UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO EM BOVINOS
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Janaina Baggio
Rio de Janeiro, set. 2008 JANAINA BAGGIO
Matrícula n.
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Trabalho monográfico de conclusão de curso (TCC), apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção de título de especialista, sob a orientação do Prof. Dr. Athos de Assumpção Pastore.
Rio de Janeiro, set. 2008
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Elaborado por Janaina Baggio
Foi analisado e aprovado com grau:... Piracicaba, _________de____________de________. __________________________ Membro __________________________ Membro __________________________ Prof. Dr. Athos de Assumpção Pastore
Presidente
Dedicamos este trabalho aos nossos familiares que sempre nos apoiou e ao nosso amigo Prof. Msc. Mauricio Barros Fernandes por pelas oportunidades por ele oferecidas.
SUMÁRIO
1. Introdução... 1
2. Revisão Bibliográfica... 2
2.1 Obtenção óocitos... 3
2.1.1 Aspiração folicular transvaginal... 3
2.1.2 Coleta de ovários em matadouro... 5
2.2 Seleção óocitos... 6 2.3 Maturação in vitro... 7 2.4 Fertilização in vitro... 9 2.4.1 Preparação espermática... 10 2.4.1.1 Seleção espermática... 10 2.4.1.2 Capacitação espermática... 11 2.4.2 Fecundação in vitro... 12 2.4.3 Cultivo in vitro... 14
2.4.4 Co-cultivo in vitro ou feeding... 16
2.4.4.1 Avaliação da clivagem... 17
2.4.4.2 Avaliação embrionária... 17
INTRODUÇÃO
A Produção in vitro (PIV) de embriões é um sistema alternativo de produção de embriões, principalmente bovinos, que utiliza oócitos imaturos coletados de ovários de doadoras de várias idades e estágios fisiológicos.
A PIV acelera a produção de animais geneticamente superiores e impede através da punção in vivo o descarte precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas portadoras de alterações adquiridas, que impedem a reprodução de forma natural (GONÇALVES, 2002). A PIV de embriões bovinos deve ser vista como mais uma alternativa a ser introduzida nos programas de reprodução assistida, pois, além de sua relevância para estudos biotecnológicos possui fundamento comercial. Em bovinos, a PIV associada à transferência de embriões (TE) é uma valiosa ferramenta para difundir animais geneticamente superiores. As recentes pesquisas têm visado estabelecer um sistema de produção eficiente, que não envolva equipamentos sofisticados e com elevado custo como as estufas gaseificadas, consideradas um fator limitante (KURTZ FILHO, 2002).
As principais etapas envolvem desde a colheita, maturação in vitro (MIV) e fertilização in vitro (FIV) dos oócitos, bem como, o cultivo in vitro (CIV) de zigotos e estruturas embrionárias (GONSALVES, 2002).
Os resultados obtidos com a PIV têm mostrado que a técnica tem perspectivas de produzir cerca de 36 bezerros por ano, de uma mesma doadora. Promover um avanço genético na pecuária aumentando os índices produtivos é uma questão de competitividade, principalmente no mundo globalizado que estamos vivendo hoje (AZEVEDO, 2006).
Esta biotécnica também alcançou um desenvolvimento tecnológico que já permite a sua aplicação comercial. Além disso, permite ainda empregar sêmen de touros do mais alto valor genético, aumentando a eficiência desse sêmen, sem que o custo afete o preço do embrião produzido, já que uma palheta de sêmen podem ser produzidos 100 embriões (RHEINGANTZ, 2000).
Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias também vêm sendo amplamente utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção e, ao longo da sua evolução, tem revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser um processo economicamente viável, bastante divulgado e empregado na pecuária moderna (RENESTO, 2004).
2- REVISÃO BLIBLIOGRÁFICA
A PIV tem início na obtenção de oócitos, que podem ser adquiridos pela aspiração folicular transvaginal obtidos de diferentes tipos de doadoras ou pela coleta de ovários em matadouros, e também pelas etapas de maturação, fertilização de oócitos e cultivo de zigotos e embriões.
