está o composto (II) que se encontra em fase II (Pinard, 2010). Em 2013 foi relatado o composto (III) que apresentou IC50 de 0,064 µM para a inibição do transportador de glicina rGlyT1, além de ter apresentado atividade in vivo (Sugane,
2013).
Figura 1: Inibidores do transportador de glicina rGly T1 com ação antiesquizofrênica.
1.2. Triazóis
Triazóis são caracterizados por possuírem um anel aromático de cinco componentes onde três deles são átomos de nitrogênio e o sistema possui 6 elétrons π. Eles são classificados de acordo com sua isomeria sendo os vicinais 1, 2, 3 – triazóis e os simétricos 1, 2, 4 – triazóis (MELO, et al 2006), como indicado na Figura 2.
Figura 2: Formas isoméricas dos triazóis.
O que define qual isômero será formado é a rota sintética escolhida. 1,2,4- triazol
3 Um dos métodos mais conhecidos para a obtenção de triazóis é a cicloadição entre alcinos e azidas terminais, descrito por Sharpless colaboradores (KOLB, FINN, SHARPLESS, 2001). Essa nova metodologia é mais vantajosa em relação a maioria dos métodos conhecidos da época, pois nestas as temperaturas reacionais eram muito altas e a regiosseletividade era baixa (Jiang, et al 2014), enquanto que na metodologia Sharpless, ao formar triazóis 1,4-dissubtituídos os rendimentos são bons e as temperaturas reacionais são baixas, pois se trata de uma cicloadição catalisada por cobre. (KOLB e SHARPLESS, et al 2001).
A natureza especial da química do triazol favorece a sua ampla aplicação em diversas áreas de estudos, tais como: bioquímicos, na marcação de sistema biológicos; produtos farmacêuticos, agrotóxicos, corantes, inibidores de corrosão polímeros e materiais (KOLB e SHARPLESS, 2003; AGALAVE et al, 2011).
2. JUSTIFICATIVA
Visto a grande necessidade de aperfeiçoamento dos tratamentos atuais em relação à esquizofrenia, o fato dos compostos triazóis (Figura 1, composto III) já ter apresentado um efeito interessante em relação a este problema, e o pequeno número de trabalhos voltados para essa abordagem terapêutica, este projeto visa desenvolver uma série de novos compostos contendo anéis triazóis com diversos substituintes, que possam ser empregados como inibidores seletivos do transportador de glicina (Gly T1) relacionados ao tratamento terapêutico da esquizofrenia.
3. OBJETIVO
A proposta deste trabalho envolve preparar heterociclos nitrogenados estruturalmente relacionados aos compostos recentemente aprovados para o tratamento da esquizofrenia, em especial os inibidores seletivos de GlyT1. Estes compostos possuem em sua estrutura um anel triazólico ligado a anéis aromáticos (ou heterociclos nitrogenados) com distâncias semelhantes aos compostos já existentes.
4 4. METODOLOGIA
4.1. Estratégia Sintética
No Esquema 1 encontra-se a análise retrossintética dos triazóis prostostos neste trabalho. Os produtos finais foram obtidos através da reação Click entre os alcinos (5a-c) e as aril-azidas (3a-(5a-c), catalisada por sulfato de cobre. Estes, por sua vez, foram sintetizados através de aminas aromáticas (1a-b) e ácido borônico (2) enquanto os alcinos foram obtidos através do aldeídos aromáticos (4a-c), contendo ou não heteroátomo passando por uma etapa extra de reação de Suzuki quando necessário, nos casos (5a-b).
5 Para a síntese dos precursores das reações click, levando em consideração as rotas sintéticas escolhidas, foram estudadas as melhores condições experimentais visando alto rendimento, redução de subprodutos e solventes menos poluentes. De acordo com o que foi encontrado na literatura e levando em conta a disponibilidade dos reagentes, solventes e catalizadores, foram realizados os ensaios descritos a seguir.