2.1.Obtenção de oócitos
Os oócitos bovinos podem ser obtidos de ovários de vacas abatidas em frigoríficos, fonte abundante de oócitos para pesquisa. Eventualmente também se pode utilizar vacas de excelente desempenho e de alto valor comercial que, quando abatidas seriam aproveitadas. Adicionalmente, a coleta in vivo de oócitos de fêmeas bovinas adultas e pré-púberes de alto valor genético tem se tornado um procedimento freqüente através da aspiração transvaginal (KURTZ FILHO, 2002).
2.1.1. Aspiração folicular transvaginal
A primeira etapa da PIV é a obtenção in vivo dos oócitos (ovum pick up - OPU), através da técnica de aspiração folicular transvaginal. A OPU tem sido estudada por diversos grupos de pesquisa, e importantes melhorias foram implementadas, objetivando aumentar a eficiência e reduzir o investimento inicial para realização da técnica (SENEDA, 2005).
A técnica de OPU foi desenvolvida, na década de 80, para atender a demanda por um procedimento para a coleta de complexo cumulus-oócito (CCOs) que fosse menos traumática que as abordagens cirúrgica ou por laparoscopia até então utilizadas. A aspiração folicular orientada por ultra-som foi posteriormente adaptada para uso veterinário, sendo rapidamente reconhecida como a técnica de eleição para a recuperação de CCOs (VIANA, 2005).
A OPU associado à PIV, é ainda de fundamental importância para produzir embriões de vacas prenhes, de vacas que não respondem á superovulação, dos animais portadores de patologias reprodutivas adquiridas, de animais senis e pré - púberes. Esses podem ser coletados semanalmente, sem causar transtornos para o ciclo estral ou para a prenhez (EMBRAPA/CENARGEM, 2000).
Os principais fatores relacionados com o êxito da OPU podem ser divididos em duas grandes categorias. A primeira categoria se refere aos aspectos técnicos: procedimento de aspiração, tipo e diâmetro de agulha, pressão de aspiração e a possibilidade de influência do bisel da agulha. A segunda categoria inclui os fatores biológicos, como: estimulação hormonal prévia a punção folicular, o momento do ciclo estral que realizado o procedimento, raça e estado fisiológico da doadora (BOLS, 2001).
Segundos dados da EMBRAPA/CENARGEN (2000), a média de oócitos viáveis obtidos por coleta in vivo de vacas, é de cinco oócitos viáveis por punção, o que pode ser duplicado, se os animais receberem uma estimulação hormonal prévia. As taxas de blastocistos, após a PIV, estão em torno de 30%, com 40-50% de prenhez. Entretanto, existe uma grande variação na produção de blastocisto, que pode ser devido não só a doadora, mas também ao sêmen utilizado.
2.1.2. Coleta de ovários em matadouro
Segundo Hafez et al. (2004) para a obtenção de oócitos atualmente, pode ser realizada através dar coleta de ovários provenientes de frigoríficos. Os oócitos podem ser coletados por dissecação, fatiamento ou aspiração. A técnica de dissecação permite o isolamento de folículos individuais, o fatiamento de tecidos ovarianos fornece o maior número de oócitos, e a aspiração é a técnica mais eficiente em termo de tempo para obter oócitos.
Os ovários de abatedouro, apesar de serem uma importante fonte de oócitos para serem utilizados na pesquisa, são geralmente provenientes de animais sem valor econômico. Esses ovários são coletados logo após o abate, e são colocados em PBS (Phosphated Buffered Saline Solution) a uma temperatura de 30 á 35ºC, sendo transportados até o laboratório em recipiente hermético. Como os oócitos são sensíveis a choque térmicos, é importante um cuidadoso monitoramento da temperatura durantes os procedimentos de coleta e transporte (GALLI, 2003).
A colheita in vitro de oócitos provenientes de abatedouros é, geralmente, efetuada por meio de punção folicular com agulha acoplado a uma seringa. O tempo transcorrido entre a obtenção de ovários e o início da colheita varia entre grupos de pesquisa, mas não pode afetar a viabilidade dos oócitos quando realizado no período de até 3 horas (GONSALVES, 2002).
2.2. Seleção de oócitos
A seleção dos oócitos é feita em líquido folicular, sob fluxo laminar e sobre placa aquecedora. São selecionados oócitos com tamanho médio, ooplasma de coloração marrom homogênea e cobertura de células do cumulus (compacto em toda superfície do oócito), descartando oócitos muito grandes, retraídos ou de contorno irregular; com ooplasma com coloração muito clara ou apresentando granulação escura e com cummulus incompleto, frouxo ou expandido (CENTENO, 2005).
Conforme Gonsalves et al. (2002) algumas classificações morfológicas têm sido adotadas para selecionar oócitos bovinos na tentativa de identificar os de maior viabilidade. Classificação com escala de 1 a 4, considerando as características do cumulus (cobertura do oócito) e do ooplasma (citoplasma do oócito):
Qualaidade 1: Cumulus compacto presente, contendo mais de três camadas de células. Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom.
Qualidade 2: Cumulus compacto parcialmente presente em volta do oócito ou rodeando completamente o oócito, com menos de 3 camadas celulares. Ooplasma, com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentrados no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida.
Qualidade 3 : Cumulus presente, mas expandido. Ooplasma contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo
irregularmente o espaço perivitelíneo, degenerado, vacuolizado ou fragmentado.
Qualidade 4 : Oócito desnudo, sem cumulus.
Os oócitos imaturos são colocados em placa de Petri e sob estéreo microscópio, complexos CCOs são visualizados e colocados em cultura no meio de maturação (COELHO, 2000).
Apesar das células do cumulus não serem essenciais para a maturação dos oócitos, melhores resultados de maturação, fecundação e de desenvolvimento embrionário são alcançados na presença desse tipo celular, fato que evidencia a importância das células do cumulus na maturação do oócito in vitro (GONSALVES, 2002).
2.3. Maturação in vitro
A maturação de oócitos é procedimento chave na PIV de embriões, visto que as demais etapas do processo dependem da quantidade de oócitos maturos e com potencial de desenvolvimento. Portanto o sucesso tanto da PIV como de várias técnicas de reprodução assistida dependem, basicamente, da disponibilidade de uma população uniforme e competente de oócitos imaturos para serem utilizados na MIV. Mesmo após a rigorosa seleção de oócitos, a taxa de produção de embriões viáveis é menos em oócitos maturados
in vitro do que aqueles produzidos in vivo (DODE, 1999).
Segundo Gonsalves et al. (2002), as transformações que ocorrem tanto no núcleo quanto no citoplasma, estão ligadas a uma série de mudanças estruturais e bioquímicas que tornam o gameta feminino apto a ser fecundado e ter desenvolvimento embrionário
subseqüente. In vivo, esse processo tem início, coincidentemente, com o pico pré-ovulatório de LH durante o estro, e, in vitro, com a simples retirada do oócito do folículo. Enquanto oócitos para a PIV são obtidos de folículos e 2 a 6 mm de diâmetro e demorariam de 4 a 10 dias para uma possível ovulação, já in vivo recomeçam a meiose com 15 mm de diâmetro (PAVLOK et al., 1992). Em adição, o período de MIV é de 24horas, enquanto que o folículo dominante cresce de 4 para 15 mm em aproximadamente 5 dias. Conseqüentemente, é plausível dizer que a heterogeneidade do desenvolvimento cromossômico do oócito maturo reflete na influência de fatores intrínsecos no oócito que ocorre diferencialmente entre os folículos. Sabe-se que a mudança do núcleo do oócito ocorre durante o crescimento final e sua maturação assim como, o crescimento do folículo (FAIR et al.,1996). Essas mudanças podem ter um efeito crucial no desenvolvimento dos oócitos (FREITAS, 2004).
Segundo Sá et. al, (2003) enquanto está dentro de um folículo não-ovulatório, o reinício da meiose do oócito é inibido por fatores presentes no ambiente folicular. Entretanto, logo após a aspiração, o oócito perde contato com o fluído folicular e reinicia a meiose espontaneamente, tornando importante o tempo entre a aspiração e o início da MIV, a fim de não comprometer a capacidade de fertilização do oócito e do desenvolvimento do embrião. Portanto, é necessário que o oócito seja colocado o quanto antes em ambiente e meio de cultivo adequado para a MIV.
Quando os oócitos são retirados de folículos terciários e cultivados in vitro, a maturação ocorre tanto no núcleo quanto no citoplasma. Somente oócitos com maturação nuclear e citoplasmática podem ser fecundados. A primeira modificação visível do núcleo é a condensação da cromatina e a dissolução da membrana nuclear, processo conhecido
Os oócitos bovinos são maturados em meios específicos, acrescentados com soro fetal bovino e gonadotrofinas. Os oócitos são transferidos para uma placa contendo esse meio de maturação. Após romper os folículos para a liberação do CCOs, quatro a cinco ou um grupo de CCOs são colocados em microgotas do mesmo meio sob óleo em placas de Petri e incubados por 24 horas (HAFEZ, 2004).