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1. Síntese das azidas
5.1.1. Via sal de diazônio
O primeiro ensaio realizado foi a azidação da 4-Bromoanilina e da cumarina para a obtenção do 4-Bromoazidobenzeno e da 6-azida cumarina. A reação, representada no Esquema 2, foi feita via formação de sal diazônio seguida de adição de azida de sódio (NaN3), de acordo com uma adaptação da metodologia proposta por Wilkening et al, 2010. Esta via sintética apresentou altos rendimentos tanto para a 4-Bromoazidobenzeno, quanto para a 6-azida cumarina, sendo os valores de 73% e 94% respectivamente.
Esquema 2: Azidação de anilinas.
5.1.2. Via Ácido Borônico
Para a obtenção da segunda azida prevista na rota sintética, foi adotada a reação de obtenção de azidas catalisada por Cobre (II) de acordo com a metodologia de Oikawa et al, 2016. Desta forma foi possível obter o 4-Fluorazidobenzeno (3c) através do Ácido 4-Fluorfenilborônico (2). Esta reação está representada no Esquema 3 a seguir e o produto gerado foi necessário para a obtenção dos produtos triazóis (ii), (iii) e (iv). Para esta reação, não foi possível verificar o rendimento, pois as etapas seguintes foram
6 feitas diretamente in situ, sem isolar a azida do solvente presente, entretanto, ao verificar-se um bom rendimento na reação click, pode-se dizer que a reação para produção da azida também possui um bom rendimento.
Esquema 3: Reação de formação de azida a partir de Ácido Borônico.
5.2. Reação de Suzuki
Para a obtenção dos alcinos, a primeira etapa consiste na reação de Suzuki entre o ácido fenilborônico (6) e os reagentes (4a-b), como representado no Esquema 4. Ambas as reações apresentaram altos rendimentos, sendo para a obtenção de (5a) 70% e a de obtenção de (5b) 90%.
Esquema 4: Reação de Suzuki.
5.3. Síntese dos alcinos
Para a obtenção dos alcinos precursores para a reação click, foi feita uma reação de adição 1,2 a carbonila aos reagentes (5a-c) como representado no Esquema 5, seguindo a metodologia Weinhold, 2011. Os rendimentos foram respectivamente 53, 40 e 82% para (6a-b) o que indica que a presença do grupamento fenil na posição (Y) pode ter sido um fator de redução do rendimento reacional.
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Esquema 5: Reação adição do etiniltrimetilsilano.
Para a obtenção dos triazóis (ii) e (iv), uma etapa a mais no preparo dos alcinos foi necessária. Nessas etapas testamos dois procedimentos para a desproteção do alcino terminal seguindo a metodologia UEDA, 2014, como pode ser observado nos esquemas 6 e 7. Apesar de ambos em ambas as reações os rendimentos serem altos (80% para (7a) e 76% para (7b)), o K2CO3 se demonstrou como o agente mais apropriado para a remoção do grupo abandonador TMS, principalmente levando em conta o tempo reacional de apenas uma hora, contra as 28 horas para a reação de obtenção de (7b).
Esquema 6: Reação para remoção do grupo TMS.
Esquema 7: Reação para remoção do grupo TMS.
5.4 Síntese dos Triazóis
Para síntese dos triazóis utilizou-se a abordagem da reação “click” de acordo com a metodologia de Sharpless et al (2001) e Oikawa et al, 2016. Os casos estão representados nos Esquemas 8 e 9.
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Esquema 8: Reação click para a obtenção dos produtos (i) e (v).
Visando reduzir etapas reacionais optamos pela metodologia desenvolvida por Oikawa et al, 2016, onde ocorre a desproteção do alcino terminal no próprio meio reacional.
Esquema 9: Reações click para a obtenção dos produtos (ii), (iii) e (iv).
Observando os diferentes rendimentos representados na Tabela 1, pode-se supor que a substituição do bromo por um fenil contribuiu para o aumento de triazol (iii) produzido (de 54% para 70%). Também se observa que a substituição do bromo por flúor no anel ligado ao nitrogênio do anel triazol não demonstrou muita influência no avanço da reação. A utilização de piridinaldeído no lugar de benzaldeído apresentou uma redução de 10% no rendimento.
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Tabela 1: Rendimentos das reações click
Reagentes Produto Rendimento Azida Alcino 53% 54% 70% 60% 42%
Todos os cinco produtos finais foram confirmados através de RMN de hidrogênio.