A maturação oocitária tem que levar o oócito próximo ao ambiente encontrado no fluído folicular, para não somente levar a formação de blastocistos, mas também de embriões de qualidade garantindo assim boa taxa de prenhes (FREITAS, 2004).
2.4. Fertilização in vitro
A vida de um indivíduo é iniciada com a fusão do material genético de dois gametas -o espermat-ozóide e -o -oócit-o. Essa fusã-o chamada de fecundaçã-o estimula -o -ov-o -ou zig-ot-o a iniciar o desenvolvimento embrionário. A fecundação realiza, então, duas atividades independentes: a sexual (combinação de genes derivados dos pais) e a reprodutiva (criação de novos organismos). Portanto, a primeira função da fecundação envolve a transmissão dos genes dos pais para os descendentes e a segunda é iniciar no citoplasma do zigoto as reações que permitem que o desenvolvimento ocorra (PRESTES, 2006).
Depois que o espermatozóide penetra mecanicamente no oócito, este é incitado a se dividir e a se desenvolver embriologicamente. A penetração do oócito implica em que o espermatozóide atravesse primeiro a massa de células foliculares, nos animais que a
motilidade própria do espermatozóide e á intervenção de alguns processos enzimáticos (DERIVAUX, 1980).
2.4.1. Preparação espermática
2.4.1.1. Seleção espermática
As técnicas mais utilizadas para a separação de espermatozóides vivos dos demais componentes do sêmen e dos crioprotetores são: swin up, gradiente descontínuo e o lavado espermático. De acordo com Gonsalves et al. (2002), a técnica ideal para a separação espermática deve ser rápida, simples, de baixo custo, capaz de recuperar a maioria dos espermatozóides móveis, não resultar em alterações espermáticas, remover substâncias tóxicas e bioativas, permitir o processamento de grandes volumes de sêmen, além de permitir o controle da concentração e volume final da suspensão espermática.
No swin up, os espermatozóides vivos são separados dos mortos, do plasma seminal e dos componentes dos diluidores pela motilidade ascendente. Na separação espermática com gradiente descontinuo, o sêmen é centrifugado através da passagem por diferentes gradientes para permitir a separação dos espermatozóides vivos dos demais constituintes do sêmen, baseado na diferença de densidade, no lavado espermático, o sêmen é lavado por centrifugação restando um pellet ressuspendendo para a inseminação (GONSALVES,
De acordo com Parrish et al. (1995), o método do gradiente descontínuo resulta em uma recuperação de espermatozóides móveis seis vezes maior do que o swim up. Por outro lado, os espermatozóides preparados pelo método do swim up penetram um maior número de oócitos, ou seja, este método resulta em taxas de fecundação e de clivagem maiores durante a FIV do que o do gradiente descontínuo, quando a mesma concentração de espermatozóides é utilizada.
O método do gradiente descontínuo consiste na deposição dos espermatozóides sobre duas ou mais camadas de meio de cultura, com diferentes concentrações, dentro de um tubo que é submetido à centrifugação. Quando centrifugado, o meio de cultura forma um gradiente de densidade, devido à grande variação no tamanho das suas partículas. A centrifugação em gradiente descontínuo possibilita o fracionamento de subpopulações de espermatozóides. Este fracionamento separa claramente os espermatozóides de materiais estranhos, tais como partículas do diluidor utilizado, outras células e também bactérias (RHEINGANTZ, 2002).
2.4.1.2. Capacitação espermática
Segundo Assumpção et al. (2002) os espermatozóides de mamíferos não possuem habilidade para fecundar os oócitos imediatamente após a ejaculação, mesmo estando móveis e com aparente morfologia normal. No processo in vivo, os espermatozóides alcançam esta capacidade fecundante no trato genital feminino. A capacidade de adquirir
Nos processos in vitro, uma glicosaminoglicana, a heparina, tem sido utilizada para capacitar espermatozóides em bovinos. O mecanismo pelo qual a heparina atua na capacitação espermática não é completamente conhecido, todavia, parece estar envolvido no desencadeamento de mudanças bioquímicas na membrana plasmática do espermatozóide (GONSALVES,2002).
Existe variação individual entre touros quanto à concentração de heparina necessária para a capacitação espermática. A concentração ideal de heparina varia dependendo do touro e do processo de separação espermática. No entanto, é adequado, sempre que possível, determinar a concentração ideal para o sêmen que vai ser utilizado na rotina do laboratório (SEIDEL, 2004).
2.4.2. Fecundação in vitro
A fecundação marca o início do período embrionário pré - implantação, caracterizado por uma sucessão de divisões celulares mitóticas, até a ocorrência da primeira diferenciação celular no estágio de blastocisto e a liberação da zona pelúcida (PRESTES 2006).
Após a maturação dos oócitos e separação dos espermatozóides viáveis, deve-se proporcionar um ambiente adequado para que ocorra a capacitação espermática e a fecundação. Esse ambiente deve permitir o metabolismo dos oócitos e manter a função espermática eficiente (GONSALVES, 2002).
A ligação do espermatozóide ao oócito é mediada por receptores espermáticos espécie - específicos presentes na zona pelúcida. O oócito ativado pelo espermatozóide responde inicialmente com a despolarização da membrana plasmática, hidrólise de fosfatidilinositol bifosfato, aumento das oscilações intracelulares de cálcio, exocitose dos grânulos corticais, aumento do pH intracelular e da síntese protéica (VEECK, 1998).
Para impedir a penetração de mais de um espermatozóide, ocorre o bloqueio primário da polispermia que é devido á rápida despolarização da membrana plasmática do oócito após a fecundação, denominado bloqueio vitelínico. O bloqueio secundário resulta da reação cortical ou também denominada de reação da zona, após a penetração espermática que envolve a fusão da membrana plasmática do oócito com a membrana dos grânulos corticais. Essa fusão é propagada como uma onda, a partir do ponto da fusão espermatozóide - oócito (HAFEZ, 2004).
Após a penetração espermática, ocorre a segunda divisão meiótica e os cromossomos que permanecem no oócito são envolvidos por uma membrana nuclear, formando o pró-núcleo feminino. De forma concomitante, a membrana nuclear do espermatozóide se desintegra, a cromatina nuclear descondensa pela remoção de proteínas nucleares espermáticas específicas e ocorre a formação de nova membrana nuclear que envolve os cromossomos paternos, formando o pró-núcleo masculino (GONSALVES, 2002).
2.4.3. Cultivo in vitro
O cultivo in vitro (CIV) de embriões é feito após um período de 15 á 17 horas da FIV, segundo Rauber et al. (2003), os oócitos / zigotos são retirados do meio FIV e transferidos para o meio CIV onde permanece por 8 dias em placas de cultivo sob óleo mineral.
Após esse período, deve ser feito a desnudamento ao redor das células do cumulus para só assim realizar o cultivo. A taxa de clivagem é avaliada após 72 horas do CIV e o número de embriões que se desenvolvem para a fase de blastocisto é avaliado no dia 8 (ALI, 2005).
A retirada do cumulus que circunda os presumíveis zigotos pode ser realizada através de sucessivas aspirações e liberações dos zigotos com uma micropipeta de vidro. Esse método consiste no uso de uma pipeta de vidro com diâmetro ligeiramente superior ao zigoto. São realizadas aspirações sucessivas com 10 zigotos de cada vez na gota de fecundação até a retirada total das células somáticas e dos espermatozóides aderidos. Logo após, os zigotos são lavados três vezes em meio de cultivo, e então transferidos para gotas. É importante salientar que se o diâmetro da pipeta ficar muito grande, a retirada das células torna-se dificultada, todavia, se o diâmetro for menor do que o zigoto, essa célula poderá ser danificada a ponto de comprometer seu desenvolvimento (RHEINGANTZ, 2002; GONSALVES, 2002).
primeiros dias do desenvolvimento embrionário e da glicose durante os próximos três a quatro dias. Os aminoácidos (AA) são componentes essenciais utilizados nos meios de cultivo, que também atuam como fonte de energia, reguladores de pH e precursores de proteínas e ácidos nucléicos. Seu uso permitiu o aumento da proporção de embriões viáveis de várias espécies domésticas (muares, ovina e bovina). A água é também de fundamental importância, constituindo quase 99% do conteúdo do meio de cultivo (PALMA, 2001).