5.5. Análise dos espectros RMN de hidrogênio dos produtos (i – iv)
5.5.1. Espectro do Triazol (i e ii)
Como para os triazóis (i) e (ii) a única diferença é a troca de um átomo de Flúor por um átomo de Bromo, seus espectros estão muito parecidos estão representados na Figura 1 abaixo.
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Figura 1: Espectro RMN de hidrogênio do produto (ii).
Apesar dos picos do espectro estarem relativamente largos devido a influência do átomo de Flúor, suas posições se encontram nos lugares esperados. Há um no local característico do hidrogênio do anel triazol, por volta de 7,4 e além disso a região dos aromáticos totaliza 9 hidrogênios, assim como na molécula prevista. Também se pode ver que o hidrogênio do carbono ligado à hidroxila se mostra presente no espectro próximo a 6,4ppm. O hidrogênio da hidroxila não se encontra no espectro e os picos próximos a 1,0 e 1,5 ppm são provavelmente resquícios de solvente. Dessa forma pode-se confirmar que os produtos (i) e (ii) obtidos são bem aqueles que pode-se depode-sejava.
5.5.2. Espectro do Triazol (iii)
11 Da mesma forma que o espectro anterior, o átomo de flúor ocasionou o alargamento dos sinais, entretanto ainda é possível identificar os sinais característicos do hidrogênio do triazol em 7,58 ppm, da região dos aromáticos e o hidrogênio do carbono ligado à hidroxila, próximo a 6,2 ppm. Esses e o número total de hidrogênios indicados no espectro são fortes indícios que o produto (iii) foi obtido.
5.5.3. Espectro do Triazol (iv)
Figura 3: Espectro RMN de hidrogênio do produto (iv).
Analisando o espectro, é possível confirmar que o produto obtido é de fato o triazol (iv). O hidrogênio do anel triazol se encontra em um singleto próximo a 7,6 ppm como indicado na literatura. Os três hidrogênios do anel piridínicos estão bem identificados próximo a 7,37, 8,67 e 8,08 ppm. Sendo o sinal presente em 8,67 ppm característico do hidrogênio orto ao anel piridínico. Todos os outros hidrogênios se encontram na região dos aromáticos (entre 7,0 e 8,2 ppm). Esses fatores e o fato que a quantidade de hidrogênios da molécula esperada é 15 e a quantidade presente no espectro (soma das integrações) é aproximadamente 14, considerando que o hidrogênio da hidroxila muitas vezes não aparece no espectro, são indícios muito fortes que a molécula obtida é a molécula esperada.
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b12 5.5.4. Espectro do Triazol (v)
Figura 4: Espectro RMN de hidrogênio do produto (v).
Pode-se ver que o sinal do hidrogênio do anel triazol está claramente presente próximo a 7,7. Outro fator que indica que a molécula obtida era a desejada são os sinais presentes na região aromática e o fato que o total dos valores integrados é igual ao número total de hidrogênios presentes na molécula.
Assim foi possível confirmar através da análise dos espectros de RMN de hidrogênio que todos os quatro triazóis desejados foram obtidos.
5.6. Análise biológica
Após a confirmação da obtenção de todos os 5 triazóis por RMN de hidrogênio, os produtos foram enviados ao laboratório na UFRJ que está em parceria com nosso grupo de pesquisa, para que as análises de toxicidade celular e da taxa de inibição do transportador de glicina Gly-T1 fossem feitas. Os resultados de inibição mostraram que destas cinco moléculas, apenas o triazol (i) demonstrou alguma taxa de inibição (42%), que ainda é considerado insuficiente. Os resultados do teste de toxicidade celular ainda não foram recebidos.
a
13 6. CONCLUSÃO
Pode-se dizer que houve um grande avanço no projeto, pois além de ter sido possível sintetizar todos os triazóis inicialmente propostos, para a maior parte das reações intermediárias e finais os rendimentos foram relativamente altos (acima de 50%, chegando até 90 %). Todas as moléculas obtidas foram confirmadas por RMN de hidrogênio e foram enviadas ao laboratório de análise biológica, onde foi confirmado que apenas o triazol (i) demonstrou alguma taxa de inibição (42%) para o transportador de glicina rGlyT1. Novas modificações serão propostas com o intuito de ampliar esta ação biológica.
7. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
7.1. Síntese das azidas
7.1.1. Via sal de diazônio
Esquema 10: Azidação de anilinas.
O procedimento a seguir foi utilizado na azidação da 4-Bromoanilina. Adicionou-se 6,7 mmol de 4-Bromoanilina e 10 mL de água a um balão de 50 mL que em seguida foi colocado sob agitação em um banho de gelo a uma temperatura constante de aproximadamente 5 °C. Adicionou-se 3,5 mL de uma solução de Ácido Sulfúrico 98% ao balão gota a gota e em seguida adicionou-se o Nitrito de Sódio. Após a formação do sal de diazônio e a total ressolubilização do precipitado, adicionou-se a Azida de Sódio. Deixou-se a mistura reacional sob agitação por 3 horas. Após esse tempo, extraiu-se a mistura 3 vezes com 10 mL de Acetato. Secou-se a fase orgânica o com Sulfato de Sódio anidro. Verificou-se o produto obtido com uma análise por RMN de hidrogênio.
14 No caso da cumarina, a quantidade de partida foi 1,28 mmol e as outras quantidades foram reduzidas de forma proporcional.
7.1.2. Via Ácido Borônico
Esquema 11: Reação de formação de azida a partir de Ácido Borônico.
Adicionou-se 0,21 mmol de Ácido 4-Fluorfenilborônico, 0,35 mmol de azida de sódio, 0,023 mmol de acetato de cobre (II) e, por fim, e 2 mL de metanol a um balão de 5 mL. A mistura permaneceu a agitação constante e a uma temperatura de 55 °C durante 1,5 horas. O consumo total dos reagentes foi monitorado por TLC e a reação click foi feita no mesmo balão.
7.2. Reação de Suzuki
Esquema 12: Reação de Suzuki.
Adicionou-se 2,16 mmol de 2-Bromobenzaldeído, 3,11 mmol de ácido fenilborônico, 0,216 mmol de Pd(OAc)2 e 0,432 mmol de trifenilfosfina a um balão de 25 mL. Em seguida adicionou-se 6,4 mL de tolueno para depois adicionar 4,4 mL de uma solução 2M de K2CO3. O sistema foi mantido sob agitação constante a 100 °C e refluxo overnight. Uma extração foi feita com 10 mL de água e 15 mL de acetato. A solução orgânica foi concentrada no rota evaporador e em seguida foi feita uma purificação por coluna de cromatografia com um eluente acetato/hexano (5:95). O solvente foi concentrado através da bomba de vácuo.
15 7.3. Síntese dos alcinos
Esquema 13: Reação adição do etiniltrimetilsilano.
Nesta etapa para a obtenção dos alcinos, a um balão seco com atmosfera de N2 foram adicionados 3 mL de THF seco seguido de 230 µL de etiniltrimetilsilano. O sistema vedado foi resfriado a -5 °C através de um banho de gelo. Em seguida gotejou-se 0,65 µL de n-BuLi e após 15 minutos, adicionou-gotejou-se 1,09 mmol de (5a). O sistema permaneceu a agitação constante e a -5 °C durante 4 horas. Por fim, adicionou-se 10 mL de uma solução saturada de NaHCO3 e uma extração foi feita com 3 vezes 15 mL de éter etílico. Uma coluna cromatográfica foi necessária para a purificação do produto. Assim sendo, empacotou-se a sílica com hexano e ET3N (3 gotas para 100 mL de hexano). Em seguida preparou-se a pasta com o produto, adicionando-se CH2Cl2, 2 gotas de Et3N e sílica. Colunou-se com fase móvel de acetato/hexano (10%), e após a saída do reagente, aumentou-se a proporção para (25%). Por fim, secou-se a fase orgânica com sulfato de sódio anidro e o solvente foi retirado através do rota evaporador.
Para o reagente (5b) e (5c), as quantidades iniciais foram de 1,03 e 0,62 mmol respectivamente. As quantidades dos outros reagentes foram ajustadas proporcionalmente e o procedimento foi repetido.