Gonsalves et al. (2002), destaca que é necessário, no cultivo embrionário, o uso de meio simples que suporte a nutrição celular e o desenvolvimento durante a fase de pré-implantação embrionária. A composição básica do meio é baseada nos fluídos do útero e do oviduto durante o início da gestação. O fluído do oviduto é composto por secreções das células epiteliais, a partir da difusão de nutrientes do plasma.
Embriões cultivados na ausência de proteínas de origem animal possuem diferenças na sua atividade metabólica, diminuição na capacidade de desenvolvimento e no número de células quando comparados àqueles cultivados na presença destas proteínas (MOZZAQUATRO, 2004).
Durante o cultivo in vitro, gametas e embriões são expostos a uma série de situações artificiais como alterações de temperatura, pressão de CO2 e O2, alterações nas
condições de luz, temperatura etc., e que podem afetar gametas e embriões, além de verem-se expostos ás substâncias com as quais dificilmente chegariam a contatar de forma natural e que podem afetar o desenvolvimento embrionário (SCHEFFER, 2003).
2.4.4. Co-cultivo in vitro ou feeding
A prática do co-cultivo em embriões parece invalidar a importância da utilização de um meio com características nutritivas específicas para sustentar o crescimento dos embriões em diferentes fases de desenvolvimento. São muitos os possíveis efeitos positivos do uso de diferentes células somáticas para o sustento do desenvolvimento do embrião in vitro, desde a liberação de fatores embriotróficos até a destoxificação dos meios de cultura e diminuição do efeito dos radicais livres. Em qualquer caso a recomendação é que cada laboratório utilize as condições de cultivo que forneçam os melhores resultados (SCHEFFER, 2003).
Segundo Tavares et al. (1999) para minimizar o bloqueio celular durante o CIV, vêm sendo utilizados sistemas de co-cultivo com células epiteliais de oviduto ou com células estabelecidas ou meios condicionados, demonstrando a não-especificidade do oviduto sobre o desenvolvimento embrionário. É sabido que o fluído do oviduto é constituído de várias substâncias derivadas do plasma sangüíneo e de proteínas específicas secretadas pelas células do oviduto, sendo que uma proteína de baixo peso molecular, provavelmente sintetizada pelo oviduto, é importante nas primeiras clivagens dos embriões.
É importante salientar que nesses sistemas de co-cultivo, os meios utilizados não podem ser pobres em componentes porque as células somáticas, após o quarto dia de cultivo, começam a competir com os embriões. A contribuição das células somáticas está na produção de fatores de crescimento que estimulam e são importantes para o desenvolvimento embrionário in vitro e na remoção dos componentes inibitórios do
amônia e outros. A opção do tipo celular para o co-cultivo vai depender da rotina e da disponibilidade do laboratório, não influenciando no desenvolvimento embrionário (GONSALVES, 2002).
2.4.4.1. Avaliação da clivagem
Para Gonsalves et al. (2002), ao final da singamia, origina-se o zigoto com novo arranjo citoplasmático e começa a formação de um organismo multicelular com outro potencial genético. Nessa fase tem início uma série de divisões mitóticas, por meio das qual o zigoto, que possuem uma célula com grande volume, se divide em numerosas células nucleadas de menor tamanho até a formação de blastocisto. Esse processo é conhecido como clivagem e as células resultantes da clivagem são denominadas de blastômeros.
2.4.3.2. Avaliação embrionária
O termo blastômero quer dizer segmento jovem ou os primeiros segmentos surgidos das divisões mitóticas do ovo. É bom ressaltar que o processo embrionário é feito por meio de mitose, sendo um processo onde todas as células que surgirão terão obrigatoriamente o mesmo material genéticas, descontadas as especializações das células. Toda a superfície do zigoto sofrerá segmentação e de esta ocorre de cima a baixo. Divide-se ao meio em dois blastômeros. A seguir, novas divisões vão surgindo cada uma formando mais duas células. As divisões se sucedem daí por diante. O número
blastômeros que recebeu o nome latino de mórula (amora). Todos os blastômeros integrantes dessa mórula são iguais (MARCZWSKI, 2002).