16 Este procedimento de remoção do grupamento TMS está presente no artigo UEDA, 2014. Ao balão contendo (6c), adicionou-se 0,081 mmol de K2CO3 e 3,5 mL de metanol. A reação foi colocada a agitação a temperatura ambiente durante 1 hora. Após esse tempo, foi feita uma extração com 10 mL de água e 3 vezes 1 mL de éter etílico. O produto obtido foi separado em uma coluna cromatográfica utilizando acetato/hexano (5:95) como eluente. O solvente foi retirado através de uma bomba a vácuo. O produto obtido foi confirmado através de uma análise RMN de hidrogênio.
Esquema 15: Reação para remoção do grupo TMS.
Para a retirada do grupo trimetilsilano, adicionou-se 0,5 mmol de (6a), 1,4 mmol de KF e 2,5 mL de metanol a um balão de 5 mL. A mistura reacional foi mantida sob agitação a temperatura ambiente por 2 horas. Após esse tempo foram adicionados mais 6 mg de KF e após completar-se 20 horas, foram adicionados mais 29 mg de KF. Quando se completou 28 horas do início da reação, uma extração com acetato e água foi feita, não havendo necessidade de coluna cromatográfica para purificação do produto. A fase orgânica foi concentrada no rota evaporador.
7.4 Síntese dos Triazóis
Para síntese dos triazóis utilizou-se a abordagem da reação “click” de acordo com a metodologia de Sharpless et al (2001) e Oikawa et al, 2016.
Para a reação click de acordo com a metodologia descrita por Sharpless, em um balão foram adicionados 0,51 mmol da azida (1a), 0,48 mmol do alcino (7a) e 0,05 mmol de ascorbato de sódio dissolvido em 2 mL de uma solução t-BuOH/H2O (1:1). Em seguida adicionou-se 0,008 mmol de sulfato de cobre (II) dissolvido em 2 mL de uma solução de t-BuOH/H2O (1:1). O balão foi vedado e colocado sob agitação a temperatura ambiente durante 8 horas. Após o tempo reacional, o produto foi filtrado com 10 mL de água gelada. Para a purificação do triazol obtido, foi necessária uma coluna de cromatografia iniciada a fase móvel acetato/hexano (20%). Depois que foi constatada a saída do reagente restante, a fase móvel foi modificada para Dicloro/metanol/Et3N (95:5:1) e assim o produto foi retirado da coluna. Este foi concentrado no rotaevaporador.
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Esquema 16: Reação click para a obtenção dos produtos (i) e (v).
Visando reduzir etapas reacionais optamos pela metodologia desenvolvida por Oikawa et al, 2016, onde ocorre a desproteção do alcino terminal no próprio meio reacional.
Esquema 17: Reação click para a obtenção dos produtos (ii - iv).
Para o reagente (3b), a quantidade inicial foi de 0,19 mmol e as outras quantidades foram com uma alteração proporcional.
Para a obtenção de (ii), 0,5 mmol de (6c) e 0,05 mmol do ascorbato de sódio dissolvido em uma solução de 0,5 mL de metanol foram adicionados diretamente no balão do 4-Fluorazidobenzeno (3c) que já continha Cu(OAc). A atmosfera foi modificada para N2 e a mistura reacional foi fechada sob agitação durante 17 horas. Após esse tempo, o balão foi deixado aberto para que ocorresse a oxidação do ácido borônico não reagido e em seguida foi feita uma extração com 25 mL de acetato e 3 vezes 20 mL de água. Após a secagem da fase orgânica, o produto foi purificado através de uma coluna cromatográfica com uma fase móvel acetato/hexano (30:70) para a retirada dos reagentes restantes. Para a retirada do produto, utilizou-se uma solução metanol/CH2Cl2 (5%). Por fim, o produto foi concentrado no rota evaporador.
18 Para os produtos (iii) e (iv), foram utilizados 0,19 mmol de (7b) e 0,21 mmol de (6b). Os outros reagentes foram utilizados de forma proporcional. Além disso, para esses dois casos uma pequena parcela de água foi adicionada para melhor solubilização do ascorbato e o tempo reacional aumentou para 24 horas.
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