Logo se forma uma cavidade na mórula, convertendo-a em um blastocisto que consiste em uma massa celular interna, ou embrioblasto, que vai originar o embrião, uma cavidade blastocística e uma camada externa de células, o trofoblasto, que envolve a massa celular interna e a cavidade blastocística (MARCZWSKI, 2002).
A formação da blastocele, cavidade do blastocisto, é uma etapa que acontece após a compactação do embrião que é denominada de mórula compacta. Para a formação da blastocele é necessário haver acúmulo de fluido que passa através das células do trofoblasto, no interior do embrião. O número de células embrionárias no momento da formação do blastocisto varia consideravelmente entre as espécies (GONSALVES, 2002).
O blastocisto parece desempenhar o papel principal na eclosão à medida que a zona é rompida pela distensão do blastocisto para comprimir-se entre as bordas da abertura. A expansão do blastocisto envolve a hiperplasia celular e o acumulo de liquído dentro na blastocele (HAFEZ, 2004).
A classificação dos embriões, conforme o estágio de desenvolvimento é feita de acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões (SBTE), onde os embriões são divididos em sete categorias:
Mo - Mórula: apresenta-se como uma massa de células com separação nítida entre os blastômeros, ocupando quase a totalidade do espaço perivitelino (E. P. V.).
Mc - Mórula Compacta: os blastômeros estão agregados entre si, formando uma massa compacta e ocupam 60-70% do E.P.V.
Bi – Blastocisto inicial: formação da blastocele e ocorre o início da diferenciação entre trofoblasto e botão embrionário. O embrião ocupa 70-80% do E.P.V.
Bl – Blastocisto: evidente diferenciação entre células do trofoblasto e do botão embrionário; as células do botão embrionário estão compactadas, a blastocele é proeminente e o embrião ocupa a totalidade do E. P. V.
Bx – Blasocisto expandido: o embrião aumenta 1,5 x o seu diâmetro e a membrana pelúcida diminuem m 1/3 sua espessura.
Bn – Blastocisto em eclosão: o embrião está iniciando o processo de saída da membrana pelúcida.
Be – Blastocisto eclodido: o embrião está completamente livre da membrana pelúcida; ainda é nítida a presença da blastocele.
Só serão considerados os Blastocistos iniciais (Bi), Blastocistos (Bl), Blastocistos expandidos (Bx), Blastocistos em eclosão (Bn) e Blastocistos eclodidos (Be). Visto que, neste dia 07 da FIV, os embriões devem alcançar no mínimo o estágio de Bi, sendo que a maioria deverá estar no estágio de Bl e alguns no estágio de Bx. Alguns embriões só alcançarão estes estágios no dia 08 ou no dia 09, sendo estes considerados embriões de baixa qualidade (GALLI, 2003).
A avaliação da qualidade dos embriões era feita segundo os parâmetros de qualidade propostos pela IETS (Sociedade Internacional de Transferência de embriões) (1998).
Excelente ou Bom: estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado; massa embrionária simétrica esférica com blastômeros individuais que são uniformes em tamanho, cor, densidade, forma regular, a zona pelúcida (ZP) não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa, preferencialmente intacta, especialmente se o embrião é destinado á exportação; células extrusadas da massa celular do embrião compreendem menos de 15% do material celular total.
Regular: estágio de desenvolvimento correspondente ao esperado; forma regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; células extrusadas da massa celular do embrião compreendem mais de 15% do material total celular; pelo menos 50% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta.
Pobre: estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado; irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; menos d 75 % das células degeneradas; pelo menos 25% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta.
Morto ou degenerado: estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de todo material presente no interior da ZP; oócitos ou estruturas unicelulares degenerados.
2.4.5. Envase
O embrião é envasado em palhetas de 0,25 ml. A palheta é carregada em primeiro lugar com o meio de manutenção, deixa um espaço com ar e logo se carrega o embrião com meio de manutenção. Posteriormente, a segunda coluna de ar e a última novamente com o meio. A palheta que contem o embrião é colocada em uma bainha estéril e em seguida no inovulador. Para manter a bainha do inovulador livre de contaminações, deve ser usada a camisinha sanitária (PRADO, 2005).
3 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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4- ANEXOS - FIGURAS
Figura 1 – Aspiração de ovários
Figura 3 – Lavagem de oócito
Figura 5 – Placas
Figura 7 – Seleção de espermatozóide
